AT231072B - Verfahren zur Reinigung von Polymyxinen - Google Patents

Description

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  Verfahren zur Reinigung von Polymyxinen 
Die Erfindung betrifft Antibiotika, insbesondere Polymyxine und deren Reinigung. 



   Die Polymyxine sind eine Familie von Polypeptidantibiotika mit antibakterieller Aktivität und besonders wirksam gegen gramnegative Bakterien. Sie können aus den Fermentationsprodukten einiger besonderer Medien durch Stämme von Bazillus Polymyxa erhalten werden. Es sind die Polymyxine A, B, C, D und E bekannt, von welchen Polymyxin B infolge seiner geringen Toxizität für medizinische Zwecke bevorzugt wird. 



   Die Polymyxinpolypeptide sind basische Substanzen und werden üblicherweise in Form ihrer Säureadditionssalze isoliert und verwendet. Es können auch deren N-Methansulfonatabkömmlinge, hergestellt durch Behandlung mit Formaldehyd und einem Disulfid, verwendet werden und besitzen den Vorteil einer verminderten örtlichen Toxizität bei Injektion insbesondere auf intramuskulärem Weg. 



   Ein aus dem Fermentationsmedium erhaltenes und im allgemeinen durch organische Substanzen aus dem Medium verfärbtes rohes Polymyxin wurde bisher durch eine Anzahl von   Fällungs-oder Kristallisa-   tionsstufen mit organischen Säuren gereinigt. Diese Schritte sind umständlich und können mit einem wesentlichen Verlust an aktivem Material verbunden sein. Es wurde gefunden, dass die Zahl solcher Stufen dadurch herabgesetzt werden kann, dass in das Reinigungsverfahren die Massnahme der Behandlung des unreinen Polymyxins in wässeriger Lösung mit einem Permanganat vorzugsweise im pH-Bereich von ungefähr 3,0 bis ungefähr 7, 5 eingeführt wird. Dieser neue Schritt ist besonders wirksam zur Verbesserung des Aussehens eines verfärbten Polymyxins.

   Das Polymyxin wird vorzugsweise in konzentrierter Lösung, gewöhnlich ungefähr   lolo   G/V, verwendet. Das Permanganat, gewöhnlich Kaliumpermanganat oder Natriumpermanganat, kann in neutraler Lösung verwendet werden, wird jedoch vorzugsweise in Anwesenheit einer Mineralsäure, wie Schwefelsäure, angewendet. Es ist zweckmässig, die Verwendung eines wesentlichen Überschusses an Säure über die erforderliche Menge gemäss der Gleichung : 
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 worin 5H den oxydierbaren Wasserstoff in den Unreinheiten desPolymyxins darstellt, zu vermeiden, so dass nach Beendigung der Oxydation die Polymyxinlösung nicht weit von ihrem Anfangs-pH entfernt liegt. Die Permanganatlösung wird vorzugsweise allmählich zur Polymyxinlösung zugesetzt und die Anwesenheit eines geringen Überschusses wird aus der bleibenden Rosafärbung ersichtlich.

   Jeder Überschuss an Permanganat kann in bekannter Weise gewöhnlich durch Zugabe von Wasserstoffperoxyd zerstört werden. In allen Stufen soll zweckmässigerweise vermieden werden, dass die Polymyxinlösung wesentlich alkalisch wird und auf jeden Fall nicht über PH 8, 0 gelangt. 



   Das Polymyxin wird vom Reinigungsverfahren als eine wässerige Lösung erhalten, welche Mangankationen und die Kationen des verwendeten Permanganates enthält und auch andere im als Ausgangsmaterial verwendeten unreinen Polymyxin anwesende anorganische Kationen enthalten kann. Das Polymyxin kann von diesen Kationen in bekannter Weise z. B. durch Fällung getrennt werden. Gewöhnlich wird die Trennung   ausgefühft,   indem die Lösung durch ein Kationenaustauschermaterial geleitet wirdb welches stark saure Gruppen in freier Säureform enthält und einen wesentlichen Vernetzungsgrad über das gesamte Material zeigt. Ein sulfoniertes Polystyrolharz, hergestellt mit einem verhältnismässig hohen Anteil (z. B. ungefähr   20(1o)   an Divinylbenzol, ist ein geeignetes Material.

   Ein solches Material absorbiert die Kationen 

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 geringen Molekulargewichts, jedoch nicht das Polymyxin, sofern der Vernetzungsgrad ausreichend hoch ist. Daher wird in der ausfliessenden Flüssigkeit ein von Mangan und andern niedermolekularen Kationen freies Polymyxin in saurer Lösung erhalten. Aus dieser Lösung kann die freie Base oder ein gewünschtes Salz oder Derivat hergestellt werden. 



   Das neue Verfahren ist besonders wichtig zur Reinigung von Polymyxin B infolge dessen medizinischer Verwendbarkeit. Das unmittelbar erhaltene Produkt kann, wenn nötig nach weiterer Reinigung, in therapeutisch verträgliche Form, wie Polymyxin-B-sulfat   oder Natrium-polymyxin-B-N-methansulfonat mge-   wandelt werden. 



