DE2502097A1

DE2502097A1 - Verfahren zur reinigung von cephalosporinen

Info

Publication number: DE2502097A1
Application number: DE19752502097
Authority: DE
Inventors: Dale Warren Blackburn
Original assignee: SmithKline Corp
Current assignee: GlaxoSmithKline LLC
Priority date: 1974-01-23
Filing date: 1975-01-20
Publication date: 1975-07-24
Also published as: CH613971A5; IE40481B1; IE40481L; BE824028A; FR2258388A1; NL7500805A; ES433995A1; JPS50106996A; FR2258388B1; GB1472966A

Description

SMITIIKLINE CORPORATION
Philadelphia, Pennsylvania, V.St.A.

" Verfahren zur Reinigung von Cephalosporinen "

Priorität: 23. Januar .1974, V.St.A., Nr. 435 911 · .

Die Erfindung betrifft den in den Ansprüchen gekennzeichneten Gegenstand.

Cephalosporine sind wichtige Breitband-Antibiotika, die in großem Umfang zur Behandlung von bakteriellen Infektionen verwendet werden. Als wirtschaftlich erfolgreich haben sich sogenannte halbsynthetische Cephalosporine erwiesen, die durch chemische Modifikation von aus natürlichen Quellen stammenden Produkten erhalten werden. Bei den meisten chemischen Modifi-■" kationen werden die Produkte zusammen mit Verunreinigungen erhalten, die entfernt v/erden müssen. Die herkömmlichen Verfahren zur Reinigung dieser Rohprodukte zur Herstellung von pharmakologisch verträglichen Präparaten haben sich als unzureichend erwiesen. Diese herkömmlichen Verfahren umfassen Lösungsmittelextraktion, Einsatz von Ionenaustauscherharzen, Chromatographie mit üblichen Adsorptionsmittel)^ Aussalzen oder Verwendung von _j

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ORIGINAL INSPECTS*

Aktivkohle.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Reinigung von Cephalosporinen zur Verfügung zu stellen, bei dem hochreine Produkte unter minimalen Materialverlusten erhalten werden.

Es wurde erfindungsgemäß festgestellt, daß sich synthetische makroretikuläre, polymere Adsorptionsmittel zur raschen und wirksamen Reinigung von Cephalosporinen und deren Zwischenprodukten, die jeweils eine freie Carboxylgruppe aufweisen, eignen, wobei die jeweiligen Produkte in hohen Ausbeuten erhalten werden.

Die entsprechenden Kunstharze und ihre Verwendungsarten sind in den US-PSen 3 531 463, 3 663 467 und 3 725 400 beschrieben. Die dort beschriebenen Verfahren beziehen sich auf die Isolierung von wasserlöslichen organischen Verbindungen aus verdünnten wäßrigen Lösungen oder die Entfernung von organischen Verunreinigungen aus wäßrigen Flüssigkeiten. Beispielsweise ist die Entfärbung von Rohzucker beschrieben.

Im allgemeinen unterscheiden sich pharmakologisch wichtige Cephalosporine voneinander durch die Substituenten in den 7- und 3-Stellungen des Cephemkerns. Diese Verbindungen werden durch Acylierung von 7-rAminocephalosporin hergestellt, welches vorher oder anschließend in der 3-Stellung modifiziert wird, beispielsweise durch Ersatz einer Acetöxygruppe durch einen nucleophilen Rest.

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Im folgenden wird das erfindungsgemäße Verfahren anhand von Cefazolin, das heißt 7-(1-Tetrazolylacetamido)-3-(5-methyl-1 ,S^-thiadiazol-^-ylthiomethyl) -3-cephem-4-carbonsäure, be-, schrieben. Das erfindungsgemäße Verfahren ist jedoch nicht auf diese Verbindung beschränkt, es läßt sich vielmehr auf alle Cephalosporine anwenden, die eine freie Carboxylgruppe, vorzugsweise in der 4-Stellung des Cephemkerns aufweisen. Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren können auch Cephalosporine mit verschiedenen anderen Acylresten gereinigt v/erden. Beispiele für solche Acylreste sind die Thienylacetyl-, Mandeloyl-, Phenylglycyl-, p-Hydroxyphenylglycyl-, Cyanoacetyl-, Pyridylthioace- ' tyl- und ot.-Amino-1 ^-cyclohexadienylacetylgruppe in der 7-Stellung. Beispiele für Substituenten in der 3-Stellung sind die Methyl-, Acetoxymethyl- und durch heterocyclische Reste substituierte Thiomethylgruppe, wobei die heterocyclischen Reste Tetrazolyl-, Thiadiazolyl-, Triazolyl- und Oxadiazolyl-\ gruppen sein können. Spezielle Beispiele für Cephalosporine, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gereinigt werden können, sind 7-Thienylacetamidocephalosporansäure (Cephalothin), 7-Thienylacetamido-3-pyridiniummethyl-3-cephem-4-carboxylat (Cephaloradin) , 7- (c^-Arainopheny!acetamido) -cephalosporansäure (Cephaloglycin), 7-(o(~Aminophenylacetamido)-desacetoxycephalosporansäure (Cephalexin), 7- (<¥-Amino-l, 4-cyclohexadie~ nylacetamido)-desacetoxycephalosporansäure (Cephradin), 7-Cyanoacetamidocephalosporansäure, 7-(4-Pyridylthioacetamido)-cephalosporansäure, 7-Mandelamido-3-(l-methyltetrazol-5-ylthiomethyl)-3-cephem~4-carbonsäure und 7-(3-Sydnonacetamido)-3-(5-methyl-l,3,4-thiadiazol-2-ylthiomethyl)-3-cephem-4-carbonsäure, j_ Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich auch zur Reinigung _j

