LU84327A1 - Verfahren zur herstellung von humanisulin,threoninderivaten,salzen oder komplexen davon - Google Patents

Description

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Prioritätsbeanspruchung einer Patentanmeldung ein- ±J ' v,^w ’y gereicht in Dänemark am 10. August 1981 unter Nr.

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Patentanmeldung NOVO INDUSTRI A/S Novo Allé

DK - 2880 BAGSVAERD

Verfahren zur Herstellung von Humaninsulin,

Threoninderivaten, Salzen oder Komplexen davon c

Es sind verschiedene Verfahren zur Herstellung * von Humaninsulin bekannt. Beispiele solcher

Verfahren sind inter àlia, die Extraktion aus Humanpancreas, die Synthese aus entsprechenden Aminosäuren, gen-technische Prozesse und die Konversion von Schweineinsulin in Humaninsulin.

Einige der Verfahren zur Konversion von Schweineinsulin in Humaninsulin verlaufen via Schweine- des-octapeptid-(B23-B30)-Insulin und andere ver- B30 laufen via des (Ala )-Insulin.

Speziell betrifft nun diese Erfindung die Kon- B30

Version von Schweine-des(Ala )-Insulin in * B30

Humaninsulin via einem Threonin -Derivats von Humaninsulin.

) - 2 -

Bei der Behandlung von Diabetes mellitus werden im allgemeinen Insulinpräparate auf der Basis von Schweine- oder Rinder-Insulin eingesetzt.

Rinder-, Schweine- und Human-Insulin zeigen kleinere Differenzen hinsichtlich ihres Amino-säureaufbaus. Die Differenz zwischen Human- und Schweine-Insulin ist auf eine einzige Aminosäure begrenzt: Die B30-Aminosäure von Humaninsulin ist Threonin, währenddem die gleiche Aminosäure bei Schweineinsulin Alanin ist.

Ein Verfahren zur Herstellung von Human-Insulin B30 aus des(Ala )-Insulin wird in der veröffentlichten europäischen Patentanmeldung Nr. 80 101 966 beschrieben (siehe dazu auch Nature 280 (1979),

Seite 412 ). Gemäss der genannten Patentanmeldung , wird die Amidierung bevorzugterweise in einem

Medium ausgeführt, das 0 bis 65, speziell bevorzugterweise 40 bis 60 % eines organischen Lösungsmittels enthält. Weiter liegt die bevorzugte Reaktionstempe-i ratur zwischen 20 und 40°C, wobei in allen Beispielen i eine Temperatur von 37°C eingehalten wird. Die Aus- ; beute der Verkupplung war, gemäss den drei Bei spielen, 75, 80 und ungefähr 50 %. Die genannte Aus-i i beute wurde übrigens mittels Hochdruckflüssig- | „ . Chromatographie bestimmt. Gemäss der angegebenen ί ‘ Veröffentlichung in Nature betrug die Ausbeute 73 %.

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t \ ; - 3 -

Ein weiteres Verfahren für die Herstellung von B30

Humaninsulin aus des(Ala )-Insulin ist beschrieben in"Proceedings of the 2nd International Insulin Symposium"/Aachen, BRD, 1979. Gemäss dieser Veröffentlichung wurde die Amidierung in einem Medium ausgeführt, welches ungefähr 60 % organisches Lösungsmittel enthält. Die Reaktionstemperatur lag bei 38°C. Die Ausbeute, welche wiederum mittels HPLC bestimmt wurde, lag bei 67 %.

Noch ein weiteres Verfahren zur Herstellung von B30

Humäninsulin aus des(Ala )-Insulin ist beschrieben in "Proceedings of the 16th European Peptide Symposium, HelsingjzSr, Dänemark, 1980".

Gemäss dieser Veröffentlichung wurde das Verfahren * in einem Medium ausgeführt, welches ungefähr 60 % organisches Lösungsmittel enthielt. Wahrscheinlich lag die Reaktionstemperatur bei 37°C. Nach einer Reaktionszeit von 30 Minuten betrug die Ausbeute 85 %.

Nach 22 Stunden betrug der entsprechende Wert jedoch nur noch 70 %.

