CH620362A5

CH620362A5 -

Info

Publication number: CH620362A5
Application number: CH868874A
Authority: CH
Inventors: Richard Lee Jackson
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 1973-07-16
Filing date: 1974-06-25
Publication date: 1980-11-28
Also published as: NL179910B; BE817649A; AT344925B; ES428329A1; GB1472427A; BG25803A3; AU6959774A; CA1025851A; HU171574B; DK148282B; DK379374A; PL90037B1; JPS5735825B2; DE2431483A1; SE415229B; DD114597A5; NL179910C; FR2237879A1; SE7409248L; DE2431483C3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Alkalimetall- und Ammoniuminsulinen, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man eine wässrig-alkalische Lösung herstellt, welche ein Metallinsulin eines zweiwertigen Metalls, einen Chelatbildner für zweiwertiges Metallion und Alkalimetall- oder Ammoniumionen enthält, wobei die Konzentration an Metallinsulin von zweiwertigem Metall 10 bis 1000 Einheiten pro ml beträgt, das zweiwertige Metall ein

Element der Gruppen VIIB, VIII, IB oder IIB des periodi-40 sehen Systems ist, die Konzentration an Alkalimetall- oder Ammoniumionen 0,2 bis l.Omolar ist, der pH-Wert der Lösung 7,6 bis 8,6 beträgt, die Konzentration an Chelatbildner 0,0002 bis 0,5molar ist, das Molverhältnis von Chelatbildner zu zweiwertigem Metall im Metallinsulin mindestens 3:1 be-45 trägt und der Chelatbildner folgende Formel aufweist:

Ri

Rs

N-(CH2)fn-(CH)n -(CHs)

m

Ra

N-(CH I

R4

"1

12) —I—n'

■\e worin Rj und R5 einwertige organische Reste bedeuten, die unabhängig voneinander Carboxymethyl, Carboxyäthyl, Ci-C6-Alkyl oder Q-Q-hydroxyalkyl darstellen, R2 und R6 einwertige organische Reste bedeuten, die unabhängig voneinander Carboxymethyl oder Carboxyäthyl sind, R3 einen der einwertigen Substituenten Wasserstoff, Hydroxyl oder Ci-C6-Alkyl darstellt, R4 einen der einwertigen Substituenten Wasserstoff, Carboxymethyl oder Carboxyäthyl darstellt, m eine ganze Zahl von 1 bis 6, n die ganze Zahl 0 oder 1, p die ganze Zahl 0 oder 1, r eine ganze Zahl von 2 bis 6 und s eine ganze Zahl von 0 bis 2 darstellen, und das Alkalimetall- oder Ammoniuminsulin kristallisiert.

Die heute im Handel erhältlichen Insulinpräparate zur Behandlung von Diabetes Mellitus werden gewöhnlich einge-

55 teilt in solche mit kurzer, mittlerer oder längerer hypoglykämi-scher Wirkung. In zahlreichen Fällen von Diabetes, insbesondere bei Kindern, ist ein Insulinpräparat mit rasch einsetzender und verlängerter Dauer der hypoglykämischen Wirkung, das heisst ein Insulinpräparat mit dualer Wirkung, erwünscht.

60 In den letzten Jahren wurden Insulinpräparate mit dualer Wirkung erzielt durch Vermischen von mindestens zwei verschiedenen Insulinpräparaten. Typischerweise besteht ein derartiges Gemisch aus einer Lösung von Zinkinsulin aus Schweinepankreas und einer Suspension von Rinderinsulin mit hohem Zinkgehalt. Andere Präparate bestehen aus Gemischen einer Zinkinsulinlösung mit entweder einem Protamin-Insulin oder einer Protamin-Zinkinsulin-Suspension.

Bei allen bekannten Insulinpräparaten dieser Art treten

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Probleme auf, obgleich eine duale Wirkung bis zu einem gewissen Grad erzielt wird. Bei den Problemen handelt es sich gewöhnlich um die Lagerung, Konservierung, Reinheit, Stabilität, Färbung und Verunreinigungen durch einen hyperglykä-mischen Faktor (Glucagon) und Antigen-Proteine hohen 5

Molekulargewichts.

