DE3229674A1 - Verfahren zur herstellung von humaninsulin, threoninderivaten, salzen oder komplexen davon - Google Patents
Verfahren zur herstellung von humaninsulin, threoninderivaten, salzen oder komplexen davonInfo
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Description
Novo Industri A/S, Novo AlIe7DK-2880 Bagsvaerd, Dänemark
Verfahren zur Herstellung von Humaninsulin, Threoninderivaten, Salzen oder Komplexen davon
Es sind verschiedene Verfahren zur Herstellung von Humaninsulin bekannt. Beispiele solcher Verfahren sind inter
alia, die Extraktion aus Humanpancreas, die Synthese aus entsprechenden Aminosäuren, gen-technische Prozesse und
die Konversion von Schweineinsulin in Humaninsulin. Einige der Verfahren zur Konversion von Schweineinsulin in
Humaninsulin verlaufen via Schweine-des-octapeptid-(B23-B30)-
B3 0 Insulin und andere verlaufen via des (AIa )-Insulin.
Speziell betrifft nun diese Erfindung die Konversion von
B3 0
Schweine-des(AIa )-Insulin in Humaninsulin via einem
Schweine-des(AIa )-Insulin in Humaninsulin via einem
B3 0
Threonin -Derivat von Humaninsulin.
Threonin -Derivat von Humaninsulin.
813
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Hollerallee 32, D-2800 Bremen 1
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Telex: 244958 bopatd
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Bei der Behandlung von Diabetes mellitus werden im allgemeinen Insulinpräparate auf der Basis
von Schweine- oder Rinder-Insulin eingesetzt. Rinder-, Schweine- und Human-Insulin zeigen
kleinere Differenzen hinsichtlich ihres Aminosäureaufbaus. Die Differenz zwischen Human- und
Schweine-Insulin ist auf eine einzige Aminosäure begrenzt: Die B30-Aminosäure von Humaninsulin ist
Threonin, währenddem die gleiche Aminosäure bei Schweineinsulin Alanin ist.
Ein Verfahren zur Herstellung von Human-Insulin
B30
aus des (AIa )rlnsulin wird in der veröffentlichten
europäischen Patentanmeldung Nr. 80 101 966 beschrieben (siehe dazu auch Nature 280 (1979),
Seite 412 ). Gemäss der genannten Patentanmeldung wird die Amidierung bevorzugterweise in einem
Medium ausgeführt, das 0 bis 65, speziell bevorzugterweise 40 bis 6 0 % eines organischen Lösungsmittels
enthält. Weiter liegt die bevorzugte Reaktionstempe-^
ratur zwischen 20 und 40 C, wobei in allen Beispielen eine Temperatur von 37 C eingehalten wird. Die Ausbeute
der Verkupplung war, gemäss den drei Beispielen, 75, 80 und ungefähr 50 %. Die genannte Ausbeute
wurde übrigens mittels Hochdruckflüssigchromatographie bestimmt. Gemäss der angegebenen
Veröffentlichung in Nature betrug die Ausbeute 73 %.
Ein weiteres Verfahren für die Herstellung von
B30
Humaninsulin aus des (AIa )-Insulin ist beschrieben
in"Proceedings of the 2nd International Insulin Symposium",Aachen, BRD, 1979. Gemäss dieser
Veröffentlichung wurde die Amidierung in einem Medium ausgeführt, welches ungefähr 6 0 % organisches
Lösungsmittel enthält. Die Reaktionstemperatur lag bei 38 C- Die Ausbeute, welche wiederum mittels
HPLC bestimmt wurde, lag bei 67 %.
Noch ein weiteres Verfahren zur Herstellung von
B30
Humaninsulin aus des (AIa )-Insulin ist beschrieben in "Proceedings of the 16th European Peptide Symposium, Helsing^r, Dänemark, 19 80".
Humaninsulin aus des (AIa )-Insulin ist beschrieben in "Proceedings of the 16th European Peptide Symposium, Helsing^r, Dänemark, 19 80".