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von Zwischenprodukten, wie 7-ACS, 7-ADCS, 7-Amino-3-(1-methyltetrazol-5-ylthiomethyl) -3-cephem-4-carbonsäure und 7-Amino-3-(5-methyl-l ,3 ,4-thiadiazol-2-ylthiomethyl) -3-cephem-4-carbonsäure.

Die letzte Stufe bei der üblichen Reaktionsfolge zur Herstellung von Cefazolin besteht in der Acylierung von 7-Amino-3~ (5-methyl-l,3_/4-thiadiazol-2-ylthiomethyl)-3-cephem-4-carbonsäure mit 1-Tetrazolylessigsäure. Dazu wird im allgemeinen das gemischte Anhydridverfahren verwendet. Das erhaltene Rohprodukt enthält verschiedene Verunreinigungen, darunter nicht umgesetzte Ausgangsverbindungen, die Carbonsäuren aus cfem gemischten Anhydrid und gefärbte Substanzen unbekannter Struktur, die als Teer bezeichnet werden, enthalten.

Wie bereits erwähnt, lassen sich diese Verunreinigungen durch selektive Adsorption an einem polymeren, nichtionogenen Kunstharz entfernen. In einem bestimmten pH-Bereich, werden die Verunreinigungen stärker an das Kunstharz adsorbiert als die Cephalosporinsalze, wie das Natrium- oder Triäthylammoniumsalz, die nur schwach adsorbiert und deshalb zuerst eluiert werden.

Im erfindungsgemäßen Verfahren eignen sich als polymere nichtionogene Kunstharze vernetzte Copolymerisate aus Styrol und Divinylbenzol oder vernetzte Polymerisate von Acrylsäureestern. Diese Kunstharze haben einen durchschnittlichen Porendurchmesser von 50 bis 250 A* und eine Oberfläche von 100 bis 750 m /g.

entsprechend Es können handelsübliche Kunstharze / einer lichten Maschen- _j

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weite von 0,84 bis 0,29 mm verwendet werden, jedoch ergeben

entsprechend
Kunstharze / einer lichten Maschenweite von 0,177 bis " 0,149 mm eine verbesserte Wirksamkeit. Beispiele für Kunstharze, die sich im erfindungsgemäßen Verfahren einsetzen lassen, sind Amberlite XAD-2, Amberlite XAD-7 und Amberlite XAD-8. Bevorzugt sind XAD-2 und XAD-8, wobei XAD-8 besonders bevorzugt " ist. XAD-2 ist ein vernetztes Copolymerisat aus Styrol und Divinylbenzol mit einem durchschnittlichen Porendurchmesser von 90 R. XAD-7 und XAD-8 sind vernetzte Polymerisate von Acryl-, säureestern mit einem durchschnittlichen Porendurchmesser von 80 bzw. 250 &\

Ncich der Isolation des Cef azolins (oder allgemein eines Cephalosporins) aus dem Reaktionsgemisch als roher Feststoff wird durch Auflösen des rohen Cefazolins in einem Puffer, dessen pH-Wert größer als der pKa-Wert des Cefazolins ist, eine Lösung hergestellt. Der pH- Bereich dieses Puffers kann 3 bis 6,5 betragen, wobei ein pH-Bereich, der 0,5 pH-Einheiten oberhalb bzw. unterhalb des pKa-Wertes der Carbonsäure, die mit Tetrazolessigsäure im gemischten Anhydrid vorliegt, bevorzugt wird. Außerdem wird der bevorzugte pH-Bereich so gewählt, daß das Cefazolin zu etwa 99 % ionisiert ist, das heißt ein pH-