Zahlreiche oder sämtliche dieser Probleme, die sich bei handelsüblichen Insulinpräparaten mit dualer Wirkung ergeben, werden vermieden bei Verwendung von Präparaten, die ein Alkalimetall- oder Ammoniuminsulin und Protamin ent- 10 halten. Derartige Präparate sind in der US-PS 3 758 683 beschrieben.

Die Alkalimetall- und Ammoniuminsuline werden im allgemeinen nach dem Verfahren der US-PS 3 719 655 hergestellt, bei welchem man eine insulinhaltige Lösung auf pH etwa 15 7,2 bis 10,0 und die Alkalimetall- oder Ammoniumionenkonzentration auf etwa 0,2 bis l,0molar einstellt, wodurch die Kristallisierung des Alkalimetall- oder Ammoniuminsulins verursacht wird. Obgleich man die bei der Krsitallisierung von Zinkinsulinen auftretenden Probleme vermeidet, bleiben die 20 nicht aus Insulinprotein bestehenden Bestandteile, die gewöhnlich nur durch die Zinkkristallisation entfernt werden, im Alkalimetall- oder Ammoniuminsulin. Ein Insulinpräparat mit dualer Wirkung muss daher entweder aus einem Alkalimetalloder Ammoniuminsulin bestehen, das häufig von Insulinpro- 25 tein verschiedene Bestandteile enthält, die im Zinkinsulin nicht vorliegen, oder es muss ein Gemisch der bekannten Art darstellen, dem die oben genannten Nachteile anhaften.

Die beiliegende Zeichnung illustriert die Polyacrylamid-Gelelektrophorese der Natriuminsulin-Ausgangsmaterialien und der Natriuminsulin-Produkte der Beispiele 2 und 3.

Unter der Bezeichnung «Alkalimetall» werden die Elemente der Gruppe 1A bis und mit fünfter Periode des periodischen Systems verstanden (siehe «Handbook of Chemistry and Physics», 53. Aufl., The Chemical Rubber Co., Cleveland, Ohio, 1972-1973, S. B-3). Lithium, Natrium und Kalium werden bevorzugt, Natrium wird besonders bevorzugt.

Zu den «zweiwertigen Metallen» gehören die Elemente der Gruppen VIIB, VIII, IB und IIB des periodischen Systems. Die bevorzugten zweiwertigen Metalle sind Mangan, Eisen, Kobalt, Nickel, Kupfer, Zink und Cadmium. Aus wirtschaftlichen Gründen wird Zink besonders bevorzugt.

Wie bereits erwähnt, benötigt das erfindungsgemässe Verfahren eine wässrig-alkalische Lösung eines Metallinsulins eines zweiwertigen Metalls, die gleichzeitig einen Chelatbildner und Alkalimetall- oder Ammoniumionen enthält. Der pH-Wert der Lösung liegt zwischen 7,6 und 8,6, und beträgt vorzugsweise etwa 8,2.

Die Konzentration an zweiwertigem Metallinsulin beträgt zwischen 10 und 1000 internationalen Einheiten pro ml Lösung (E/ml). Die bevorzugte Konzentration an zweiwertigem Metallinsulin beträgt etwa 500 E/ml.

Die erfindungsgemäss verwendeten Chelatbildner werden durch folgende Formel wiedergegeben:

Ri

Rs

\

y

.N-(CHa) -(CH)-(CHs)

m

I

Ra n

N-(CHs) I

R4

•N

Rs

Re worin Ri und Rs einwertige organische Reste bedeuten, die unabhängig voneinander Carboxymethyl, Carboxyäthyl, Ci-C6-Alkyl oder Ci-C6-Hydroxyalkyl darstellen, R2 und R6 40 einwertige organische Reste bedeuten, die unabhängig voneinander Carboxymethyl oder Carboxyäthyl sind, R3 einen einwertigen Substituenten in Form von Wasserstoff, Hydroxyl oder Q-Q-Alkyl, R4 einen einwertigen Substituenten in Form von Wasserstoff, Carboxymethyl oder Carboxyäthyl, m 45 eine ganze Zahl von 1 bis 6, n die ganze Zahl 0 oder 1, p die ganze Zahl 0 oder 1, r eine ganze Zahl von 2 bis 6 und s eine ganze Zahl von 0 bis 2 darstellen.