Gemäss dieser Veröffentlichung wurde das Verfahren
in einem Medium ausgeführt, welches ungefähr 60 % organisches Lösungsmittel enthielt. Wahrscheinlich
lag die Reaktionstemperatur bei 37 C. Nach einer Reaktionszeit von 30 Minuten betrug die Ausbeute 85 %.
Nach 22 Stunden betrug der entsprechende Wert jedoch nur noch 70 %.
Einerder Gründe für die niederen Ausbeuten der bekannten
Verfahren liegt im Verlust von Insulin wegen unerwünschten Nebenreaktionen, beispielsweise der
2 1
Bildung von DOI-Thr(R )-OR . In dieser Formel steht DOI für Schweine-des-Octapeptid-(B23-B30)-Insulin, und R und R für die obengenannten Substituenten.
Bildung von DOI-Thr(R )-OR . In dieser Formel steht DOI für Schweine-des-Octapeptid-(B23-B30)-Insulin, und R und R für die obengenannten Substituenten.
Das Ziel der hier beschriebenen Erfindung war es, ein Verfahren zu' finden, mittels dem die Ausbeute
an Reaktionsprodukten extrem gesteigert werden konnte, bevorzugterweise auf über 90 %.
Es ist nun überraschenderweise gefunden worden , dass eine solche Ausbeute dann erreichbar ist,
wenn die Wasserkonzentration in der Reaktionsmischung viel tiefer liegt als diejenige der
bekannten Verfahren. Ebenso werden die gesuchten hohen Ausbeuten erreicht, wenn die Umsetzungen
bei niedrigeren Temperaturen als diejenigen der bekannten Prozesse, ausgeführt werden.
Das Verfahren gemäss dieser Erfindung umfasst die Umsetzung von des (AIa )-Insulin, eines Salzes
oder eines Komplexes davon mit einem L-Threoninderivat der allgemeinen Formel (I)
(I)
oder eines Salzes davon,
in der R für eine Carboxylrest-Schutzgruppe und
2
R für Wasserstoff oder eine Hydroxylrest-Schutzgruppe stehen, in einer Mischung aus Wasser, aus einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungs mittel und aus Trypsin, wobei der Gehalt an Wasser in der Reaktionsmischung zwischen 10 und 30 Vol.-% liegt. Die bevorzugte Reaktionstemperatur liegt etwa zwischen 0 und etwa zwischen Raumtemperatur, d.h. ungefähr bei 20°C bis 25°C.
R für Wasserstoff oder eine Hydroxylrest-Schutzgruppe stehen, in einer Mischung aus Wasser, aus einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungs mittel und aus Trypsin, wobei der Gehalt an Wasser in der Reaktionsmischung zwischen 10 und 30 Vol.-% liegt. Die bevorzugte Reaktionstemperatur liegt etwa zwischen 0 und etwa zwischen Raumtemperatur, d.h. ungefähr bei 20°C bis 25°C.
Das erfindungsgemässe Verfahren kann so ausge-'
führt werden/ dass des(Ala -Insulin, ein L-Threoninderivat der Formel (I) und Trypsin
zusammen in einer Mischung aus Wasser und mindestens einem mit Wasser mischbaren organischen
Lösungsmittel gelöst werden, gegebenenfalls in Anwesenheit einer Säure.
Die organischen Lösungsmittel, welche im erfindungSgemässen
Verfahren eingesetzt werden können, sind polare Lösungsmittel, die mit Wasser mischbar sind. Es sind zugleich bevorzugterweise jene
Lösungsmittel, welche Insulinverbindungen und Threoninester in hoher Konzentration zu lösen
vermögen- Beispiele solcher geeigneter organischer Lösungsmittel sind aprotische Lösungsmittel, wie
Ν,Ν-Dimethylformamid, Ν,Ν-Dimethylacetamid," N-Methy!pyrrolidon,
Hexamethylphosphortriamid,
Dimethylsulfoxid, Diaxan, Aceton, Tetrahydrofuran,
Formamid und Acetonitril und protische Lösungsmittel wie Aethanol, Methanol, 2-Propanol und 1,2-Aethandiol.
