KR100554481B1

KR100554481B1 - 반코마이신 염산염의 정제방법

Info

Publication number: KR100554481B1
Application number: KR1020040050429A
Authority: KR
Inventors: 이주원; 정윤택; 서정우; 이광섭
Original assignee: 씨제이 주식회사
Priority date: 2004-06-30
Filing date: 2004-06-30
Publication date: 2006-03-03
Also published as: US7018814B2; ATE442380T1; EP1612216A1; TW200600576A; TWI270575B; KR20060001329A; JP2006014720A; DE602004023065D1; JP4173124B2; EP1612216B1; US20060003406A1; WO2006004238A1

Abstract

본 발명은 반코마이신을 함유하는 미생물 발효액을 강산성 양이온교환수지, 약염기성 음이온교환수지, 알루미나 및 소수성 흡착수지에 순차적으로 통과시켜 고순도의 반코마이신을 분리정제하는 방법을 제공한다.

반코마이신, 정제

Description

반코마이신 염산염의 정제방법{Process for the purification of vancomycin HCl}

도 1은 본 발명에 따라 정제된 반코마이신 염산염의 HPLC 분석결과 (유럽항생물질 의약품 기준 분석법)를 나타내는 도면이다.

도 2는 대조품으로 반코마이신 염산염 (일본 Lilly 사)의 HPLC 분석결과 (유럽항생물질 의약품 기준 분석법)를 나타내는 도면이다.

본 발명은 반코마이신을 함유하는 미생물 발효액으로부터 고순도의 반코마이신 염산염을 분리정제하는 방법에 관한 것이다.

반코마이신은 악티노마이세테스 (Actinomycetes) 속의 미생물, 예를 들면, 아미콜라톱시스 오리엔탈리스 (Amycolatopsis orientalis) 종 (ATCC 19795) 균주에 의해 생산되는 글리코펩타이드계 항생제로서 포도상구균 (Streptococci), 연쇄상 구균 (Staphylococci), 클로스트리디움 디피실 (Clostridium difficile)과 같은 그람 양성균 및 페니실린이나 세파계의 항생제 내성 그람 양성균에 우수한 약효를 나타낸다. 또한, 수술환자 및 고령환자, 면역력이 약한 사람에게 치명적인 메치실린 내성 포도상구균 (MRSA)의 치료에 효과가 높은 것으로 알려져 있다. 반코마이신 염산염은 경구 (액제 혹은 캡슐) 또는 주사제로 상용되고 있다.

현재 유럽 항생물질 의약품 기준에 따르면, 반코마이신의 함량이 93 % 이상이고 이외의 최대불순물의 함량이 4 % 이하인 품질을 갖는 반코마이신을 요구하고 있다.

종래의 통상적인 반코마이신을 정제하는 방법은 미국특허 제4,440,753호, 제4,845,194호, 제5,037,652호, 제5,149,784호, 제5,235,037호, 제5,258,495호, 제5,574,135호 등에 개시된 방법을 들 수 있다. 이 특허 방법에 따르면, 수율을 높이기 위해 발효액의 pH를 11로 조정한 후 여과하고, 여액의 pH를 8로 조정한 후 2회 내지는 3회의 흡착수지에 통과시켜 용출한다. 다음으로, 용매를 사용하여 반코마이신 염기염 결정을 수득한 후 다시 산성화하여 아세톤 또는 알코올 류의 용매 내에서 결정화하므로써 반코마이신 염산염을 제조한다. 그러나, 이러한 방법을 이용할 경우, pH의 수 차례 조정에 의하여 반코마이신 염산염 결정을 수득하며, 중간체로 반코마이신 염기염 결정을 수득한 후 다시 반코마이신 염산염을 수득하므로 공정이 매우 복잡하고 높은 pH에서 반코마이신의 안정성이 문제가 될 수 있다. 특히, 잔존한 색소의 영향으로 제품이 약간 붉은 색깔을 나타내고, 순도가 93 % 이상인 반코마이신의 제조가 어렵다. 그 결과, 유럽 항생물질 의약품 기준에 규정된 품질을 충족시키는 반코마이신을 생산하기 어렵다.

