KR840002477B1 - 세파로스포린류의 분리법 - Google Patents

Abstract

내용 없음.

Description

세파로스포린류의 분리법

도면은 실시예 1의 활성탄 크로마토그래피의 용출곡선을 나타냄.

본 발명은, 데아세틸세파로스포린 C(이하 D-CPC라 약칭함), 데아세톡시세파로스포린 C(이하 DA-CPC라 약칭함), 세파로스포린 C(이하 CPC라 약칭함)의 분리법에 관한 것이다.

D-CPC, DA-CPC, CPC는 각각 다음 식으로 표시되며, 어느 것이나 반합성 세파로스포린계 화합물의 합성원료로서 중요한 화합물이다.

일반적으로 CPC, D-CPC, DA-CPC의 2종류 이상을 동시에 축적하는 균주(예를들면 특개소 50-18692, 특개소 50-100291, 특개소 50-63193 등에 기재된 균주)를 배양하여 얻은 발효액에서 CPC, D-CPC, DA-CPC를 각각 단리하는 방법은 복잡하며, 종래 이들의 분리에는 보통 셀룰로오스컬럼크로마토 그래피가 쓰여지고 있다. 그러나, 이 종래법은 미리 피처리액을 가급적 소량으로까지 농축할 필요가 있다. 또 대량의 셀룰로오스를 사용할 필요가 있으며, 그러자면 분리에 장시간을 요하는 등, 공업상 유리한 것이라고는 말할 수 없다. 셀룰로오스의 대신에 활성탄을 크로마토적 분리의 목적으로 사용한 예(예를들면, U.S.P. 3,926,973등)도 있으나, CPC, 세파로스포린 N, 색소의 상호분리를 목적으로 한 것으로서 CPC, D-CPC, DA-CPC 상호의 분리의 목적으로 사용한 예는 발견치 못했다. 또, 활성탄을 CPC, D-CPC, DA-CPC의 2종 이상을 함유한 조수용액의 단순한 정제수단으로서 사용한 예(특개소 50-18692, 특개소 50-100291등)도 있으나, 각 세파로스포린의 분별을 행하고 있지 않다.

본 발명자들은, CPC, D-CPC, DA-CPC 등의 세파로스포린계 화합물의 혼합물을 분별하는 방법을 연구하고, 이들을 활성탄에 흡착시켜 유기용제를 소량함유하고 있어도 좋은 물로서 분별 용출을 행하면, D-CPC, DA-CPC, CPC의 상호분리가 공업상 이상적으로 행하여진다는 것을 알아내고, 이들의 새로운 발견을 기본으로 하여 본 발명을 완성하였다. 즉, 본 발명은 유기용제를 0∼20%(V/V) 함유한 수중에서의 활성탄에 대한 CPC, D-CPC, DA-CPC 의 친화성의 차이를 이용한 것으로서, CPC, D-CPC, DA-CPC의 적어도 2종류 이상을 함유한 조수용액을 활성탄에 접촉시키고, 함유한 세파로스포린류를 흡착시킨 다음, 유기용제를 0∼20%(V/V) 함유한 물을 사용해서 분별 용출하는 것을 특징으로 하는 CPC, DA-CPC, CPC의 분리법이다.

본 발명 방법에 적용할 수 있는 CPC, D-CPC, DA-CPC 함유 조수용액으로서는 CPC, D-CPC, DA-CPC의 적어도 2종류 이상을 임의의 비율로서 함유하는 것이며, 예를들면 세파로스포린 발효액, 혹은 그 부분적 정제액 예를들면, 이온 교환수지 탈착액, 농축액, 정출모액 등이 쓰여지며, 각별하게 D-CPC를 함유하는 경우에는 염류가 혼재하고 있는 부분정제액에 본 발명을 적용하는 것이 효과적이다. 즉 예를들면 염화나트륨, 염화칼륨, 염화마그네슘, 황산나트륨, 초산나트륨, 개미산나트륨, 식초산나트륨, 구연산나트륨, 인산나트륨 등의 염류가 0.01∼2몰, 바람직하게로는 0.05∼0.5몰 공존하고 있을 경우에 활성탄으로의 흡착량이 증대되기 때문이다.

한편, 본 발명방법에 있어서 사용되는 활성탄은, 예를들면 큰 톱밥, 야자껍데기, 석탄 등을 수증기부활, 약품부활(예를들면 염화아연 등에 의한)시켜 얻어지는 것 등은, 어느것이든 사용되지만, 염화아연부활에 의해서 얻어지는 활성탄이 특히 적당하다. 또, 10∼50 메시의 입상의 것이 바람직하게 쓰여진다.

본 발명 방법을 실시하자면, 먼저 CPC, D-CPC, DA-CPC의 적어도 2종류 이상을 함유한 조수용액을 활성탄에 접촉시키고 나서 함유한 세파로스포린류를 흡착시킨다. 그때의 접촉의 흡착조작은 예를들면 컬럼법으로서, 용출될 때의 분리능력을 좋게하기 위하여 상부부로터 흡착시키는 것이 좋다. 활성탄컬럼의 길이 및 접촉속도는 적당하게 조절할 필요가 있는데, 접촉속도는 보통 SV(1시간당 컬럼에 충전된 활성탄의 양에 상당한 용액이 흐르는 속도) 0.1∼2.0, 바람직하게로는 0.5∼1.0이다. 이와 같이하여 활성탄에 흡착된 CPC, D-CPC, DA-CPC의 적어도 2종류 이상의 목적물은, 유기용제를 0∼20%(V/V) 함유한 수용액[물에 20%(V/V) 이상 녹지 않는 용제에 있어서는 그 포화용해도 이하의 용제를 함유한 수용액]으로 용출하면 D-CPC, DA-CPC, CPC의 순으로 용출되어 온다. 쓰여지는 유기용제로서는, 물에 조금이라도 녹는 용제이라면 거의 모든 유기용제가 사용 가능하지만, 경제성을 고려해서 예를들면 알코올류(메탄올, 에탄올, 프로판올, 이서프로판올, 부탄올, 이소부탄올, 아밀알코올, 이소아밀알코올, 시클로헥사놀 등), 에테르류(디옥산, 테트라히드로프란, 메틸에틸에테르 등), 케톤류(아세톤, 메틸에틸케톤, 디에틸케톤 등), 에스테르류(초산에틸, 초산부틸 등)이 적당히 쓰여진다. 그 중에서도 알코올류가 좋고, 메탄올이 적합하다. 용출방법은 용출도중에서 용제농도를 변화시키지 않는 통상적인 용출방법이 제일 간단하지만, 용출도중에서 용제농도를 변화시키는 용출방법도 적당히 이용 가능하다. 예를들면 D-CPC가 흡착되어 있는 경우에는, 용제로서 물을 사용하여 용출하고 D-CPV만을 함유한 프랙션을 채취한 후에, 유기용제를 0.1∼20%(V/V)함유한 수용액을 사용하여 용출하는 것이 유리하다. 또 분리효율을 높이기 위해서 재크로마토그래피 등 보통 컬럼크로마토그래피로서 쓰여지는 일반적인 수법은 어느 것이든 적용할 수 있다. 용출액은, 일정량씩 분획 채취되며 적당한 검출방법(예를들면 박층크로마토그래피, 여지전기영동, 고속액채크로마토그래피 등)에 의해 목적물의 프랙션을 모을 수가 있다.

얻어진 각 목적물을 함유한 프랙션을 예를들면 NaOH, KOH, 암모니아 등의 염기로서 중화시킨 후 농축하고, 농축액을 예를들면, 동결건조, 용매첨가 등의 보통 쓰여지는 수단에 따라, 염으로서 회수된다. 또 소망에 따라 분획프랙션 혹은 일단 염으로서 채취한 것을 물에 용해하고, 이온교환수지로서 탈염하여 유리산으로 한 후 예를들면 농축, 용매침전 등을 행하든지, 동결건조 등 일반적 경제수단을 사용하여 유리산으로 하여 회수할 수도 있다. 또, 본 발명 방법으로 정제분획한 각 목적물 함유 프랙션을 예를들면 직접 아실화시약과 접촉시켜 지용성 유도체로서 용매 추출법에 의해 회수하는 등, 여러가지의 정제법을 조합하는 것도 가능하다.

이하 실시예에 따라 더욱 상세하게 본 발명의 내용을 구체적으로 설명하겠으나, 이것에 의해서 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1]

CPC, DA-CPC, D-CPC 각각 250g을 초산소오다 완충액(pH6, 0.2M) 250ℓ에 용해하고, 미리 물로서 현탁한 크로마토그래피용 활성탄*(*는 다께다 약품 공업주식회사제 이라는 것을 나타냄) 80ℓ을 충전한 컬럼(직경 25㎝+ 높이 163㎝)에 SV=1.0(80ℓ/Hr)로서 흐르게 하고, 순수 80ℓ로서 씻는다. 다음에 0∼10% EtOH240ℓ을 SV=1.0(80ℓ/Hr)로서 흐르게 하고, 용출액을 8ℓ씩 분취하고, CPC, D-CPC, DA-CPC 함유량을 고속액체크로마토그래피(이하 HPLC라 약칭한다)에 의하여 검출하면 도면 1 전반의 용출곡선이 얻어졌다. D-CPC와 DA-CPC가 명료하게 분별되어 용출되고 있다는 것을 알 수 있다.(CPC 의 용출은 10% EtOH를 그대로 계속 흐르게 하여도 가능하지만, 시간의 절약과 용출곡선을 보다 샤아프하게 하기 위하여) 용출용제를 20%EtOH로 교체하여, 8ℓ씩 분취하고, HPLC에 의하여 검출하면 도면 1의 후반의 용출곡선이 얻어졌다. 각 분획액을 미결정 셀룰로오스 분말을 사용하는 박층판(도오꾜 오까세이제)에 스포트하고, n-부탄올 : 초산 : 물=3 : 1 : 1(V/V)로서 전개하고, 바람건조한 후, 닌히드린으로 색갈을 나타나게 하면, D-CPC, Rf=0.15, CPC, Rf=0.28, DA-CPC Rf=0.30 에 각 spot가 보인다.

프랙션 No, 10∼17까지의 주로 D-CPC를 함유한 프랙션을 모아서, NaOH로서 pH6.5로 보정한 후 감압 농축하고, 얻어진 시

에 에틸알코올을 가하고 D-CPC를 모노나트륨염으로 결정화시켰다. 석출한 결정을 여취 건조하면 D-CPC. Na. 3.5H₂O로서 200g이 얻어졌다. 여기서 얻어진 결정을 D-CPC. Na 표품과 비교했든바, 항균 스펙톨, 페이퍼크로마토그래피, 박층크로마토그래피, 자외선 흡수스펙톨, NMR 스펙톨, IR 스펙톨 등 이화학적, 생리학적 성질에 있어서 동일한 성질을 나타내었다.