Die Natur des Lösungsmittels beeinflusst · das System als Ganzes und ein Zusammenhang zwischen
einem bestimmten Lösungsmittel und einem hohen Amidierungsgrad kann nicht auf ein anderes Lösungsmittel
übertragen werden. Die besten Ausbeuten wurden erhalten mit aprotischen Lösungsmitteln und solche
Lösungsmittel sind daher die bevorzugten bei der Ausführung des.erfindungsgemassen Verfahrens.
JS -
Je nach verwendetem organischen Lösungsmittel, ^nach
gewählter Reaktionstemperatur und obysäure anwesend ist oder nicht, sollte der Wassergehalt in der
Reaktionsmischung zwischen 10 und 30 Vol.-%, bevorzugterweise zwischen 15 und 25 VoI„-% betragen.
Ein Vorteil des verringerten Wassergehaltes in der Reaktionsmischung ist die Verhütung von Nebenreaktionen.
Auch durch Erhöhen des Säuregehaltes in der Reaktionsmischung wird der gleiche Effekt
erreicht. Die Erhöhung an Ausbeute korreliert positiv mit einem niederen Gehalt an Wasser in der Reaktionsmischung. Um die Denaturierung des Enzyms in der
Reaktionsmischung wegen dem niedrigen Wassergehalt zu verhüten, sollte die Reaktionstemperatur um
einiges tiefer liegen als die Reaktionstemperatur von bekannten Verfahren in der Peptidsynthese mit
Trypsin, d.h. tiefer als ungefähr 37 C liegen.
Der Trypsintyp ist nicht kritisch für die Ausführung
•des erfindungsgemässen Verfahrens. Trypsin ist ein gut charakterisiertes Enzym, welches in hoher Reinheit
kommerziell erhältlich ist und zwar vor allem aus Rinder- oder Schweine-Präparaten. Es kann aber
auch Trypsin von mikrobieller Herkunft eingesetzt werden. Zudem ist auch die Form des Trypsins für die
Ausführung des erfindungsgemässen 'Verfahrens nicht kritisch, d.h. das Enzym kann kristallin (lösliche Form),
immobilisiert oder sogar als Derivat (solange die Trypsinaktivität beibehalten wird) vorliegen. Der
Ausdruck "Trypsin" wird hier verwendet, um die Trypsine aller Herkünfte und in allen Formen zu umfassen.
welche die Amidierungsaktivität beibehalten. Der Ausdruck umfasst a'lso auch Proteasen^'mit trypsinähnlicher
Spezifizität, beispielsweise Achromabacter lyticus protease; siehe dazu Agric. Biol. Chem. 42,
Seite 1443.
Als Beispiele für aktive Trypsinderivate können die
folgenden genannt werden: acetyliertes Trypsin, succinyliertes Trypsin, Glutaraldehyd-behandeltes
Trypsin und immobilisierte Trypsinderivate. Falls ein immobilisiertes Trypsin verwendet wird, wird
es im Reaktionsmedium suspendiert.
Organische oder anorganische Säuren wie Salzsäure, Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure und Buttersäure und/
oder Basen wie Pyridin, TRIS (Tris-(hydroxymethyl)aminomethan), N-Methylmorpholin und N-Ethylmorpholin können
dem Reaktionsmedium zugegeben werden, um ein geeignetes Puffersystem zu schaffen. Organische Säuren werden dabei
bevorzugt. Die Reaktion kann jedoch auch ohne solche
Zusätze durchgeführt werden. Die Menge der zugegebenen Säure ist normalerweise kleiner als ungefähr 10
Aequivalente pro Aequivalent L-Threoninderivat der
Formel (I). Bevorzugterweise beträgt die Menge an
Säure zwischen 0,5 und 5 Aequivalente pro Aequivalent · L-Threoninderivate der Formel (I). Ionen, welche Trypsin zu stabilisieren vermögen, wie beispielsweise Calciumionen, können ebenfalls in Form ihrer Salze zugegeben
werden.
