KR950009201B1 - 이온 교환수지 및 알루미나 수지를 이용한 반코마이신의 정제 - Google Patents

Abstract

내용 없음.

Description

이온 교환수지 및 알루미나 수지를 이용한 반코마이신의 정제

제1도는 발효 여액, PK208 용리액, 알루미나 통과액 및 CM-Toyopearl 650의 용리액의 고압 액체크로마토그라피 분석 결과이고,

제2도는 SK1B, A561(PA408) 및 PK208 수지로부터의 반코마이신의 용리 그래프이며,

제3도는 CM-Toyopearl 650의 흡착 및 용리 그래프이고,

제4도는 본 발명에 의해 제조된 최종 제품과 미국약전 표준품과의 고압액체 크로마토그라피 분석결과이다.

본 발명은 토양으로부터 분리한 미생물인 노카르디아 오리엔탈리스(Norcardia orientalisl 과거에는 streptomyces orientalis로 명명)를 배양하여 균체를 분리시킨 후, 반코마이신을 함유한 발효 배양액을 정제시, 양이온 교환수지와 음이온 교환수지 및 다공성 양이온 교환수지(porous type)를 연속통액시키고 암모니아로 용출한 뒤, 알루미나 및 약산성 양이온 교환수지를 이용하여 색소 및 단백질 등의 불순물이 제거된 염산염 형태의 반코마이신을 분리, 회수함을 특징으로 하는 반코마이신의 정제방법에 관한 것이다.

반코마이신은 글리코 펩타이드(glycopeptide)계 항생제로서 항균기작은 세포벽의 합성을 저해하는 것으로, 그람-양성 박테리아성 질환의 치료에 사용되며 특히 페니실린이나 세팔로스포린계의 항상제에 저항성이 있는 세균성 질환에 유용성이 높아지고 있다.

종래의 반코마이신 제조방법은 발효액을 여과한 후 양이온 교환수지를 통과시키고 용출한 후, 표백탄으로 처리한 다음, 가용성 반코마이신을 불용성 구리 착화합물로 분리하고, 이를 산성 조건하에서 황화수소를 처리하여 반코마이신을 용해시키고 유리염기로 분리하였다. 그러나 이는 가끔 악취가 발생하고 또한 다른 색깔을 띤 반코마이신 생성물을 생성시키며 수율도 30%를 넘지 못하는 단점을 지니고 있었다(EP 84308610).

또한, 미국특허 4,440,753에 의한 반코마이신의 정제방법은 발효공정이 완료된 후 발효액을 여과하여 고체 및 균사를 제거하고, 가용성 항생물질을 함유하는 여과액을 양이온 교환수지와 비온성 흡착수지인 다이아이온 HP(고다공성)계 수지를 사용하여 용리시킨 후 농축하여 에탄올을 가함으로써 정석을 수행한 다음, 이를 회수하여 건조함으로써 인산염의 반코마이신을 제조하는 것으로 알려져 있다. 그러나, 이 방법에도 다시 염산염으로 치환하는 공정이 필요하며 반코마이신의 회수율도 높지 않다.

따라서 본 발명들은 종래기술에 있어서의 단점을 보완하고 다단계의 분리 및 정제공정을 수행하였음에도 회수율이 50%-60%에 이를뿐 아니라, 개선된 높은 순도 및 약학 특성을 갖는 반코마이신의 정제공정을 개발하게 되었다.

반코마이신의 발효액은 노카르디아 오리엔탈리스 균주를 진탕배양한 배양액을 사용하였다. 이 발효액을 황산으로 pH를 2.0 내지 3.0의 산성으로 조절한 후, 통상적인 규조토 여과기를 사용하여 고체 불순물 및 균사를 제거하고 아래의 연속적인 공정을 통해 반코마이신을 회수하였다.

이를 상세히 설명하면 다음과 같다.

반코마이신 발효액에는 각종 양이온과 음이온이 다량 함유되어 있으므로, 이를 제거하기 위해 다양한 종류의 이온교환수지를 실험하였다.

다음의 표 1.은 그 결과를 요약해 놓은 것이다.

[표 1]

* 탈색율은 420㎚에서의 흡광도로 계산한 것임.

스티렌계 강산성 양이온 교환수지인 듀오리트 C-20(Duolite C-20)(또는 다이아이온 SK1B : Diaion SK1B)과 스트린계 강염기성 음이온 교환수지인 다이아이온 PA408(또는 약염기성 음이온 교환수지인 A561)의 결과가 수율 및 탈색, 탈염의 효과가 좋으므로 이 수지를 사용한 후 반코마이신을 흡착시킬 수지를 선정하기 위한 여러가지 이온 교환수지를 실험하였다.

