Verfahren zur Herstellung neuer Derivate der 7-Aminocephalosporansäure mit antibiotischer Wirkung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung neuer Derivate der 7-Amino-cephalosporansäure, d. h.
der Verbindung, deren Struktur normalerweise wie folgt angegeben wird:
EMI1.1
Die neuen Verbindungen entsprechen der Formel
EMI1.2
worin R1 eine Alkoxy-, Alkylthio-, Acyloxy-, Acyl (z. B. Carbamoyl-), Carboxyalkyl-, Alkyl-, Hydroxy-, Amino- oder substituierte Aminogruppe oder ein Wasserstoff oder Halogenatom, R2 ein Wasserstoff- oder Halogenatom oder eine Alkoxy-, Alkylthio- Acyloxy-, Acyl- (z. B.
Carbamoyl-), Carboxyalkyl-, Alkyl-, Hydro- xy-, Amino- oder substituierte Aminogruppe, R8 ein Wasserstoffatom, ausser wenn R1 ein Wasserstoffatom ist, oder ein Alkyl-, Hydroxyalkyl-, N-Hydroxyalkylcarbamoyl- oder Alkanoyloxygruppe, wobeifidie Alkylantei 1 nicht mehr als 4 Kohlenstoffatome aufweisen, und x die Zahi 1 oder 2 bedeuten, wobei, wenn x = 2 ist, die beiden R3-Gruppen nicht gleich sein müssen. Wenn R; nicht Wasserstoff ist, können R1 und R2 gleich oder verschieden sein.
Die Verbindungen der Formel 2 erwiesen sich nicht nur als widerstandsfähig gegen den Angriff von Penicillinase erzeugenden Staphylococcen, sondern zeigen allgemein eine bessere Wirksamkeit gegen grampositive sowie gegen gramnegative Organis men. z. B. das N-(7-Phenyl-acetamido-ceph-3-em-3-yl- methyl)-pyridinium-4-carboxylat der Formel
EMI2.1
dessen antibiotische Wirksamkeit gegen grampositive Organismen bekannt ist und das ausserdem gegen den Angriff von Penicillinase erzeugenden Bakterien widerstandsfähig ist.
Von besonderem Interesse infolge ihrer Wirksamkeit gegen gramnegative Organismen, sind Verbindungen der Formel
EMI2.2
worin R eine Alkyl- oder Hydroxyalkylgruppe mit nicht mehr als 4 Kohlenstoffatomen bedeutet.
Verbindungen bei denen R. eine Amino- Hydroxy-.
Carbamoyl-, Carboxyalkyl- oder Acyloxygruppe und R2 Wasserstoff ist, sind infolge ihrer inte essanten Wirksamkeit gegen gramnegative Organismen besonders wichtig.
Weiter Vergindungen Yon besonderem Interesse sind solche der Formel
EMI2.3
worin R5 eine Acyloxy- oder N-Hydroxyalkyl-carba- moylgruppe bedeutet.
Das erfindungsgemässe Verfahren ist dadurch gekennzeichnet. dass man eine Verbindung der Formel
EMI2.4
worin R ein Wasserstoffatom oder die Gruppe R1-#-CH2-CO-
R2 bedeutet. oder ein wasserlösliches Salz davon, in einem stark polaren Medium mit einer nukleophilen Verbindung der Formel
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umsetzt und die erhaltene Verbindung, wenn R ein Wasserstoffatom ist, mit einer die Gruppe
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abgebenden Verbindung phenylacetyliert.
Vorzugsweise setzt man eine Verbindung der Formel
EMI3.2
oder ein wasscrlösliches Salz davon, in einem stark polaren Medium mit einer nukleophilen Verbindung der obigen Formel 4 um.
Als Salze von Verbindungen der Formel 3 sind beispielsweise Natrium-, Kalium- oder Ammoniumsalze geeignet. Wasser ist im allgemeinen ein geeignetes polares Medium, doch kann in den Fällen, wo die nukleophile Verbindung in Wasser nicht gut löslich ist, ein mit Wasser mischbares organisches Lösungsmittel wie N,N Dimethylformamid oder Aceton zugegeben werden, obschon dies zu einer Verminderung der Ausbeute führen kann.
Die Reaktionstemperatur beträgt zweckmässig mindestens 15 C, im allgemeinen jedoch weniger als 70 OC.
Die Reaktionsdauer hängt von der Reaktionstemperatur ab, kann jedoch durch einfache Vorversuche ermittelt ,werden.
Die Ausgangsstoffe werden vorteilhaft in einem Verhältnis von etwa 1 Moläquivalent der Verbindung der Formel 3 zu 1 bis 10 Moläquivalenten der nukleophilen Verbindung der Formel 4 verwendet. Das pH der Lösung wird zweckmässig zwischen 5 und 8, vorzugsweise zwischen 6 und 7 gehalten. Nötigenfalls soll das pH der Lösung durch Zugabe eines Puffermittels wie Ammoniumacetat, auf den gewünschten Wert eingestellt werden; falls ein Alkalimetallsalz der Verbindung der Formel 3 verwendet wird, kann zu diesem Zwecke beispielsweise Essigsäure zugegeben werden.
Das Umsetzungsprodukt kann dann aus dem Reak tionsgemisch, welches beispielsweise unveränderte Verbindung der Formel 3 oder andere Stoffe enthalten kann, mittels konventioneller Verfahren, wie Kristallisa- tion, Elektrophorese, Papierchromatographie oder Behandlung mit einem Ionenaustauscherharz, abgetrennt werden.
Zweckmässig geht man so vor, dass man einen Überschuss der Verbindung der Formel 4 mit der Verbindung der Formel 3 in Wasser umsetzt, bis die optimale Ausbeute des gewünschten Produkts der For mel 2 erreicht ist. Der Überschuss an Verbindung der
Formel 4 und ein Teil der nichtreagierten Verbindung 3 wird dann mit einem organischen Lösungsmittel, z. B.
Methylenchlorid, extrahiert und die übrigbleibende Lösung zwecks Entfernung von freien Carboxylverbindun gen, einschliesslicih des Restes der nichtreagierten Verbindung der Formel 3, durch ein Ionenaustauscherharz, z. B. in Acetatform, durchfliessen gelassen. Die erhaltene Lösung wird dann konzentriert, z. B. in einem rotierenden Eindampfer, und Gefriergetrocknet. Der Rückstand kann dann aus einem geeigneten Lösungsmittel, z. B. Methanol, kristallisiert oder durch Fällung gereinigt werden, beispielsweise aus einer methanoli- schen Lösung durch Zugabe von Aceton.