본 발명자들은 기존에 개발된 반코마이신 정제방법의 문제점을 보완하여 고순도의 반코마이신 염산염을 얻을 수 있는 간단하고 새로운 정제 방법을 개발하고 자 집중적인 연구를 수행하였다. 그 결과, 반코마이신을 함유하는 미생물 발효액을 강산성 양이온 교환수지에 통과시키고 용출시킨 다음, pH를 산성 즉, pH 3~5으로 조정한 후 약염기성 음이온 교환수지 및 알루미나에 의해 색소를 제거하고, 소수성 흡착수지에 순차적으로 통과시켜 아세톤 용매에 의해 반코마이신 염산염을 회수하므로써, pH를 염기성으로 바꾸는 조작에 의해 반코마이신 염기염의 중간체를 수득하는 과정없이 직접 반코마이신 염산염을 회수하므로써 공정을 단순화하면서 반코마이신의 순도도 증가하며 특히, 대부분의 색소가 제거되어 소기의 목적을 달성할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

따라서, 본 발명의 목적은 반코마이신을 함유하는 미생물 발효액으로부터 고순도 반코마이신 염산염을 간단하게 정제하는 방법을 제공하기 위한 것이다.

본 발명은 (a) 반코마이신을 함유하는 미생물 발효액을 pH 1 내지 3의 조건에서 강산성 양이온 교환수지에 통과시키고 pH가 9 내지 11이고 농도가 0.05 N 내지 0.2 N인 수산화 암모늄 용액으로 용출시키는 단계; (b) 얻어진 용출액을 pH 3 내지 5로 조정한 후 약염기성 음이온 교환수지 및 알루미나에 연속적으로 통과시키고 물로 세척하여 색소를 제거하는 단계; (c) 얻어진 용출액을 소수성 흡착수지에 통과시키고 C1 내지 C4의 알콜 수용액으로 용출시키는 단계; 및 (d) 상기 용출액에 염산을 가하여 pH를 2 내지 5의 범위로 조정하고 C1 내지 C4의 알코올, 아세토니트릴, 아세톤 또는 메틸이소부틸케톤을 포함하는 수용성 유기용매, 바람직하게 는 아세톤을 가하여 반코마이신 염산염을 결정화하는 단계를 포함하는, 반코마이신을 함유하는 미생물 발효액으로부터 반코마이신 염산염을 정제하는 방법을 제공한다.

본 발명의 (a) 단계에서, 반코마이신을 함유하는 미생물 발효액을 pH 1 내지 3의 조건에서 강산성 양이온 교환수지에 통과시키고 수산화 암모늄 용액으로 용출시킨다. 상기 미생물은 반코마이신을 생산하고, 배양물 중에 반코마이신을 축적할 수 있는 미생물이면 어느 것이 포함된다. 예를 들면, 아미콜라톱시스 오리엔탈리스 (Amycolatopsis orientalis), 더욱 구체적으로는 아미콜라톱시스 오리엔탈리스 (Amycolatopsis orientalis) (ATT 19795)를 진탕 배양한 배양물이 될 수 있다. 이러한 배양물은 산, 예를 들면 염산 및 황산과 같은 강한 무기산을 사용하여 배양물을 pH 1 내지 3으로 조정할 수 있다. 산성 pH로 조정된 배양물을 일정한 시간 예를 들면, 30 분 동안 방치한 다음, 여과 깔때기를 사용하여 균체와 고형 분순물을 제거하고 여액을 추후의 정제과정에 사용할 수 있다. 상기 강산성 양이온 교환수지는 강산성 바람직하게는 pH 1 내지 3의 조건에서 양이온 물질을 흡착할 수 있는 화합물이다. 상기 강산성 양이온 교환수지는 바람직하게는, DOWEX 50WX2 (50 ~ 100mesh, 설폰계 수지, Dow chemical 사)이다. 발효액을 상기 양이온 교환수지에 로딩하는 속도는 당업자라면 임의적으로 조절 할 수 있으며, 예를 들면 0.5 내지 2.0 배의 칼럼 부피의 유속으로 로딩할 수 있다. 용출은 수산화 암모늄 용액 예를 들면, pH가 9 에서 11이고 농도가 0.05 N 내지 0.2 N인 수산화 암모늄 수용액을 이용하여 용출한다. 본 단계에서 얻어지는 반코마이신의 순도는 약 85 % 이상이다. 상기 반코마이신 용출액은 용출되는 동시에 바로 산 예를 들면, 염산으로 pH를 3 내지 5로 조정하여야 한다.

