DE1256649B - Verfahren zur Reinigung von Polymyxin - Google Patents

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND

DEUTSCHES

PATENTAMT

AUSLEGESCHRIFT

Int. Cl.:

Deutsche Kl.:

Nummer: 1 256 649

Aktenzeichen: W 37355 IV b/12 q

Anmeldetag: 10. August 1964

Auslegetag: 21. Dezember 1967

Polymyxine sind eine Familie von Polypeptidantibiotica. welche antibakterielle Wirksamkeit besitzen und am meisten gegen gramnegative Bakterien wirksam sind. Sie sind Stoffwechselprodukte, welche in Kulturbriihen gebildet werden, in denen ein Stamm von Bacillus polymyxa (syn. Bacillus aerosporus) oder Bacillus colistinus gewachsen ist. Es sind die Polymyxine A, B, C, D, E und Colistin bekannt.

Colistin oder Colimycin, welches das Produkt von Bacillus colistinus ist, wird für alle Zwecke als ein Polymyxin betrachtet; es wird angenommen, daß es identisch ist mit Polymyxin E (S. Wilkinson, Lancet, [1963] [i], S. 922 und 923, und W. B. H u g ο und R. J. Stetton, J. Pharm. Pharmacol. [1963], 15, S. 490 und 491).

Die Polymyxine B und E sind wegen ihrer geringen Toxizität für medizinischen Gebrauch bevorzugt. In der vorliegenden Beschreibung soll der Ausdruck »Polymyxin« die Polymyxine B. E und das Antibiotikum bezeichnen, welches als Colistin oder Colimycin beschrieben ist.

Die Polymyxine sind basische Substanzen und werden zweckmäßig in Form eines Säureadditionsalzes mit einer therapeutisch annehmbaren Säure, beispielsweise Schwefelsäure, bereitet und verwendet. Ihre N-Sulfomethylderivate, welche durch eine Behandlung mit Formaldehyd und einem Bisulfit gebildet werden, können ebenfalls verwendet werden und besitzen den Vorteil verminderter örtlicher Toxizität bei Injektion. Diese Derivate werden gewöhnlich in Form eines Salzes mit einem therapeutisch annehmbaren Kation, beispielsweise Natrium, bereitet.

Die Aktivität einer Polymyxinzubereitung kann gemäß der Britischen Pharmacopoeia, 1958, bestimmt werden. Die Potenz der Zubereitung gibt die Wirksamkeit je Milligramm oder Kubikzentimeter an.

Rohes Polymyxin, welches aus dem Fermentationsmedium gewöhnlich in Form eines Salzes gewonnen wird, ist durch anorganische und organische Substanz aus dem Medium verfärbt und verunreinigt. Zur Gewinnung von Polymyxin in gereinigter Form sind Methoden vorgeschlagen worden, welche sich der Ausfällung, Kristallisation oder] der Adsorption an aktiver Kohle oder an Ionenaustauschmaterial und nachfolgender Eluierung bedienen.

Wenn auch eine einfache Ausfällung von Polymyxin mit alkalischen Mitteln, wie dies in der britischen Patentschrift 646 258 beschrieben ist, die Potenz des Produktes verbessert, so leidet doch diese Ausfällung unter dem Nachteil, daß anorganische mehrwertige Kationen, zusammen mit anderen Verunreinigungen, ebenfalls ausgefällt werden. Außerdem ist diese Me-Verfahren zur Reinigung von Polymyxin

Anmelder:

The Wellcome Foundation Limited. London

Vertreter:

Dipl.-Chem. Dr. rer. nat. W. Berg
und Dipl.-Ing. O. Stapf, Patentanwälte.
München 2, Hilblestr. 20

Als Erfinder benannt:
Ravmond Weddle, London

Beanspruchte Priorität:

Großbritannien vom 30. August 1963 (34 394)

thode nur in Fällen ausführbar, wo das rohe PoIymyxin eine Potenz von mindestens 3000 Einheiten je Milligramm oder vorzugsweise mehr besitzt, weil Materialien geringerer Reinheit gewöhnlich unverarbeitbare, klebrige und gelatinöse Ausfällungen ergeben.