Die Verbindungen der obigen Formel 3 können durch Umsetzung von 7-Amino-cephalosporansäure mit einem geeigneten Phenylacetylierungsmittel hergestellt werden. Zweckmässige Phenylacetylierungsmittel sind im allgemeinen solche des Typs, oder Analoge davon, wie er für die Phenylacetylierung von Aminoamiden, z. B. Peptiden, geeignet ist; dazu gehören besonders Phenylacetyl-halogenide, insbesondere die Chloride oder Bromide, und gemischte Anhydride, beispielsweise die von einer Phenylessigsäure und einem Alkylhalogenformiat abgeleiteten. Die Acylierung wird zweckmässig in einem wässrigen Medium durchgeführt, z. B. einem wässrigen mit Wasser mischbaren Keton, wie Aceton, oder wässrigem Tetrahydrofuran, vorzugsweise in Gegenwart eines säurebindenden Mittels, z. B. Natriumbicarbonat.
Das pH wird während der Umsetzung vorzugsweise zwischen 5 und 7 gehalten; diese kann bei Temperaturen von 0 bis 25"C durchgeführt werden.
Die Acylierung kann auch in einem organischen Lösungsmittel, z. B. Aethylacetat, durchgeführt werden, beispielsweise durch einfaches Erhitzen am Rückfluss.
Andererseits kann man die Verbindungen der Formel 2 so herstellen, dass man zuerst 7-Amino-cephalosporansäure mit der gewählten Verbindung der Formel 4 zu einer Verbindung der Formel
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umsetzt und diese darauf mit einem geeigneten Phenylacetylierungsmittel acyliert. Diese Umsetzung kann im allgemeinen unter den gleichen Bedingungenldurchge- führt werden, wie sie oben für die Durchführung der @@@@@@ nukleophilen und der Acylierungsreaktionen in der bevorzugten Reihenfolge beschrieben sind.
Die Verbindung der Formel 5 kann aber auch aus einer Verbindung (1er formel
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nach den für die Umwandlung von Cephalosporin-C in 7-Aminocephalosporansäure bekannten Verfahrensweisen hergestellt werden. Die Verbindung der Formel 6 kann aus Cephalosporin-C durch Umsetzung mit nukleophilen Verbindungen der Formel 4 nach Verfahrensweisen, die den oben für die Umsetzung von Verbindungen der Formel 3 mit Verbindungen der Formel 4 beschriebenen analog sind, hergestellt werden.
Die Namensgebung der hier offenbarten spezifischen quaternären Ammoniumverbindungen erfolgt unter Bezug auf die Substanz Cepham (vgl. J.Am.Chem.Soc., 84, 1962, 3400).
Eine Verbindung von besonderer Wichtigkeit ist das N-67-Phenyl-acetamido-ceph-3 -em-3-yl-methyl)-2,4-di- methyl-pyridlnium- 4-carboxylat der Formel
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Diese Verbindung zeigte in vivo ausgesprochene biologische Wirksamkeit gegen Staph. aureus, E. coli, B.
proteus und Salmonella sp. Ebenso wie die gegen penicillinempfindliche Stämme von Staph. aureus wirksam war, war sie auch gegen penicillinresistente Stämme dieses Organismus wirksam. Sie erwies sich auch als sehr widerstandsfähig gegen staphylococcische Penicillinase. Die Verbindung erhielt in vivo auch hohe Serumspiegel aufrecht. Zu den weiteren Vorteilen dieser Verbindung gehören die gegenüber der Verbindung der Formel Ia grössere Stabilität in vivo und die grössere Wasserlöslichkeit.
Die neuen Verbindungen können ganz analog wie andere Antibiotika, wie Penicillin und Neomycin, in eine zur Verwendung in der Human- und Veterinärmedizin geeignete Form gebracht werden. Solche Präparate können nötigenfalls die üblichen Trägerstoffe und Grundrinassen aufweisen.
Die Verbindungen können daher zu injizierbaren Zubereitungen verarbeitet werden, indem sie in einem geeigneten Medium. z. B. sterilem, pyrogenfreiem Wasser, gelöst oder suspendiert werden oder aber zu trockenen Präparaten, die zur Bereitung von injizierbaren Präparaten geeignet sind. Die Verbindungen können auch mit zu diesem Zweck geeigneten Grundmassen zu Zubereitungen für topische Anwendung, wie Lotionen, Salben, Cremen, verarbeitet werden oder in eine für orale Verabreichung geeignete Form gebracht werden.
Für;die Veterinärmedizin können die Verbindungen in einer in der Veterinärmedizin üblichen Weise zu Präparaten verarbeitet werden, insbesondere zu injizierbaren Zeraten.
Die neuen Verbindungen können kombiniert mit anderen antibakteriellen Antibiotika, insbesondere Penicillinen, wie Penicillin G, und/oder Tetracyclinen verwendet werden.
In den folgenden Beispielen bezieht sich die Ultra- violettabsorption auf Lösungen in Wasser oder wässrigem Phosphatpuffer bei pH 6,0.
Die Papierchromatographie in den Beispielen 1-15, 16b und 23 wurde an mit 0,1 m Natriumacetat auf pH 5 gepuffertem Papier Whatman No. 1 durch geführt. Das Lösungsmittelsystem war Aethylacetat (8 Volumenteile), n-Butanol (1 Volumenteil), 0,1 m Natriumacetat (8 Volumenteile); es wurde mit absteigendem Lösungsmittel gearbeitet.
In den anderen Beispielen wurde die Papierchromatographie ebenfalls an Wathman No. 1 -Papier durchgeführt, das entweder, bei Verwendung eines Lösungsmittelsystems aus n-Butanol (4 Volu7nenteile), Wasser (5 Volumenteile), Aethanol (1 Volumenteil), auf pH 6, oder bei Verwendung von Aethylacetat auf pH 5 gepuffert war.
Die Elektrophorese wurde an Whatman 3MM Papier bei einem Gradienten von 10-30 V/cm durchgeführt. Als Pufferlösungen dienten: (a) für pH 1,9: Essigsäure (84 Volumenteile), Ameisensäure (17 Volumenteile), Aceton (105 Volumenteile), Wasser (495 Volumenteile); (b) für pH 7: 0,05 m Dinatriumhydrogenphosphat, wobei das pH mittels Phosporsäure eingestellt wurde.
Die Fraktionen wurden auf den Chromatogrammen und Elektrophoretogrammen bei der Bestrahlung mit ultraviolettem Licht als dunkle Flecken festgestellt.
Zwitterionen liefern als Basen bei der Elektrophorese bei pH 1,9, wurden jedoch bei pH 7 nicht bewegt.