Beispiele für Chelatbildner gemäss obiger Formel sind unter anderen die Äthylendiamin-N,N,N',N-tetraessigsäure, 50 l,2-Diaminopropan-N,N,N',N'-tetraessigsäure, 1,3-Diamino-2-hydroxypropan-N,N,N',N'-tetraessigsäure, Diäthylentri-amintetraessigsäure, Diäthylentriaminpentaessigsäure, Hexa-methylendiamin-N,N,N',N'-tetraessigsäure, N-Butyläthylen-diamin-N,N',N'-triessigsäure, N,N'-Dimethyltetramethylen- 5s diamin-N,N'-diessigsäure, N-(2-Hydroxyäthyl)äthyIendi-amin-N,N',N'-triessigsäure, Äthylendiamin-N,N,N',N'-tetra-propionsäure und dergleichen. Die bevorzugten Chelatbildner sind Polyäthylendiamintetraessigsäuren, insbesondere die Äthylendiamin-N,N,N',N'-tetraessigsäure. 60

Im allgemeinen kann der Chelatbildner als freie Säure oder Alkalimetall- oder Ammoniumsalz verwendet werden. Bei Verwendung eines Salzes muss das Kation mit dem Kation des angestrebten Alkalimetall- oder Ammoniuminsulins identisch sein. Ferner muss die Menge an Kation, die aus der Verwen- 65 dung eines Salzes resultiert, bei der Ermittlung der geeigneten Menge an Alkalimetall- oder Ammoniumionen in Betracht gezogen werden.

Um das zweiwertige Metall vom Insulin zu trennen und eine rasche Kristallisierung des Alkalimetall- oder Ammoniuminsulins zu bewirken, beträgt das Molverhältnis von Chelatbildner zu zweiwertigem Metall des Metallinsulins mindestens 3:1. Bei geringeren Mengenverhältnissen wird die Kristallisationsgeschwindigkeit des Alkalimetall- oder Ammoniuminsulins aus der alkalischen Lösung vermindert. Ferner wird es bei geringeren Mengenverhältnissen wahrscheinlicher, dass mindestens etwas zweiwertiges Metall am Insulin gebunden bleibt.

Die Konzentration des Chelatbildners ist folglich mindestens 0,0002molar und bis zu 0.5molar. Bei einer Konzentration des zweiwertigen Metallinsulins von etwa 500 E/ml liegt die bevorzugte Konzentration des Chelatbildners bei etwa 0,01molar.

Die wässrig-alkalische Lösung des zweiwertigen Metallinsulins muss ferner Alkalimetall- oder Ammoniuionen enthalten. Dabei muss die Konzentration an Alkalimetall- oder Ammoniumionen von 0,2molar bis l,0molar betragen.

Die Alkalimetall- oder Ammoniumionen können durch beliebige wasserlösliche Verbindungen beigesteuert werden, die unter den Verfahrensbedingungen das Insulin nicht schädigen. Auch können die Alkalimetall- oder Ammoniumionen durch mehr als eine dieser wasserlöslichen Verbindungen beigesteuert werden. Selbstverständlich wird durch das Kation des angestrebten Alkalimetall- oder Ammoniuminsulins das zu verwendende Ion bestimmt.

Wie bereits erwähnt, kann ein Teil der benötigten Alkalimetall- oder Ammoniumionen durch Verwendung des Chelatbildners in Form eines Alkalimetall- oder Ammoniumsalzes eingeführt werden. Die erforderlichen Ionen können auch durch die basische Alkalimetall- oder Ammoniumverbindung

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eingeführt werden, mit der gewöhnlich der pH-Wert der Lösung auf die erforderliche Alkalinität eingestellt wird. Ferner können die Ionen durch ein Alkalimetall- oder Ammoniumsalz beigesteuert werden, dessen Anion z. B. das Chlorid, Bromid, Fluorid, Jodid, Acetat, Sulfat, Phosphat od. dgl. sein kann. Chloride und Phosphate werden bevorzugt, insbesondere die Chloride. Wie bereits erwähnt, sollen die verwendeten Alkalimetall- oder Ammoniumionen identisch sein mit dem Kation des angestrebten Alkalimetall- oder Ammoniuminsulins. Gewöhnlich werden die erforderlichen Ionen durch eine Kombination der drei genannten Zusätze bereitgestellt.

Im allgemeinen kann die wässrig-alkalische Lösung des erfindungsgemäss eingesetzten zweiwertigen Metallinsulins nach an sich bekannten Methoden hergestellt werden. Da sämtliche Bestandteile der wässrig-alkalischen Lösung unter den angewandten Bedingungen löslich sind, ist die Herstellungsweise der wässrig-alkalischen Lösung nicht kritisch.

Bei einer bevorzugten Methode zur Herstellung der wäss-rig-alkalischen Lösung des zweiwertigen Metallinsulins löst man das zweiwertige Metallinsulin in einem wässrig-sauren Medium und stellt den pH-Wert der resultierenden Lösung mit einer geeigneten Base alkalisch. Im allgemeinen können Chelatbildner und zusätzliche Alkalimetall- oder Ammoniumionen zu beliebigem Zeitpunkt als Feststoffe oder wässrige Lösungen zugesetzt werden. Bei Verwendung von Lösungen muss die Zunahme des gesamten Lösungsvolumens in Betracht gezogen werden, damit die erwünschten Endkonzentrationen der einzelnen Bestandteile erreicht werden.

Die wässrig-saure Lösung des zweiwertigen Metallinsulins sollte einen pH-Wert von 2,5 bis 3,5 aufweisen. Die Azidität der Lösung kann durch eine beliebige Mineralsäure eingestellt werden, wobei jedoch Salzsäure bevorzugt wird. Der bevorzugte pH-Wert beträgt etwa 3, er wird am einfachsten erhalten, indem man das zweiwertige Metallinsulin in verdünnter Salzsäure löst.

Falls erwünscht, kann die wässrig-saure Lösung des zweiwertigen Metallinsulins Konservierungsstoffe und/oder andere Stoffe, z. B. isotonische Mittel, enthalten. Beispiele für geeignete Konservierungsmittel sind Phenol, Methylparaben u. dgl., für isotonische Mittel Glycerin, Glucose u. dgl.

Die Menge an Konservierungsmittel kann bis zu 0,4% (Gewicht/Volumen) betragen, wobei eine bevorzugte Konzentration bei etwa 0,2 % liegt. Die Verwendung eines Konservierungsmittels empfiehlt sich, und Phenol wird zu diesem Zweck bevorzugt. Es wurde festgestellt, dass Phenol die Kristallisationsgeschwindigkeit des angestrebten Alkalimetall- oder Ammoniuminsulins erhöht.

Die wässrig-saure Lösung des zweiwertigen Metallinsulins wird dann mit einer geeigneten Base alkalisch gestellt. Im allgemeinen verwendet man ein Alkalimetall- oder Ammoniumhydroxyd, -carbonat oder eine ähnliche basische Verbindung. Man bevorzugt den Zusatz einer konzentrierten wässrigen Lösung des entsprechenden Hydroxyds, um eine übermässige Verdünnung der Metallinsulinlösung einerseits und Wärmentwicklung, wie z. B. bei festen Alkalimetallhydroxyden, anderseits zìi vermeiden.