본 발명의 (b) 단계에서, (a) 단계에서 얻어진 용출액을 약염기성 음이온 교환수지 및 알루미나에 연속적으로 통과시키고 물로 세척하여 반코마이신을 용출시키고, 색소를 흡착시켜 제거한다. 상기 약염기성 음이온 교환 수지는 예를 들면, DCA11 (아크릴계 다공성 수지, Mitsubishi 사)이 될 수 있으며, 상기 알루미나는 활성 알루미나 (~150 mesh, 산성활성, ALDRICH 사)가 될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 (b) 단계에서 얻어진 용출액을 활성 탄소와 혼합하여 교반한 다음 여과하여 색소를 더 제거할 수 있다. 활성 탄소의 사용량은 예를 들면, 반코마이신 양의 10 %가 될 수 있다. 이렇게 얻어진 물 중에는 반코마이신의 순도가 약 90 %로 증가한다.

본 발명의 (c) 단계에서, (b) 단계에서 얻어진 용출액을 소수성 흡착수지에 통과시키고 C1 내지 C4 알콜 수용액으로 용출시킨다. 소수성 흡착수지는 역상 크로마토그래피에 사용되는 통상의 소수성 수지가 사용될 수 있다. 예를 들면, Amberchrom CG-161M (입자크기 75 ㎛, Rohm & haas 사)가 될 수 있다. 상기 C1 내지 C4 알콜 용액은 예를 들면, 메탄올, 에탄올, 및 이소프로판올로 이루어지는 군으로부터 선택되는 알콜 용액이 될 수 있다. 또한, 상기 알콜 용액에는 무기염, 예를 들면 50 mM 농도의 무수인산나트륨 (NaH₂PO₄)이 포함될 수 있으며, 용출은 반코마이신의 용출의 효율을 높이기 위하여 일정한 구배를 통하여 적용할 수 있다. 이 러한 농도 구배를 가하는 과정은 당업자라면 적절한 예비 실험을 통하여 용이하게 설정할 수 있다. 상기 C1 내지 C4 알콜 용액에 의한 용출에 의하여 얻어지는 반코마이신은 유럽 항생물질기준에 의한 HPLC로 분석한 결과, 순도가 95 % 이상이 된다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 (c) 단계로부터 얻어지는 용출액을 농축하는 단계를 더 포함한다. 이러한 농축 과정은 당업계에 통상적으로 알려진 방법, 예를 들면, 역삼투 및 진공 건조 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 (d) 단계에서, 상기 용출액에 염산을 가하여 pH를 2 내지 5 범위로 조정하고 C1~C4의 알코올, 아세토니트릴, 아세톤 또는 메틸이소부틸케톤을 포함하는 수용성 유기용매, 바람직하게는 아세톤을 가하여 반코마이신 염산염을 결정화한다. 상기 용출액은 예를 들면, 역삼투에 의하여 농축된 다음, 염산을 가하여 pH를 2 내지 5의 범위로 조정하고, 아세톤을 상기 용출액 부피의 5배의 양으로 가한 다음, 약 2 내지 8 ℃에서 일정한 시간 예를 들면, 약 20 시간 방치함으로써 반코마이신 결정을 얻을 수 있다. 이렇게 얻어진 반코마이신 결정을 여과하고, 진공건조기를 통하여 건조함으로서 반코마이신 염산염을 회수할 수 있다. 최종적으로 회수된 반코마이신 염산염은 유럽 항생물질기준에 의한 HPLC로 분석한 결과, 순도가 95 % 이상이며, 1,000 mcg/ml 이상의 항균 역가를 갖는 것이다. 따라서, 본 발명의 방법에 의하여, 고순도의 반코마이신을 간단한 정제 공정을 통하여 얻을 수 있다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예 에 한정되는 것은 아니다.

