SE451073B - Forfarande for framstellning av insulinderivat - Google Patents

Description

15 20 25 30 35 451 075 bestämdes medelst HPLC till 67 procento Ännu ett förfarande för framställning av humaninsulin från des(AlaB30)-insulin beskrivs i Proceedings of the lóth European Peptide Symposium, Helsingör, Denmark, 1980. Enligt denna utför- des processen i en blandning, som innehöll omkring 60 procent organiskt lösningsmedel. Reaktionstemperaturen var med all sanno- likhet 37°C. Efter en reaktionstid på 30 minuter var utbytet 85 procent, varvid dock utbytet sjönk till 70 procent efter 22 timmar.

En av orsakerna till det lägre utbytet vid de kända förfa- randena är den förlust av insulin som orsakas av icke önskvärda bireaktioner, t.ex. bildningen av DOI-Thr(R2)-0R1, vari DOI repre- senterar svin-des-oktapeptid-(B23-B30)-insulin, och R1 och R2 har nedan angivna betydelser. Ändamålet med föreliggande uppfinning var att åstadkomma ett förfarande, medelst vilket utbytet av reaktionsprodukten var mycket högt, företrädesvis högre än 90 procent.

Det har överraskande visat sig, att ett sådant utbyte kan erhållas genom användning av en mycket lägre koncentration av vatten i reaktionsblandningen än vid de tidigare kända förfaran- dena, och dessutom genom att förfarandet företrädesvis utföres vid betydligt lägre reaktíonstemperatur än vid de tidigare kända för- farandena.

Förfarandet enligt föreliggande uppfinning utmärkes av att des(AlaB3O)-insulin eller ett salt eller komplex därav omsättes med ett L-treoninderivat med den allmänna formeln I Thruzz) -oal 1 vari R1 representerar en karboxylskyddsgrupp, och RZ represente- rar väte eller en hydroxylskyddsgrupp, eller ett salt därav i en blanàüng av vatten, ett med vatten blandbart, organiskt lösnings- medel och trypsin, varvid innehållet av vatten i reaktionsbland- ningen är mellan 30 och 10 procent. Den föredragna reaktionstem- peraturen är mellan ca 0°C och rumstemperatur, dvs. ca 25-20°C.

Förfarandet enligt föreliggande uppfinning kan utföras ge- nom upplösning av des(AlaB30)-insulin, ett L-treoninderivat med formeln I och trypsin i en blænhüng av vatten och minst ett med vatten blandbart, organiskt lösningsmedel, eventuellt i närvaro av en syra.

De organiska lösningsmedel, som är lämpade för användning 10 15 20 25 30 35 451 073 vid föreliggande uppfinning, är polära lösningsmedel, som är blandbara med vatten, och företrädesvis sådana, som kan innehål- la höga koncentrationer av insulinföreningar och treoninestrar.

Exempel på sådana lämpliga organiska lösningsmedel är aprotiska lösningsmedel såsom t.ex. N,N-dimetylformamid, N,N-dimetylacet- amíd, N-metylpyrrolidon, hexametylfosfortriamid, dimetylsulfoxid, dioxan, aceton, tetrahydrofuran, formamid och acetonitril samt protiska lösningsmedel såsom t.ex. etanol, metanol, 2-propanol och 1,2-etandiol. Lösningsmedlet påverkar hela systemet som så- dant, och de betingelser, som passar för ett lösningsmedelssy- stem med högt amideringsutbyte, passar icke nödvändigtvis till ett annat lösningsmedel. De bästa resultaten med avseende på ut- byte erhölls med aprotiska lösningsmedel, och aprotiska lösnings- medel är de mest föredragna vid genomförande av föreliggande upp- finning.

Beroende på vilket med vatten blandbart, organiskt lösnings- medel, som användes, på den valda reaktionstemperaturen och på när- varon av en syra í reaktionsblandningen bör innehållet av vatten i reaktionsblandningen vara mindre än ca 30 procent (vol/vol), fö- reträdesvis mindre än ca 25 procent (vol/vol), och mera än ca 10 procent (vol/vol), företrädesvis mera än ca 15 procent (voll vol).