Eine der Gründe für die niederen Ausbeuten der bekannten Verfahren liegt im Verlust von Insulin wegen - > unerwünschten Nebenreaktionen, beispielsweise der w 2 1

Bildung von DQI-Thr(R )-OR . ln dieser Formel steht DOI für Schweine-des-Üctapeprid-(B23-B30)-Insulin, 1 2 « und R und R für die obengenannten Substituenten.

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i - 4 -

Das Ziel der hier beschriebenen Erfindung war es, ein Verfahren zu finden, mittels dem die Ausbeute an Reaktionsprodukten extrem gesteigert werden konnte, bevorzugterweise auf über 90 %.

Es ist nun überraschenderweise gefunden worden , dass eine solche Ausbeute dann erreichbar ist, wenn die Wasserkonzentration in der Reaktionsmischung viel tiefer liegt als diejenige der bekannten Verfahren. Ebenso werden die gesuchten hohen Ausbeuten erreicht, wenn die Umsetzungen bei niedrigeren Temperaturen als diejenigen der bekannten Prozesse, ausgeführt werden.

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Das Verfahren gemäss dieser Erfindung umfasst die B30

Umsetzung von des(Ala )-Insulin eines Salzes oder eines Komplexes davon mit einem L-Threonin-derivat der allgemeinen Formel (I)

Thr(R2)-OR1 (I) oder eines Salzes davon, in der R^ für eine Carboxylrest-Schutzgruppe und 2 R für Wasserstoff oder eine Hydroxylrest-Schutz-gruppe stehen, in einer Mischung aus Wasser, aus einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel und aus Trypsin, wobei der Gehalt an Wasser in der Reaktionsmischung zwischen 10 und 30 Vol.-l liegt. Die bevorzugte Reaktionstemperatur liegt etwa zwischen 0° und etwa zwischen Raumtemperatur, d.h. ungefähr bei 20°C bis 25°C.

/ i - 5 -

Das erfindungsgemässe Verfahren kann so ausgeführt werden, dass des(Ala^^^^-Insulin, ein L-Threoninderivat der Formel (I) und Trypsin zusammen in einer Mischung aus Wasser und mindestens einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel gelöst werden, gegebenenfalls in Anwesenheit einer Säure.

Die organischen Lösungsmittel, welche im erfin-dungfigemässen Verfahren eingesetzt werden können, sind polare Lösungsmittel, die mit Wasser mischbar sind. Es sind zugleich bevorzugterweise jene Lösungsmittel, welche Insulinverbindungen und Threoninester in hoher Konzentration zu lösen vermögen. Beispiele solcher geeigneter organischer Lösungsmittel sind aprotische Lösungsmittel, wie N,N-Dimethylformamid, Ν,Ν-Dimethylacetamid, N-* Methylpyrrolidon, Hexamethylphosphortriamid,

Dimethylsulfoxid, Dioxan, Aceton, Tetrahydrofuran, Formamid und Acetonitril und protische Lösungsmittel wie Aethanol, Methanol, 2-Propanol und 1,2-Aethandiol. Die Natur des Lösungsmittels beeinflusst das System als Ganzes und ein Zusammenhang zwischen einem bestimmten Lösungsmittel und einem hohen Amidierungsgrad kann nicht auf ein anderes Lösungsmittel übertragen werden. Die besten Ausbeuten wurden erhalten mit aprotischen Lösungsmitteln und solche v Lösungsmittel sind daher die bevorzugten bei der

Ausführung des erfindungsgemässen Verfahrens.

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Je nach verwendetem organischen Lösungsmittel, nach gewählter Reaktionstemperatur und ob Säure anwesend ist oder nicht, sollte der Wassergehalt in der Reaktionsmischung zwischen 10 und 30 Vol.-%, bevorzugterweise zwischen 15 und 25 Vol.-% betragen.

Ein Vorteil des verringerten Wassergehaltes in der Reaktionsmischung ist die Verhütung von Nebenreaktionen. Auch durch Erhöhen des Säuregehaltes in der Reaktionsmischung wird der gleiche Effekt erreicht. Die Erhöhung an Ausbeute korreliert positiv mit einem niederen Gehalt an Wasser in der Reaktionsmischung.Um die Denaturierung des Enzyms in der Reaktionsmischung wegen dem niedrigen Wassergehalt zu verhüten, sollte die Reaktionstemperatur um einiges tiefer liegen als die Reaktionstemperatur von bekannten Verfahren in der Peptidsynthese mit Trypsin, d.h. tiefer als ungefähr 37°C liegen.