실시예

실시예 1 : 강산성 양이온 교환수지 (DOWEX 50WX2)를 통한 정제

먼저, 반코마이신을 5,000 ㎎/ℓ 농도로 함유하는 아미콜라톱시스 오리엔탈리스 (Amycolatopsis orientalis) 종 (ATCC 19795)의 발효액 6,000 ml에 황산을 혼합하여 pH를 2로 조정하였다. 산성으로 조정된 배양물을 30 분 동안 방치한 다음, 규조토 여과기를 사용하여 여과하여 7,500 ml의 여액을 얻었다.

농축액을 강산성 양이온 교환수지인 DOWEX 50WX2 (Dow chemical) 2,000 ml에 시간 당 2,000 ml의 유속으로 통과시켜 흡착시켰다. 다음으로, 시간당 2,000 ml 유속으로 증류수 4,000 ml를 가하여 세척하고, 세척 후 pH 10인 0.1 N NH₄OH 수용액 5,000 ml를 사용하여 DOWEX 50WX2 수지로부터 반코마이신을 용출시켰다. 그 결과, 4,500 ml의 용출액을 얻었다 (수율: 88 %). 용출 즉시 2 N HCl을 가하여 용출액의 pH를 3.5로 조정하였다.

실시예 2: 약염기성 음이온 교환수지 및 알루미나를 통한 정제

실시예 1에서 얻은 용출액 4,500 ml를 약염기성 음이온 교환수지인 DCA11 (Mitsubishi 사, 일본) 1,000 ml 및 활성 알루미나 (ALDRICH 사,미국) 800 ml에 시간당 1,000 ml의 유속으로 연속적으로 통과시켰다. 이후 물 2,000 ml를 시간당 1,000 ml 유속으로 세척하였다.

수득된 용출액에 활성 탄소 15 g을 투입하고 20 분 동안 교반한 후 여과하였 다. 수득된 용출액의 부피는 4,800 ml이었다 (수율: 85%).

실시예 3: 소수성 흡착수지 (Amberchrom CG-161M)를 통한 정제

실시예 2에서 얻은 용출액 4,800 ml를 소수성 흡착수지인 Amberchrom CG-161M (Rohm & haas 사) 500 ml에 시간당 1,000 ml의 속도로 통과시켜 흡착시켰다. 시간당 1,000 ml 유속으로 물 1000 ml를 적용하여 세척하고, 이후 동일 유속으로 2.5 시간 동안에 50 mM 농도의 무수인산나트륨 (NaH₂PO₄)이 첨가된 이소프로판올의 농도를 8 %까지 일정하게 연속적으로 증가시키며 반코마이신을 용출시켰다. 이때 400 ml 씩 분취하여 유럽항생물질 기준의 HPLC로 분석하여 순도가 93 %이상인 분획만을 합하여 반코마이신을 회수하였다. 수득된 용출액의 부피는 1,400 ml이었으며, 반코마이신을 95 %이상 함유하였으며, 대부분의 색소가 제거되었다.