En fördel med att minska mängden vatten i reaktionsbland- ningen är, att bildningen av biprodukter därigenom minskas. I lik- het därmed är det genom att öka mängden syra i reaktionsbland- ningen möjligt att minska bildningen av biprodukter. Ökningen i fråga om utbyte är positivt korrelerad med ett lågt vatteninne- håll i reaktionsblandningen. För att förebygga denaturering av enzymet i reaktíonsblandningar med lågt vatteninnehåll bör reak- tíonstemperaturen företrädesvis vara väsentligt lägre än de re- aktionstemperaturer, som traditionellt användes vid peptídsynte- ser med trypsin, nämligen lägre än ca 37°C.

För utövande av föreliggande uppfinning är det ej väsent- ligt, vilken art av trypsin som användes. Trypsin är ett väl ka- rakteriserat enzym, som kommersiellt finns tillgängligt i hög renhet, speciellt från ox- och svinkällor. Man kan vidare använda trypsín av mikrobiellt ursprung. För utövande av föreliggande upp- finning är trypsinformen, t.ex. kristallint trypsin (löslig form), immobiliserat trypsin eller till och med trypsinderivat (så länge 10 15 20 25 30 35 451 073 trypsinaktiviteten bibehålles), ej heller väsentlig. Den häri använda benämningen trypsin skall omfatta trypsiner av vilket som helst ursprung och alla trypsinformer, som har bibehållen amíderande aktivitet, häribland proteaser med trypsinliknande specificitet, t.ex. Achromobacter lyticus-protease, jämför Agric.Biol.Chem. íâ, 1443.

Som exempel på aktiva trypsinderivat kan nämnas acetylerat trypsin, succinylerat trypsin, glutaraldehydbehandlat trypsín och immobiliserade trypsinderivat.

Såframt man använder ett immobiliserat trypsin, suspenderas detta i mediet.

För åstadkommande av ett lämpligt buffertsystem kan man till- sätta organiska eller oorganiska syror såsom saltsyra, myrsyra, ättiksyra, propionsyra och smörsyra och/eller baser såsom pyridin, TRIS, N-metylmorfolin och N-etylmorfolin. Organiska syror föredras.

Omsättningen kan emellertid utföras utan sådana tillsatser. Den tillsatta mängden syra är vanligtvis mindre än ca 10 ekvivalenter per ekvivalent L-treoninderivat med formel I. Mängden syra är fö- reträdesvis mellan 0,5 och 5 ekvivalenter per ekvivalent L-treo- ninderivat med formel I. Man kan tillsätta joner, som stabilise- rar trypsin, såsom kalciumjoner.

Förfarandet kan utföras vid en temperatur av mellan 37°C och reaktionsblandningens fryspunkt. För uppnående av tillräcklig reaktionshastíghet utföres enzymatiska reaktioner med trypsin van- ligtvis vid 37°C. För att undvika inaktivering av trypsin är det dock fördelaktigt att utföra förfarandet enligt föreliggande upp- finning vid en temperatur under rumstemperatur. I praktiken före- dras reaktionstemperaturer på över ca 0°C.

Beroende på reaktionstemperaturen, den tillsatta mängden trypsin och andra reaktionsbetingelser är reaktionstiden vanligt- mellan några få timmar och några få dagar.

Trypsinets verkan regleras i hög grad av förhållandet mel- vis lan vatten och lösningsmedel, av förhållandet mellan syra och bas och av reaktionstemperaturen för att befrämja dess amideríng och för att hindra oönskade trypsinkatalyserande bireaktioner. Genom att minska koncentrationen av vatten i reaktionsblandningen upp- når man bägge delarna, men man ökar därigenom också den hastig- het, med vilken irreversibel trypsindenaturering sker. Trypsin- denatureringen kan - i varje fall delvis - motverkas genom en 10 15 20 25 30 35 451 075, 5 sänkning av reaktionstemperaturen. En sänkning av reaktionstem- peraturen nedsätter också amideringshastigheten, men man kan kompensera för en sådan nedsättning genom en ökning av reak- tionstíden.