Der Trypsintyp ist nicht kritisch für die Ausführung des erfindungsgemässen Verfahrens. Trypsin ist ein gut charakterisiertes Enzym, welches in hoher Reinheit kommerziell erhältlich ist und zwar vor allem aus Rinder- oder Schweine-Präparaten. Es kann aber auch Trypsin von mikrobieller Herkunft eingesetzt werden. Zudem ist auch die Form des Trypsins für die Ausführung des erfindungsgemässen Verfahrens nicht kritisch, d.h. das Enzym kann kristallin (lösliche Form), immobilisiert oder sogar als Derivat (solange die Trypsinaktivität beibehalten wird) vorliegen. Der Ausdruck "Trypsin” wird hier verwendet, um die Trypsine » aller Herkünfte und in allen Formen zu umfassen, * - 7 - welche die Amidierungsaktivität beibehalten. Der Ausdruck umfasst also auch Proteasen mit trypsinähnlicher Spezifizität, beispielsweise Achromabacter lyticus protease; siehe dazu Agric. Biol. Chem. 42,

Seite 1443.

Als Beispiele für aktive Trypsinderivate können die folgenden genannt werden: acetyliertes Trypsin, succinyliertes Trypsin, Glutaraldehyd-behandeltes Trypsin und immobilisierte Trypsinderivate. Falls ein immobilisiertes Trypsin verwendet wird, wird es im Reaktionsmedium suspendiert.

Organische oder anorganische Säuren wie Salzsäure, Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure und Buttersäure und/oder Basen wie Pyridin, TRIS, N-Methyl-morpholin und N-Aethylmorpholin können dem Reaktionsmedium zugegeben werden, um ein geeignetes Puffer- 4

System zu schaffen. Organische Säuren werden dabei bevorzugt. Die Reaktion kann jedoch auch ohne solche Zusätze durchgeführt werden. Die Menge der zugegebenen Säure ist normalerweise kleiner als ungefähr 10 Aeguivalente pro Aequivalent L-Threoninderivate der Formel (I). Bevorzugterweise beträgt die Menge an Säure zwischen 0,5 und 5 Aeguivalente pro Aequivalent L-Threoninderivate der Formel (I). Ionen, welche Trypsin zu stabilisieren vermögen, wie beispielsweise Calciumionen, können ebenfalls in Form ihrer Salze zugegeben • werden.

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Das Verfahren kann bei Temperaturen im Bereich zwischen ungefähr 37°C und dem Gefrierpunkt der Reak-! tionsmischung durchgeführt werden. Enzymatische ! Reaktionen mit Trypsin werden normalerweise bei ungefähr 37°C durchgeführt, um so eine genügend hohe Umsatzgeschwindigkeit zu erreichen. Um jedoch die Inaktivierung von Trypsin zu vermeiden, ist es von Vorteil, das erfindungsgemässe Verfahren bei Temperaturen unterhalb der Umgebungstemperatur durchzuführen. Praktisch werden Reaktionstemperaturen von oberhalb ungefähr 0°C bevorzugt.

Die Reaktionszeit liegt normalerweise zwischen einigen Stunden und einigen Tagen, je nach Reaktions-* temperatur und je nach der Menge zugesetzten Trypsins.

Auch andere Reaktionsparameter können auf die Reaktionsdauer einen Einfluss haben.

I . Zu einem grossen Ausmass wird die Wirkung von Trypsin durch die gegenseitige Beeinflussung von Wasser und j Lösungsmittel kontrolliert. Die gleiche Wirkung hängt j aber auch vom Säure/Base-Verhältnis und von der

Reaktionstemperatur ab. Diese Reaktionsbedingungen werden so gewählt, dass die Amidierungswirkung begünstigt wird und unerwünschte Webenreaktionen, die i ebenfalls durch das Trypsin katalysiert werden, unter- I drückt werden. Die Verringerung des Wassergehaltes in der Reaktionsmischung zeigt die beiden zuletzt ge-| nannten positiven Wirkungen,führt aber auch zu einer ; Erhöhung der Geschwindigkeit, welche zur irreversiblen jj Denaturierung von Trypsin führt. Der zuletztgenannten ^ Einwirkung kann jedoch zumindest teilweise dadurch ent- i l - 9 - h " gegengewirkt werden, dass die Reaktionstemperatur erniedrigt wird. Durch die Erniedrigung der Reaktionstemperatur wird zwar auch die Amidierungs-geschwindigkeit kleiner, aber dieser Nachteil wird einfach durch Verlängerung der Reaktionsdauer wiede rgutgemach t.