Beispiel 1 N-(7-Phenyl-acetamido-ceph-3-em-3-yl-methyl)-2'methylpyridinium-4-carboxylat.
a-Picolin (12,5 ml, 10 Aequivalente) wurde unter Rühren zu einer Suspension von 7-Phenyl-acetamidocephalosporansäure (5 g) in Wasser (45 ml) zugegeben; die Säure löste sich unter Bildung einer Lösung mit pH 6,8 auf. Diese Lösung wurde unter Stickstoff bei 46 C während 16 Stunden stehen gelassen und dann mit Methylenchlorid (4 x 20 ml) extrahiert. Die Lösung wurde nach Konzentration in einem rotierenden Verdam pfer bei Temperaturen unter 40 0C absteigend durch eine Kolonne mit Dowex-l -Ionenaustauscherharz im Acetatzyklus geschickt. Eluate, welche das gewünschte α-Picolin-Derivat (polarimetrisch bestimmt) enthielten, wurden vereinigt und gefriergetrocknet.
Eine Lösung des gefriergetrockneten Feststoffs (937 mg) in einer geringen Menge Aceton (ca. 2 ml) wurde langsam zu einem grossen Volumen Aceton (ca. 500 ml), das magnetisch gerührt wurde, gegeben. Dabei wurde das gewünschte α-Picolin-Derivat als ein feiner weisslicher Feststoff ausgefällt (671 mg, 12 %), der folgende Eigenschaften laufwies: 1 % - 307@ [α]25 # max. 263,5 my (E 1 cm = 307), [α]D@@ = + 108 (c = 0,825;
Wasser);
Für C22H21N3O4S.3 H2O ber.:
C 55,3% H 5,7 % N 8,8% S 6,7% gefunden:
C 54,9% H 5,55% N 9,0% S 6,3%
C 55,6% H 5,7 % N 9,7%
In ähnlicher Weise wurden die folgenden substituierten Pyridin-Derivate aus 7-Phenyl-acetamido-cephalo- sporansäure hergestellt: Beispiel Pyridine Ausbeute ? max. 1 /o [α]D Nr.
Substituent(en) % m 1 cm (Wasser)
2 3-Methyl 18 260 266 + 410
3 4-Methyl 15 254-255 288 + 61
4 2,3-Dimethyl 19 257 287 +107
5 2,4-Dimethyl 18 261 301 +107
6 2,5-Dimethyl 12 267-268 281 +146
7 2,6-Dimethyl 8 257 262 + 640
8 3,4-Dimethyl 7 259 277 + 61
9 3,5-Dimethyl 8 264-265 260 + 600 10 2-Athyl 13 264-265 300 + 96 11 4-Sithyl 9,3 253-254 285 + 66 12 4-n-Propyl 4 255 258 + 92 13 3-Äthyl-4-methyl 14 259 252 14 2-Hydroxymethyl 19 261 275 + 64 15 3-Hydroxymethyl 30 260 294 Analysen der erhaltenen Derivate:
Beispiel 2 Für C22H21N3O4S.5¸H2O ber.: C 50,6 0/0 H 6,2% N 8,0 0/0 S 6,1 0/0 gef.: C 50,1% H 5,4% N 10,0% S 6,6%
C 50,7% H 5,7% N 10,2%
Beispiel 3 Für C22H21N3O4S ber.:
C 62,4% H 5,0% N 9,9% S 7,6% gef.: C 63,5% H 5,7% N 10,0% S 6,7%
C 63,3% H 5,6%
Beispiel 4 Für C23H23N3O4S.2¸ H2O ber.: C 57,3% H 5,9% N 8,7% S 6,7% gef.: C 57,7% H 5,6% N 8,8% S 7,1%
C 57,40/o H 5,60/o
Beispiel 5
Für C23H23N3O4S.2H2O ber.: C 58,3% H 5,8% N 8,9% S 6,8% gef.: C 58,6% H 6,4% N 9,7% S 6,3%
C 58,2% H 6,6% N 9,3%
C 58,4% H 6,7%
Eine andere Probe hatte A max. 262 m .
(E1 cm1 % = 271).
Für C23H23N3O4S.3H2O ber.: C 56,2% H 6,0% N 8,5% S 6,5% gef.: C 56,1% H 5,7% N 8,9% S 6,9%
Eine dritte, aus Methanol kristallisierte Probe hatte A max. 1 0/0 260-261 m (E1 cm1 @ = 364), [α]D = +130 (c = 1,0; Wasser);
Für C23H23N3O4S.¸H2O ber.: C 61,9% H 5,4% N 9,6% S 7,2% @ @@@@ @ @@@@ @ @@@@ @ @@@@ gef.: C 62,40io H 5,4 0/0 N 9,4 0/0 S 7,1 %
C 62,0 0/o H 5,3 0/o
Beispiel 6 Für C23H23N3O4S.1¸H2O ber.: C 59,6 % H 5,6 % N 9,1 % S 6,9 % gef.: C 59,1 % H 6,8 % N 9,1 % S 7,2 %
C 60,5 % H 7,0 0/o
Beispiel 7
Für C23H23N3O4S.4H2O ber.: C 54,2 % H 6,1 % N 8,3 % S 6,3 % gef.:
C 54,1 % H 5,5 % N 8,6 % S 6,9 %
C 54,1 % H 5,9 /o
C 54,0 o H 6,0 %
Beispiel 8
Für C23H23N3O4S.2¸H2O ber.: C 57,3% H 5,9 0/0 N 8,7 0/0 S 6,7% gef.: C 57,1 % H 5,8 % N 8,7 % S 6,9 %
Beispiel 9
Für C23H23N3O4S.4H2O ber.: C 54,2 % H 6,1 % N 8,3 % S 6,3 % gef.: C 53,4 % H 6,1 % N 9,2 % S 6,3 %
C 54,2 % H 5,6 % N 9,4 %
Beispiel 10
Für C23H23N3O4S.3H2O ber.: C 56,2 % H 6.0 % N 8,5 % S 6,5 % gef.: C 56,6 % H 5,9 % N 9,10/o S 6,60/o
N 9,3 %
Beispiel 11
Für C23H23N3O4S.2H2O ber.: C 58,3 % H 5,8 0/0 N 8,9 0/0 S 6,80/o gef.:
C 58,0 % H 5,7 0/0 N 8,7 0/0 S 6,5 0/0
C 57,9 % H 5,6 %
Beispiel 12 icht ermittelt.