Es wurde bereits ein Verfahren vorgeschlagen (deutsches Patent 1 188 763), nach welchem rohes Polymyxin zur Entfernung verfärbender Verunreinigungen mit Permanganatlösung behandelt wird. Anschließend an die Behandlung können Mangan und andere anorganische Kationen durch lo^enaustauschstoffe aus der Lösung entfernt werden, i

Nunmehr wurde gefunden, daß bei Anwesenheit eines chelatbildenden Mittels beim Ausfällen des Polymyxins mit einem alkalischen Mittel aus einem wäßrigen Medium bzw. beim Behandeln des Nieder-Schlages mit einem chelatbildenden Mittel in Lösung die Anwesenheit dieser Mittel die mehrwertigen anorganischen Kationen nicht nur veranlaßt, in Lösung zu

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verbleiben bzw. sich wieder aufzulösen, falls sie bereits Die Auswahl der chelatbildenden Mittel zählt zum

ausgefällt sind, sondern das Aussehen und die Qualität allgemeinen Wissen des Fachmanns. Daher fällt die

des Niederschlages überraschenderweise viel mehr als Verwendung irgendeines Mittels, welches geeignet ist,

erwartet verbessert, insbesondere im ersteren Fall. die verunreinigenden Kationen unter alkalischen Be-

Es wird angenommen, daß dieses unerwartete Phäno- 5 dingungen in Lösung zu halten, in den Rahmen der

men wahrscheinlich auf die Tatsache zurückzuführen vorliegenden Erfindung.

ist, daß, während mehrwertige Kationen gewöhnlich Zu Mitteln, welche für diesen Zweck bekannt sind, unlösliche Verbindungen bzw. Komplexe mit ver- zählen Polyaminopolycarbonsäuren und ihre Salze, schiedenen, sonst löslichen organischen Verunreini- wie Äthylendiamin-N,N,N',N'-tetraessigsäure oder degungen im alkalischen Medium bilden oder die aus- io ren Dinatrium- oder Tetranatriumsalz, Glycinderivate gefällten Kationen solcher Verunreinigungen absor- und deren Salze, wie N,N-Di-(2-hydroxyäthyl)-glybieren, diese unnötige gemeinsame Ausfällung organi- ein und N-(Carboxymethyl)-N'-(2-hydroxyäthyl)-scher Verunreinigungen nunmehr indirekt durch die Ν,Ν'-äthylendiglycin, Gemische von Aminocarbonauflösende Wirkung der chelatbildenden Mittel auf säuren, weiche sich von Diäthylentriamin und Nitriloanorganische Kationen verhindert werden kann. Dies 15 triessigsäure ableiten. Die komplexbildende Kraft der hat zum Ergebnis, daß das Herstellungsverfahren Mittel schwankt in gewissem Ausmaß mit den anstark vereinfacht werden kann und das Endprodukt wesenden Kationen. Wenn beispielsweise der Eisenmit einer höheren Ausbeute gewinnbar ist, als dies gehalt hoch ist, kann man vorteilhaft N,N-Di-(2-hybisher möglich war. droxyäthyl)-glycin zusetzen. Da die gewöhnlichen

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur 20 Kationen, welche Polymyxin verunreinigen, Calcium

Reinigung von Polymyxin, welches aus Fermentations- und Magnesium sind, wird eine 38gewichtsprozentige

medien gewonnen wurde und Polymyxin B oder E Lösung des Tetranatriumsalzes der Äthylendiamin-

sowie mehrwertige anorganische Kationen, insbeson- tetraessigsäure bevorzugt.