Viktförhållandet mellan trypsín och des(Ala reaktionsblandningen är normalt över ca 1:200, företrädesvis över ca 1:50, och under ca 1:1.

B30-derivat av humaninsulin, som är ett resultat B30)-insulin i De treonin av amideríngen, kan anges med den allmänna formeln II (rhr(R2)-oR1JB3°-h-In 11 B30)-insuiinaeien, och R1 vari h-In representerar human-des(Thr och R2 har ovan angivna betydelser.

Användbara L-treoninderivat med formel I är sådana, vari R1 B30 är en karboxylskyddsgrupp, som kan avlägsnas från treonin tern av humaninsulin (formel II) under betingelser, som icke för- orsakar väsentlig, irreversíbel ändring i insulinmolekylen. Som exempel på sådana karboxylskyddsgrupper kan nämnas lägre alkyl, t.ex. metyl, etyl och tert.butyl, substituerad bensyl såsom p-metoxibensyl och 2,4,6-trimetylbensyl och difenylmetyl, och grupper med den allmänna formeln -CHZCHZSOZRS, vari R_ represen- terar lägre alkyl såsom metyl, etyl, propyl och n-butyl. Lämpliga hydroxylskyddsgrupper R2 är sådana, som kan avlägsnas från treonin -derivat av humaninsulin (formel II) under omständig- heter, som icke förorsakar väsentlig, irreversibel förändring i insulinmolekylen. Som exempel på en sådan grupp (R2) kan nämnas tert.butyl.

Lägre alkylgrupper innehåller mindre än 7 kolatomer, före- trädesvis mindre än 5 kolatomer.' Vidare gäller att konventionellt använda skyddsgrupper be- skrivs av Wünsch: Methoden der Organischen Chemie (Houben-Weyl), Vol. XV/1, editor: Eugen Müller, Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1974.

Ett förfarande för framställning av des(Ala beskrivs i Hoppe-Sey1er's Z.Physiol.Chem. åâg (1978), 799 ff.

Några L-treoninderivat med formel I är kända föreningar, och de resterande L-treoninderivaten kan framställas analogt med B50)-insulin framställningen av kända föreningar.

L-treoninderivat med formel I kan vara de fria baserna eller 10 15 ZS 30 35 451 073 lämpliga organiska eller oorganiska salter därav, företrädesvis acetater, propionater, butyrater och vätehalogenider såsom väte- klorider.

Det är önskvärt att använda reaktanterna, dvs. des(Ala )- -insulin och L-treoninderivat med formel I, i höga koncentrationer.

Det molära förhållandet mellan L-treoninderivat med formel I och des(AlaB3Û)-insulin är företrädesvis över ca 5:1.

Det är önskvärt, att koncentrationen av L-treoninderivat med formel I i reaktionsblandningen överstiger 0,1 molar.

B30-derivat av humaninsu- B30 16, Q: Humaninsulin kan erhållas ur treonin lin (formel II) genom avlägsnande av skyddsgruppen R1 och en even- tuell skyddsgrupp R2 medelst redan kända metoder eller analogt med redan kända metoder. Om R1 är metyl, etyl, eller en grupp -CHZCHZSOZRS, vari R3 har ovan angiven betydelse, kan nämnda skyddsgrupp avlägsnas under milda, basiska betingelseri ett vat- tenbaserat medium, företrädesvis vid ett pH-värde av mellan ca 8 och ca 12, t.ex. ca 9,5. Som bas kan man använda ammoniak, tri- etylamín, bikarbonat/karbonatbuffertar eller hydroxider av alkali- metaller såsom natriumhydroxid. Om R1 är tert.butyl, substituerad bensyl såsom p-metoxibensyl eller 2,4,6-trimetylbensyl eller difenylmetyl, kan ifrågavarande grupp avlägsnas genom acidolys, företrädesvis med trifluorättiksyra. Trifluorättiksyran kan vara icke-vattenhaltig eller innehålla något vatten, eller också kan den vara utspädd med ett organiskt lösningsmedel såsom diklor- metan. Om R2 är tert.butyl, kan ifrågavarande grupp avlägsnas ge- nom acidolys, jämför ovan.