Beispiel 13
Für C23H25N3O4S.3H2O ber.: C 57,0 % H 6,2 % N 8,3 % S 6,3 % gef.: C 56,6 0,0 H 6,0 % N 9,3 % S 6,2 0/0
N 9,3 %
N 10,3 %
Beispiel 14
Für C22H21N3O5S.4H2O ber.: C 51,7 /o H 5,70/0 N 8,2 % S 6,3 % gef.: C 51,5 % H 5,60/o N 9,9 % S 6,50/o
N 9,4 %
Beispiel 15
Für C22H21N3O5S ber.: C 60,1 % H 4,8 % N 9,6 % S 7,3 % gef.: C 59,4 % H 5,0 % N 10,5 % S 6,1 %
N 10,0 %
Beispiel 16(a) 7-(p-Methoxy-phenyl-acetamido)- cephalosporansäure.
Zu einer gerührten Lösung von 7-Aminocephalosporansäure (20 g) und Natriumbicarbonat (25 g) in wässrigem Aceton (60 %, 400 ml), welche auf 0 C gehalten wurde, wurde p-Methoxyphenylacetylchlorid (15 g) in Aceton (100 ml) im Verlaufe von 10 Minuten zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde während weiterer 40 Minuten bei 0 C und dann eine Stunde bei Umgebungstemperatur gerührt; dann wurde das Aceton unter vermindertem Druck entfernt. Die wässrige Lösung wurde mit Diäthyläther (100 ml) gewaschen und mit konzentrierter Salzsäure auf pH 1 angesäuert. Der feste Niederschlag wurde mit Aethylacetat (3 x 150 ml) extrahiert, das Aethylacetat gut mit Wasser gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet.
Das Lösungsmittel wurde abdestilliert, bis das Volumen 100 ml betrug; dann wurde die Lösung bei 0 C stehen gelassen. Die Kristalle von 7-(p-Methoxy-phenyl-acetamido)- cephalosporansäure wurden gesammelt und bei 40 C während einer Stunde getrocknet. Ausbeute: 14,6 g (47,2 %).
Aequivalentgewicht:
C19H20O7N2S ber.: 420 gef.: 420 (Titration) # max. bei 225 m (E1 cm1 % = 339) # max. bei 262 m (E1 cm1 % = 234)
Rf = 0,65 (Butanol-System).
In ähnlicher Weise wurden die folgenden substituierten Phenyl-acetamido- cephalosporansäuren aus 7-Amino-cephalosporansäure hergestellt:
Bei- Substituent Ausbeute Rf* .imgax. 1 /o Aequivalentgew.
spiel % m E1 cm ber. gef.
17(a) p-Acetoxy 84,5 0,63 260 190 448 454 18!(a) p-Fluor 82,2 0,75 260 204 408 409
19(a) p-Chlor 90 0,70 260 204 425 427 825 333
20(a) p-Brom 84 0,85 260 204 469 470
21(a) p-Acetyl 76 0,72 252 556 432 445
22(a) 3,4-Dimethoxy 73,3 0'53 23662 283 @@(a) 3,4-Dimetnoxy @5,5 0,55 266 221 450 450 * Butanol-System.
Beispiel 16(b)
N-[7-(p-Methoxy-phenyl-acetamido)-ceph-3-em-3 yl-methyl] -pyridinium-4-carboxylat.
Pyridin (4,73 ml, 5 Aequivalente) wurde unter Rüh ren zu einer Suspension von 7-(p-Methoxy-phenyl acetamido)-cephalosporansäure (5 g) in Wasser (45 ml) zugegeben; die Säure löste sich unter Bildung einer
Lösung vom pH 5,7 auf. Diese Lösung wurde unter
Stickstoff bei 46 C während 16 Stunden stehen gelassen und dann mit Methylenchlorid (4 x 20 ml) extrahiert. Die Lösung wurde nach Konzentration in einem rotierenden Eindampfer bei Temperaturen unter 40 OC, wobei alles Methylenchlorid entfernt wurde, absteigend durch eine Kolonne mit Dowex-1 -Ionenaustauscherharz im Acetatzyklus geschickt. Eluate, welche das gewünschte Pyridinium-Derivat (polarimetrisch be stimmt) enthielten, wurden vereinigt und gefriergetrock net.
Verreiben des gefriergetrockneten Feststoffes mit
Methanol (ca. 5 ml) ergab das Pyridinium-Derivat als weissen Feststoff (1,174 g, 22,4 0/o) mit folgenden
Eigenschaften: # max. 258 m E1 cm1 % = 327); [α]D = +700 (c = 1,0); R 7 PACA/Pyridin 1,0; für C22H21N3O5S.¸H2O ber.: C 58,9 !o H 4,95 % N 9,4 0/0 S 7,15% gef.:
C 58,4 % H 4,9 % N 8,8 % S 7,1 %
In ähnlicher Weise wurden die folgenden Pyridinium-Derivate aus substituierten Phenylacetamido- cephalosporansäuren hergestellt:
Beispiel Substituent Ausbeute A max. @ 1 % Rf* Rf**
Nr. % m E1 cm
17(b) p-Acetoxy 49 258 198 0,00 0,70
18(b) p-Fluor 13,6 260 200 0,00 0,65 19(b) p-Chlor 23,2 259 170 0,00 0,52 230 313 20(b) p-Brom 37 258 204 0,00 0,40 21(b) p-Acetyl 28 251 551 0,00 0,18
230 240 22(b) 3,4-Dimethoxy 42 258 198 @, 0,00 0,13 * Aethylacetat-System ** Rf Ider ursprünglichen Cephalosporansäure.
Beispiel 23
N-[7-(p-Methoxy-phenyl-acetamido)-ceph-3-em-3 yl-methyl] -2'-methyl-pyridinium4-carboxylat.
a-Picolin (5,55 ml, ca. 5 Aequivalente) wurde unter
Rühren zu einer Suspension von 7-(p-Methoxy-phenyl- acetamido)-cephalosporansäure [5 g, hergestellt wie in
Beispiel 16(a)] in Wasser (45 ml) zugegeben; die Säure löste sich unter Bildung einer Lösung vom pH 6,6 auf.
Diese Lösung wurde unter Stickstoff bei 46 C während
16 Stunden stehen gelassen und dann mit Methylenchlo rid (4 x 20 ml) extrahiert. Die Lösung wurde nach Konzentration in einem rotierenden Verdampfer bei Temperaturen unter 40 C absteigend durch eine Kolonne von Dowex-1 -Ionenaustauscherharz im Acetatzyklus geschickt. Eluate, welche das gewünschte a-
Picolin-Derivat (polarimetrisch bestimmt) enthielten, wurden vereinigt und gefriergetrocknet. Die Lösung des gefriergetrockneten Feststoffs in einer geringen Menge
Methanol (ca. 2 ml) wurde langsam zu einem grossen
Volumen Aceton (ca. 500 ml), welches magnetisch gerührt wurde, zugegeben.
Dabei wurde das gewünschte α-Picolin-Derivat als ein weisslicher Feststoff ausgefällt (937 mg, 17,9%), der folgende Eigenschaften aufwies:
1 % Ä max. 265 my (E 1 cm = 316), [α]D = +1220 (c = 0,96), R 7 PACA!Pyridin 1,13;
Für C23H23N3O5S.2H2O ber.: C 56,4 0/0 H 5,5 0/0 N 8,6 /o S 6,5 /o gef.: C 56,3 0/0 H 5,5 0/o N 8,8% S 6,8 %
Beispiel 24 N-[7-p-Aminophenyl-acetamido)-ceph-3-em-3-ylmethyl] -pyridinium-4-carboxylat.
(a) p-Nitrophenylessigsäure wurde in ihr Säurechlorid übergeführt und mit 7-Aminocehalosporansäure zur 7-(p-Nitrophenylacetamido)-cephalosporansäure mit 85-%iger Ausbeute kondensiert, wie dies im Patent Nr.
515 274 beschrieben ist.
(b) 7-(p-Nitrophenyl-acetamido)- cephalosporansäure (5,0 g) wurde in wässrigem Pyridin (10%, 50 ml) gelöst und bei 50 C während 16 Stunden reagieren gelassen. Die entstandene Lösung wurde mit Dichlor- methan (2 x 30 ml) gewaschen und auf eine Kolonne x eines Ionenaustauscherharzes ( Dowex-1 , Acetatzyklus, 100 ml) gegossen; die Kolonne wurde mit Wasser gewaschen und total 350 ml Eluate gesammelt, vereinigt und gefriergetrocknet, wobei das Pyridinium-Derivat erhalten wurde (1,80 g 34 /o).
# max. 262-263 m ,max. E1 cm1 % = 300 (wässrige Lösung 0,002 %)
Rf (Aethylacetat-System) = 0,00 (c) N-[7-p-Nitrophenyl-Acetamido)-ceph-3-em-3-ylmethyl]-pyridinium-4-carboxylat (1,0 g) wurde in Was 3er (20 ml) gelöst und die Lösung unter Wasserstoff bei einem Druck von 4,2 at in Gegenwart von Palladium auf Kohle (5 %, 1,0 g) während 5 Stunden geschüttelt. Der Katalysator wurde durch Filtration entfernt und das klare Filtrat gefriergetrocknet, wobei N-[7-p-Aminophenyl-acetamido)-ceph-3-em-3-yl-methyl]-pyridi @ium-4-carboxylat (400 mg, 42,8%) erhalten wurde.
# 242 m ,max.E1 cm1 % = 250 # 268 m , Inflexion E 1 cm 1 % = 168 (wässrige Lösung (0,003%) Rf (Butanol- und Aethylacetat-Systeme) = 0,00
Beispiel 25 @-[7-p-Hydroxyphenyl-acetamido)-ceph-3-em-3- 1-methyl] -pyridinium-4-carboxylat.
7-(p-Hydroxyphenyl-acetamido)- cephalosporansäu e wurde wie in Beispiel 24 in das Pyridinium-Derivat @it 24.5-0/oiger Ausbeute übergeführt.
# 258 m max. E1 cm1 %= 215 (wässrige Lösung
0,0025 %) R@ (Aethylacetat-System) = 0,00
Beispiel 26 @-[7-(p-Methylphenyl-acetamido)-ceph-3-em-3 @-methyl]-pyridinium-4-carboxylat.
p-Methylphenylessigsäure (0,55 g) wurde in ihr Säu chlorid übergeführt und mit 7-Amino-cephalosporan äure (1,0 g) in wässrigem Aceton in Gegenwart eines @berschusses an Natriumbicarbonat kondensiert wobei -(p-Methylphenyl-acetamido)-cephalosporansäure
1,10 g, 73 0;o) erhalten wurde.
1% Ä 255 mir max. E 1 cm = 255 (methanolische Lösung 0,003%)
Rf (Butanol-System) 0,79.
7-(p-Methylphenyl-acetamido)- cephalosporansäure (0,9 g) wurde wie in Beispiel 24 in das Pyridinium Derivat mit 21-%iger Ausbeute umgewandelt.
1%
A 256 mir max. E1 cm = 255
Rf (Aethylacetat-System) = 0,00
Beispiel 27 N- [7-p-Carbamoyl-phenyl-acetamido)-ceph-3-em-3yl-methyl] -pyridinium-4-carboxylat.
p-Carbamoyl-phenylessigsäure wurde nach der von Mellinghoff, Ber. 22, 1889, 3207, beschriebenen Methode hergestellt. Umsetzung mit Thionylchlorid ergab ein unreines Säurechlorid, welches bei der Umsetzung mit 7 Amino-cephalosporansäure 7-(p-Carbamoyl-phenylacetamido)- cephalosporansäure als kristallinen Feststoff (15,7%) ergab.
# 234 m max. E1 cm 1 % = 434 # 260 m Plateau E1 cm1 % = 243 (Natriumsalz in Wasser 0,002 %)
Rr (Butanolsystem) = 0,39.
7-(p-Carbamoyl-phenyl-acetamido)-cephalosporansäure wird wie in Beispiel 24 in Pyridinium-Derivat mit 34-%iger Ausbeute übergeführt.
# 240 m max. E1 cm1 % = 412) (wässrige Lösung 0,002 %)
Rr (Aethylacetat-System) = 0,00
Beispiel 28 N-[7-(p-Methyl-mercaptophenyl-acetamido)-ceph3-em-3-yl-methyl] -pyridinium-4-carboxylat.
p-Methyl-mercaptophenylessigsäure (Smp.
99-100 OC, 1,6g) wurde mit Thionylchlorid in ihr Säurechlorid übergeführt und in wässrigem Aceton in Gegenwart eines Überschusses an Natriumbicarbonat mit 2 g 7-Amino-cephalosporansäure kondensiert. Es wurden 7-(p-Methyl-mercaptophenyl-acetamido)- cephalosphoransäure 2,7 g mit 84,4-0/oiger Ausbeute er halten.
# 260 m max. E1 cm1 % (Natriumsalz in Wasser 0*002 %) Rr (Butanol-System) = 0,82 7-(p-Methyl-mercaptophenyl-acetamido)- cephalosporansäure wurde mit 31-%iger Ausbeute ins Pyridinium-Derivat übergeführt.
1 < > /o @ 2@0 m max.E1 cm = @@@ (wässrige Lösung 03002 !o)
Rr (Aethylacetat-System) = 0,00
Beispiel 29 N-[7-(p-Carboxymethyl-phenyl-acetamido)-ceph-3 em-3-yl-methyl] -pyridinium-4-carboxylat.
Benzol-p-diessigsäure (3,4 g) wurde am Rückfluss während 21 ;s Stunden mit Thionylchlorid erhitzt und das Thionychlorid dann entfernt. Das gebildete Säurechlorid wurde mit 7-Amino-cephalosporansäure (4,0 g) in Ge Gegenwart eines Überschusses an Natriumbicarbonat in wässrigem Aceton kondensiert, wobei 7-(p-Carboxyme- thyl-phenylacetamido)-cephalosporansäure (3,6 g, 54,7 /o) tals weisser kristalliner Feststoff erhalten wurde.
# 262 m max.E1 cm1 % = 220 (Natriumsalz in Wasser 0,005 %)
Rf (Butanol-System) = 0,19.
7-(p-Carboxymethyl-phenyl-acetamido)-cephalosporansäure wurde wie in Beispiel 24 (unter Weglassung der Behandlung mit dem Ionenaustauscher ) in das Pyridiniumderivat in 78-0/oiger Ausbeute übergeführt.
# 256 m m max.E1 cm1 % = 185 (wässrige Lösung 0,005 %) Rf (Butanol-System) = 0,10.
Beispiel 30 N-[7-p-Acetoxy-phenyl-acetamido)-ceph-3-em-3yl-methyl]-4'-methyl-pyridinium-4-carboxylat.
7-(p-Acetoxyphenyl-acetamido)- cephalosporansäure (4,0 g) y-Picolin (4,0 ml) und Wasser (36 ml) wurden bei 50 0C während 16 Stunden reagieren gelassen; die abgekühlte Lösung wurde mit Wasser (20 ml) verdünnt und mit Methylenchlorid (2 x 30 ml) gewaschen. Die wässrige Phase wurde von einer geringen Menge Gummi getrennt auf eine Kolonne von Dowex-1- Ionenaustau- scherharz im Acetatcyclus gegossen. Die Kolonne wurde mit Wasser gewaschen, die Eluate gesammelt (total 250 ml) und unter vermindertem Druck auf 5 ml eingekocht. Die konzentrierte wässrige Lösung wurde mit Methanol (5 ml) verdünnt und in Aceton (500ml) gegossen. Der weisse Niederschlag wurde gesammelt, mit Aceton und Diäthyläther gewaschen und im Exsikkator getrocknet.
Ausbeute 1,43 g (33,2%) # 256 m max. E1 cm1 % = 242 (0,002 % in 50 %igem wässrigem Methanol)
Rf (Aethylacetat-System) = 0,00
Beispiel 31 N-[7-(p-Acetoxy-phenyl-acetamido)-ceph-3-em-3 yl-methyl]-2'-methyl-pyridinium-4-carboxylat.
Diese Verbindung wurde nach der in Beispiel 30 beschriebenen Methode hergestellt.
Ausbeute: 35,1 % # 263 m max. E1 cm1 % = 260,5 (0,002 % in 50 %igem wässrigem Methanol)
Rf Aethylacetat-System) = 0,00
Beispiel 32 N- [7-(p-Acetoxy-phenyl-acetamido)-ceph-3-em-3yl-methyl]-2',4'-dimethyl-pyridinium-4-carboxylat.
Diese Verbindung wurde nach der in Beispiel 30 beschriebenen Methode hergestellt.
Ausbeute: 34,8% # 262 m max. E1 % 1 cm = 250 (0,002 % in # 262 m max. E 1 cm - 250 (0,002 /o in 50- %igem wässrigem Methanol)
Rf (Aethylacetat-System) = 0,00
Beispiel 33(a) N-[7-(p-Nitrophenyl-acetamido)-ceph-3-em-3-ylmethyl]-N'-4'-hydroxymethyl-carbamoyl-pyridinium4-carboxylat.
7-Cp-Nitrophenyl-acetamido)-cephalosporansäure (10,0 g) wird in warmem, N-Hydroxymethylisonicotina- rapid (7,0 g) enthalten.dem Wasser (120 ml) gelöst und die Lösung während 17 Stunden bei 50 C gehalten. Nach dem Abkühlen wurde die Lösung mit Methylenchlorid (2 x 50 ml) gewaschen und auf eine Kolonne von Do wex-1 -Ionenaustauscherharz in der Acetatform gegossen. Die Kolonne wurde mit Wasser (250 ml) gewaschen, das Wasser unter vermindertem Druck bis auf 10ml abdestilliert und sorgfältig in Aethylalkohol (400 ml) gegossen.
Das N-Hydroxymethyl-isonicotinamid-Derivat wurde gesammelt, mit Aethanol und Diäthyläther gewaschen und getrocknet.
Ausbeute: 2,27 g (18,7 %) # 267 m max. E1 cm1 % = 327 (0,003 in Wasser)
Rf (Butanol-System) = 0,40
Rf (Aethylacetat-System) = 0,00
Beispiel 33(b) N-[7-(p-Aminophenyl-acetamido)-ceph-3-em-3-ylmethyl] -N'-4'-hydroxymethyl-carbamoyl-pyridinium-4-carboxylat.
N-[7-(p-Nitrophenyl-acetamido)-ceph-3-em-3-ylmethyl]-N'-4'-hydroxymethyl-carbamoyl- pyridinium-4carboxylat (1,95 g) wurde in Wasser (100 ml) gelöst und in eine Wasserstoffatmosphäre bei 4,2 at in Gegenwart von Palladium auf Kohle (10 % Pd, 2,2g) während 5 Stunden geschüttelt. Die filtrierte Lösung, die beinahe farblos war, an der Luft jedoch schnell dunkel wurde, wurde gefriergetrocknet und der erhaltene Feststoff aus wässrigem Aceton gefällt, wobei das Amin erhalten wurde.
Ausbeute: 880 mg (47,9 %) # 241 m max. E1 cm1 % = 252 Ä 260-270 mii Inflexion = 215 (0,005 0/0 in Wasser) Rf (Butanol-System) = 0,07
Rf (Aethylacetat-System) = 0,00
Beispiel 34 N-[7-(p-Hydroxyphenyl-acetamido)-ceph-3-em-3yl-methyl]-N'-4'-hydroxymethyl-carbamoyl-pyridinium-4-carboxylat.
7-(p-Hydroxyphenyl-acetamido)- cephalosporansäure (4,72 g) wurde in Aceton (5 ml) gelöst und zu einer Lösung von N-Hydroxymethyl-isonicotinamid (3,66 g) in Wasser (35 ml) gegeben. Das Gemisch wurde während 17 Stunden bei 50 C gehalten und dann abkühlen gelassen. Nach dem Waschen mit Methylenchlorid (2 x 25 ml) wurde die wässrige Lösung auf einer Kolonne von Dowex-1 -Ionenaustauscherharz in der Acetatform gegossen; dann wurde Wasser (250 ml) nachgegossen. Die wässrige Lösung wurde gesammelt, unter vermindertem Druck auf 10 ml eingedampft und zu Aceton (300 ml) gegeben, wobei das N-Hydroxymethyl isonicotinamid-Derivat als sehr feiner Niederschlag erhalten wurde.
Ausbeute: 0,783 g (13,5 %) # 263 m max. E1 cm1 % = 240 (0,003 % in Was Ser)
Rf (Aethylacetat-System) = 0,00 (Ausgangsmaterial: Rf = 0,09).
Beispiel 35 N- [7-(p-Acetoxyph en yl-acetami do)-ceph3 -em-3 -yl- methyl]-N'-4'-hydroxymethyl-carbamoyl-pyridi nium-4-carhoxyl at.
7-(p-Acetoxyphenyl-acetamido)- cephalosporansäure (8,8 g) wurde wie in Beispiel 33(a) mit N-Hydroxymethyl-isonicotinamid (6,15 g) zum N-Hydroxymethylisonicotinamid-Derivat umgesetzt.
Ausbeute: 2,32 g (21,9 %) # 264 m max. E1 cm1 % = 218 (Wasser 0,003 %) Ri (Aethylacetat-System) 0,00
Rf(Butanol-System) = 0,18 (Ausgangsmaterial Rf = 0,70).
Beispiel 36(a) 7-(p-Valeryl-oxyphenyl-acetamido)-cephalospo- ransäure.
p-Valeryl-oxyphenyl-acetylchlorid (5,0 g) wurde in Aceton (20 ml) gelöst und tropfenweise im Verlaufe von 5 Minuten zu einer Lösung von 7-Amino-cephalosporansäure (5,0 g), Natriumhydrogencarbonat (6,25 g), Aceton (42 ml) in Wasser (62 ml) gegeben; die Lösung wurde gerührt und während der Zugabe auf 0 C gehalten.
Die Lösung wurde bei 0 C während einer Stunde gerührt, im Verlaufe einer weiteren Stunde auf Umgebungstemperatur erwärmen gelassen und das Aceton unter vermindertem Druck entfernt. Der wässrige Rückstand wurde mit Diäthyläther (2 x 25 ml) gewaschen, mit Salzsäure auf pH 2 eingestellt und die Cephalosporansäure mit Aethylacetat (3 x 100 ml) extrahiert. Die Aethylacetat-Lösung wurde zweimal mit Wasser gewaschen, mit Natriumsulfat getrocknet, unter vermindertem Druck auf 25 ml konzentriert und in Petroläther (Sdp. 60-80 C, 500 ml) gegossen. Die 7-(p-Valeryloxyphenylacetamido)cephalosporansäure wurde gesammelt, mit Diäthyläther gewaschen und getrocknet.
Ausbeute: 7,2 g (80,0 %) # 262-263 m max. E1 cm1 % = 183 (Methanol 0,003 0/o)
Rf (Butanol-System) = 0,88
Rf (Aethylacetat-System) = 0,56.
Beispiel 36 (b) N-[7-(p-Valeryl-oxyphenyl-acetamido)-ceph-3-em-3yl-methyl] -pyridinium-4-carboxylat.
7-(p-Valeryl-oxyphenyl-acetamido)- cephalosporansäure (7,0 g) wurde in Wasser (63 ml), welches Pyridin (7,0 ml) enthielt, gelöst und die Lösung bei 50 0C während 17 Stunden reagieren gelassen. Nach dem Abkühlen wurde die Suspension mit Methylenchlorid (2 x 30 ml) gewaschen; die wässrige Phase wurde abgetrennt und auf eine Kolonne von Dowex-1 - lonenaus- tauscherharz im Acetatzyklus gegossen. Die Kolonne wurde mit Wasser eluiert und die vereinigten Wassereluate (250 ml) wurden unter vermindertem Druck zur Trockne verdampft; der Rückstand wurde in Methylalkohol (15 ml) gelöst und in Aceton (300 ml) gegossen; das Pyridinium-Derivat wurde gesammelt, mit Diäthyläther gewaschen und getrocknet.
Ausbeute: 0,430 g (6,0 Oio)
1 % 2 258 mii max. E 1 cm = 206 (Wasser 0,003 %)
Rf (Aethylacetat-System) = 0,00 (Ausgangsmaterial Rf = 0,56)
Rf (Butanol-System) = 0,25.
Beispiel 37 N-(7-Phenyl-acetamido-ceph-3-em-3-yl-methyl)-3'acetoxy-pyridinium-4-carboxylat.
7-Phenyl-acetamido-cephalosporansäure wurde mit 3-Acetoxy-pyridin (2 Mol) in ähnlicher Weise wie in Beispiel 36 zum 3-Acetoxy-pyridinium- Derivat umgesetzt.
Ausbeute 2,5 /o # 254 m max. E1 cm1 % = 246 (Wasser 0,003 %)
Rf (Aethylacetat-System) - 0,00
Die biologischen Eigenschaften der nach den obigen Beispielen hergestellten Verbindungen sind in der folgenden Tabelle dargestellt. Die Staph.aureus-Stämme A und C waren penicillinresistent, während der Stamm B penicillinempfindlich war.