Das Gewichtsverhältnis zwischen eingesetztem Trypsin B30 und des(Ala )-Insulin in der Reaktionsmischung liegt normalerweise ungefähr oberhalb 1:200, speziell bevorzugterweise oberhalb etwa 1:50 und unterhalb etwa 1:1.

B30

Die Threonin rDerivate von Humaninsulin, welche aus der genannten Amidierung resultieren, können durch die folgende allgemeine Formel (II) dargestellt werden: (Thr(R2)-OR1)B3°-h-In (II).

B3Û

Darin steht h-In für den Human-des(Thr )-Insulinrest 1 2 und R und R sind gleich definiert wie vorne in der Beschreibung.

Einsetzbare L-Threoninderivare der Formel (I) sind solche, in denen R3 eine Carboxylrest-Schutzgruppe ist, die B 3 0 vom Threonin -Ester des Humaninsulin (Verbindung der Formel II) entfernt werden kann, ohne dass dabei, die Insulinmolekel irreversibel und wesentlich geändert werden. Beispiele solcher Carbcxylrest-Schutzgruppen sind folgende: Niederalkyl wie Methyl, Aethyl und tert-Butyl, substituierres Benzyl wie ρ-Methoxybenzyl und -10- * 2,4,6-Trimethylbenzyl und Diphenylmethyl sowie 3

Gruppen der allgemeinen Formel -CH2 CH2S02R , mit Niederalkyl wie Methyl, Aethyl, Propyl | und n-Butyl. Geeignete Hydroxylrest-Schutzgruppen 2 B30 R sind solche, welche vom Threohin -Derivat von Humaninsulin (Verbindung der Formel II) so 8 s abgespalten werden können, dass dabei keine irreversible und wesentliche Aenderung in der

Insulinmolekel aüftritt. Ein Beispiel einer 2 solchen Gruppe R ist tert-Butyl.

Der Ausdruck "Niederalkyl" steht hier für solche Gruppen mit weniger als 7 C-Atomen, bevorzugterweise weniger als 5 C-Atomen.

Weitere Schutzgruppen, die eingesetzt werden können, sind solche aus "Wünsch : Methoden der ! . Organischen Chemie " (Houben-Weyl), Band XV/1, herausgegeben von Eugen Müller, Georg Thieme Verlag, ! Stuttgart, 1974.

B30 ! Ein Verfahren für die Herstellung von des(Ala )-

Insulin ist auch in "Hoppe-Seyler1s Zeitschrift !für Physiol. Chemie 359” (1978), Seite 799, ff. beschrieben.

Einige der L-Threonin-Derivate der Formel (I) sind Ü bekannte Verbindungen; die anderen L-Threonin- ή Derivate können mittels analoger Verfahren erhalten l , werden.

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Si i - 11 -

Die L-Threonin-Derivate der Formel (I) können entweder als freie Basis vorliegen oder, zusammen mit geeigneten organischen oder anorganischen Säuren, als Salze davon. Bevorzugt sind dabei die Acetate, die Propionate, die Butyrate und die Hydrohalogenide, beispielsweise die Hydrochloride .

Bevorzugt werden die Reaktionsteilnehmer, d.h.

B3 0 das des(Ala )-Insulin und die L-Threoninderivate der Formel (I) in hohen Konzentrationen eingesetzt.

Das Molverhältnis zwischen dem L-Threoninderivat B 30 der Formel (I) und dem des(Ala )-Insulin liegt bevorzugterweise etwa oberhalb 5:1.

Die Konzentration des L-Threoninderivats der Formel (I) in der Reaktionsmischung sollte bevorzugterweise höher als 0,1 molar sein.