실시예 4: 결정 회수 및 분석

실시예 3의 방법으로 얻은 용출액을 역삼투 (R/O)를 이용하여 400 ml로 농축하였다. 농축액에 동일 부피의 물을 가하고 역삼투 (R/O) 농축을 계속하여 400 ml까지 농축하였다. 이와 같은 방법으로 물을 12회 가하여 100 ml까지 농축하였다. 2 N HCl을 사용하여 pH를 3.2로 조정한 후 5 배 부피의 아세톤을 서서히 점적하고 4 ℃에서 하룻밤 동안 방치하고 여과하였다. 여과된 침전물을 40 ℃ 이하의 진공건조기에서 하룻밤 동안 건조하였다. 건조된 반코마이신 염산염의 무게는 13,500 ㎎이었다. 이것을 2001년 유럽 항생물질 의약품 기준에 의한 HPLC로 분석하였다. 이 때, 대조품으로 현재 시판중인 반코마이신 염산염 (일본 Lilly 사)을 사용하였다.

그 결과를 도 1 및 2에 각각 나타내었다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 방법에 따라 정제함으로써, 반코마이신의 함량이 95.5 %이고, 1,024 mcg/㎎ 이상의 항균 효능을 갖는 고순도의 반코마이신 염산염을 수득할 수 있었다. 한편, 도 2에 나타낸 바와 같이, 시판품인 반코마이신의 경우, 본 발명에 따른 정제품에 비해 반코마이신의 함량이 93 % 정도이며, 색도의 차이가 많은 것으로 확인되었다.

본 발명에 따른 정제방법을 이용하면, 반코마이신 염산염 중 색소의 함량이 현저히 감소된 95 % 이상의 함량을 갖는 고순도의 반코마이신 염산염을 분리정제 할 수 있다.

Claims

(a) 반코마이신을 함유하는 미생물 발효액을 pH 1 내지 3의 조건에서 강산성 양이온 교환수지에 통과시키고 pH가 9 내지 11이고 농도가 0.05 N 내지 0.2 N인 수산화 암모늄 수용액으로 용출시키는 단계;

(b) 얻어진 용출액을 pH 3 내지 5로 조정한 후 약염기성 음이온 교환수지 및 알루미나에 연속적으로 통과시키고 물로 세척하여 색소를 제거하는 단계;

(c) 얻어진 용출액을 소수성 흡착수지에 통과시키고 C1 내지 C4의 알콜 수용액으로 용출시키는 단계; 및

(d) 상기 용출액에 염산을 가하여 pH를 2 내지 5 범위로 조정하고 C1 내지 C4의 알코올, 아세토니트릴, 아세톤 또는 메틸이소부틸케톤을 포함하는 수용성 유 기용매를 가하여 반코마이신 염산염을 결정화하는 단계를 포함하는, 반코마이신을 함유하는 미생물 발효액으로부터 반코마이신 염산염을 정제하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 미생물은 아미콜라톱시스 오리엔탈리스 (Amycolatopsis orientalis) 인 방법.
제1항에 있어서, 상기 강산성 양이온 교환수지는 DOWEX 50WX2-100 (50 ~ 100 mesh, 설폰계 수지, Dow chemical 사)인 방법.
제1항에 있어서, 상기 약염기성 음이온 교환수지는 DCA11 (아크릴계 다공성 수지, Mitsubishi 사)인 방법.
제1항에 있어서, (c) 또는 (d) 단계에서 C1 내지 C4의 알콜은 메탄올, 에탄올, 및 이소프로판올로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 소수성 흡착수지는 Amberchrom CG-161M (Rohm & haas)인 방법.
제1항에 있어서, (b) 단계로부터 얻어지는 용출액을 활성탄과 혼합하고 여과하는 단계를 더 포함하는 방법.
제1항에 있어서, (c) 단계로부터 얻어지는 용출액을 농축하는 단계를 더 포함하는 방법.