Wie bereits erwähnt, können Chelatbildner und Alkalimetall- oder Ammoniumionen der Lösung des zweiwertigen Metallinsulins zu beliebigem Zeitpunkt zugesetzt werden. Beispielsweise kann man das zweiwertige Metallinsulin in verdünnter wässriger Salzsäure, die den Chelatbildner enthält, lösen. Ferner kann man den Chelatbildner der wässrig-sauren Lösung des zweiwertigen Metallinsulins direkt oder nach der Alkalizugabe zusetzen.

Gewöhnlich wird der Chelatbildner den sauren Lösungen in Form eine Alkalimetall- oder Ammoniumsalzes zugegeben. Wegen der erhöhten Wasserlöslichkeit empfiehlt sich eine vollständige Neutralisierung sämtlicher Carboxylgruppen im Chelatbildner. Der alkalischen Lösung hingegen wird der Chelatbildner gewöhnlich in Form der freien Säure zugesetzt.

Gemäss einer bevorzugten Methode zur Herstellung der wässrig-alkalischen Lösung des zweiwertigen Metallinsulins werden Alkalimetall- oder Ammoniumionen zusammen mit dem Chelatbildner zugesetzt. Weitere Ionen werden zugeführt, wenn die saure Lösung alkalisch gestellt wird. Die restlichen Ionen, die benötigt werden, werden durch Zugabe geeigneter Mengen eines Alkalimetall- oder Ammoniumsalzes zugeführt. Die Zugabe dieses Salzes erfolgt gewöhnlich vor dem Alkalischstellen, kann jedoch auch zu beliebigem Zeitpunkt durchgeführt werden, wie für den Fall des Chelatbildners beschrieben.

Eine weitere bekannte Methode zur Herstellung einer wässrig-alkalischen Lösung eines zweiwertigen Metallinsulins besteht darin, dass man das zweiwertige Metallinsulin in einem wässrig-alkalischen Medium von pH 8 bis 9,5 löst und die resultierende Lösung auf einen pH-Wert von 7,6 bis 8,6 einstellt. Die Alkalinität der Ausgangslösung wird gewöhnlich durch eine Alkalimetall- oder Ammoniumbase bewirkt. Die Verminderung der Alkalinität kann durch Zusatz von verdünnter Mineralsäure erfolgen, wobei Salzsäure und Phosphorsäure bevorzugt werden. Es sei beachtet, dass konzentriertere Lösungen an zweiwertigem Metallinsulin wegen der verminderten Löslichkeiten in alkalischen Lösungen schwieriger herzustellen sind als verdünnte Lösungen.

Der Zusatz des Chelatbildners und der Alkalimetall- oder Ammoniumionen kann zu beliebigem Zeitpunkt erfolgen. Gewöhnlich werden Chelatbildner und Alkalimetall- oder Ammoniumionen vor der endgültigen Einstellung des pH-Wertes zugegeben.

Sobald die wässrig-alkalische Lösung des zweiwertigen Metallinsulins zubereitet ist, kristallisiert das Alkalimetalloder Ammoniuminsulin aus der Lösung, gewöhnlich bei Raumtemperatur, obgleich man gegebenenfalls auch höhere oder niedrigere Temperaturen anwenden kann. Im allgemeinen sollte die Kristallisationstemperatur jedoch unterhalb etwa 30° C liegen.

Die Kristalle des Alkalimetall- oder Ammoniuminsulins werden nach bekannten Verfahren isoliert. Typischerweise werden die Kristalle abzentrifugiert und nacheinander mit verdünnter Alkalimetall- oder Ammoniumsalzlösung (gewöhnlich etwa 0,5molar), Aceton, absolutem Alkohol und Äther gewaschen. Dann werden sie im Vakuum getrocknet.