Zusätze durchgeführt werden. Die Menge der zugegebenen Säure ist normalerweise kleiner als ungefähr 10
Aequivalente pro Aequivalent L-Threoninderivat der
Formel (I). Bevorzugterweise beträgt die Menge an
Säure zwischen 0,5 und 5 Aequivalente pro Aequivalent · L-Threoninderivate der Formel (I). Ionen, welche Trypsin zu stabilisieren vermögen, wie beispielsweise Calciumionen, können ebenfalls in Form ihrer Salze zugegeben
werden.
Das Verfahren kann bei Temperaturen im Bereich* zwischen
ungefähr 37 C und dem Gefrierpunkt der Reaktionsmischung
durchgeführt werden. Enzymatische Reaktionen mit Trypsin werden normalerweise bei
ungefähr 37 C durchgeführt, um so eine genügend hohe Umsatzgeschwindigkeit zu erreichen. Um jedoch die
Inaktivierung von Trypsin zu vermeiden, ist es von Vorteil, das erfindungsgemässe Verfahren bei Temperaturen
unterhalb der Umgebungstemperatur durchzuführen. Praktisch werden Reaktionstemperaturen von
oberhalb ungefähr 0 C bevorzugt.
Die Reaktionszeit liegt normalerweise zwischen einigen Stunden und einigen Tagen, je nach Reaktionstemperatur und je nach der Menge zugesetzten Trypsins.
Auch andere Reaktionsparameter können auf die Reaktionsdauer einen Einfluss haben.
Zu einem grossen Ausmass wird die Wirkung von Trypsin
durch die gegenseitige Beeinflussung von Wasser und Lösungsmittel kontrolliert. Die gleiche Wirkung hängt
aber auch vom Säure/Base-Verhältnis und von der Reaktionstemperatur ab. Diese Reaktionsbedingungen
werden so gewählt, dass die Amidierungswirkung begünstigt wird und unerwünschte Nebenreaktionen, die.
ebenfalls durch das Trypsin katalysiert werden, unterdrückt werden. Die Verringerung des Wassergehaltes in
der Reaktionsmischung zeigt die beiden zuletzt genannten positiven Wirkungen,führt aber auch zu einer
Erhöhung der Geschwindigkeit, welche zur irreversiblen Denaturierung von Trypsin führt. Der zuletztgenannten
Einwirkung kann jedoch zumindest teilweise dadurch ent-
gegengewirkt werden, dass die Reaktionstemperatur
erniedrigt wird. Durch die Erniedrigung der Reaktionstemperatur wird zwar auch die Amidierungsgeschwindigkeit
kleiner, aber dieser Nachteil.
wird einfach durch Verlängerung der Reaktionsdauer wiedergutgemacht.
Das Gewichtsverhältnis zwischen eingesetztem Trypsin
B30
und des(Ala )-Insulin in der Reaktionsmischung liegt normalerweise ungefähr oberhalb 1:200, speziell bevorzugterweise oberhalb etwa 1:50 und unterhalb etwa 1:1.
und des(Ala )-Insulin in der Reaktionsmischung liegt normalerweise ungefähr oberhalb 1:200, speziell bevorzugterweise oberhalb etwa 1:50 und unterhalb etwa 1:1.
B30
Die Threonin -Derivate von Humaninsulin, welche aus der genannten Amidierung resultieren, können durch die folgende allgemeine Formel (II) dargestellt werden:
Die Threonin -Derivate von Humaninsulin, welche aus der genannten Amidierung resultieren, können durch die folgende allgemeine Formel (II) dargestellt werden:
ο ι p
(Thr(R )-OR ) -h-In (II).
(Thr(R )-OR ) -h-In (II).
B30 Darin steht h-In für den Human-des(Thr )-Insulinrest
1 2
und R und R sind gleich definiert wie vorne in der Beschreibung.