EMI11.1
<tb>
<SEP> Verdünnungsversuch <SEP> i. <SEP> Rohr <SEP> γ/ml) <SEP> Schutz <SEP> der <SEP> Maus
<tb> Beispiel <SEP> ED50/mg/kg/Dosis) <SEP>
<tb> Nr. <SEP> Grampositiv <SEP> Gramnegativ <SEP> subkutane
<tb> <SEP> Verabreichung
<tb> <SEP> ,t <SEP> y <SEP> n <SEP> : <SEP>
<tb> <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP>
<tb> <SEP> F,
<SEP> n
<tb> <SEP> n <SEP> u
<tb> <SEP> II <SEP> = <SEP>
<tb> <SEP> Ï <SEP> n <SEP> 0 <SEP>
<tb> <SEP> 1 <SEP> 0,32 <SEP> 0,08 <SEP> 3,1 <SEP> 31 <SEP> < <SEP> 16 <SEP> 31 <SEP> 2,5 <SEP> 10
<tb> <SEP> 2 <SEP> 0,63 <SEP> 0204 <SEP> - <SEP> 8 <SEP> 8 <SEP> 31 <SEP> 2,5 <SEP> 25
<tb> <SEP> 3 <SEP> 0,63 <SEP> 0,04 <SEP> - <SEP> 4 <SEP> 4 <SEP> 16 <SEP> 10 <SEP> 25
<tb> <SEP> 4 <SEP> 1,25 <SEP> 0,04 <SEP> > 25 <SEP> 16 <SEP> 16 <SEP> 31 <SEP> 15 <SEP> 15
<tb> <SEP> 5 <SEP> > 2,5 <SEP> 0,04 <SEP> 12,5 <SEP> 31 <SEP> 31 <SEP> 62 <SEP> 2 <SEP> 15
<tb> <SEP> 6 <SEP> 2,5 <SEP> 0,08 <SEP> - <SEP> 62 <SEP> 62 <SEP> 125 <SEP> 2 <SEP> 25
<tb> <SEP> 7 <SEP> > 2,5 <SEP> 0,08 <SEP> - <SEP> 8 <SEP> 8 <SEP> 62 <SEP> 3,0 <SEP> > 50
<tb> <SEP> 8 <SEP> > 2,5 <SEP> Q16 <SEP> 25 <SEP> 8 <SEP> 31 <SEP> 62 <SEP> 3 <SEP> 12,5
<tb> <SEP> 9 <SEP> 0,63 <SEP> 0,08 <SEP> - <SEP> 31 <SEP> 31
<SEP> 125 <SEP> 2 <SEP> > 25
<tb> 10 <SEP> 0,62 <SEP> 0,04 <SEP> 1,6 <SEP> 31 <SEP> 31 <SEP> 62 <SEP> 2,5 <SEP> 35
<tb> 11 <SEP> 0,08 <SEP> 0,04 <SEP> - <SEP> 8 <SEP> 8 <SEP> 32 <SEP> 4,0 <SEP> > 50
<tb> 12 <SEP> > 2,5 <SEP> 0,04 <SEP> < <SEP> 4 <SEP> 8 <SEP> 31 <SEP> 12,5 <SEP> > 50
<tb> 13 <SEP> 2,5 <SEP> 0,04 <SEP> - <SEP> 16 <SEP> 16 <SEP> 125 <SEP> 10 <SEP> > 50
<tb> 14 <SEP> 0,31 <SEP> 0,08 <SEP> 1,6 <SEP> 31 <SEP> 62 <SEP> 62 <SEP> 2,0 <SEP> 15
<tb> 15 <SEP> 2,5 <SEP> 0,08 <SEP> 6,2 <SEP> 16 <SEP> 62 <SEP> 31 <SEP> < <SEP> 1,5 <SEP> 25
<tb> 16 <SEP> (b) <SEP> 0,8 <SEP> 0,08 <SEP> 12,5 <SEP> 62,5 <SEP> 125 <SEP> 250 <SEP> 2,5 <SEP> 37,5
<tb> 17 <SEP> (b) <SEP> 0,62 <SEP> 0,16 <SEP> 16 <SEP> 31 <SEP> 31 <SEP> 62 <SEP> 1,5 <SEP> 20
<tb> 18 <SEP> (b) <SEP> 0,60 <SEP> 0,08 <SEP> 16 <SEP> 62 <SEP> 62 <SEP> 125 <SEP> 4 <SEP> > 50
<tb> 19 <SEP> (b) <SEP> 2,5 <SEP> 0,04 <SEP> 4
<SEP> 250 <SEP> 250 <SEP> > 250 <SEP> 5 <SEP> > 50
<tb> 20 <SEP> (b) <SEP> 2,5 <SEP> 0,08 <SEP> 8 <SEP> 250 <SEP> 250 <SEP> > 250 <SEP> 4 <SEP> > 50
<tb> 21 <SEP> I(b) <SEP> 0,63 <SEP> 0,16 <SEP> 16 <SEP> 125 <SEP> 250 <SEP> 250 <SEP> 2,5 <SEP> > 50
<tb> 22 <SEP> ltb) <SEP> > 2,5 <SEP> 0,04 <SEP> 31 <SEP> > 250 <SEP> < 250 <SEP> > 250 <SEP> 1,5 <SEP> > 50
<tb> 23 <SEP> (b) <SEP> 0,62 <SEP> 0,04 <SEP> 8,0 <SEP> 250 <SEP> 250 <SEP> > 250 <SEP> 5 <SEP> 50
<tb> 24 <SEP> (b) <SEP> 2,5 <SEP> 0,6 <SEP> 16 <SEP> 125 <SEP> 31 <SEP> 62 <SEP> 20 <SEP> > 50
<tb> 25 <SEP> 4,0 <SEP> 0,5 <SEP> 31 <SEP> 16 <SEP> 1,6 <SEP> 31 <SEP> 5 <SEP> < 50
<tb> 26 <SEP> 1,25 <SEP> 0,08 <SEP> 4 <SEP> 31 <SEP> 62 <SEP> 250 <SEP> 5 <SEP> 50
<tb> 27 <SEP> 2,5 <SEP> 0,3 <SEP> 31 <SEP> 31 <SEP> 31 <SEP> 31 <SEP> 2,5 <SEP> 35
<tb> 28 <SEP> 2,5 <SEP> 0,04 <SEP> 4 <SEP> 250 <SEP> 125 <SEP> 250 <SEP> 10 <SEP>
> 50
<tb> 29 <SEP> 1,25 <SEP> 1,25 <SEP> 8 <SEP> 125 <SEP> 31 <SEP> 62 <SEP> 10 <SEP> > 50
<tb> 30 <SEP> > 2,5 <SEP> 0,15 <SEP> 8 <SEP> 31 <SEP> 62 <SEP> 31 <SEP> 1,5 <SEP> > 50
<tb> 31 <SEP> 0,6 <SEP> 0,08 <SEP> 31 <SEP> 8 <SEP> 62 <SEP> 16 <SEP> 1,5 <SEP> 25
<tb> 32 <SEP> 1,25 <SEP> 0,15 <SEP> 16 <SEP> 16 <SEP> 16 <SEP> 31 <SEP> 6,25 <SEP> 50
<tb> 33 <SEP> a(b) <SEP> 1,25 <SEP> 0,62 <SEP> 16 <SEP> 31 <SEP> 16 <SEP> 62 <SEP> 15 <SEP> 30
<tb> 34 <SEP> 1,25 <SEP> 0,31 <SEP> 8 <SEP> 8 <SEP> 16 <SEP> 31 <SEP> 25 <SEP> 10
<tb> 35 <SEP> 1,25 <SEP> 0,16 <SEP> 2 <SEP> 8 <SEP> 16 <SEP> 31 <SEP> 10 <SEP> 10
<tb> 316 <SEP> (b) <SEP> > 2,5 <SEP> 0,16 <SEP> 8 <SEP> 16 <SEP> - <SEP> 31 <SEP> < <SEP> 1,5 <SEP> 15
<tb> 37 <SEP> 25 <SEP> 2,5 <SEP> 16 <SEP> 62 <SEP> 31 <SEP> 16 <SEP> 20 <SEP> < 50
<tb>