Beispiel 1

8 g Zinkinsulin aus etwa 70% Rinder- und 30% Schweineinsulin werden in 400 ml saurem Phenolwasser gelöst, welches durch Auflösen von 0,8 g Phenol in 400 ml 0,01n-wässri-ger Salzsäure hergestellt worden war. Die resultierende Lösung wird in 4 gleiche Portionen aufgeteilt, von denen jede mit 2,0 g Natriumchlorid versetzt wird. Die 4 Portionen werden als Proben 1 bis 4 bezeichnet. Zu drei der Proben wird Äthylen-diamintetraessigsäure-tetranatriumsalz (EDTA) wie folgt zugesetzt:

Probe EDTA

Menge (g) Molare Konz.

1 0 0

2 0.416 0,010

3 1,04 0.025

4 2,08 0,050

Jede Lösung wird mit 40%iger wässriger Natriumhydroxydlösung auf pH 8.2 eingestellt. Bei den Proben 2 bis 4 begann sofort die Bildung von kristallinem Natriuminsulin. In Probe 1 erschienen Kristalle erst nach 3stündigem Rühren.

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Die Probe 1 wurde mit O.lmolarer wässriger Äthylendi-amintetraessigsäure (als Tetranatriumsalz) titriert. Bei einer EDTA-Konzentration von etwa 0,006molar begann Kristallisierung des Natriuminsulins. Jede Probe wurde über Nacht gerührt. Dann wurden die Natriuminsulin-Kristalle abzentrifu-giert, einmal mit Aceton, zweimal mit absolutem Alkohol und einmal mit Äther gewaschen. Nach dem Trocknen im Vakuum wurden folgende Ausbeuten ermittelt:

Probe Ausbeute an Natriuminsulin

% E/mg

1 1,705 85,2 25,6

2 1,842 92,1 25,0

3 ' 1,929 96,4 23,5

4 1,971 98,5 23,5

Die Wirksamkeit des Natriuminsulins (und sämtlicher, gemäss den folgenden Beispielen erhaltenen Insuline) wurde im immunologischen Test nach der Methode von G. W.

Probst, et. al., J. Pharm. Sei., 55, 1408 (1966) ermittelt. Es ist zu beachten, dass die Standardabweichung bei dieser Methode ± 15 bis 25 % beträgt.

Beispiel 2

2 g gereinigtes Natriuminsulin (aus Rinderpankreas) mit einer Wirksamkeit von 27,0 E/mg, die geringe Mengen weniger saurer Protein-Verunreinigungen enthielten, wurden in 400 ml 0,5n~Essigsäure gelöst. Die resultierende Lösung wurde mit etwa 20 ml absoluten Alkohols und 0,4 ml einer 20%igen Zinkchloridlösung versetzt, wobei letztere 40 mg Zinkchlorid pro g Insulin entsprach. Der pH-Wert der Lösung wurde dann durch Zusatz von 20% Ammoniumhydroxyd auf 5,95 eingestellt und die Lösung wurde etwa 72 Std. auf etwa 5° C abgekühlt. Die gebildeten Zinkinsulin-Kristalle wurden abzentrifugiert, einmal mit destilliertem Wasser gewaschen und in 50 ml Säure/Phenolwasser, das gemäss Beispiel 1 hergestellt worden war, gelöst. Die Lösung wurde mit Säure/Phenolwasser auf 100 ml verdünnt, dann wurde 2,0 g Natriumchlorid (ergibt eine 0,34molare Natriumchloridlösung) und 0,208 g EDTA (als Tetranatriumsalz, ergibt eine 0,005molare EDTA-Lösung) zugesetzt. Das Gemisch wurde dann mit 40%iger wässriger Natriumhydroxydlösung auf pH 8,2 eingestellt. Sodann begann die Bildung von kristallinem Natriuminsulin, und die Krsitallisation wurde über Nacht bei Raumtemperatur fortgesetzt. Die Natriuminsulin-Kristalle wurden abzentrifugiert und, wie in Beispiel 1 beschrieben, gewaschen und getrocknet. Man erhielt eine Ausbeute von 1,864 g, entsprechend 93,2%. Die Wirksamkeit des Natriuminsulins betrug 27,0 E/mg.

Proben des als Ausgangsmaterial verwendeten Natriuminsulins und des Produkts von Beispiel 2 wurden durch Gelelektrophorese mit Polyacrylamid-Scheiben nach dem Verahren von L. Jackson, et. al., Diabetes, 21, 235 (1972) analysiert.

Fig. 1 zeigt die Elektrophorese des Ausgangsmaterials, Fig. 2 die des Endproduktes. Bei diesen Figuren bezeichnet 1 das Polyacrylamidgel, 2 und 3 sind die insulin-fremden Proteine und 4 und 5 bezeichnen Insulin und insulin-artige Proteine.

Beispiel 3

Das Verfahren von Beispiel 2 wird wiederholt mit der Abweichung, dass als Ausgangsmaterial Natriuminsulin aus

Schweinepankreas mit einer Wirksamkeit von 25,0 E/mg verwendet wird. Die Endausbeute betrug 1,862 g, entsprechend 93,1 %, mit einer Wirksamkeit von 28,9 E/mg.

Ausgangsmaterial (Fig. 3) und Endprodukt (Fig. 4) von Beispiel 1 wurden durch Gelelektrophorese wie in Beispiel 2 analysiert. In den Fig. 3 und 4 werden mit 1 das Polyacrylamidgel, mit 6, 7 und 8 die insulin-fremden Proteine und mit 9 und 10 Insulin oder insulin-ähnliche Proteine bezeichnet.

Aus den Fig. 1 und 4 ist ersichtlich, dass durch das erfin-dungsgemässe Verfahren insulin-fremde Proteine entfernt werden. Diese Verbesserung der Reinheit des Alkalimetall-oder Ammoniuminsulins ist aus der Wirksamkeit und anderen Daten allein nicht erkennbar.

Beispiel 4

6 g Zinkinsulin-Kristalle (70% aus Rinderpankreas, 30% aus Schweinepankreas) werden in 300 ml Säure/Phenolwasser, hergestellt nach Beispiel 1, gelöst. Zu 100 ml dieser Lösung werden 2,5 g (0,033 Mol) Kaliumchlorid gegeben. Der pH-Wert der schwach trüben Lösung wird mit 3,5 ml 10%iger wässriger Kaliumhydroxydlösung auf 8,2 eingestellt. Zur resultierenden trüben Lösung werden dann 0,3 g (0,001 Mol) Äthylendiamintetraessigsäure zugegeben. Sodann wird der pH-Wert der Lösung mit 10%iger Kaliumhydroxydlösung wieder auf stabil 8,2 eingestellt. Die Lösung wird 48 Std. bei Raumtemperatur (etwa 25° C) gerührt, wobei die Kristallisierung während der ersten 12 Std. einsetzt. Das resultierende Kaliuminsulin wird abzentrifugiert, zweimal mit absolutem Alkohol und einmal mit Äther gewaschen und im Vakuum getrocknet. Die Ausbeute an Kaliuminsulin beträgt 1,736 g (86,8%), Wirksamkeit 24,9 E/mg, Kaliumgehalt 1,48%, Feuchtigkeitsgehalt 10,1%.

Beispiel 5

Zu 100 ml der Zinkinsulinlösung von Beispiel 4 werden 1,4 g (0,033 Mol) Lithiumchlorid zugegeben. Die Lösung wird durch Zusatz von 6,2 ml ln-Lithiumhydroxydlösung auf pH 8,2 eingestellt. Dann wird die trübe Lösung mit Äthylendiamintetraessigsäure behandelt und der pH wird mit ln-Lithiumhydroxydlösung auf 8,2 eingestellt, worauf das Verfahren von Beispiel 4 angeschlossen wird. Auch die Kristallisierung erfolgt gemäss Beispiel 4, mit ähnlichen Ergebnissen. Das resultierende Lithiuminsulin wird wie in Beispiel 4 beschrieben gesammelt, wobei man eine Ausbeute von 1,234 g (61,6%) erhält, Wirksamkeit 27,8 E/mg, Lithiumgehalt 2,37% und Feuchtigkeitsgehalt 3,6%.