다음의 표 2.는 그 결과를 요약해 놓은 것이다.

[표 2]

여러가지의 수지 선정 실험결과 PK208(Diaion)이 가장 적합한 수지로 나타났으며, 전처리 공정, 즉 SK1B 및 PA408 처리를 하지 않은 여액의 경우보다 30-35% 정도 더 많은 양의 반코마이신을 흡착하였다. 따라 SK1B(DC-20)와 PK408(DA-561) 및 PK2-8을 연속통액하는 방법을 사용하였다.

즉, 상기 3개의 수지컬럼(SK1B → A561 → PK208)을 유속 0.5-2.0SV(PK208기준)로 연속적으로 통액시킨다. 수지를 물로 세척하고, 수세의 종결은 마지막 컬럼(PK208)의 280㎚에서의 흡광도가 0.1이하가 되었을때 수세를 완료하였다.

수세가 완료되면 홉착된 수지를 pH 약 10.1-11.0의 알카리 수용액으로 용출시킴으로써 반코마이신을 수지로부터 용출한다. 통상적인 용출 용매는 pH 10.0-11.0의 수성 암모니아를 사용하였다.

반코마이신을 함유하는 수지 용출액은 즉시 무기산(염산, 수산, 황산)으로 반코마이신이 안정한 pH인 2.0-4.0으로 조절하고, 알루미나(활성알루미나, Wako) 수지상을 통액시킨다. 알루미나 수지에는 아직 반코마이신 수용액에 남아있는 색소 및 단백질, 발열성물질(pyrogen)등의 불순물이 흡착되며, 반코마이신은 그대로 통과되어 나온다.

알루미나 통액후 반코마이신 수용액을 농축과정에서 무기염류도 제거할 수 있는 역삼투막을 이용하여 농축한다. 사용되는 막의 재질은 폴리아미드계, 폴리스티렌계, 폴리설폰계였고 온도는 10-30℃, 압력은 10-40㎏/㎠로 반코마이신의 농도가 50-80g/L까지 농축하였다.

다음의 표 3.은 역삼투과 실험결과이다.

[표 3]

농축된 용액을 다시 강산성 스티렌계 양이온 교환수지인 C-20 또는 SK1B에 통액하여 탈색 및 양이온을 제거하고, 약산성 양이온 교환수지인 CM-Toyopearl 650(TOSOH 회사) 또는 CM 세파로스 FF를 통과시켜 반코마이신을 흡착시킨다. 물로 수세를 완료한 후, 적절한 용출 용매, 바람직하게는 0.1N-0.4N의 염화암모늄 수용액으로 용출시킨다.

CM-Toyopearl 650으로부터 용출된 반코마이신 액을 염산을 사용하여 pH 2.0-4.0으로 조절한 후 역삼투막을 이용한 농축 공정을 다시 실시한다. 반코마이신의 농도를 150g/L-200g/L까지 농축하고 그때의 수용액 부피의 1배-2배의 에탄올로 세척한 후, 진공상태에서 20℃-40℃의 온도를 유지시키면서 하루동안 건조시킨다.

분말 반코마이신의 수분함량은 5% 미만, 반코마이신 B의 인자는 92이상%, 항균효능은 990mcg/㎎ 이상(무수물기준)의 반코마이신을 얻을 수 있었다.

다음의 실시예들은 본 발명을 보다 상세히 설명한 것이다.

[실시예 1]

반코마이신 발효액 20L를 황산을 사용하여 pH 2.0-2.5의 산성으로 조절하고 통상적인 규조토 여과기를 사용하여 여과한다. 여과후 30L의 여과액을 듀오리트 C-20수지, 1.0L가 충진된 컬럼을 시간당 3L의 유속으로 통과시킨 후 물로 세척하였으며 수세의 종결점을 280㎚에서의 흡광도가 0.1이하인 경우로 정하였다. 이때 회수액의 부피는 36L였으며 회수율은 98%이었다. 다시 이 용액을 듀오리트 A-561 수지 2.0L가 충진된 컬럼을 통과시키고 물로 세척하여 반코마이신 함유 부분을 회수하였다. 회수액의 부피는 40L였으며, 회수율은 99%, 유속은 시간당 4L이었다.

이 통액된 반코마이신 수용액을 다이아이온 PK208 양이온 교환수지 6L에 시간당 6L의 유속으로 통과시키고 수세한 후, pH 11 내지 pH 13의 암모니아수로 반코마이신을 용출했다.

반코마이신을 함유하는 분회 l1L를 염산을 사용하여 pH를 2.5 내지 pH 4.0으로 낮추었다. 이때 회수율은 97%, 용출 유속은 시간당 6L이었다. 이 용출액을 알루미나 수지 3L에 통과시켜 탈색공정을 수행했다. 총 탈색율은 90% 이상이었고 회수액의 부피는 15L이었다. 이 용액을 역삼투막을 사용하여 50 내지 80g/L의 반코마이신의 농도가 되도록 농축하고, 다시 듀오리트 C-20 수지 1L에 통과시켜 양이온 및 색소를 제거하였다. 이때 유속은 시간당 1L, 회수율은 98%, 회수액은 2.5L였다.

이 회수액에 수산화나트륨을 가하여 pH를 5-6으로 중화하고, CM-Toyopearl 650 수지 4L에 시간당 8L의 유속으로 통과시켰다. 물로 세척하고 pH 5.5의 염화암모늄 완충액으로 반코마이신을 용출했다. 용출액의 부피는 23L, 회수율은 98%이었으며 고압액체크로마토그라피로 검출한 결과 면적대비 94%의 반코마이신 B를 함유하였다.

이 용출액을 염산을 사용하여 pH를 2.5-3.5로 조정하고, 앞에서 행한 역삼투막을 이용한 농축공정을 다시 실시하여 800㎖로 농축하고, 에탄올 1.6L을 상온에서 천천히 교반하면서 가했다. 하룻밤 동안 4℃에 숙성시킨 후 결정성 침전을 여과하고 1.6L의 에탄올로 세척한 후 진공에서 24시간 건조하여 87.5g의 반코마이신 염산염을 얻었다.

[실시예 2]

양이온 교환수지 SK1B, 음이온 교환수지 PA408, 거대 다공성 양이온 교환수지 PK208을 각각 5L, 15L, 25L씩 충진시킨 컬럼을 직렬연결시키고, 여기에 반코마이신 9g/L를 함유하는 발효 여액 100L에 소량의 황산을 첨가하여 pH 2.2로 조절한 것을 규조토 여과기를 사용하여 여과하고, 이 여액을 시간 20L의 유속으로 흘려 흡착 공정을 완료시키고, 동일 유속으로 물 200L을 연속으로 수세를 완료하였다. 이어 0.1N 암모니아수로 PK208 수지로부터 반코마이신을 용출하고, 용출 즉시 염산으로 pH를 2.5 내지 3.5로 조정하였다. 용출액의 부피는 60L, 회수율은 95%이었다. 이 용출액을 15L의 알루미나수지를 통액하고, 실시예 1과 마찬가지로 역삼투막을 사용하여 농축한 후 5L의 C-20 양이온 교환수지를 시간당 22L의 유속으로 통액하였다. 이때 회수액의 부피는 15L이었다. 수산화나트륨으로 중화시킨 이 반코마이신 용액을 CM-Toyopearl 650 약산성 양이온 교환수지에 흡착시키고, pH 5.0의 염화 암모늄 완충액으로 용출하여 pH를 2.5로 조정하고 다시 160g/L의 반코마이신 농도가 되도록 농축한 후, 실시예 1과 마찬가지로 에탄올로 정석을 수행하여 반코마이신 결정성 침전물을 회수하였다. 이 결정성 침전물을 진공중, 35℃에서 12시간 건조시켜 반코마이신 염산염 511g을 얻었으며 총 회수율은 56.7%, 수분의 함량은 3.2%이었다.

이때 각 공정의 고압액체크로마토그라피 분석 결과를 제1도에 나타내었다.

[실시예 3]

SI1B와 PA408, PA208을 각각 5L, 15L, 25L씩 충진하여 직렬연결하고 황산으로 pH 2.2로 조절된 발효액 150L(반코마이신의 농도 7g/L)을 여과한 후 여액을 시간당 25L의 유속으로 흘려 반코마이신을 흡착시킨 후 암모니아 완충액 60L로 반코마이신을 용리하였다. 염산으로 pH를 3.0으로 조정하고, 이 용출액 65L를 알루미나 수지 15L와, SK1B수지 5L가 직렬로 연결된 수지탑을 시간당 10L의 유속으로 연속통액하여 탈색공정을 수행하였다. 이때 회수액의 부피는 총 81L였으며 이 공정의 회수율은 95%이었다. 이 회수액을 수산화나트륨으로 pH를 6.0으로 조절하고 12L의 세파로스 고속 유동 수지(파마시아)에 시간당 10L의 유속으로 통액한 후 수세하였다. 수세가 완료된 후 pH 5.0의 염화암모늄 완충액으로 반코마이신을 용리하고, 실시예 2와 마찬가지로 정석공정을 수행하여, 반코마이신 결정성 침전물을 회수하였다. 이 결정성 침전물을 진공중 35℃에서 12시간 건조시켜 반코마이신 염산염 546g을 얻었으며 총회수율은 52%, 수분의 함량은 3.0%이었다.

[실시예 4]

실시예 2와 3에서 얻은 반코마이신으로 반코마이신 염산염 주사제를 제조하였다. 즉, 멸균 증류수를 사용하여 100g/L의 농도가 되도록 용해한 후, 무균실에서 필터 공정을 통해 제균 여과한 후, 바이알당 500㎎의 역가가 되도록 수분하여 24시간 동안 냉동건조를 실시하였다. 제조된 주사용 반코마이신 염산염으로 다음과 같은 품질 분석 결과를 얻었다.

[표 1]

[ 반코마이신 염산염 주사제의 품질 분석 결과]

[실시예 5]

본 발명이 제공하는 반코마이신 염산염 결정형은 오랜시간에 걸쳐 안정한 결정성 고체이다. 실시예 2의 방법으로 화합물 3로트(lot)를 제조하여 반코마이신 염산염 벌크샘플의 안정성을 측정하였다. 세가지 각 로트의 샘플을 유리병에 넣어 빛이 차단된 장소에서 21℃-25℃로 저장했다. 이 샘플의 각 물리 화학적 특성을 0, 3, 6개월 및 12개월에 분석했다.

그 결과를 다음 표에 기술한다.

[표 2]

[반코마이신 염산염 벌크의 안정성]

1) 함습도 : 칼피셔 방법.

2) 색 가 : 5%(w/v) 반코마이신 용액.

3) 고압액체 크로마토 그라피 상에서 반코마이신 B의 면적%

위에서 기술한 데이타들은 본 발명의 반코마이신 염산염이 매우 안정하며 최소한 12개월에 걸쳐 최초의 생물학적 반코마이신 활성의 95% 이상의 활성이 유지됨을 나타낸다.

Claims (4)

1. 반코마이신을 함유하는 발효 배양액에서 발효 여액을 무기산으로 pH 2.0-3.0으로 조정한 다음 강산성 양이온 교환수지와 염기성 음이온 교환수지 및 다공성 타입의 강산성 양이온 교환수지를 단계별로 단독 사용하거나 또는 연결하여 사용하여 다단계로 분리, 정제하고 pH 11-13의 암모니아수로 용출한 후 무기산으로 pH 2.0-4.0으로 조정하고, 활성 알루미나로 탈색해서 역삼투막으로 농축한 다음 강산성 양이온 교환수지 통액 후 약산성 양이온 교환수지로 흡착하고, 염화 암모늄 완충액으로 용출한 뒤 pH 2.0-4.0으로 조정하고 에탄올로 정석하여 회수, 건조함을 특징으로 하는 반코마이신의 정제방법.
2. 제1항에 있어서, 강산성 양이온 교환수지로서 스티렌계 젤형인 SK1B 또는 듀오리트 C-20(Duolite C-20)을 사용하고 다공성 타입의 강산성 양이온 교환수지로서 PK208 또는 PK212를 사용하며 약산성 양이온 교환수지로서 CM-토요펄(Toyopearl) 650 또는 CM-세파로스 FF 수지를 사용함을 특징으로 하는 방법.
3. 제1항에 있어서, 염기성 음이온 교환수지로는 강염기성 음이온 교환수지로서 PA408과 같은 다공성 타입의 스티렌계 수지를 사용하거나 또는 약 염기성 음이온 교환수지로서 A561과 같은 페놀릭계 수지를 사용함을 특징으로 하는 방법.
4. 제1항에 있어서, 역삼투막은 폴리아미드, 폴리스티렌 또는 폴리설폰계의 재질로 하고 온도는 10-30℃, 압력은 10-40㎏/㎠로 하여 농축하는 것을 특징으로 하는 방법.