Bereich von 4,5 + 0,5 ist bevorzugt. Beispiele für entsprechende Puffer sind Formiat- und Acetatpuffer. Die Auswahl und Herstellung innerhalb des gegebenen pH-Spielraums, wobei die Wahl der nachstehend angeführten Anioneri berücksichtigt wird, liegt im Bereich des fachmännischen Könnens. ■

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Wird die Acylierungsreaktion in einem wäßrigen Medium durchge~ führt, so können etwaige organische Lösungsmittel durch Verdampfen oder Extraktion entfernt v/erden. Die wäßrige Lösung wird bis zu einer Acetatkonzentration von 0,2 m mit festem Natriumacetat versetzt. Die erhaltene wäßrige Lösung wird gegebenenfalls mit einer üblichen Säure oder Base auf einen pH-Wert von 4,O bis 4,8 eingestellt. Der pH-Wert hängt von der im gemischten Anhydrid verwendeten Carbonsäure ab, ferner davon, ob eine extraktive Vorbehandlung durchgeführt wird und schließlich von der Art der angewendeten Absorptionstechnik, das heißt Säulen- oder Aufschlämmungstechnik. Bevorzugt wird ein pH-Wert in einem Bereich von jeweils 0,5 pH-Einheiten unterhalb bzw.oberhalb des pKa-Wertes der im gemischten Anhydrid verwendeten Carbonsäure. Das wäßrige Konzentrat kann anschließend mit einem organischen Lösungsmittel, wie Essigsäureisobutylester und/oder Methylenchlorid extrahiert werden, wobei der Großteil der im gemischten Anhydrid verwendeten Carbonsäure und bestimmte nicht umgesetzte Ausgangsverbindungen entfernt werden. Die erhaltene wäßrige Lösung wird sodann nach dem erfindungsgemäßen Verfahren mit dem Kunstharz behandelt.

Es wurde festgestellt, daß bestimmte Anionen die Adsorption des Teers verzögern und somit die Wirksamkeit des Verfahrens beeinträchtigen. Das Ausmaß dieses ungünstigen Effekts hängt von der Art des Cephalosporins ab. Beispiele für derartige Anionen sind Phosphat, Sulfat, Tartrat, Citrat und Sthylendiamintetraacetat. Beispiele für Anionen, die diese ungünstige Wirkung nicht zeigen, sind Acetat, Propionat, Benzoat, Formiat und Chlorid. Ob bestimmte Anionen im Puffer für das erfin-

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dungsgemäße Verfahren geeignet sind, läßt sich durch einfaches Ausprobieren feststellen, indem man einen Vorversuch in kleinem Maßstab durchführt und die Ergebnisse untersucht. Auf diese Weise läßt sich leicht feststellen, welche Anionen geeignet sind.

Die Cefazolinlösung wird auf eine mit dem Kunstharz beschickte Säule aufgesetzt und eluiert. Die Kunstharzmenge beträgt im allgemeinen 5 bis 30 ml/g rohes Cefazolin. Das Verhältnis von Kunstharz zu Cephalosporin hängt von der Art des Cephalosporins ab. Dieses Verhältnis läßt sich jedoch durch einfache Versuche bestimmen. Als Elutionsmittel können beispielsweise Puffer, Natriumacetatlosungen oder Natrxumchloridlösungen verwendet werden. Im allgemeinen werden die gleichen Puffer wie zur oben beschriebenen Herstellung der Cefazolinlösungen aus dem festen Cefazolin verwendet. Ein typisches Elutionsmittel besteht aus 0,1 m Essigsäure, 0,1 m Natriumacetat und 0,2 m Natriumchlorid, Die maximale Ausbeute an Cefazolin und die maximale Entfernung von Teerprodukten können durch Veränderung, der Ionenstärke und des im Elutionsmittel vorhandenen Anions eingestellt werden. Bei Erhöhung der Ionenstärke werden mehr Teerprodukte entfernt, wobei die Cefazolinverluste steigen. . * .

Der Hauptanteil des Produkts wird mit den. ersten Säulenvolumina an Elutionsmittel eluiert. Diese Lösung kann anschließend über eine kurze Aluminiumoxidsäule gegeben werden, um restliche Spuren von gefärbten Verunreinigungen zu entfernen. Je nach der Menge der im rohen Cephalosporin vorhandenen Verunreinigungen kann diese Reinigungsstufe auch entfallen. Das Cefazolin

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wird durch Ansäuern der Lösung, beispielsweise mit einer anorganischen Säure, auf einen pH-Wert von etwa 1,5, Abkühlen und Abfiltrieren des reinen Produkts isoliert. Um die Produktreinheit zu steigern und die Färbung zu vermindern, kann die saure Lösung mit Isopropanol versetzt werden.

Um das Kunstharz mit dem Cephalosporin in Berührung zu bringen, kann man sich auch eines Aufschlämmungsverfahrens bedienen. Dabei wird das Kunstharz direkt zur wäßrigen Lösung des rohen Cefazolins gegeben. Das erhaltene Gemisch wird einige Zeit gerührt, wobei der pH-Wert langsam auf 4,5 + 0,5 eingestellt wird. Sodann wird das Gemisch direkt in eine Säule gefüllt und mit einem Mehrfachen des Säulenvolumens mit Elutionsmittel eluiert. Das Aufschlämmungsverfahren kann auch so durchgeführt werden, daß die Lösung zu dem bereits in einer Säule befindlichen Kunstharz gegeben, das Gemisch gründlich durchgemischt und der pH-Wert wie oben beschrieben unter Rühren eingestellt wird. Anschließend läßt man das Kunstharz absetzen und eluiert auf die vorbeschriebene Weise. Das Produkt kann anschließend über eine Aluminiumoxidsäule gegeben und auf die beim Säulenverfahren beschriebene Weise isoliert werden. Durch das Aufschläramungsverfahren wird die Wirksamkeit und die Re-

produzierbarkeit der Adsorption am Kunstharz erhöht. Jedoch kann dabei eine vorherige Extraktion (vgl. vorstehende Beschreibung) notwendig sein, um die vorhandenen Verunreinigungen zu entfernen.

Beim Aufschlämmungsverfahren können das XAD-Kunstharz und das Aluminiumoxid miteinander vermischt oder in zwei Säulen hin-

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tereinander verwendet werden. Durch Vereinigung der beiden Ad-' sorptionsmittel beim Aüfschlämrnungsverfahren gelangt man zu verbesserten Ergebnissen, was einen synergistischen Effekt anzeigt. Insbesondere gelangt man zu besseren Ergebnissen, wenn die Adsorptionsmittel zu einer Cefazolinlösung gegeben werden, deren pH-Wert etwa 1,25 bis 2,25 Ein-

heiten höher als der pH-Wert des anschließend zu verwendenden Elutionspuffers liegt. Anschließend wird das Gemisch'langsam ■ auf den pH-Wert des Puffers eingestellt, gerührt, in eine Säule gefüllt und auf die vorbeschriebene Weise eluiert. Eine andere Möglichkeit, die·ebenfalls zu verbesserten Ergebnissen führt, besteht darin, die Adsorptionsmittel zur Cefazolinlösung zu geben, den pH-Wert auf 6 bis 6,5 einzustellen, zu rühren und'

den pH-Wert

langsam auf/4 bis 4,5 einzustellen. Ferner können die Adsorptionsmittel zu einer Cefazolinlösung vom pH-Wert 6 bis 6,5 gegeben werden, worauf der pH-Wert langsam unter Rühren auf 4 bis 4,5 eingestellt wird. Bei allen vorgenannten Verfahren zur pH-Einstellung können das Kunstharz und das Aluminiumoxid gemeinsam oder das Kunstharz allein verwendet werden.

Anstelle der Verwendung einer Säule kann das reine Cefazolin von den Adsorptionsmitteln auch eluiert werden, indem man das Lösungsmittel über eine aus dem Adsorptionsmittel bestehende Filtrierschicht gibt. Beispielsweise kann beim Äufschlämmungsverfahren das Adsorptionsmittel auf einem Filter gesammelt und anschließend das Elutionsmittel darüber gegeben, wobei Druck oder Unterdruck angelegt werden kann.

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Die Kunstharze.können regeneriert und wiederholt verwendet werden. Die Regeneration wird durch Waschen des Kunstharzes mit 0,2 in Natriurahydroxidlösung, 50prozentiger wäßriger Methanollösung oder einer O,lprozentigen Natriumhydroxidlösung in 50prozentigem wäßrigem Methanol vorgenommen. Das Kunstharz wird vor seiner Wiederverwendung gründlich mit Wasser und anschließend mit dem Elutionsmittel gespült.

Das erfindungsgemäße Verfahren führt im Vergleich zu herkömmlichen Verfahren, wie Lösungsmittelextraktion und Entfärbung, zu reineren Produkten in höheren Ausbeuten. Beispielsweise erhält man Cefazolin aus roher 7-Amino-3-(5-methyl-l,3,4-thiadia- ' zol-2-ylthiomethyl)-3-cephem-4-carbonsäure in einer Gesamtausbeute von etwa 55 bis 60 %, wenn man das herkömmliche Reinigungsverfahren anwendet. Bei der Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens beträgt die Gesamtausbeute aus roher 7-Amino-3-(5-methyl-l >3 , 4-thiadiazol-ⁱ2-ylthiomethyl) -3-cephem-4-carbonsäure etwa 80 bis 85 %. Zusätzlich zu der mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erzielten verbesserten Ausbeute ergibt sich ein Produkt von höherer Reinheit. Demzufolge kann die Vorreinigung des Ausgangsraaterials entfallen.

Die Beispiele erläutern die Erfindung. In den Beispielen werden folgende Puffer verwendet:

Puffer A; 0,1 m Natriumacetat, 0,1 m Essigsäure und

0,2 m NaCl.
Püffer B: 0,1 m Natriumacetat, 0,1 m Essigsäure und

< 0,1 m NaCl. _j

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Beispiel 1

Aus einem Wasser/Aceton-Acylierungsgemisch wird das Aceton unter vermindertem Druck abgedampft und der wäßrige Rückstand (50 ml, 4 g Cefazolin) mit Natriumacetat bis zu

einer Konzentration von 0,2 m versetzt. Anschließend wird die Lösung mit verdünnter HCl auf den pH-Wert 4,3 bis 4,8 eingestellt und auf eine mit XAD-8 (75 ml) beschickte Säule gegeben. Die Säule wird mit dem Puffer A eluiert. Das Eluat wir.d über eine kurze, mit neutralem Aluminiumoxid beschickte Säule gegeben. Die erhaltene Lösung wird mit einem Drittel ihres Volumens mit Isopropanol versetzt und anschließend mit HCi auf den pH-Wert 1,4 bis 1,6 angesäuert. Das ausgefallene weiße Cefazolin wird abfiltriert und getrocknet.

Beispiel 2

In eine 100 ml fassende Säule werden 6 ml neutrales Aluminiumoxid, eine Schicht Glaswolle und darüber 48 ml XAD-8-Kunstharz gegeben. Anschließend wird die Säule mit Wasser und sodann mit dem Puffer B gewaschen. 1,816 g rohes Cefazolin (4 mMol) v/erden unter Zusatz von 275 mg Natriumbicarbonat in dem Puffer B gelöst und auf die Säule aufgesetzt. Mit 185 ml Puffer B wird reines Natriumsalz von Cefazolin eluiert. Durch Ansäuern des Eluats mit verdünnter HCl erhält man 1,172 g Cefazolin.

Beispiel 3

30 ml XAD-7-Kunstharz werden mit Methanol und Wasser gewaschen und als Aufschlämmung in eine Säule gegeben. Anschließend wird wieder mit Wasser gewaschen. Sodann wird eine Lösung von

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454 mg rohem Cefazolin, 300 mg Natriumacetat-trihydrat und 60 mg Natriumbicarbonat in einer solchen Menge Wasser, daß ein Gesamtvolumen von 7 ml erreicht wird, auf die Säule gegeben. Durch Elution mit lprozentiger Natriumacetatlösung erhält man eine gute Abtrennung von gefärbten polaren Verunreinigungen und Cefazolin. Die einzelnen Fraktionen v/erden jeweils durch Ansäuern mit verdünnter HCl auf den pH-Wert 1,3 .bis 1,6 auf die Anwesenheit von Cefazolin untersucht.

Bei der Durchführung des vorgenannten Verfahrens unter Verwendung von XAD-8-Kunstharz ergibt sich ebenfalls eine Abtrennung der Verunreinigungen.

Verwendet man im vorgenannten Verfahren XAD-8-Kunstharz und eine dem dreifachen Säulenvolumen entsprechende Menge eines Acetatpuffers vom pH-Wert 4,7 (0,6 m Natriumacetat und 0,5 m Essigsäure) und anschließend eine lprozentige Natriumacetatlösung, so erreicht man eine verbesserte Abtrennung.

Beispiel 4

2,3 g rohes Cefazolin werden unter Zusatz von Na₃CO- in 20 ml Puffer A zu einer Lösung mit einem pH-Wert von 6,5 gelöst. Anschließend werden 10 ml XAD-8 langsam zugegeben. Die Lösung wird hierauf durch langsame Zugabe von verdünnter HCl auf den pH-Wert von 4,8 eingestellt. Unter Beibehaltung des pH-Werts 4,8 werden anschließend langsam 4 g neutrales Aluminiumoxid zu diesem Gemisch gegeben. Nach 15minütigem Rühren wird das Gemisch auf eine mit 4,5 g neutralem Aluminiumoxid beschickte l_ Säule gegeben und mit einer dem zweifachen Säulenvolumeri ent- _j

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sprechenden Menge des Puffers A und anschließend mit 2prozentiger Natriumacetatlösung eluiert. Das Eluat wird mit verdünnter HCl auf den pH-Wert 1,8 angesäuert. Man erhält 1,9 g gereinigtes Cefazolin.

B e i s pi e 1 5

44 ml eines Wasser/Aceton-Acylierungsgemisches werden mit Wasser auf ein Gesamtvolumen von 75 ml verdünnt und nach' Überschichtung mit einem entsprechenden Volumen Essigsäureisobutyl^ ester auf den pH-Wert 4,4 eingestellt. Die abgetrennte wäßrige Phase wird bis zu' einer Konzentration von 0,2 m mit Natriumacetat versetzt und sodann mit Natriumcarbonat auf den pH-Wert 6,5 eingestellt. 150 ml XAD-8-Kunstharz werden zugegeben. Das Gemisch wird sodann gerührt und mit verdünnter HClauf den pH-Wert 4,4 bis 4,8 eingestellt. Die Aufschlämmung wird in eine Säule gegeben und mit dem Puffer A eluiert. Das Eluat wird über eine kleine, mit Aluminiumoxid beschickte Säule gegeben, mit Isopropanol in einer Menge, die einem Drittel des Eluatvolumens entspricht, verdünnt, und auf den pH-Wert 1,5 eingestellt. Das reine Cefazolin wird abfiltriert.

Beispiel 6 ·

Aus dem irohen Reaktionsgemisch, das durch Acylierung von 7-Amino-3- (5-methyl-l,3,4-thiadiazol-2-ylthiomethyl) -3-cepheirt-4-carbonsäure (118 g, 87,6 % Reinheit) mit Tetrazolessigsäure nach dem gemischten Anhydridverfahren erhalten worden ist, wird das als Lösungsmittelbestandteil verwendete Aceton durch Destillation unter vermindertem Druck entfernt. Der wäßrige Rückstand (1183 g) wird mit 1,2 Liter Essigsäureisobutylester

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überschichtet, mit konzentrierter HCl auf den pH-Wert 4,1 eingestellt und anschließend nach der Trennung der Schichten mit 1,2 Liter Methylenchlorid extrahiert. Die wäßrige Lösung wird sodann mit 1152 ml regeneriertem XAD-8-Kunstharz, das vorher mit dem Puffer A gewaschen worden ist, in Berührung gebracht und sodann mit Triäthylamin auf den pH-Wert 6,0 bis 6,5 eingestellt. Anschließend wird die Suspension unter Rühren langsam mit konzentrierter HCl auf den pH-Wert 4,6 eingestellt. Nach 2Ominütigem Rühren wird die Suspension in eine Säule gegeben, die so geschaltet ist, daß das Eluat auf eine zweite, 576 g Aluminiumoxid enthaltende Säule gelangt. Sodann werden 7,5 Liter Puffer A über die Säulen gegeben. Ein Gesamtvolumen von 10,1
/ Liter Eluat wird aufgefangen. Zur Aufrechterhaltung einer Durchflußgeschwindigkeit von etwa 4 Liter/Stunde/Liter Kunstharz kann entweder Unterdruck oder Druck angelegt werden. Das Eluat wird mit 2 Liter Isopropanol versetzt und die Lösung mit einer Mineralsäure auf den pH-Wert 2 eingestellt. Nach dem Abkühlen wird das Cefazolin abfiltriert und'getrocknet. Man erhält 110,4 g Produkt, was einer Ausbeute von 81,2 % entspricht.

Beispiel 7

10 g rohe 3-(5-Methyl-l,3,4-thiadiazol-2-ylthiomethyl)-7-D-(-)-mandelamido-3-cephem-4-carbonsäure werden unter Zusatz von 1,76 g Natriumbicarbonat in 50 ml Puffer A gelöst. Die Lösung wird mit Natriumbicarbonat auf den pH-Wert 6,3 eingestellt und anschließend mit 100 ml XAD-8-Kunstharz versetzt. Die .erhaltene Suspension wird unter Rühren langsam durch Zugabe von" HCl auf den pH-Wert 4,7 eingestellt. Die Aufschlämmung wird in eine Säule gegeben und mit dem Puffer A eluiert. Das _|

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Eluat wird direkt über eine mit 15 g Aluminiumoxid beschickte' Säule gegeben und anschließend auf den pH-Wert 2 angesäuert. Das gereinigte Produkt wird abfiltriert und getrocknet.

Beispiele .

40 g 7-Amino-3-(5-methyl-l,3,4-thiadiazol-2-yl)-3-cephem-4-carbonsäure werden in 400 ml 0,25 m Natriumacetatlösung suspendiert und durch Zusatz eines Äquivalents Triäthylamin (16 ml) in Lösung gebracht. Die Lösung wird mit 3 η HCl wieder auf den pH-Wert 8,5 gebracht, wodurch' keine Ausfällung hervorgerufen wird. Die Lösung (635 ml) wird sodann auf eine mit 600 ml" XAD-2-Kunstharz beschickte Säule gegeben, die so angeordnet ist, daß das Eluat direkt auf eine mit Aluminiumoxid beschickte Säule gelangt. Die XAD-2-Säule wird mit einer 0,25 m Natriumacetatlösung, die mit Triäthylamin auf den pH-Wert 8,5 eingestellt ist, eluiert. Das Eluat wird in Fraktionen aufgefangen und angesäuert. Die Niederschläge stellen das reine Produkt dar und werden abfiltriert.

Beispiel 9

2 q 7-Aminocephalosporansäure (78,6prozentig; dunkelgelb) werden in 20 ml 1 m dibasischem Kaliumphosphat unter Zusatz von Triäthylamin gelöst. Die endgültige Lösung weist einen pH-Wert von 6,0 auf. Sodann wird die rohe Lösung· üb₄er ;eine 25 ml XAD-2 enthaltende Säule gegeben. Die 7-Aminocephalosporansäure wird mit den ersten beiden Säulenvolumina des Elutionsmittels eluiert. Die Fraktionen werden vereinigt und auf den pH-Wert 3,6 angesäuert. Man erhält 1,304 g hellbeigen Niederschlag, dessen Reinheit zu 89,2 % bestimmt wird.

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Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zur Reinigung von Cephalosporinen mit einer freien Carboxylgruppe, dadurch gekennzeichnet, daß man

(a) eine wäßrige Lösung eines Cephalosporins mit einem pH-Wert von '3 bis 6,5 mit einem nichtionogenen, makroretikulären polymeren Kunstharz, .das aus einem vernetzten Styrol-Divinylbenzol-Copolymerisat oder einem vernetzten Acrylsäureestcr-Pölymerisat besteht, als Adsorptionsmittel in Kontakt bringt und das Cephalosporin von diesem Adsorptionsmittel mit einer wäßrigen Lösung vom pH-Wert 3 bis 8,5 eluiert;

(b) das das Cephalosporin enthaltende Eluat bis zu einem pH-wert unter dem pK-Wert des Cephalosporins ansäuert und

(c) das ausgefällte Cephalosporin gewinnt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man

(a) entweder eine wäßrige Lösung des Cephalosporins mit einem pH-Wert von 3 bis 6,5 mit einem Gemisch aus dem Kunstharz und Aluminiumoxid als Adsorptionsmittel in Kontakt bringt und das Cephalosporin mit dem Elutionsmittel von diesen Adsorptionsmitteln eluiert

oder die wäßrige Lösung des Cephalosporins mit dem Kunstharz in Kontakt bringt, das Cephalosporin mit dem Elutionsmittel vom Kunstharz eluiert und das Eluat über Aluminiumoxid gibt; ' .

(b) das das Cephalosporin enthaltende Eluat bis zu einem pH-Wert unter dem pK-Wert des Cephalosporins ansäuert und

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(c) das ausgefällte Cephalosporin gewinnt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die wäßrige Lösung des Cephalosporins rait einem Gemisch der Adsorptionsmittel in Kontakt bringt.

4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die wäßrige Lösung des Cephalosporins mit dem Kunstharz in Kontakt bringt, das Cephalosporin vom Kunstharz mit einem wäßrigen Puffer mit einem pH-Wert von 3 bis 8,5 eluiert und das Eluat über Aluminiumoxid gibt.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als Kunstharz ein vernetztes Styrol-Divinylbenzol-Copolymerisat verwendet.

6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als Kunstharz ein vernetztes Acrylsäureesterpolymerisat verwendet.

7. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Cephalosporin Cefazolin, Cephalothin," Cephaloridin, Cephaloglycin, Cephalexin, Cephradin, 7-Cyanoacetamidocephalo-. sporansäure, 7-(4-Pyridylthioacetamido)-cephalosporansäure, 7-Mandelamido-3- (l-methyltetrazol-5-ylthiomethyi.) -3-cephem-4-

. carbonsäure, 7-(3-Sydnonacetamido)-3-(5-methyl-l,3,4-thiadiazol-2-ylthiomethyl)-3-cephem-4-carbonsäure, 7-Amino.cephalosporansäure, 7-Aminodesacetoxycephalosporansäure, 7-Amino-3-(1-methyl-

, tetrazol-5-ylthiomethyl)-3-cephem-4~carbonsäure oder 7-Amino-3- _]

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(5-methyl-l ,3 ,4.-thiadiazol-2-ylthiomethyl) -3-cephem-4-carbonsäure verwendet.

verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als Cephalosporin Cefazolin verwendet.

9. Verfahren nach Anspruch 8_f dadurch gekennzeichnet, daß man als Kunstharz ein vernetztes Acrylsäureesterpolymerisat mit einer durchschnittlichen Porengröße von 250 S verwendet.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man die wäßrige Cefazolinlösung mit einem pH-Wert von 4 bis 6,5 mit dem Kunstharz in Kontakt bringt, auf einen pH-Wert von 6 bis 6;5 und sodann auf einen pH-Wert von 4 bis 4,6 einstellt und mit dem Elutionsmittel eluiert. ■ ■

11. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man die wäßrige Cefazolinlösung mit einem pH-Wert von 6 bis 6,5 mit dem Kunstharz in Kontakt bringt, auf einen pH-Wert von 4 bis 4,6 einstellt und anschließend mit dem Elutionsmittel eluiert.

12. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man als Elutionsmittel einen Acetatpuffer verwendet, der 0,1 m Natriumacetat, 0,1 m Essigsäure und 0,2 m Natriumchlorid enthält.

13. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man als Elutionsmittel einen Acetatpuffer verwendet, der 0,1 m Natriumacetat, 0,1 m Essigsäure und 0,2 m Natriumchlorid ent-

L hält. . ^J

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14. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man

(a) eine wäßrige Cefazolinlösung mit einem pH-Wert von 4 bis 6,5 mit einem vernetzten Acrylsäureesterpolymerisat mit einer durchschnittlichen Porengröße von 250 A in Kontakt bringt;

(b) die Aufschlämmung auf einen'pH-Wert von 4 bis 4,6 einstellt;

(c) das Cefazolin aus dem Kunstharz mit einem Acetatpuffer, der 0,1 m Natriumacetat, 0,1 m Essigsäure und 0,2 m Natriumchlorid enthält, eluiert;

(d) das Eluat über eine mit Aluminiumoxid beschickte Säule oderein Aluminiumoxidbett gibt;

(e) das nach dem Passieren des, Aluminiumoxids erhaltene, das

Cefazolin enthaltende Eluat mit einer Mineralsäure auf einen pH-Wert von 1,5 bis 2 ansäuert; und

(f) den erhaltenen Cefazolinniederschlag gewinnt.

15. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Kunstharz vernetztes Styrol-Divinylbenzol-Copolymerisat verwendet. .

16. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Kunstharz vernetztes Acrylsäureester-Polymerisat verwendet.

17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß man als Kunstharz vernetztes Acrylsäureester-Polymerisat mit einer durchschnittlichen Porengröße von 250 S verwendet.

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18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß man als Cephalosporin Cefazolin verwendet.

19. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man

(a) eine wäßrige Cefazolinlösung mit einem pH-Wert 4 bis 6,5 mit einem vernetzten Acrylsäureesterpolymerisat mit einer

durchschnittlichen Porengröße von 250 A in Kontakt bringt;

(b) die Aufschlämmung auf einen pH-Wert von 4 bis 4,6 einstellt;

(c) das Cefazolin vom Kunstharz mit einem Acetatpuffer, der 0,1 m Natriumacetat, 0,1 m Essigsäure und 0,2 m Natriumchlorid enthält, eluiert;

(d) die das Cefazolin enthaltende Eluatfraktion mit einer Mineralsäure auf einen pH-Wert von 1,5 bis 2 ansäuert!? und

(e) den erhaltenen Cefazolinniederschlag gewinnt.

20. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Cephalosporin Cefazolin, Cephalothin, .Cephaloridin, Cepha-. logylcin, Cephalexin, Cephradin, 7-Cyanoacetamidocephalosporan~ säure, 7-(4-Pyridylthioacetamido)-cephalosporansäure, 7-Mandelamido-3-(l-methyltetrazol-5-ylthiomethyl)-3-cephem-4-carbonsäure, 7-(3-Sydnonacetamido)-3-(5-methyl-l,3,4-thiadiazol-2-ylthiomethyl) -S-cephenv-^-carbonsäure, 7-Aminocephalosporansäure, 7-Aminodesacetoxycephalosporansäure, 7-Amino-3-(l-methyltetrazol-5-ylthiomethyl)-3-cephem-4-carbonsäure oder 7-Amino-3-(5-methyl-l,3,4-thiadiazol-2-ylthiomethyl)-3-cephem-4-carbonsäure verwendet.

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