Einsetzbare L-Threoninderivate der Formel (I) sind solche,
in denen R eine Carboxylrest-Schutzgruppe ist, die
B30
vom Threonin -Ester des Humaninsulin (Verbindung der
vom Threonin -Ester des Humaninsulin (Verbindung der
Formel II) entfernt werden kann, ohne dass dabei die Insulinmolekel irreversibel und wesentlich geändert werden.
Beispiele solcher Carboxylrest-Schutzgruppen sind folgende: Niederalkyl wie Methyl, Aethyl und tert-Butyl,
substituiertes Benzyl wie p-Methoxybenzyl und
322967/.
2,4,6-Trimethylbenzyl und Diphenylmethyl sowie '
Gruppen der allgemeinen Formel -CH 'CH SO9R ,
3 112.
mit R Niederalkyl wie Methyl, Aethyl, Propyl und η-Butyl. Geeignete Hydroxylrest-Schutzgruppen
R sind solche, welche vom Threonin -Derivat von Humaninsulin (Verbindung der Formel II) so
abgespalten werden können, dass dabei keine irreversible und wesentliche Aenderung in der
Insulinmolekel auftritt. Ein Beispiel einer
solchen Gruppe R ist tert-Butyl.
Der Ausdruck "Niederalkyl" steht hier für solche Gruppen mit weniger als 7 C-Atomen, bevorzugterweise
weniger als 5 C-Atomen.
Weitere Schutzgruppen, die eingesetzt werden können, sind solche aus "Wünsch : Methoden der
Organischen Chemie "(Houben-Weyl), Band XV/1,
herausgegeben von Eugen Müller, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 19 74.
Ein Verfahren für die Herstellung von des(Ala )-Insulin
ist auch in "Hoppe-Seyler's Zeitschrift
für Physiol. Chemie 359'/ (1978), Seite 799, ff.
beschrieben.
Einige der L-Threonin-Derivate der Formel (I) sind bekannte Verbindungen; die anderen L-Threonin-Derivate
können mittels analoger Verfahren erhalten werden.
Die L-Threonin-Derivate der Formel..-fl) können
entweder als freie Basen vorliegen oder, zusammen mit geeigneten organischen oder anorganischen
Säuren, als Salze davon. Bevorzugt sind dabei die Acetate, die Propionate, die Butyrate und
die Hydrohalogenide, beispielsweise die Hydrochloride
.
Bevorzugt werden die Reaktionsteilnehmer, d.h. das des (AIa )-Insulin und die L-Threoninderivate
der Formel (I) in hohen Konzentrationen eingesetzt. Das Molverhältnis zwischen dem L-Threoninderivat
' B30
der Formel (I) und dem des (AIa )-Insulin liegt
bevorzugterweise etwa oberhalb 5:1.
Die Konzentration des L-Threoninderivats der Formel (I) in der Reaktionsinischung sollte bevorzugterweise
höher als 0,1 molar sein.
B30 —
Von den Threonin Derivaten von Humaninsulin (Verbindungen der Formel II) kann das Humaninsulin mittels Entfernen der Schutzgruppen R und allfällig vorhandener Schutzgruppen R erhalten werden und zwar mittels an und für sich bekannter Methoden. Falls R Methyl, Aethyl oder eine der Gruppen
Von den Threonin Derivaten von Humaninsulin (Verbindungen der Formel II) kann das Humaninsulin mittels Entfernen der Schutzgruppen R und allfällig vorhandener Schutzgruppen R erhalten werden und zwar mittels an und für sich bekannter Methoden. Falls R Methyl, Aethyl oder eine der Gruppen
3 3
-CH2CH SO R mit R gemäss obiger Definition ist,
-CH2CH SO R mit R gemäss obiger Definition ist,
kann die genannte Schutzgruppe in schwach basischen Bedingungen in einem wässrigen Medium entfernt
werden. Bevorzugterweise wird dabei bei einem pH-Wert zwischen 8 bis 12, speziell bei etwa 9,5
gearbeitet. Als Basen können eingesetzt werden:
Ammoniak, Triäthylamin, Bicarbonat/Carbonat-Puffer
oder Hydroxide von Alkalimetallen wie Natriumhydroxid. Falls R tert-Butyl , substituiertes
Benzyl wie p-Methoxybenzyl oder 2,4,6-Trimethylbenzyl"
oder Diphenylmethyl ist, kann· die genannte Schutzgruppe mittels Acidolyse
entfernt werden, und zwar bevorzugterweise mit Trifluoressigsäure. Die Trifluoressigsäure kann
Wasser enthalten oder auch nicht; sie kann aber auch mit einem organischen Lösungsmittel verdünnt
sein wie beispielsweise Dichlormethan. Wenn R
tert-Butyl ist, kann diese Schutzgruppe ebenfalls mittels der oben beschriebenen Acidolyse entfernt
werden.