ß30~

Von den Threonin Derivaten von Humaninsulin (Verbindungen der Formel II) kann das Humaninsulin mittels Entfernen der Schutzgruppen R^ und all- 2 fällig vorhandener Schutzgruppen R erhalten werden und zwar mittels an und für sich bekannter Methoden.

Falls R Methyl, Aethyl oder eine der Gruppen 3 3 -C^C^SC^R mit R gemäss obiger Definition ist, kann die genannte Schutzgruppe in schwach basischen Bedingungen in einem wässrigen Medium entfernt werden. Bevorzugterweise wird dabei bei einem pH-, Wert zwischen 8 bis 12, speziell bei etwa 9,5 gearbeitet. Als Bassi können eingesetzt werden: », ' - 12 -

Ammoniak, Triäthylamin, Bi carbona t/Carb.on a t-Puffer oder Hydroxide von Alkalimetallen wie Natriumhydroxid. Falls tert-Butyl , substituiertes Benzyl wie p-Methoxybenzyl oder 2,4,6-Trimethylbenzyl' oder Diphenylmethyl ist, kann - die genannte Schutzgruppe mittels Acidolyse entfernt werden, und zwar bevorzugterweise mit Trifluoressigsäure. Die Trifluoressigsäure kann Wasser enthalten oder auch nicht; sie kann aber auch mit einem organischen Lösungsmittel verdünnt sein wie beispielsweise Dichlormethan. Wenn R^ tert-Butyl ist, kann diese Schutzgruppe ebenfalls mittels der oben beschriebenen Acidolyse entfernt werden.

B3 0

Bevorzugte Threonin -Derivate von Humaninsulin der Formel (II) sind diejenigen Verbindungen, in 2 denen R Wasserstoff ist. Diese Verbindungen werden hergestellt aus L-Threoninderivate der Formel 2 (I), in denen R schon Wasserstoff ist.

Als Beispiele für Komplexe oder Salze von des(Ala®^^-Insulin kann das Zinksalz oder der Zinkkomplex davon angegeben werden.

Wenn die Reaktionsbedingungen gemäss dem oben Gesagten ausgewählt werden, und wenn auch die Angaben der folgenden Beispiele dabei berücksichtigt werden, ist B30 es möglich, eine Ausbeute von Threonin -Derivate „ von Humaninsulin (Verbindung der Formel II) zu erhalten, welche über 90 %, ja sogar über 95 % liegt.

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Eine bevorzugte Methode für die Herstellung von B30

Human-Insulin, ausgehend von einem Threonin

Derivat von Humaninsulin, ist die folgende: 1) Falls irgendwelche Rest-Trypsinaktivitäten nach der Amidierung vorliegen, ist es von Vorteil, wenn diese entfernt werden. Dies kann beispielsweise so geschehen, dass die Zustandsbedingungen derart verändert werden, dass Trypsin inaktiviert wird. Praktisch bedeutet das, dass man zum Beispiel in einem sauren Medium, und zwar unterhalb dem pH-Wert 3, arbeitet. Trypsin kann aber auch mittels Abtrennmethoden entfernt werden, die gemäss dem Molekulargewicht agieren, beispielsweise mittels Gelfiltration an"Sephadex G-50"-Gel oder an "Bio-Gel P-30"-Gel in Essig- . säure; siehe wiederum Nature 280, loc, cit.

B30 2) Unreinheiten wie nicht umgesetztes des(Ala )-Insulin können mittels Anionen- und/oder Kationen-Austausch-Chromatographie entfernt werden.

B 3 0 3) Anschliessend wird das Threonin -Derivat von Humaninsulin (Verbindung der Formel II) . . deblockiert und das Humaninsulin isoliert, beispielsweise mittels Kristallisierung und zwar gemäss Methoden, die an und für sich bekannt sind.

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Das so erhaltene Humaninsulin ist schon von einer annehmbaren pharmazeutischen Reinheit; es kann aber gemäss bekannter Methoden weiter gereinigt werden.

Abkürzungen in dieser Beschreibung sind im Sinne der IUPAC-IUB Rules, Commission on Bio-chemical Nomenclature, 2nd Edition, Maryland 1975, eingesetzt und sollen auch entsprechend verstanden werden.