B30-derivat av humaninsulin med for- Föredragna, treonin mel II är föreningar, vari R2 är väte, och dessa kan framställas från L-treoninderívat med formel I, vari R2 är väte.

Som exempel på ett komplex eller ett salt av des(AlaB30)- -insulin kan nämnas ett zínkkomplex eller zinksalt.

Om man väljer reaktionsbetingelserna mot bakgrund av vad som har omtalats ovan, och om man betraktar reaktíonsbetingel- serna i de efterföljande exemplen, är det möjligt att uppnå ett utbyte av treoninßso-derivat av humaninsulin (formel II), som är högre än 90 procent eller till och med högre än 95 procent.

Ett föredraget förfarande för framställning av humaninsulin B3 från treonin 0-derivat av humaninsulin är följande: 10 15 20 25 30 7 451 075 1. Om det finns någon trypsínaktivitet kvar efter amideringen, föredrar man att avlägsna denna, t.ex. under betingelser, vid vilka trypsinet är inaktivt, t.ex. i surt medium vid ett pH-värde av under 3. Trypsin kan avlägsnas medelst separation enligt mole- kylvikt, t.ex. medelst gelfiltrering på en "Sephadex G-50"-gel eller på en "Bio-gel P-30"-gel i ättiksyra; jämför ovannämnda Nature §§Q¿ 2. Föroreningar såsom oreagerat des(AlaB 30)-insulin kan avlägs- nas genom användning av anjon- och/eller katjonbytarkromatografi. 3. Därefter spaltas treoninßso-derivatet av humaninsulin (formel II), och humaninsulin isoleras, t.ex. kristallíseras, på i och för sig känt sätt.

På detta sätt kan man få humaninsulin med acceptabel farma- ceutisk renhet, och humaninsulinet kan om så önskas renas ytter- ligare.

Använda förkortningar är i överensstämmelse med de regler, som godkändes (1974) av IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature, se Collected Tentative Rules & Recommendations of the Commission on Biochemical Nomenclature IUPAC-IUB, Zand ed., Maryland 1975.

Förfarandet för framställning av humaninsulinderivat och humaninsulin illustreras genom följande exempel, som emellertid icke får betraktas såsom begränsande. Exemplen illustrerar några föredragna utföríngsformer av förfarandet enligt uppfinningen.

Exempel 1 10 mg svin-aes(A1aB3°)-1nsu11n wstes i 100 01 10 M ättik- syra. Till 50 pl av denna lösning tillfördes: 100 ul 2 M Thr-0Me (Me betyder metyl) i N,N-dimetylacetamid, 60 pl N,N-dimetylacet- amid, 15 ul vatten och 10 ul av en lösning av trypsin (8 procent vikt/vol) i 0,05 M kalciumklorid. Efter inkubatíon vid 4°C i 24 timmar utfälldes produkten med 8 ml aceton, varpå den isolera- des genom centrifugering, tvättades med 8 ml aceton, isolerades genom centrifugering och torkades i vakuum. Utbytet av (Thr-OMe)B30-h-In bestämdes medelst HPCL.

Produkten löstes i 2 ml l M ättiksyra, och 100 ul av lös- ningen applicerades på en 4 x 200 mm "Nucleosil 5 C18 kolonn" för motströms-HPCL, varvid man använder en 0,2 M ammoniumsulfat- buffert, som inställes på ett pH-värde av 3,5, och som innehåller 26,8 procent (vol/vol) acetonitril som eluent. Vid en flödes- 10 15 20 25 451 073 8 B30)-insulin efter hastighet av l ml/min. eluerade des-(Ala 18 minuter och (Thr-0Me)B30-h-In efter 24 minuter. Biprodukten från reaktionen, nämligen (Thr-0Me)BZ3-des-heptapeptid-(B24-B3O)- -insulin, eluerade efter 7 minuter. Pâvisandet och mängdbestäm- ningen av proteinerna baserades på extinktionen vid 280 nm.