Beispiel 6

Das Verfahren von Beispiel 5 wird wiederholt, mit der Abweichung, dass man das Lithiumchlorid durch 1,8 g Ammoniumchlorid und das Lithiumhydroxyd durch 60 ml ln-Ammoniumhydroxydlösung ersetzt. Nach Zugabe der Äthylendiamintetraessigsäure und Einstellung des pH-Wertes mit ln-Ammoniumhydroxydlösung erfolgt nach Ablauf von 24 Std. keine Kristallisierung. Es werden weitere 1,8 g Ammoniumchlorid zugegeben, dann tritt Kristallisation nach 24stündigem Rühren ein. Das resultierende Ammoniuminsulin wird wie in Beispiel 4 beschrieben isoliert, Ausbeute 1,018 g (50,9%), Wirksamkeit 27, 6 E/mg, Feuchtigkeitsgehalt 7,3 %. Das Insulin liefert 0,08% sulfatierte Asche.

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1 Blatt Zeichnungen

Claims

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2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als zweiwertiges Metall Mangan, Eisen, Kobalt, Nickel, Kupfer, Zink oder Cadmium verwendet.

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PATENTANSPRÜCHE 1. Verfahren zur Herstellung eines Alkalimetall- oder Ammoniuminsulins, dadurch gekennzeichnet, dass man

A. eine wässrig-alkalische Lösung herstellt, welche ein Metallinsulin eines zweiwertigen Metalls, einen Chelatbildner für zweiwertiges Metallion und Alkalimetall- und/oder Ammoniumionen enthält, wobei die Konzentration an zweiwertigem Metallinsulin 10 bis 1000 E/ml beträgt, das zweiwertige Metall ein Element der Gruppen V1IB, VIII, IB oder IIB des periodischen Systems ist, die Konzentration an Alkalimetall- oder Ammoniumionen 0,2 bis l,0molar ist, der pH-Wert der Lösung 7,6 bis 8,6 beträgt, die Konzentration des Chelatbildners 0,0002 bis 0,05molar ist, das Molverhältnis zwischen Chelatbildner und zweiwertigem Metall in zweiwertigem Metallinsulin mindestens 3 :1 beträgt und der Chelatbildner die allgemeine Formel

R\

Ra

N-(CHa) ~ (CH x; -(CHs)

m

I

Rs n

N-(CHa)

R<

I ,Rs

XRs aufweist, worin Rt und Rs einwertige organische Reste darstellen, die unabhängig voneinander Carboxymethyl, Carboxy-äthyl, Q-Ca-Alkyl oder Ci-C6-Hydroxyalkyl bedeuten, R2 und R6 einwertige organische Reste darstellen, die unabhängig voneinander Carboxymethyl oder Carboxyäthyl darstellen, R3 einen der einwertigen Substituenten Wasserstoff, Hydroxyl oder Ci-C6-Alkyl, R4 einen der einwertigen Substituenten Wasserstoff, Carboxymethyl oder Carboxyäthyl, m eine ganze Zahl von 1 bis 6, n die Zahl 0 oder 1, p die Zahl 0 oder 1, r eine ganze Zahl von 2 bis 6 und s eine ganze Zahl von 0 bis 2 darstellen und

B. das Alkalimetall- oder Ammoniuminsulin kristallisiert.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man als zweiwertiges Metall Zink verwendet.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Alkalimetallinsulin kristallisiert.

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5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass man Natriuminsulin kristallisiert.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Chelatbildner Äthylendiamin-N,N,N',N'-tetraes-sigsäure oder ein Alkalimetall- oder Ammoniumsalz davon

25 verwendet.
7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die wässrig-alkalische Lösung des zweiwertigen Metallinsulins ein Konservierungsmittel in einer Menge bis zu 0,4 Gewichts/Volumen-Prozent enthält.

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8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Lösung Phenol enthält.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Phenolkonzentration 0,2% beträgt.