Jeder neue Gesichtspunkt in dieser Beschreibung sowie auch Kombinierungen solcher Gesichtspunkte werden.als wesentlich betrachtet.

Das erfindungsgemässe Verfahren für die Herstellung von Humaninsulinderivaten und Humaninsulin wird im folgenden anhand von Beispielen weiter erläutert. Diese Beispiele sind nicht als Limitierung des Erfindungsgedankens zu betrachten, sondern zeigen nur einige bevorzugte f Ausführungsformen der Erfindung.

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Λ y - 15 -

Beispiel 1 B30 10 mg Schweine-des (Ala )-Insulin wurden in 100 pl einer 10 M-Essigsäurelösung gelöst. Zu 50 P1 dieser Lösung wurden gegeben: 100 μΐ einer 2 M Thr-OMe (Me steht für Methyl)-Lösung in N,N-Dimethylacetamid, 60 μΐ NfN-Dimethylacetamid, 15 pl Wasser und 10 pl einer Lösung von Trypsin (8 % Gew./Vol.) in einer 0,05 M Calciumchloridlösung. Die Mischung wurde 24 Stunden lang bei 4°c inkubiert. Anschliessend wurde das Produkt mit 8 ml Aceton ausgefällt, mittels Zentrifugierung isoliert, mit 8 ml Aceton gewaschen, mittels Zentrifugierung wieder isoliert und dann in vacuo getrocknet. Die Ausbeute an B3 0

Thr-OMe -h-In wurde mittels HPLC bestimmt.

Das Produkt wurde anschliessend in 2 ml einer , 1 M Essigsäurelösung gelöst. 100 pl dieser Lösung wurden auf eine Kolonne von 4 x 200 mm gegeben, die mit "Nucleosil 5 C10" beschickt war. Das Material X o wurde einer Umkehrphase-HPLC unterworfen, wobei als Eluent eine 0,2 M Ammoniumsulphat-Pufferlösung verwendet wurde, die auf einen pH-Wert von 3,5 eingestellt war. Die gleiche Lösung enthielt 26,8 Vol.-% Acetonitril. Bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 1 ml/Min. wurde nach 18 Minuten B3 0 des(Ala )-Insulin eluiert und, nach 24 Minuten, B30 > Thr-OMe -h-In. Das Nebenprodukt der Reaktion, d.h.

B2 3 das Thr-OMe “'"-des-heptapeptid- (B24-B30) -Insulin wurde nach 7 Minuten eluiert. Die qualitative und quantitative Bestimmung der Proteine wurde ausgeführt aufgrund der Extinktion der verschiedenen Lösungen bei 280 nrc. Die Analyse ergab die folgende T- Verteilung der Verbindungen: o - 16 - (Thr-OMe) “ 97,1 % des(AlaB3°)-Insulin: 2,5 % / , ,B23-des-heptapeptid (B24-B30)- (Thr-OMe) r r r

Insulin: 0,4 %

Beispiele 2 bis 16:

Die Beispiele 2 bis 16, deren Parameter und Resultate in der folgenden Tabelle 1 zusammengestellt sind, wurden analog dem Beispiel 1 ausgeführt. Die Reaktions-parameter, die gegenüber dem Beispiel 1 verschieden sind, sind in der genannten Tabelle aufgeführt. In allen Beispielen wurden 10 pl einer 8 %-igen Trypsinlösung in Wasser, 100 pl eines organischen Lösungsmittels mit dem Threonin-Derivat der Formel (I) und B30 50 pl Essigsäure mit 20 % des(Ala )-Insulin zugegeben. Die Molarität des Threoninderivates der Formel (I) im genannten organischen Lösungsmittel und in der Essigsäurelösung ist ebenfalls in Tabelle 1 angegeben. Die Reaktionsdauer betrug 24 Stunden.

In Tabelle 1 werden die folgenden Abkürzungen verwendet : HOAc ist Essigsäure, DMAA ist N,N-Dimethylacetamid, DMF ist Κ,Ν-Dimethylformamid, DMSO ist Dimethylsulfoxid, NMP ist N-Methylpyrrolidon und THF ist Tetrahydrofuran.