Analysen gav följande fördelning av föreningar: c (Ihr-oxweflšw-h-In; 91,1 a desçmaßflß-msunn; 2,5 *a »- B23 % (Th:-(WE) -des-heptapeptid(B24-B50)-insulin: 0,4 Exempel 2 till 16 Följande Exempel 2 till 16 i Tabell l utfördes på samma sätt som Exempel l, varvid man ändrade reaktionsparametrarna såsom vi- sas i tabellen. I samtliga exempel tillfördes dock 10 ul 8 procent trypsin i en vattenhaltig lösning, 100 ul organiskt lösningsmedel innehållande ett treoninderivat med formeln I samt 50 pl ättiksyra innehållande 20 procent des(AlaB30)-insulin. Molariteten för treoninderivatet med formel I i nämnda organiska lösningsmedel och för nämnda ättiksyra framgår av Tabell 1. Reaktionstiden var 24 timmar. I Tabell l användes följande förkortningar: HOAc är ättiksyra, DMAA är N,N-dimetylacetamid, DMF är N,N-dimetylformamid, DMSO är dimetylsulfoxid, NMP är N-metylpyrro- lidon och THF är tetrahydrofuran.

Vid syntetiseringen av (Thr-0But)B30 -h-In, jämför Exem- pel 15, utfördes elueringen genom användning av en gradient i acetonítril från 26,8 procent till 40 procent (vol/vol). 451 073 S på på ä S ü 3 S N ÉS 2 ON , E ußm ß m N H m H OO O H N ä m H ß N I 02 Om N N l m H OO w N ä QH HN I 02 va NH O mß w N gå MH ßN I 02 æw NH mH OO W N <<2Q NH ON E QÉ ßm NH mH OO OH N m2 HH ON E må Om Q mH OO OH N m2 OH O N I G2 .vm N H mH OO O H N Omas m O N I 02 ß m .w m H OO O H N OWEQ w O N I 02 ß m m N m H Oo O H N HÉÉ ß ON E 92 ßm NH mH Oo OH N måü O O N I vä ß m .w m H OO O H N Es m mH I 02 mm .v O mß OH N ä w ON I må ßm mN mH OO OH N <<2Q m O N E 02 ß m N H m H Oo OH N <<š N w m. .w oo H1 Hmwmewmcflc z 2 É Mßfimwæmwmww» mwwä àcwmmwfi ä www Émmøwc: umfimnmm Nm m måna: . åöæ Owm MHWMWHNHMWHHH w_u H HHonmH 10 15 20 451 073 10 Exempel 17 till 34 Dessa exempel utfördes på samma sätt som Exemplen 1 till 16 med det förbehållet, att reaktionstiden var 4 timmar. I vart och ett av dessa exempel var utbytet detsamma som det, som erhölls í Exemplen 1 till 16.

Det framgår av en jämförelse mellan Exemplen 1 till 16 och Exemplen 17 till 34, att samma utbyte uppnåddes, och det är bl.a. detta, som skiljer det nya förfarandet från det tidigare kända för- e farande, som är beskrivet i Proceedings of the lóth European Peptide Symposium, se ovan. Som en följd därav har tidsberoendet va, eliminerats.

Exempel 35 250 mg kristallínt (Thr-0Me) vatten och löstes genom tillsats av l N natriumhydroxidlösning till ett pH-värde av 10,0. pH-värdet hölls konstant vid 10,0 i 24 timmar vid 25°C. Det humaninsulin, som bildades, kristallise- B30-h-In suspenderades i 25 ml rades genom tillsats av 2 g natriumklorid, 350 mg natríumacetat- trihydrat och 2,5 mg zinkacetatdíhydrat följt av tillsats av 1 N saltsyra för åstadkommande av ett pH-värde av 5,52. Efter lagring i 24 timmar vid 4°C isolerades de romboedriska kristallerna genom centrifugering, varpå de tvättades med 3 ml vatten, isolerades ge- nom centrifugering och torkades i vakuum. Utbyte: 220 mg human- insulin. f!