dere Calcium, Magnesium, Mangan oder Eisen ent- Die Menge benötigten Mittels kann geschätzt werhält, durch Behandlung einer überwiegend wäßrigen 25 den durch Bestimmung des Aschegehaltes des verLösung eines Säureadditionssalzes des rohen Poly- wendeten rohen Polymyxins oder des getrockneten myxins mit einem alkalischen Mittel und anschließende Rückstandes der zur Verfügung stehenden Polymyxin-Abtrennung des dadurch gebildeten Niederschlages, lösung. Die Annahme, daß der Aschegehalt vollkomdadurch gekennzeichnet, daß man eine ein chelat- men aus Magnesiumsalz besteht, welches das niedbildendes Mittel enthaltende Lösung verwendet bzw. 30 rigste Äquivalentgewicht unter den gewöhnlichen der Lösung ein chelatbildendes Mittel zusetzt, oder mehrwertigen Kationen besitzt, schafft eine sichere daß man den Niederschlag anschließend mit einer Überschätzung der Gesamtstärke vorhandener mehr-Lösung des chelatbildenden Mittels behandelt. wertiger anorganischer Ionen. Eine Menge an chelat-

Die Lösung kann, wenn sie nicht schon verfügbar bildendem Mittel, welche dieser Ionenstärke äqui-

ist, beispielsweise in einem Herstellungsprozeß bereitet 35 valent ist, ist mit Sicherheit ausreichend. Jedoch soll

werden, indem man die Polymyxinbase mit einer diese Schätzung nicht so betrachtet werden, als ob

genügenden Säuremenge in Wasser auflöst. Säuren, eine obere Grenze für die Menge des zu verwendenden

wie Schwefel-, Salz- oder Essigsäure, von denen be- chelatbildenden Mittels gesetzt würde. Ein Überschuß,

kannt ist, daß sie mit Polymyxin ein lösliches Addi- welcher sich auf das Mehrfache dieser Menge beläuft,

tionssalz bilden, können zweckmäßig verwendet wer- *o hat offenbar keine nachteilige Wirkung auf die Aus-

den. Man kann auch ein solches Polymyxinsalz in fällung oder auf die Ausbeute,

fester Form bereiten und dann in Wasser auflösen. Es ist bevorzugt, daß chelatbildende Mittel zu-

Vorzugsweise verwendet man eine konzentrierte sammen mit einem alkalischen Mittel zugesetzt wer-Lösung mit einer Potenz zwischen 0,3 Megaeinheiten den. Man kann auch der Polymyxinlösung vor der je Kubikzentimeter und 1,0 Megaeinheiten je Kubik- 45 Ausfällung eine neutrale Lösung, beispielsweise eine Zentimeter, und sie kann auch in begrenztem Ausmaß Lösung des Dinatriumsalzes der Äthylendiaminandere Lösungsmittel enthalten, welche zumindest Ν,Ν,Ν',Ν'-tetraessigsäure, an Stelle des Tetranatriumteilweise mit Wasser mischbar sind, beispielsweise salzes zusetzen. Wiederum kann die Polymyxinbase Methanol, Äthanol, Aceton oder Diäthyläther. Wenn zuerst mit einem alkalischen Mittel gefällt und an-Aceton auch in der Lösung anwesend ist, so scheint 50 schließend die Fällung mit einer Lösung des chelatder Niederschlag in einer Form ausgefällt zu werden, bildenden Mittels behandelt werden. Obwohl das welche leichter zu handhaben ist. Rohes Polymyxin-B- Mittel in der Lage ist, die ausgefällten anorganischen Sulfat, aufgelöst in einer wäßrigen Lösung, welche Kationen erneut aufzulösen, so ist dies doch ein etwa 10 Volumprozent Aceton enthält und eine Potenz langsamer Prozeß und die Verbesserung im Aussehen von etwa 0,6 Megaeinheiten je Kubikzentimeter auf- 55 und in der Ausbeute nicht so markant wie in den weist, wurde als geeignet befunden. ersteren Fällen.

Zur Verwendung bei der Durchführung der vorlie- Es kann irgendein alkalisches Mittel verwendet genden Erfindung geeignete chelatbildende Mittel sind werden, welches zur Ausfällung von Polymyxin diejenigen, welche mit mehrwertigen anorganischen bekannt ist, wie Carbonate oder Hydroxyde von Kationen lösliche Verbindungen bilden und wobei 60 Alkalimetallen, jedoch ist eine starke wäßrige Lösung diese Verbindungen selbst unter alkalischen Bedingun- von Ammoniak bevorzugt. In allen Fällen wird das gen löslich bleiben. Insbesondere können Mittel ver- pH der Lösung auf einen Wert oberhalb 8,5 und vorwendet werden, welche Calcium, Magnesium, Mangan zugsweise unterhalb 11 eingestellt, um eine mögliche oder Eisen chelatisieren. Je nach der tatsächlichen Teilzersetzung bzw. einen Potenzverlust des Polymy-Zusammensetzung des rohen Polymyxins oder von 65 xins infolge des hochalkalischen Mediums zu verdessen Lösung können auch andere Mittel, welche meiden. Gewöhnlich liegt der Optimalbereich der spezifisch andere Kationen chelatisieren, verwendet Ausfällung zwischen pH 9 und 10,5. Die ausgefällte bzw. zugesetzt werden. Polymyxinbase wird von der überstehenden Flüssig-

keit abgetrennt oder in das Sulfat oder ein anderes Salz oder ein Derivat des Polymyxins umgewandelt, oder sie wird weiter gereinigt.

Eine andere bevorzugte Ausführungsform des Verfahrens ist die Ausführung der Fällung gemäß der vorliegenden Erfindung im Anschluß an eine Behandlung mit Permanganat. An Stelle der Verwendung des Ionenaustausches zur Entfernung des Mangans zusammen mit anderen kationischen Verunreinigungen aus der Lösung kann die vorliegende Methode mit Vorteil angewendet werden.

Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung.

Beispiel 1

100 g rohes Polymyxin-E-Sulfat (Potenz 1796 Einheiten je Milligramm) werden in 500 cm³ Wasser aufgelöst, und das unlösliche Material wird abfiltriert. Zu der klaren Lösung setzt man unter konstantem Rühren langsam ein Gemisch aus 250 cm³ 35%'gem Ammoniak und 250 cm³ »Detarex 100« (Warenzeichen), hergestellt von F. W. Berk & Company, Ltd., mit einem Gehalt an 38 Gewichtsprozent Tetranatriumäthylendiamin-N,N,N',N'-tetraessigsäure hinzu, und man läßt die Lösung 4 Stunden lang stehen.

Der Niederschlag wird dann durch Filtration gesammelt, mit Wasser gewaschen, bis er von Ammoniakgeruch befreit ist, und im Vakuum bei niedriger Temperatur getrocknet, wobei sich 6,9 g Polymyxin-E-Base ergeben (Potenz 13060 Einheiten je Milligramm, Rückstand beim Entzünden 0,1%).

In einem Versuch, welcher für Vergleichszwecke ausgeführt wird, werden wiederum 100 g des obigen rohen Polymyxin-E-Sulfats verwendet und die Fällung wird ausgeführt durch Zusatz eines Gemisches von 100 cm³ 35%igem Ammoniak und 250 cm* destilliertem Wasser, ohne daß man ein chelatbildendes Mittel verwendet. Man erhält 13,7 g Polymyxin-E-Base (Potenz infolge Verunreinigungen unzuverlässig, Rückstand beim Entzünden 69,6%).

Beispiel 2

1,0 kg rohes Polymyxin-B-Sulfat (Potenz 1166 Einheiten je Milligramm, Rückstand beim Entzünden 21,1%). welches aus der Fermentationsbrühe erhalten wurde, wird in 101 Wasser aufgelöst und das unlösliche Material abfiltriert. Die klare Lösung wird dann bei einer niedrigen Temperatur auf ein Volumen von 51 konzentriert. Zu der Lösung wird gemäß einem bereits vorgeschlagenen Verfahren (deutsches Patent 1 188 763) 0,475 η-Schwefelsäure mit einem Gehalt an 2,5% Kaliumpermanganat hinzugegeben, bis die rosa Färbung 5 Minuten lang bestehenbleibt. Es wird etwa 11 angesäuerter Permanganatlösung benötigt. Die Lösung wird dann zur Entfärbung mit 20 cm³ Wasserstoffperoxyd behandelt, welches 30 g H₂O₂ in 100 cm³ enthält.