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In demjenigen Fall, in dem Thr-OBut) -h-In synthetisiert wurde,(Beispiel 15) wurde eluiert unter Verwendung einer Gradientenlösung in Acetonitril.und zwar von 26,8 bis 40 Vol.-%. i —j-f $ / i - 18 - , u P , 0 i oonooooooo^-^ir^-oo P 0 C tn ^ΟΙΗ(ΝΟίΓΊΟΙΓ\1ο|(Ν|[\ΙοιοΐΓΊΜ ä SSS §' m tu -P xj Q) (Λ -P V ο en m μ (3 en s a sut CN 0 K KK-KffiWKKtCKEKKSKm

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Beispiele 17 bis 34

Diese Beispiele wurden analog den Beispielen 1 bis 16 ausgeführt mit der Ausnahme, dass die Reaktionsdauer nur 4 Stunden betrug. In allen diesen Beispielen wurden jedoch praktisch die gleichen Ausbeuten erreicht wie diejenigen der Beispiele 1 bis 16.

Daraus folgt, dass das erfindungsgemässe Verfahren unter anderem sich von den bekannten Verfahren dadurch unterscheidet, dass die Zeitabhängigkeit der Ausbeute ausgeschaltet wird.

Beispiel 35 * B 3 0 250 mg kristallines(Thr-OMe) -h-In wurden in 25 ml Wasser dispergiert und durch Zugabe von 1 N Natriumhydroxidlösung bis zu einem pH-Wert von 10,0 in Lösung gebracht. Der pH-Wert wurde 24 Stunden lang konstant auf 10,0 gehalten; die Temperatur betrug 25°C. Das dabei gebildete Humaninsulin kristallisierte nach Zugabe von 2 g Natriumchlorid, 350 mg Natrium-acetattrihydrat und 2,5 mg Zinkacetatdihydrat und einer anschliessenden Zugabe von 1 N Salzsäurelösung, um einen pH-Wert von 5,52 zu erhalten, aus. Nach Lagerung des Produktes während 24 Stunden bei 4°C wurden die rhombohedralen Kristalle mittels Zentrifugierung abgetrennt, mit 3 ml Wasser gewaschen, durch Zentrifugierung isoliert und in vacuo getrocknet. Die Aus-> beute betrug 220 mg Humaninsulin.

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Claims (23)

1. Verfahren zur Herstellung von Human-Insulin oder Threoninderivaten, Salzen oder Komplexen davon, B30 mittels Umsetzung von Schweine-des (Ala )-Insulin oder eines Salzes oder eines Komplexes davon mit einem L-Threoninderivat der Formel (I) < Thr(R2) - OR1 (I), oder mit einem Salz davon, ' 1 worin R für eine Carboxylrest-Schutzgruppe und 2 R für Wasserstoff oder eine Hydroxylrest-Schutz-gruppe stehen, in einer Mischung aus Wasser, aus einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel und aus Trypsin, dadurch gekennzeichnet, dass der Gehalt an Wasser in der Reaktionsmischung zwischen 10 und 30 Vol.-% liegt und dass die Reaktionstemperatur unter 37°C liegt, wobei gegebenenfalls zusätzlich Säure in der Mischung vorhanden ist, wonach das resultierende Derivat, falls gewünscht, deblockiert wird, um die Form des Human-Insulins zu erhalten. * j i * - 21-

2. Verfahren gemäss Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration an L-Threonin-derivat der Formel (I) in der Reaktionsmischung mehr als 0,1 molar ist, dass die Reaktionstempe-ratur über dem Gefrierpunkt der Mischung liegt und dass die Reaktionsmischung nicht mehr als

3. Verfahren gemäss irgendeinem der vorangehenden Patentansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktionstemperatur unterhalb ungefähr der Raumtemperatur und oberhalb ungefähr 0°C liegt.

4. Verfahren gemäss irgendeinem der vorangehenden , Patentansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Gehalt an Wasser in der Reaktionsmischung unterhalb 25 Vol.-% liegt.

5. Verfahren gemäss irgendeinem der vorangehenden Patentansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Gehalt an Wasser in der Reaktionsmischung oberhalb 15 Vol.-% liegt.

6. Verfahren gemäss irgendeinem der vorangehenden ' Patentansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das molare Verhältnis zwischen dem L-Threonin- B30 dérivât der Formel (I) und dem des (Ala )- « ! Insulin oberhalb 5:1 liegt. t * * - 22 -

7. Verfahren gemäss irgendeinem der vorangehenden Patentansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das mit Wasser mischbare organische Lösungsmittel eines aus der folgenden Gruppe ist: Methanol, Aethanol, 2-Propanol, 1,2-Aethahdiol, Aceton, Dioxan, Tetrahydrofuran, Formamid, N,N-Dime thy 1formami d, N,N-Dimethy1a cet ami d, N-Methylpyrrolidon, Hexamethylphosphortriamid, : Acetonitril oder DMSO.

8. Verfahren gemäss Patentanspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Lösungsmittel eines aus der folgenden Gruppe ist: Formamid, Ν,Ν-Dimethylformamid, N,D-Dimethylacetamid, N-Methylpyrrolidon, Hexamethylphosphortriamid, Acetonitril oder DMSO.

9. Verfahren gemäss irgendeinem der vorangehenden Patentansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Säure eine organische Säure ist und zwar bevorzugterweise eine aus der folgenden Gruppe: Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure oder Buttersäure-

10. Verfahren gemäss irgendeinem der vorangehenden Patentansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Menge an Säure in’der Reaktionsmischung zwischen 0,5 und 5 Aequivalente auf 1 Aequivalent L-Threoninderivat der Formel (I) beträgt. T/ ν - 23 - ί-

10 Aequivalente an Säure pro Aequivalent L-Threoninderivat der Formel (I) enthält.

11. Verfahren gemäss irgendeinem der vorangehenden Patentansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Gewichtsverhältnis zwischen Trypsin und 630 des(Ala )-Insulin in der Reaktionsmischung oberhalb 1:-200 ist, bevorzugterweise oberhalb 1:50 und unterhalb 1:1.

12. Verfahren gemäss irgendeinem der vorangehenden Patentansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es in Anwesenheit von Kalziumionen durchgeführt wird. s'

13. Verfahren gemäss irgendeinem der vorangehenden Patentansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es in einem gepufferten System durchgeführt wird.

, 14. Verfahren gemäss irgendeinem der vorangehenden Patentansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das L-Threoninderivat der Formel (I) in Form eines Acetats, eines Propionats, eines Butyrats, eines Hydrohalogenides wie Hydrochlorid, zugegeben wird.

15. Verfahren gemäss irgendeinem der vorangehenden Patentansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktionstemperatur und die Gehalte an - Wasser und Säure in der Reaktionsmischung so gewählt werden, dass die Ausbeute an ThreoninB^u-Derivat mit Humaninsulin in der Reaktionsmischung ( über 90 %, bevorzugterweise über 95 %, beträgt. v - 24 - J*

16. Verfahren gemäss irgendeinem der vorangehenden Patentansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass R^ Niederalkyl, substituiertes Benzyl oder Diphenylmethyl oder eine Gruppe der allgemeinen 3 3 Formel -CH^CH-^SO^R mit R Niederalkyl bedeutet.

17. Verfahren gemäss Patentanspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass R^ Methyl, Aethyl, tert-buty1, p-methoxybenzyl, 2,4,6-TrimethyIbenzyl 3 oder eine Gruppe der Formel -CH C^SC^R , mit R^ Methyl, Aethyl, Propyl oder n-Butyl bedeutet. B30

18. Threonin -Derivate von Humaninsulin, hergestellt mittels den Verfahren gemäss Patentansprüchen 1 bis 17. B 3 0

19. Threonin -Derivate von Humaninsulin, hergestellt " gemäss den Beispielen 1 bis 34.

20. Verfahren gemäss Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Deblockierung in einem wässrigen Medium in Anwesenheit einer Säure, bevorzugterweise bei einem pH-Wert zwischen 8 und 12, ausgeführt wird.

21. Verfahren gemäss Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Deblockierung mittels Acidolyse , bevorzugterweise mit Trifluoressigsäure, ausgeführt I wird. « - 25 - k

22. Humaninsulin, erhalten mittels der Verfahren gemäss irgendeinem Patentanspruch von 1 bis 17 sowie gemäss Patentansprüchen 20 und 21.

23. Jedes neue'Merkmal oder Kombination von Merkmalen, die in dieser Schrift enthalten sind. «<