Claims (10)

451 073 ll PATENTKRAV

1. Förfarande för framställning av humaninsulin eller treoninßso-derivat av humaninsulin eller ett salt eller komplex därav genom reaktion mellan svin-des[AlaB30)-insulin eller ett salt eller komplex därav och ett L-treoninderivat med den all- männa formeln I rhrurz) -onl I. vari R1 representerar en karboxylskyddsgrupp, och R? represente- rar väte eller en hydroxylskyddsgrupp, eller ett salt därav i en blandning av vatten, ett med vatten blandbart, organiskt lösnings- medel och trypsin, k ä n n e t e c k n a t av att vatteninnehål- let i reaktionsblandningen är mellan 30 och 10 procent (vol/vol), att reaktionstemperaturen är lägre än ca 37°C, och att en syra eventuellt är närvarande, varefter det resulterande derívatet om så önskas avblockeras för att bilda humaninsulín. i

2. Förfarande enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t av att koncentrationen av L-treoninderivat med formeln I i reak- tionsblandningen överstiger 0,1 molar, att reaktíonstemperaturen är över reaktionsblandningens fryspunkt, och att reaktíonsbland- ningen icke innehåller mera än 10 ekvivalenter av en syra per ekvivalent L-treoninderivat med formeln I.

3. Förfarande enligt något av de föregående kraven, k ä n n e t e c k n a t av att reaktionstemperaturen ligger under ungefär rumstemperatur och över ca 0°C.

4. Förfarande afligt något av de föregående kraven, k ä n n e t e c k n a t av att vatteninnehållet i reaktions- blandningen är under 25 procent och över 15 procent (vol/vol).

5. Förfarande enligt något av de föregående kraven, k ä n n e t e c k n a t av att det med vatten blandbara, orga- niska lösningsmedlet är metanol, etanol, 2-propanol, 1,2-etandiol, aceton, dioxan, tetrahydrofuran, formamid, N,N-dimetylformamid, N,N-dímetylacetamid, N-metylpyrrolidon, hexametylfosfortríamid, acetonitril eller DMSO, företrädesvis formamid, N,N-dímetyl- formamid, N,N-dimetylacetamid, N-metylpyrrolidon, hexametylfos- fortriamid, acetonitril eller DMSO. _

6. Förfarande enligt något av de föregående kraven, k ä n n e t e c k n a t av att syran är en organisk syra, före- trädesvis myrsyra, ättiksyra, propionsyra eller smörsyra. 451 075 12

7. Förfarande enligt något av de föregående kraven, k ä n n e t e c k n a t av att mängden syra i reaktíonsbland- ningen är mellan 0,5 och S ekvivalenter per ekvivalent L-treo- ninderivat med formel I.

8. Förfarande enligt något av de föregående kraven, k ä n n e t e c k n a t av att viktförhållandet mellan trypsin och des(AlaB30 företrädesvis över 1:50, och under 1:1. )-insulin i reaktionsblandningen är över 1:Z00,

9. Förfarande enligt något av de föregående kraven, k ä n n e t e c k n a t av att Rl är lägre alkyl, substituerad bensyl eller difenylmetyl eller en grupp med den allmänna for- meln -CHZCHZSOZRS, vari R3 representerar lägre alkyl, och speci- ellt är Rl metyl, etyl, tert-butyl, p-metoxíbensyl, 2,4,6-tri- metylbensyl eller en grupp med formeln -CHZCHZSOZR3, vari R3 är metyl, etyl, propyl eller n-butyl.

10. Förfarande enligt krav l, k ä n n e t e c k n a t av att avblockeringen utföres i ett vattenhaltigt medium i när- varo av en bas, företrädesvis vid ett pH-värde av mellan 8 och 12, eller genom acidolys, företrädesvis med trifluorättiksyra. f: