KR820001605B1 - 세파로스포린 함유액의 탈색방법 - Google Patents

Abstract

내용 없음.

Description

세파로스포린 함유액의 탈색방법

본 발명은 세파로스포린계 항생물질 함유액의 탈색방법에 관한 것이다.

세파로스포린계 항생물질은 디히드로 티아진 환을 갖는 베타락탐(β-lactam)계 항생물질로써 광범위한 항균력을 나타내며 C₃위치의 구조에 따라 7-ACA 및 7-ADCA계로 구분할 수 있다.

7-ACA는 발효에 의해 생성된 세파로스포린 C에서, 영국특허 1,041,985등에 의한 아마이드 하라이드 방법에 의하여 얻어지며, 7-ADCA는 6-아미노 페니시린산(6-APA)에서 합성되었으나 최근에는 미국특허 3,847,742등에 의한 방법에 의하여 직접 발효로 생성된다.

그러나 발효에 의하여 생성된 세파로스포린 C배양액이나 7-ADCA 배양액 또는 이들 유도체의 함유액 중에는 발효과정에서 생성된 많은 불순물 즉, 단백질, 탄수화물, 페니실린화합물계통의 불순물등이 다량 존재하고 있으며 또한 메라닌계열이나 카라멜 계열의 색소 또한 다량 함유되어 있어 함유액을 농축후 정석하게 되면 제품의 순도가 낮아 재결정을 해야 하는등 제조공정상 많은 문제점이 있었다.

또한 배양액의 정제과정에 있어서도 세파로스포린 C의 경우, 배양액을 비 이온성 흡착제인 XAD계 수지(미국 Rohm ＆ Haas사 제품명)에 의하여 정제하는 방법인 일 본특허 공보 소화 50-106,996이나 또한 HP계수지(일본 미쓰비시화성사 제품명)에 의하여 정제하는 방법인 일본특허 공보소화 51-32791등에 있어서도 함유 액중에 포함된 불순물이나 색소 때문에 사용하는 수지량에 비하여 소량의 함유액을 흡착시킬 수 밖에 없는 단점이 있었으며, 7-ADCA 배양액을 정제하는 방법인 미국특허 3,847,742등에 의한 방법에 있어서도 활성탄 및 음이온 교환수지, 셀루로오즈 또는 실리카겔등을 사용하는 등 정제공정이 길고 복잡해 지는 단점이 있었다.

위의 어느 방법이던간에 정제과정 중 탈색이 저조하여, 결정 후 다시 재 결정 하여야 하였으며 이로 인하여 수율이 저하됨은 당연한 것이었다.

본 발명자들은 세파로스포린계 항생물질을 연구하던중 약염기성 음이온 교환수지와 비 이온성 흡착제를 병용하여 사용하면 세파로스포린 함유액의 탈색에 효과적임을 발견하였다.

위에서 말하는 세파로스포린계 항생물질이란 미생물 배양에 의하여 얻어진 세파로스포린 C 및 데 아세톡시 세파로스포린 C, 그리고 세파로스포린 C를 유도체의 형태로 하여 유기용매로 추울한 세파로스포린 C 유도체등을 포함한다.

이를 좀더 상세히 설명하며 다음과 같다.

세파로스포린 C 및 데 아세톡시 세파로스포린 C는 식 I 및 II와 같은 구조를 갖는다.

Ⅳ. 데 아세톡시 세파로스포린 C

구조식에서 알수 있는 바와 같이 세파로스포린 C 및 데 아세톡시세파로스포린C 는 알카리성 pH에서는 카복실기가 해리되어 음성전하를 갖게되므로 강염기성 수지에 강력히 흡착하나 중성 및 약산성 pH에서는 그 흡착력이 약하다.

그리고 약염기성 수지에는 거의 흡착되지 않음을 알수 있었다. 반면에 색소등의 불순물은 약염기성 수지에 강력히 흡착함을 알 수 있었다.

여기서 사용할 수 있는 약염기성 음이온 교환수지로는 Duolite(미국 Diamond Shamrock사 제품명) A-30B, A-340, A-7, A-374(1), A-377(2), A-378(3), A-561 수지 Amberlite(미국 Rohm and Haas사 제품명) IRA-93, IRA-35, IRA-99, Diaion (일본 미쓰비시 화성사 제품명) WA10,WA11,WA20,WA21,WA30수지등이 있으나 수지 입자 분포가 넓고 페놀 구조를 갖고 있는 수지를 사용하는 것이 효과적이었다.

상기 약염기성 음이온 교환수지를 사용하여 탈색하기전에 발효 배양액의 경우에는 입자가 미세한 규조토(예를 들면 미국 Johns Manvill사의 Hyflo Super Cel)을 사용하여 배양액중에 함유되어 있는 균체 및 고형분의 불순물을 제거한 후 약염기성 수지에 통과시키는 것이 수지의 수명을 연장시킬 수도 있고 탈색효과도 증가 시킬 수 있으므로 효과적이었다.

이와 같이 하여 여과된 발효 배양액 또는 기타 유도체의 형태로 변화시켜 정제된 세파로스포린계 행생물질의 수용액을 pH4.5-6.0으로 조정하여 약염기성 음이온 교환수지층을 통과시키면, 420㎚에서 측정한 흡광도 대비 80% 정도의 탈색효과를 얻을 수 있었으며 이때 세파로스포린계 항생물질은 거의 수지에 흡착하지 않았고, 일부 흡착된 것은 탈이온수를 이용하여 수세하며 완저히 회수 할 수 있었다.

수지량에 비교하여 탈색액의 량은 10배 정도의 범위가 좋았으며 이는 탈색액이 함유하는 색소의 량에 따라 조정하여야 하나, 보통의 경우 10배 이상의 탈색액을 통과시킬 경우에는 탈색율이 서서히 감소됨을 알 수 있었다.

또한 위에서와 같이 약염기성 음이온 교환수지만을 사용하였을 경우에는 만족한 탈색효과를 얻을 수 없어 재차 비이온성 흡착제를 사용하여 약염기성 음이온 교환수지 통과액을 통과시켰다. 이때에는 이온 교환에 의하여 탈색 및 흡착이되는 것이 아니고 비 이온성 접착제의 세공경이 작고 입자분포가 넓기 때문에 분자 상호간의 수지에 대한 무극성의 흡착에 의한 탈색 효과를 얻을 수 있다.

통과액의 pH가 강산성이 되면 세파로스포린계 화합물이 무극성을 띄게 되어 수지와 흡착할 수도 있으므로 통과액의 pH는 약산성이나 중성을 유지하는 것이 좋다.

비 이온성 흡착제로 사용할 수 있는 흡착제로는 Duolite S-861,S-863,S-865,Amberlite XAD-1,2,4,7,8, Diaion HP-10,20,30,40,50 등의 있으나 Duolite S-861이 가장 효과적 이었다.

일단 약염기성 수지를 통과시킨액을 다시 비이온성 흡착제를 통과 시키면 420㎜ 흡광도대비 95%이상의 높은 탈색효과를 얻을 수 있었으며 한가지 특징적인 것은 이때 세파로스포린계 항생물질이 비 이온성 흡착제에 거의 흡착하지 않으므로 수율 또한 높다는 것이다.

그러나 약염기성 음이온 교환수지를 통과시키지 않고 바로 비이온성 흡착제에만 통과시켰을 경우는 420㎜ 흡광도 대비하여 70%이하의 낮은 탈색효과 이었음을 확인하였다.

본 발명에 사용되는 약염기성 음이온 교환수지는 2N-NaOH용액으로 일단 재생한 후 다시 2N-HCl로 재생하여 수지를 OH 및 Cl형으로 치환하여 사용하는 것이 효과적이며 OH형이나 C1형 단독으로 재생하여 사용할 경우에는 탈색율이 급격히 감소됨을 알수 있었다. 재생 후 에는 탈이온수로 충분히 수세하여 수지 통과액의 pH가 3.0이상에서 탈색에 이용하는 것이 좋았다. 또한 비 이온성 흡착제의 경우에 있어서는 재생제로는 2N-NaOH 및 메탄올, 이소프트 판올등의 저급 알콜을 사용하는 것이 좋으며 아세톤, 부탄올 등을 사용시에는 수지중에 흡착된 색소가 완전히 제거되지 않으므로 사용하지 않는 것이 좋다.

탈색시의 탈색액을 통과하는 탈색액의 유속은 통과속도가 적을수록 좋으나 시간당 수지량과 동량의 탈색액을 통과시키는 정도의 유속(SV=1)이 효과적이며 약염기성 음이온 교환수지와 비이온성 흡착제를 연결하여 탈색할 경우에는 SV=2로 조정하여도 가능하다.

또한 약염기성 음이온 교환수지와 비 이온성 흡착제의 연결 방법은, 일단 음이온 교환수지를 통과한 후 탈 이온수로 수세후 비 이온성 흡착제에 통과시키게되면 액의 부피가 증가되고 시간도 오래 소요되므로 약염기성 음이온 교환수지와 비이온성 흡착제를 복상으로 연결하여 통과시키던지 아니면 혼상으로하여 통과시키는 것이 좋다.

그럼 상세한 것을 실시예에 의하여 설명하면 다음과 같다.

[실시예 1]

발효에 의하여 얻어진 세파로스포린 C함유액을 규조토 Hyflo Super Cel(미국 Johns Manvill사 제품)을 여과지 위에 3㎝의 두께로 깔고 감압 여과하여, 420㎚에서의 흡광도 42 및 고속액체 크로마토그라피에 의해 순품과 비교하여 농도 15g/ℓ를 나타내는 배양여액 10ℓ를 얻었다.

이액에 0.5N-HCl 50㎖를 서서히 가하면서 교반하여 pH를 5.5로 조정한 후, Duolite A-7 수지 1ℓ(OH 및 Cl형)가 충진된 수지압(높이 70㎝ 직경 7㎝)과 Duolite S-861 수지 1ℓ(2N-Naoh로 재생후 수세)가 충진된 수지탑 (높이 80㎝ 직경 7㎝)을 복상으로 연결한 후, 시간당 2l의 유속으로 통과시켰다.

Duolite S-861수지를 통과하여 나오는 수지공과액을 500㎖ 씩 분획으로 받으면서 각 분획의 420㎜에서의 흡광도 및 고속액체 크로마토그라피에 의하여 순품과의 농도를 비교 측정하였다. 통과가 다 끝난 후에는 탈이온수 3ℓ를 사용하여 수지를 수세하여 일부 수지에 흡착되어 있던 세파로스포린 C를 회수하여 앞과 같은 방법으로 통과액으로 받았다. 1-4 및 25-26의 분획에서는 420㎜에서의 흡광도는 낮았으나 농도 또한 낮았으므로 5-24분획만을 합하였다. 5-24분획 10l의 pH는 6.2, 420㎜에서의 흡광도 0.45, 고속 액체 크로마토그라치에 의한 순품과의 비교농도는 14.4g/ℓ였으며 또한 통과 전과 비교하여 불순물이 거의 검출되지 않음 또한 확인 할 수 있었다.

상기 통과액 10ℓ를 공지의 방법에 의하여 정제한 후 감압 농축하고 0.5N-NaOH로 pH를 조정한 후 메탄올을 첨가하여 백색의 세파로스포린 C의 나트륨염의 주상형 결정 126g을 얻었다.

[실시예 2]

실시예 1과 동일한 배양여액 10ℓ에 0.5N-HCl 50㎖를 서서히 가하여 pH를 5.5로 조정한 후 Duolite A-7 수지 1ℓ(OH 및 Cl형)가 충진된 수지탑(높이 70㎝,직경 7㎝)에 시간당 2ℓ의 유속으로 통과시켰다.

통과되어 나오는 수지 통과액을 500㎖씩 분획으로 받으면서 실시예 1과 같이 흡광도 및 농도를 측정하였다.

통과가 끝난 후에는 탈이온수 3ℓ를 사용하여 수지를 수세하여 일부 수지에 흡착되어 있던 세파로스포린 C를 회수하여 앞과 같은 방법으로 통과액을 받았다. 1-2 및 25-26분획의 420㎜에서의 흡광도는 낮았으나 농도 또한 낮았으므로 3-24 분획만을 합하였다.

3-24 분획 11ℓ의 pH는 5.7, 420㎚의 흡광도 8.2, 고속액체 크로마토그라피에 의한 순품과의 비교 농도는 13.1g/ℓ였으며 불순물을 소량 확인 할 수 있었다.

[실시예 3]

실시예 2에서 얻은 수지 통과액 10ℓ를 0.5N-HCl소량을 가하여 pH를 5.5로 조정한 후 Duolite S-861수지(2N-NaOH로 재생후 수세)1ℓ가 충진된 수지탑 (높이 80㎝,직경 7㎝)에 시간당 2ℓ의 유속으로 통과시켰다.

통과되어 나오는 수지 통과액을 500㎖씩 분획으로 받으면서 실시예 1과 같이 흡광도 및 농도를 측정하였다.

통과가 끝난 후에는 탈이온수 4l를 사용하여 수지를 수세하여 일부 수지에 흡착되어 있던 세파로스포린 C를 회수하여 앞과 같은 방법으로 통과액을 받았다. 1-3 및 27-28분획의 420㎜에서의 흡광도는 낮았으나 농도 또한 낮았으므로 4-26 분획만을 합하였다. 4-26 분획 11.5ℓ의 pH는 6.3, 420㎚의 흡광도 0.42, 고속액체 크로마토그라피에 의한 순품과의 비교 농도는 11.9g/ℓ였으며 통과전과 비교하여 불순물이 현저히 감소 되었음을 확인 할 수 있었다.

상기 통과액 11.5ℓ를 공지의 방법에 의하여 농축정석하여 백색의 세파로스포린 C의 나트륨염의 주상형 결정 120g을 얻었다.

그러나 실시예 1과 동일한 배양여액 10ℓ를 약염기성음이온 교환수지에 통과시키지 않고 비이온성 흡착제인 Duolite S-861단독에만 통과시켰을 경우 420㎚에서의 흡광도는 13.4로 낮은 탈색효과를 확인하였다.

[실시예 4]

발효에 의해서 얻어진 데 아세톡시 세파로스포린 C함유액을 규조토 Hyflo Super Cel(미국 John Man vill사 제품)을 여과지 위에 3㎝두께로 깔고 감압 여과하여, 420㎚에서의 흡광도 48 및 고속액체 크로마토그라피에 의해 순품과비교하여 농도 10.2g/ℓ를 나타내는 배양여액 10ℓ를 얻었다.

이액에 0.5N-HCl 35㎖를 서서히 가하면서 교반하여 pH를 5.5로 조정한 후 Duolite A-7수지 1ℓ(OH 및 Cl형)가 충진된 수지탑(높이 70㎝, 직경 7㎝)과 Duolite S-861수지 1ℓ(2N-NaOH로 재생후 수세)가 충진된 수지탑(높이 80㎝,직경 7㎝)을 복상으로 연결한 후, 시간당 2ℓ의 유속으로 통과시켰다.

통과되어 나오는 수지 통과액을 500㎖씩 분획으로 받으면서 420㎚의 흡광도 및 고속액체 크로마토그라피에 의하여 순품과의 농도를 비교측정하였다.

통과가 다 끝난 후에는 탈이온수 3ℓ를 사용하여 수지를 수세하여 일부 수지에 흡착되어 있던 아세톡시 세파로스포린 C를 회수하여 앞과 같은 방법으로 통과액을 받았다.

1-3 및 25-26 분획의 420㎚에서의 흡광도는 낮았으나 농도 또한 낮았으므로 4-24분획만을 합하였다. 4-24 분획 10.5의 pH 6.3는 420㎚에서의 흡광도는 0.6, 고속액체 크로마토그라피에 의한 순품과의 비교 농도는 9.2g/l였으며 이때는 통과전과 비교하여 불순물이 상당히 제거 되었음을 확인할 수 있었다.

상기 통과액 10.5ℓ를 공지의 방법에 의하여 정제한 후 감압농축하고 정석하여 백색의 데 아세톡시 세파로스포린 C 의 무정형 결정 81.2g을 얻었다.

[실시예 5]

공지의 방법(미국 특허 3,923,798)에 의하여 얻어진 이소보닐 옥시 카보닐 세파로스포란의 조결정 10g을 탈이온수 1ℓ에 용해시킨후(이때 420㎚에서의 흡광도 0.64),0.5N-HCl소량을 가하여 용액의 pH를 5.5로 조정하고 Duolite A-7 수지 100㎖(OH 및 Cl형)가 충진된 수지탑(높이 15㎝,직경 4㎝)과 Duolite S-861 지수 100㎖(높이 16㎝,직경 4㎝)가 충진된 수지탑을 복상으로 연결하여, 시간당 200㎖의 유속으로 통과시켰다. Duolite S-861 수지탑을 통과하여 나오는 액을 100㎖씩 문획으로 받았다.

통과가 끝난 후에는 탈이온수 300㎖를 사용하여 수세하고 앞과 같이 분획으로 받았다. 2-12분획을 합한 액의 pH는 6.3이었고 420㎚에서의 흡광도는 0.08이었다. 이액을 감합 농축하고 에틸 아세테이트소량을 강하여 이소보닐옥시 카보닐 세파로스포린 C의 백색 결정 9.7g을 얻었다.

[실시예 6]

실시예 1과 동일한 배양여액 10ℓ를 pH 5.5로 조정하고 Duolite A-7수지 1ℓ(OH 및 Cl형) 및 Duolite S-861 수지 1ℓ(NaOH재생후 수세)를 혼상으로 충진한 수지탑(직경 10㎝,높이 60㎝)에 시간당 2ℓ의 유속으로 통과시키면서 통과액을 500㎖씩 분획으로 받으면서 실시예 1과 같이 흡광도 및 농도를 측정하였다. 통과가 끝난 후에는 탈이온수 3ℓ를 사용하여 수지를 수세하고 일부 수지에 흡착되어 있던 세파로스포린 C를 회수하여 앞과 같은 방법으로 통과액을 받았다. 3-24분획을 합한 11ℓ의 pH는 5.6, 420㎚에서의 흡광도는 0.46, 고속액체 크로마토 그라피에 의한 순품과의 비교농도는 13.2g/l였으며 또한 불순물의 통과 전과 비교하여 현저히 감소되었음을 알 수 있었다.

상기 통과액 11ℓ를 공지의 방법에 의하여 감압 농축하고 메탄놀을 첨가하여 정석하여 백색의 세파로스포린 C 나트륨 결정 128g을 얻었다.

사용한 수지는 수세에 의하여 두 수지층을 분리한 후 Duolite A-7 수지는 2N - NaOH로 재생하고 Duolite S-861 수지는 2N-NaOH 또는 메탄올, 이소프로판올만을 사용하여 밑에서 위로 재생하여 다시 탈색에 사용할 수 있다.

Claims (1)

1. 발효에 의해서 직접 생성된 세파로스포린 C의 배양액이나 데 아세톡시 세파로스포린 C의 배양액 또는 이들 유도체의 함유액을 염산 또는 기타 약산에 의하여 pH를 4.5-6.0으로 조정한 후, 약염기성 음이온 교환수지 및 비 이온성 흡착제를 혼상 또는 복상으로 연결시킨 수지탑에 통과시키는 것을 특징으로하는 세파로스포린 함유액의 탈색방법.