   Ein Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Steigerung der Reinheit eines unreinen Polymyxins, welches eine Behandlung des Polymyxins in wässeriger Lösung unter sauren oder annähernd neutralen Bedingungen mit einem Permanganat umfasst. Vorzugsweise wird danach das Polymyxin von den Mangankationen abgetrennt. 



   Im einzelnen schafft die Erfindung ein Verfahren zur Steigerung der Reinheit eines unreinen Polymyxins, wobei zunächst das Polymyxin in wässeriger Lösung vorzugsweise im pH-Bereich von 3,0 bis 7, 5 mit einem Permanganat behandelt und gegebenenfalls dann die so erhaltene Polymyxinlösung durch ein Kationenaustauschermaterial, welches stark saure Gruppen in Form der freien Säure enthält und durchgehend einen wesentlichen Vernetzungsgrad zeigt, geleitet wird, wodurch niedermolekulare Kationen einschliesslich Mangankationen von diesem Material absorbiert werden und das Polymyxin im wesentlichen unabsorbiert bleibt. 



   Die Erfindung schafft somit ein Polymyxin entweder als freie Base oder als Additionssalz mit einer Säure oder als ein N-Methansulfonatderivat, dessen Polypeptidmolekül durch Behandeln mit einem Permanganat, wie in einem der vorstehenden beiden Abschnitte beschrieben, unterzogen wurde. 



   Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung. 
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 zu einer strohigen Farbe entfärbt und das   ausgefällte   Manganoxyd entfernt. 



     0. 5   g in ähnlicher Weise erhaltenes rohes Polymyxin-B-sulfat wurden in Kaliumpermanganat in der oben beschriebenen Weise behandelt. Es trat kein Verlust an biologischer Aktivität auf. 



     1, 6   g rohes Polymyxin-A-sulfat wurden in gleicher Weise mit Kaliumpermanganat behandelt. Das Produkt wurde durch Fällung mit einer Mischung von Natriumsalzen sulfonierter Fettalkohole gereinigt und danach zum Sulfat umgewandelt. Es blieb die volle biologische Aktivität erhalten. 



   Beispiel 2: 1 kg aus einer Fermentationsbrühe erhaltenes rohes Polymyxin-B-sulfat, enthaltend ungefähr 60% anorganische Stoffe, wurde mit 10 1 Wasser extrahiert und das   unlösliche Material abfiltriert.   



  Die klare Lösung wurde allmählich mit einer Lösung, enthaltend 25 g Kaliumpermanganat/1 und 0, 475n an Schwefelsäure, behandelt. Die Behandlung wurde fortgesetzt, bis beim Stehenlassen die rosa Färbung 5 min bestehen blieb ; es war ungefähr   11   an angesäuerter Permanganatlösung erforderlich. Hierauf wurden 30%   G/V Wasserstoffperoxydlösung   zugesetzt, bis die Färbung verschwand ; es waren ungefähr 20 ml erforderlich. Danach wurde die Mischung 30 min stehen gelassen. Zu diesem Zeitpunkt kann eine Filtration zweckmässig sein, wodurch etwas gelöster Sauerstoff und unlösliche Stoffe entfernt werden. 



   Das Polymyxin B wurde durch nachfolgende Massnahme gewonnen : Es wurde die Reaktionsmischung durch eigene Schwere mit einer Geschwindigkeit von 50   m1/min   durch ein vertikales Glasrohr von 10 cm Durchmesser und 46 cm Höhe fliessen gelassen. Das Rohr enthielt 4, 5 kg eines sulfonierten Polystyrol- 
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 oder durch Leiten durch ein Anionenaustauscherharz auf PH 7 gebracht. Die neutrale Lösung wurde in einem Umlaufverdampfer auf ein Volumen von 5 1 konzentriert. Die Polymyxin-B-Base wurde durch Zugabe von   2, 5 l 34, 5% igem Ammoniak   gefällt und während 4 h stehen gelassen.

   Das Produkt wurde gesammelt, mit Wasser bis Ammòniakfreiheit gewaschen und bei niedrigen Temperaturen im Vakuum getrocknet, wodurch 150 g Polymyxin-B-Base, geeignet für eine weitere Reinigung durch fraktionierte Kristallisation, als Naphthalin-2-sulfonat erhalten wurden. 

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Claims (1)

1. PATENTANSPRÜCHE : 1. Verfahren zur Reinigung von Polymyxinen, dadurch gekennzeichnet, dass eine wässerige Lösung des unreinen Polymyxins mit einem Permanganat vorzugsweise im pH-Bereich von 3,0 bis 7, 5 behandelt <Desc/Clms Page number 3> und danach gegebenenfalls das Polymyxin von anwesenden anorganischen Kationen in an sich bekannter Weise durch Fällung oder Kationenaustauschermaterial abgetrennt wird.

   2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Ausgangsmaterial Polymyxin B verwendet wird.