다음에 No, 18∼28의 주로 DA-CPC를 함유한 프랙션을 모아서, NaOH 로서 pH6.5로 보정한 후, 감압 농축하고, 얻어진 시

에 에틸 알코올을 가하면 DA-CPC의 Na염이 결정 모양으로 석출하였다. 결정을 여취하고, 건조하면 DA-CPC의 Na염으로 180g이 얻어졌다. 여기서 얻어진 결정을 DA-CPC. Na 염준품과 비교하였든바 항균스펙톨, 페이퍼크로마토그래피, 박층크로마토그래피, 자외선흡수 스펙톨, IR스펙톨, NMR스펙톨 등의 이화학적, 생물학적 성질에 있어서 동일한 성질을 나타내었다.

최후에 No, 41∼51의 주로 CPC를 함유한 프랙션을 모아서 NaOH로서 pH6.5로 보정한 후, 감압농축하였다. 얻어진 시럽에 에틸알코올을 가하면 CPC. Na 염이 결정모양으로 석출하였다. 결정을 여취하고, 건조하면 CPC. Na .2H₃O가 150g 얻어졌다. 여기서 얻어진 결정을 CPC. Na 염의 표품과 비교했는바, 항균스펙톨, 페이퍼크로마토그래피, 박층크로마토그래피, 자외선 흡수 스펙톨, IR 스펙톨, NMR 스펙톡 등 이 화학적, 생물학적 성질에 있어서 동일한 성질을 나타내었다. 이렇게 하여 얻어진 CPC, D-CPC, DA-CPC의 Na염을 각각 5g씩 취하여, 물각 50㎖에 용해하고, 암버얼라이트 IR-120(H⁺형, 로옴 앤드 하아즈사제, 미국) 15㎖을 충전한 컬럼을 미리 5℃ 부근의 냉수를 흘려서 냉각시켜 둔 곳에 SV=3∼5의 유속으로 통과시켜 탈염한다. 탈염액을 동결건조하면, CPC 3.2g, D-CPC 3.5g, DA-CPC 3.3g이 얻어졌다.

[실시예 2]

CPC 2475 r/㎖, D-CPV 2200 r/㎖을 함유한 구연산소오다 완충액(pH 8.0, 0.2M) 250㎖을 미리 물로서 현탁시킨 크로마토그래피용 활성탄* 100㎖을 충전시킨 컬럼(직경 2㎝×높이 32㎝)KSV=1.0(100㎖/Hr)으로서 흘리고, 순수 100㎖로서 수세한다. 다음에 5% 메탄올을 SV=1.0(100㎖/Hr)으로서 흘리면 용리액 200㎖가 얻어졌다. CPC와 L-CPC 함유량을 HPLC에 의해 측정하면 D-CPC 523㎎(95% 수율)이 함유되며, CPC는 거의 보이지 않았다. 있따라서 5% 메탄올을 SV=1.0으로서 흐르게하고, 30㎖을 분획한 후, 다시 30㎖을 모았다. 다음에 20% 메탄올을 SV=1.0으로서 흐르게 하고, 용리액 340㎖를 얻었다. 전술한 5% 메탄올의 최종 용리분획 30㎖와 20% 메탄올 용리액 340㎖을 혼합하고, HPLC로서 측정하면 CPC 464㎎(75% 수율)이 검출되며, D-CPC는 거의 보이지 않았다. 이들의 영리액에서 실시예 1의 방법에 준해서 농축 결정화하고 D-CPC. Na. 3.5 H₂O로서 420㎎, CPC. Na. 2H₂O로서 390㎎을 얻었다.

[실시예 3]

CPC 269㎎, D-CPC 152㎎을 함유한 초산소오다 완충액(pH 7.0, 0.2M) 436㎖을 미리 물로서 현탁한 크로마토그래피용 활성탄* 200㎖을 충전시킨 컬럼(직경 2㎝×높이 64㎝)에 SV=1.0(200㎖/Hr)으로서 흐르게 하고, D-CPC, CPC를 흡착시켰다. 다음에 10℃로 냉각시킨 1% 아세톤을 SV=1.0으로서 흘리고 용출액을 50㎖씩 분획 채취하였다. 각 분획액을 실시예 1 기재의 박층 크로마토그래피에 붙이고, 적당한 분획(본 예에서는 2∼12분획)을 합병하고 HPLC로서 측정했든 바 D=CPC 1.430㎎(수율 94%)가 검출되었으며, CPC는 거의 보이지 않았다. 다음에 14∼24분획을 모은 후 20% 아세톤을 SV=1.0으로서 흘리고 29분획까지 채취하였다. 분획번호 14∼29를 합병하고, 용출액중의 D-CPC와 CPC를 HPLC로서 측정하면 CPC 172㎎(수율 63.9%)가 검출되었으며, D-CPC는 보이지 않았다. 이들의 용출액에서 실시예 1의 방법에 준하여 결정화하고, D-CPC·Na·3.5 H₂O로서 1.2g, CPC·Na·2H₂O로서 150㎎을 얻었다.

[실시예 4]

CPC 272㎎, D-CPC 1539㎎을 함유한 초산소오다 완충액(pH 7.0, 0.2M) 441㎖을 미리 물로서 현탁시킨 크로마토그래피용 활성탄 200㎖을 충전시킨 컬럼(직경 2㎝×높이 64㎝)에 SV=1.0(200㎖/Hr)으로서 흐르게 하고, CPC와 D-CPC를 흡착시켰다. 순수 200㎖을 사용하여 수세한 후 10℃로 냉각한 1% 초산에틸을 SV=1.0으로서 흐르게 하고, 용출액을 50㎖씩 분획 채취하였다. 각 분획액을 박층크로마토그래피에 붙이고 적당한 분획을 합병하여 HPLC로서 D-CPC, CPC 함유량을 측정하였다. 2∼18 분획에는 D-CPC가 1.462㎎(수율 95%) 검출되었으며, CPC는 보이지 않았다.또 20∼25분획에는 CPC가 233㎎(수율 85.6%) 검출되었으며, D-CPC는 거의 보이지 않았다.

[실시예 5]

CPC 275㎎, D-CPC 1560㎎을 함유한 초산소오다 완충액(pH 7.0, 0.2M) 447㎖을 미리 물로서 현탁한 크로마토그래피용 활성탄* 200㎖을 충전시킨 컬럼에 SV=1.0(200㎖/Hr)으로서 흐르게 하고, CPC와 D-CPC를 흡착시켰다. 순수 200㎖를 사용하여 수세한 후 10℃로 냉각한 0.1 테트라히드로프란을 SV=1.0으로서 흐르게 하고, 용출액을 50㎖씩 분획 채취하였다. 분획 1∼15에는 D-CPC 1.443㎎(수율 92.5%)이 함유되며, CPC는 거의 검출되지 않았다. 다음에 10℃로 냉각한 0.5% 테트라히드로프란250㎖을 SV=1.0으로서 흐르게 한후, 10℃로 냉각한 1% 테트라히드로푸란을 SV=1.0으로서 흐르게 하였다. 분획 21∼33을 합병하고 HPLC로서 측정하면 CPC 213.2㎎(수율 78%)이 함유되었으며, D-CPC는 거의 보이지 않았다.

[실시예 6]

CPC 1125㎎, D-CPC 1075㎎을 함유한 개미산소오다 완충액(pH 6.0, 0.2M) 250㎖을 미리 물로서 현탁한 크로마토그래피용 활성탄* 200㎖을 충전시킨 컬럼에 SV=1.0(200㎖/Hr)으로서 흐르게 하고, CPC와 D-CPC를 흡착시킨 후 순수 200㎖로서 수세하였다. 다시 10℃로 냉각한 물 800㎖을 SV=1.0(200㎖/Hr)으로서 흐르게 하고, 용출액을 50㎖씩 분획 채취하였다. 다음에 20% 메탄올 1100㎖을 SV=1.0으로서 흐르게 한다. 분획 5∼16에는 D-CPC 908㎎(수율 84%)이 함유되었으며, CPC는 거의 함유되어 있지 않았다. 또 분획 18∼38에는 CPC가 825㎎(73% 수율)이 함유되어 있음에 대하여, D-CPC는 거의 보이지 않았다.

[실시예 7]

수크로스 3.0%, 육에키스 1.5%, 코온스팁프리커 0.5% 밀 CaCO₃0.15%로서 된 종배지 500㎖을 2ℓ들이의 사까구찌 프라스크에 분주멸균하고 이것에 세파로스포륨 아크레모늄 ATCC 14553을 접종하고, 왕복 진탕기 상에서 28℃, 3일간 배양하였다. 따로 스테인레스제 50ℓ 발효조에 수크로스 3.0% 생대두분 3.2% DL-메티오닌 0.5% 및 CaCO₃0.15%로서 된 배지 30ℓ을 속에 넣고, 상법에 따라 멸균 냉각해 둔다.

이것에 상기한 종배양액을 무균적으로 접종하고, 28℃로서 통기 교반 배양(통기량매분 100%, 교반 200 r.p.m.)하였다. 120시간 배양후, 배양물을 끄집어내고, 여과후 여액중의 CPC와 D-CPC 함유량을 HPLC로서 측정하면 CPC 135r/㎖, D-CPC 25r/㎖이었다. 이 배양여액 25.7ℓ에 페니실리나제(슈발쯔만 사제)를 가하여 세파로스포린 N을 완전히 분해한 다음, 이를 희황산으로서 pH 4.0으로 조절한 후 불용물을 여거하고, 여액을 10℃로 냉각한 다음, 미리 물로서 현탁한 크로마토그래피용 활성탄*5ℓ을 충전시킨 컬럼(직경 10㎝×높이 64㎝)에 통과시키고 냉각한 손수 5ℓ을 사용하여 수세하였다. 다음에 컬럼을 10℃로 냉각한 40% 아세톤 수를 사용하여 용리하고, 용리액 15ℓ을 10℃로 냉각하고, 암버얼라이트 IRA 402(초산형, 롬앤드하아스사제) 500㎖을 충전시킨 컬럼(직경 3㎝×높이 71㎝)에 통과시키고, D-CPC, CPC를 흡착시킨 다음, 순수 2ℓ을 사용하여 수세하였다. 수세종료후, 10℃로 냉각시킨 0.2몰 초산소오다 완충액(pH 7.0) 2.5ℓ을 사용 SV=1.0(500㎖/Hr)으로서 용리하였다.

이 수지용리액을 미리 물로서 현탁한 크로마토그래프용 활성탄^*400㎖을 충전시킨 컬럼(직경 2㎝×높이 127㎝)에 SV=1.0(400㎖/Hr)으로서 흐르게 하고, 다음에 순수 400㎖로서 수세하였다. 수세 종료후 10℃로 냉각한 1% 메탄올을 SV=1.0으로서 흐르게 하고, 용리액을 100㎖씩 분획 채취하였다. 5∼11 분획을 합병하고, 용리액 중의 조성을 n-부탄올 : 초산 : 물=3 : 1 : 1의 전개계에 있어서의 미결정 셀룰로오스상에서의 박층 크로마토그램에 붙이면, Rf=0.15에 실질적으로 D-CPC 단일의 스폿트를 나타냈으며, CPC는 거의 검출되지 않았다. 다음에 잇따라서 20% 메탄올을 SV=1.0으로서 흐르게 하고, 적당한 분획(본 예에서는 12∼32)을 합병하고, 전기한 박층크로마토그램에 붙이면 Rf=0.28에 실질적으로 CPC 단일의 스폿트를 나타냈으며 D-CPC는 검출되지 않았다.

이어서 전기한 D-CPC 획분(5∼11)을 NaOH로서 중화시킨 후, D-CPC 유리산으로서 25∼30%(W/V)로 되기까지, 감압농축(내온 20℃ 이하)하고, 이 농축액에 에탄올을 가하고 결정을 석출시킨다. 5℃로 하루밤 정출 후, 여별 건조했든바 담황색의 D-CPC.Na 염이 얻어진다. 그와 같이 정출모액으로부터 결정을 반복해서 석출시키면 전량 60㎎의 D-CPC.Na 염이 얻어졌다. 여기서 얻어진 조결정을 다시 정제하고, 얻어진 D-CPC.Na 염 결정 D-CPC.Na 염 표품과 비교했든바, 이화학적 생물학적 성질이 일치하였다. 다음에 CPC 획분(12∼82)를 중화시킨 후, 전기한 D-CPC 획분의 처리방법에 준하여 CPC를 석출시켰든바, 전량 240㎎의 CPC.Na 염 분말이 얻어진다. 이것을 다시 정제하여 얻어진 CPC.Na 염 결정을 CPC.Na 염 표품과 비교했든바 이화학적 생물학적 성질이 일치하였다.

[실시예 8]

실시에 7에 기재된 방법에 따라서 세파로스포륨 아크레모늄 K-121(ATCC 20427)을 앞서 배양하였다. 따로 스테인레스제 50ℓ 발효조에 수크로즈 6.0%, 글루코스 5.0%, 낙화생박 3.0%, DL-메티오닌 1.0% 및 CaCO₃0.15%로서 된 배지 30ℓ을 버물러 넣고, 상법대로 멸균 냉각시켰다. 이것에 상기한 앞서해둔 배양액을 무균적으로 접종하고, 28℃로서 190시간 통기교반 배양(통기량 매분 100%, 교반 250 r.p.m.)하였다. 배양 종료후, 배양물을 끄집어 내고 고형분을 제거하면 여액 25ℓ이 얻어졌다. 이 여액에 함유된 CPC는 10500r/㎖ 이었다. 이것에 특개소 49-491의 방법에 따라 조제한 D-CPC를 100r/㎖로 되도록 첨가하였다.

상기 방법으로 얻어진 CPC 10500r/㎖, D-CPC 1000r/㎖를 함유한 배양여액 25ℓ을 10℃로 냉각하고, 암버얼라이트 IRC-50(H+형, 롬앤드하아스사제) 2.8ℓ을 충전시킨 컬럼과 암버얼라이트 IRA-402(CH₂COO형, 롬앤드하아스사제) 17.8ℓ을 충전시킨 컬럼에 연속해서 1시간 17.8ℓ의 속도로서 통과시키고, D-CPC와 CPC를 흡착시켰다. 다음에 10℃로 냉각한 초산소오다 완충액(pH 7.5, 0.2M)를 사용하여 1시간 17.8ℓ의 속도로서 용리하고 용리액 89ℓ(pH 7.5)을 모았다. 이 용리액을 미리 물로서 현탁한 크로마토그래프용 활성탄^*21ℓ(직경 14㎝×높이 136㎝)를 충전시킨 컬럼에 10℃로서 1시간 10ℓ의 속도로서 통과시키고 CPC와 D-CPC를 흡착시켜 컬럼을 물 21ℓ을 사용하여 수세한 다음 10℃로 냉각한 1% 메탄올 수 58ℓ을 1시간 10ℓ의 속도로서 흐르게 하고 용리액을 5.3ℓ씩 분획 채취했다.

다음에 10℃로 냉각한 20% 메탄올수 110ℓ을 1시간 10ℓ의 유속으로 흐르게 하고 용리액을 5.3ℓ씩 분획 채취하였다. 각 분획액에 대해 박층크로마토그래피에 붙이고, 실질적으로 Rf=0.15의 D-CPC의 단일 스폿트를 주는 분획 5∼11과 Rf=0.28에 CPC의 단일 스폿트를 주는 분획 12∼32를 각각 합친다. D-CPC 함유획분 5∼11을 NaOH로서 중화시킨 후, 실시예 1에 기재된 방법에 따라 농축 정출하면 전량 15g의 D-CPC 나트륨염 결정이 얻어졌다. 또 CPC 함유획분(12∼32)을 중화시킨 후, 실시예 1에 기재된 방법에 따라 농축 정출하면 전량 135g의 CPC의 나트륨염 결정이 얻어졌다.

[실시예 9]

실시예 7에 기재된 방법에 따라 세파로스포륨 아크레모늄 K-121(ATCC 20427)을 96시간 배양하였다. 배양 종료휴 배양물을 끄집어내고 고형분을 제거하면 여액 26.5ℓ가 얻어졌다. 이 여액중에 함유된 CPC는 4700r/㎖이었다. 이것에 특개소 49-491의 방법에 따라 조제한 D-CPC 를 5000r/㎖로 되도록 첨가하였다.

상기한 방법에 의해 얻어진 CPC 4700r/㎖, D-CPC 5000r/㎖을 함유한 배양여액 26.5ℓ를 10℃로 냉각하고, 암버얼라이드 IRC-50(H⁺형, 롬앤드하아스사제) 2.5ℓ를 충전시킨 컬럼과 암버얼라이트 IRA-402 (CH₃COO형, 롬앤드하아스사제)를 충전시킨 컬럼에 연속해서 1시간 16ℓ의 속도로서 통과시키고 CPC와 D-CPC를 흡착시켰다. 다음에 10℃로 냉각한 순수 64ℓ를 사용하여 연속해서 수세한 다음, 암버얼라이트 IRA-402컬럼을 초산소오다 완충액(pH 7.0, 0.2M, 10℃)를 사용하여 16ℓ/Hr의 유속으로 용리하고 용리액 80ℓ(pH 7.0)을 얻었다.

이 용리액을 미리 물로서 현탁한 크로마토그래피용 활성탄^*19ℓ을 충전시킨 컬럼(직경 14㎝×높이 136㎝)에 10ℓ/Hr로서 통과시키고 CPC와 D-CPC를 흡착시켜, 컬럼을 냉수 19ℓ로서 수세한 다음, 10℃로 냉각한 물을 다시 19ℓ/Hr로서 흐르게 하면 무색징명의 용리액 42.8ℓ이 얻어졌다. 이 용리액은 박층크로마토그래피로서 실질적으로 D-CPC의 단일 스폿트를 나타내었다. 다음에 10℃로 냉각한 3% 에탄올을 33.3ℓ을 19ℓ/Hr로서 흐르게 하고 전구분(前區分)9.5ℓ를 분획한 다음, 후구분 23.8ℓ를 모으면 후구분에는 CPC만이 용출된다.

다음에 10℃로 냉각한 15% 에틸알코올수 57ℓ을 19ℓ/Hr의 유속으로 흐르게 하고, 3% 에탄올수용리액 23.8ℓ과 혼합하였다. 이 용리액 80.8ℓ중의 조성을 HPLC로서 측정하면 CPC 86g이 검출되며, D-CPC는 거의 보이지 않았다.

이와 같이 하여 얻어진 D-CPC 획분 및 CPC 획분을 실시예 1에 기재된 방법에 준해서 농축 정출하면 D-CPC 나트륨염 결정이 80g, CPC 나트륨염 결정이 66g 얻어졌다.

[실시예 10]

실시예 7에 기재된 방법에 따라 세파로스포륨 아크레모늄 K-121(ATCC 20427)을 48시간 배양하였다. 배양 종료후 배양물을 끄집어내고 고형분을 제거하면 여액 27.2ℓ가 얻어졌다. 이 여액중에 함유된 CPC는 1020r/㎖ 이었다. 이것에 특개소 49-491의 방법에 따라 소재한 D-CPC를 9000r/㎖로 되도록 첨가하였다.

상기 방법으로 얻어진 CPC 1020r/㎖, D-CPC 9000r/㎖ 을 함유한 배양여액 27.2ℓ을 10℃로 냉각하고 암버얼라이트 IRC-50(H⁺형, 롬앤드하아스사제)2.7ℓ을 충전시킨 컬럼과 암버얼라이트 IRA-410(CH₃COO형, 롬앤드하아스사제)를 충전시킨 컬럼에 연속하여 17ℓ/Hr의 속도로서 통과시키고 CPC와 D-CPC를 흡착시켰다. 다음에 냉수 68ℓ로서 수세한 다음, 암버얼라이트 IRA-410컬럼을 10℃의 초산소오다 완충액(pH 7.0, 0.2M)을 사용하여 1시간 17ℓ의 속도로서 용리하고, 용리액 85ℓ(pH 7.0)을 얻었다. 이 용리액을 미리 물로서 현탁한 크로마토그래피용 활성탄^*20ℓ(직경 14㎝×높이 130㎝)를 충전시킨 컬럼에 20ℓ/Hr로서 통과시키고 CPC와 D-CPC를 흡착시켰다. 다음에 냉수 20ℓ로서 수세한 다음, 10℃로 냉각한 1% 이소프로판올수 75ℓ을 20ℓ/Hr로서 흐르게 하여 용리하였다. HPCL측정에 의해 이용리액 75ℓ중에는 D-CPC 204g이 함유되었고, CPC는 거의 보이지 않았다. 다음에 5% 이소프로판올수를 20ℓ/Hr로서 흐르게 하여 전구분 10ℓ을 버리고 난 후, 다시 60ℓ를 흘리면 미황색징명의 용리액이 얻어지며, HPLC에 의하여 12ℓ의 CPC가 함유되어 있음을 알았다.

이와 같이 하여 얻어진 D-CPC 및 CPC 획분을 실시예 1 기재의 방법에 준하여 농축 정출하면 D-CPC 나트륨염결정 190g과 CPC 나트륨염 결정이 6g이 얻어졌다.

[실시예 11]

글루코스 5%, 면실분 1%, 생대두분 0.5%, 호모에키스 0.5%, 펩톤 0.5% 및 CaCO₃1%로서된 배지 500㎖을 2ℓ들이 사까구찌 프라스코에 분주멸균시킨 후, 이것에 페시로미세스 카아네우스 C-2237(IFO 9729)를 접종하고, 왕복 진탕 기상에서 28℃, 3일간 배양하였다. 따로 스테인레스 제 50ℓ 발효조에 글루코스 8%, 면실분 2% 및 CaCO₃1%로서된 배지 30ℓ을 버물러 넣고, 상법대로 멸균·냉각하였다. 이것에 상기한 배양액을 무균적으로 접종하고, 24℃로서 164시간 통기 교반 배양(통기배분 20ℓ, 교반 230r.p.m)하였다.

배양 종료후, 배양물을 끄집어 내고 고형분을 제거하면 여액 25이 얻어졌다. 이 여액중에는 CPC 110r/㎖, D-CPC 30r/㎖, DA-CPC 155r/㎖이 함유되어 있었다. 이 배양여액에 페니실리나제(슈발쯔만사제)를 가하고 세파로스포린 N을 완전히 분해한 다음 희황산으로서 pH 4.0으로 보정하고, 불용물을 여거한다. 여액을 5℃로 냉각한 다음, 미리 물로서 현탁한 크로마토그래피용 활성탄^*5.0ℓ을 충전시킨 컬럼(직경 10㎝×높이 64㎝)에 통과시킨다. 냉수로서 수세한 다음, 5℃로 냉각한 50% 아세톤수로서 용리하였다. 용리액 15ℓ(pH 5.0)을 10℃로 냉각하고, 암버얼라이트 IRA-410(C^-1형, 롬앤드하아스사제) 3.5ℓ을 충전시킨 컬럼에 통과시키고, CPC, D-CPC 및 DA-CPC를 흡착시켰다. 수세 종료후, 5℃로 냉각한 0.2M 식염용액 10ℓ을 사용하여 SV=1.0(3.5ℓ/Hr)로서 용리하였다. 이 수지 용리액을 미리 물로서 현탁한 크로마토그래프용 활성탄^*6ℓ을 충전시킨 컬럼(직경 5㎝×높이 300㎝)에 SV=1.0(6ℓ/Hr)으로서 흐르게 한다. 수세 종료후, 5℃로 냉각한 5% 메탄올 수를 SV=1.0(6ℓ/Hr)로서 흐르게 하고, 용리액을 1.2ℓ씩 분획 채취하였다. 각 획분을 박층크로마토그래피에 붙이면 먼저 D-CPC가 용리하고, 이어서 DA-CPC가 용리하였다. DA-CPC가 완전히 용리한 다음 20% 메탄올수를 SV=1.0(6/Hr)으로서 흐르게 하면 최후에 CPC가 용리하였다.

주로 D-CPC를 함유한 획분) 프랙션 No, 6∼10)을 모으고 NaOH로서 중화시킨 후, 농축·정출·건조하면 전량 35㎎의 염이 D-CPC Na 염이 얻어진다. 다음에 주로 NA-CPC를 함유한 프랙션 No, 11∼17을 모으고 NaOH로서 중화시킨 후, 농축·정출·건조하면 380㎎의 DA-CPC 나트륨 염이 얻어졌다. 또 주로 CPC를 함유한 프랙션 Po, 22∼40을 모으고, NaOH로서 중화시킨 후, 농축·정출하면 130㎎의 CPC의 나트륨 염이 얻어졌다.

[실시예 12]

수크로즈 5%, 면실분 1%, 코온스티프리커 3% 및 CaCO₃0.15%로서된 배지 500㎖을 2ℓ들이 사까구찌(坂口) 프라스코에 분주하고, 멸균한 다음 아니키시오프시스 페르비아나 BS-301.67를 접종하고, 왕복 진탕기 상에서 28℃, 4일간 배양하였다. 따로 스테인레스 제 50ℓ 발효조에 글루코스 8%, 면실분 2%, 생대두분 1%, 코온스티프리커 1%, DL-메티오닌 0.5% 및 CaCO₃1%로서 된 배지 30ℓ을 버물러 넣고, 상법대로 멸균·냉각하였다. 이것에 상기한 배양액을 무균적으로 접종하고, 28℃로서 통기 교반 배양(통기량 100%, 교반 280r.p.m)하였다. 184시간 후 배양물을 끄집어 내고 고형분을 제거하면 여액 25ℓ이 얻어졌다. 이 여액 중에는 CPC 30r/㎖, D-CPC 110r/㎖, DA-CPC 415r/㎖이 함유되어 있었다.

이 배양여액에 페니실리나제(슈발쯔만사제)를 가하고 세파로스포린 N을 완전히 분해한 다음 회황산으로서 pH 4.0으로 보정하고, 불용물을 여거한다. 여액을 5℃로 냉각한 다음, 미리 물로서 현탁한 크로마토그래피용 활성탄^*5ℓ을 충전시킨 컬럼(직경 10㎝×높이 64㎝)에 통과시키고, 냉수를 사용하여 수세하였다.

다음에 5℃로 냉각한 40% 아세톤수를 사용하여 용리하고, 용리액 15ℓ(pH 5.0)을 암버얼라이트 IRA-402(CH₃COO-형, 롬앤드하아스사제) 2ℓ을 충전시킨 컬럼에 통과시키고, CPC, D-CPC 및 DA-CPC를 흡착시켰다. 수세 종료후, 0.2M 초산소오다완충액(pH7. 0,5℃) 10ℓ을 사용하여 SV=1.0(2ℓ/Hr)으로서 용리하였다.

이 수지 용출액을 미리 물로서 현탁한 크로마토그래프용 활성탄^*6ℓ을 충전시킨 컬럼(직경 6㎝×높이 208㎝)에 SV=1.0(6/Hr)으로서 흐르게 하고, 다음에 냉수 8ℓ로서 수세하였다. 수세종료후, 1% 이소프로판올(5℃)를 SV=1.0으로서 흐르게 하고, 용리액을 1.2ℓ씩 분획 채취하였다. 각 획분을 박층크로마토그래피에 붙이면, 먼저 D-CPC가 용리하고, 이어서 DA-CPC가 용리하고 있었다. DA-CPC가 완전히 용리한 다음, 5% 이소프로판올수(5℃)를 SV=1.0으로서 흐르게 하면 최후에 CPC가 용리하였다.

주로 D-CPC를 함유한 프랙션 No, 5∼10을 모아 pH6.5로 보정한 후, 농축·정출하면 200㎎의 D-CPC 나트륨 염이 얻어졌다. 다음에 주로 DA-CPC를 함유한 프랙션 No, 11∼19를 모아 pH 6.5로 보정한 후, 농축·정출하면 DA-CPC 나트륨 염이 얻어졌다. 또 주로 CPC를 함유한 프랙션 No, 24∼43을 모아 pH 6.5로 보정한 후, 농축·정출하면 40㎎의 CPC 나트륨 염이 얻어졌다.

[실시예 13]

실시예 7에 기재된 방법에 따라 세파로스포륨 아크레모늄 K-121(ATCC 20427)을 96시간 배양하였다. 배양 종료 후, 배양물을 끄집어내고 고형분을 제거하면, 여액 25ℓ가 얻어졌다. 이 여액중에 함유된 CPC는 4500r/㎖ 이었다. 이것에 특개소 49-491의 방법에 따라 조제한 D-CPC를 5000r/㎖로 되도록 다시 CPC를 접촉 수소 첨가하여 조제한 DA-CPC를 5000r/㎖로 되도록 첨가하였다.

상기 방법으로 얻어진 CPC 4500r/㎖, D-CPC 5000r/㎖, DA-CPC 5000r/㎖ 을 함유한 배양여액 25ℓ을 5℃로 냉각하고, 암버얼라이트 IRC-50(H⁺형, 롬앤드하아스사제) 3.6ℓ을 충전시킨 컬럼과 암버얼라이트 IRA-402(CH₃COO^-형, 롬앤드하아스사제) 22ℓ를 충전시킨 컬럼에 연속해서 22ℓ/Hr로서 통과시킨 후, 냉수 88ℓ를 사용하여 연속해서 수세하였다. 다음에 암버얼라이트 IRA-402 컬럼을 5℃로 냉각한 초산소오다완충액(pH 7.0, 0.2M)을 사용하여 22ℓ/Hr로서 흐르게 하고, 용리액 110ℓ(pH 7.0)을 얻었다. 이 용리액을 미리 물로서 현탁한 크로마토그래피용 활성탄^*27ℓ을 충전시킨 컬럼(직경 10㎝×높이 343㎝)에 27ℓ/Hr로서 통과시키고, CPC D-CPC 및 DA-CPC를 흡착시켰다. 컬럼을 냉수 27ℓ로서 수세한 다음, 다시 5℃로 냉각한 물을 40ℓ를 27ℓ/Hr로서 흐르게 하고, 용리액을 2.7ℓ씩 분획 채취하였다. 각 획분을 박층크로마토그래피에 붙였든바, 먼저 D-CPC가 용리하였다. 이어서 5% 메탄올수를 27ℓ/Hr로서 흘리면 DA-CPC가 용리하고 있다는 것을 알았다. DA-CP가 완전히 용리한 다음 20% 메탄올수를 27ℓ/Hr로서 흐르게 하면 최후에 CPC가 용리되어 왔다.

주로 D-CPC를 함유한 프랙션 No, 5∼25을 모아 pH6.5로 보정한 후, 농축·정출하면 50g의 D-CPC 나트륨 염이 얻어졌다. 다음에 주로 DA-CPC를 함유한 프랙션 No, 26∼43을 모아 pH 6.5로 보정한 후, 농축·정출하면 45g의 DA-CPC 나트륨 염이, 또 주로 CPC를 함유한 프랙션 No, 47∼75를 모으로, pH 6.5로 보정한 후, 농축·정출하면 30g의 CPC 나트륨염이 얻어졌다.

Claims (1)

1. 세파로스포린C, 데아세틸세파로스포린C, 데아세톡시세파로스포린C의 적어도 2종류 이상을 함유하는 조수용액을 활성탄과 접촉시켜서, 함유하는 세파로스포린류를 흡착시키고, 유기용제를 0∼20%(V/V) 함유한 물을 사용하여 분별용출하는 것을 특징으로 하는 데아세틸세파로스포린C, 데아세톡시세파로스포린C, 세파로스포린C의 분리법.

Images