Nach dem Filtrieren setzt man unter konstantem Rühren langsam ein Gemisch aus 2,51 35%igem Ammoniak und 2,0 1 »Detarex 100« hinzu, und man läßt die Lösung 4 Stunden lang stehen. Der Niederschlag wird durch Filtration gesammelt, mit Wasser gewaschen, bis er von Ammoniakgeruch frei ist, und bei niedriger Temperatur im Vakuum getrocknet. Es ergeben sich 67,5 g Polymyxin-B-Base (Potenz 9166 Einheiten je Milligramm, Rückstand beim Entzünden 0,15%).

Das Produkt wird dann in das Sulfat umgewandelt, indem man die Base in Wasser mit einem Gehalt an 1 Äquivalent Schwefelsäure auflöst, und das Polymyxin-B-Sulfat wird durch Gefriertrocknen gewonnen. Die volle biologische Aktivität wird beibehalten.

Beispiel 3

ίο 104 g rohes Polymyxin-E-Sulfat (Potenz 1,192 Einheiten je Milligramm, sulfatierte Asche 28,1%) wird wie im Beispiel 1 in Wasser aufgelöst, und das Filtrat wird auf 1500 cm³ aufgefüllt.
Zu 100-cm³-Portionen der obigen Lösung setzt man 10 cm⁸ Aceton und ein Gemisch aus 25 cm³ 35%igem Ammoniak und einer 25-cm³-Lösung eines chelatbildenden Mittels hinzu. Die chelatbildenden Mittel, welche von F. W. Berk & Company Ltd. hergestellt wurden, sind die folgenden:

Probe

5 6

Mittel

38 Gewichtsprozent Tetranatrium-äthylen-diamin-N,N,N',N'-tetraessigsäure (Detarex 100, Warenzeichen)

34.4 Gewichtsprozent Trinatrium-N-(carboxymethyl)-N'-(2-hydroxyäthyl)-N,N'-äthylen- diglycin (Detarol, Warenzeichen)

gleiches Gemisch von Detarex 100 und 39 Gewichtsprozent Natrium- N,N-di-(2-hydroxy äthyl)-glycin (Detarex F, Warenzeichen)

34gewichtsprozentige Lösung eines Gemisches von Aminocarbonsäuren, abgeleitet von Diäthylen-triamin (Detarex PY, Warenzeichen)

12.5 g Trinatrium-nitrilotriessigsäure (Detarex NTA), aufgefüllt auf 25 cm³ mit Wasser

Wasser (Bezugsprobe)

Der Niederschlag wird gesammelt und wie im Beispiel 1 getrocknet. Die Ergebnisse sind die folgenden:

	Gewonnene	Potenz	Sulfa	Aktivitäts
	Polymyxin-	(Einheit/mg)	tierte	ertrag aus
irrOOc	base		Asche	rohem Sulfat
	(g)	13 310	(Vo)	<7o>
1	0,312	13 240	2,2	50,2
2	0,317	13 290	0,65	50,8
3	0,370	13 310	0,10	59,5
4	0,310	12 660	0,46	50,4
5	0,312	3 646	2,7	47,8
6	0,749	61,3	32,8

Beispiel 4

500 g rohes Polymyxin-B-Sulfat (Potenz 1387 Einheiten je Milligramm, sulfatierte Asche 17,6%) werden wie im Beispiel 2 in 5 1 Wasser aufgelöst, und das Filtrat wird bei niedriger Temperatur auf 2,5 1 konzentriert.

«5 Zu 50-cm³-Portionen der obigen Lösung setzt man 5 cm³ Aceton und ein Gemisch von 25 cm³ 35%igem Ammoniak und 25 cm³ Lösung eines chelatbildenden Mittels hinzu. Der Niederschlag wird wie im Beispiel 1

gesammelt und getrocknet. Die Ergebnisse sind die folgenden·

Probe	Mittel	Gewonnene Base (8)	Potenz (Einheit/mg)	Sulfatierte Asche (7o)	Aktivitätsertrag aus rohem Sulfat (7o>
1 2 3 4 5 6	Detarex 100 Detarol	1,13 1,13 1,84 1,24 1,13 1,69	7 063 7191 4 965 6 988 7 026 4 514	1,17 1,17 0,19 0,72 2,22 19,45	57,7 58,7 65,8 62,5 57,3 55,0
Detarex F
Detarex PY Detarex NTA kein Mittel (Wasser)

B e i s ρ i e! 5

11 der im Beispiel 4 nach der Konzentrierung erhaltenen Lösung wird mit einer 250-cm³-Lösung 0,475 η-Schwefelsäure mit einem Gehalt an 2,5 °/o Kaliumpermanganat gemäß der im Beispiel 2 angegebenen Methode behandelt. Das Mangandioxyd wird durch den Zusatz einer Minimalmenge Wasserstoffperoxyd wieder aufgelöst, die Lösung wird nitriert und das Volumen der Lösung auf 1,5 1 eingestellt.

Zu 150-cm³-Portionen der Lösung setzt man 15 cm* Aceton und ein Gemisch aus 75 cm³ 35¹Vo'!^ Ammoniak und 75 cm* Lösung eines chelatbildenden Mittels hinzu. Der Niederschlag wird wie im Beispiel 2 gesammelt und getrocknet. Die Ergebnisse sind die folgenden:

Probe	Mittel	Gewonnene Base (g)	Potenz (Einheit/mg)	Sulfatierte Asche (Vo)	Aktivitätsertrag aus rohem Sulfat (Vo)
1 2 3 4	Detarex 100 Detarex PY Detarex NTA kein Mittel (Wasser)	1,86 1,73 1,86 2,99	7 240 7 602 7 127 4 127	0,42 0,38 0,58 45,4	48,4 47,25 47,77 44,47

Claims (5)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Reinigung von Polymyxin, welches aus Fermentationsmedien gewonnen wurde und Polymyxin B oder E sowie mehrwertige anorganische Kationen, insbesondere Calcium, Magnesium, Mangan oder Eisen enthält, durch Behandlung einer überwiegend wäßrigen Lösung eines Säureadditionssalzes des rohen Polymyxins mit einem alkalischen Mittel und anschließende Abtrennung des dadurch gebildeten Niederschlages, dadurch gekennzeichnet, daß man eine ein chelatbildendes Mittel enthaltende Lösung verwendet bzw. der Lösung ein chelatbildendes Mittel zusetzt oder daß man den Niederschlag anschließend mit einer Lösung des chelatbildenden Mittels behandelt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein chelatbildendes Mittel ver- 5» wendet, das Diaminoäthan-tetraessigsäure oder ein dissoziierendes Salz dieser Säure, Ν,Ν-Di-(2 - hydroxyäthyl) - glycin, N - (Carboxymethyl)-N'-(2-hydroxyäthyl)-N,N'-äthylendiglycin, ein Gemisch aus Aminocarbonsäuren, welche vom Diäthylentriamin abgeleitet sind, oder Nitrilotriessigsäure enthält.

3. Verfahren nach den vorhergehenden Ansprüchen, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Lösung verwendet, die etwa 10 g Aceton je 100 cm³ enthält.

4. Verfahren nach den vorhergehenden Ansprüchen, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration des Polymyxins in der Lösung zwischen 0,3 und 1,4 Megaeinheiten je Kubikzentimeter liegt.

5. Verfahren nach den vorhergehenden Ansprüchen, dadurch gekennzeichnet, daß man die Ausfällung dadurch ausführt, daß man den pH-Wert der Lösung mit einer Lösung des alkalischen Mittels, welche auch das chelatbildende Mittel enthält, auf einen Wert innerhalb des Bereiches von pH 8,5 bis 11 einstellt.

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