B30
Bevorzugte Threonin -Derivate von Humaninsulin der Formel (II) sind diejenigen Verbindungen, in
Bevorzugte Threonin -Derivate von Humaninsulin der Formel (II) sind diejenigen Verbindungen, in
denen. R Wasserstoff ist. Diese Verbindungen werden hergestellt aus L-Threoninderivate der Formel
2
(I), in denen R schon Wasserstoff ist.
(I), in denen R schon Wasserstoff ist.
Als Beispiele für Komplexe oder Salze von des(Ala Insulin kann das Zinksalz oder der Zinkkomplex da- ·
von angegeben werden.
Wenn die Reaktionsbedingungen gemäss dem oben Gesagten
ausgewählt werden, und wenn auch die Angaben der
folgenden Beispiele dabei berücksichtigt werden, ist
B30 es möglich, eine Ausbeute von Threonin -Derivat' von Humaninsulin (Verbindung der Formel II) zu erhalten,
welche über 90 %, ja sogar über 95 % liegt.
Eine bevorzugte Methode für die Herstellung von Human-Insulin, ausgehend von einem Threonin
Derivat von Humaninsulin,, ist die folgende:
1) Falls irgendwelche Rest-Trypsinaktivitäten
nach der Amidierung vorliegen, ist es von Vorteil, wenn diese entfernt werden. Dies kann
. beispielsweise so geschehen, dass die Zustandsbedingungen derart verändert werden, dass Trypsin
inaktiviert wird. Praktisch bedeutet das, dass man zum Beispiel in einem sauren Medium, und zwar
unterhalb dem pH-Wert 3, arbeitet. Trypsin kann aber auch mittels Abtrennmethoden entfernt wer-
* t
den,die gemäss dem Molekulargewicht agieren,
beispielsweise mittels Gelfiltration an"Sephadex G-50"-Gel oder an "Bio-Gel P-30"-Gel in Essigsäure;
siehe wiederum Nature 280, loc, cit.
B30
2) Unreinheiten wie nicht umgesetztes des(Ala )-
Insulin können mittels Anionen- und/oder Kationen-Austausch—Chromatographie entfernt
werden.
3) Anschliessend wird das Threonin -Derivat von Humaninsulin (Verbindung der Formel II)
deblockiert und das Humaninsulin isoliert, beispielsweise mittels Kristallisxerung und
zwar gemäss Methoden, die an und für sich bekannt sind.
Das so erhaltene Humaninsulin ist schon von einer annehmbaren pharmazeutischen Reinheit;
es kann aber gemäss bekannter Methoden weiter gereinigt werden.
Abkürzungen in dieser Beschreibung sind im Sinne der IUPAC-IUB Rules, Commission on Bio- ·
chemical Nomenclature, 2nd Edition, Maryland 19 75, eingesetzt und sollen auch entsprechend
verstanden werden.
Jeder neue Gesichtspunkt in dieser Beschreibung sowie auch Kombinierungen solcher Gesichtspunkte,
werden, als wesentlich betrachtet.
Das erfindungsgemässe Verfahren für die Herstellung von Humaninsulinderivaten und Humaninsulin
wird im folgenden anhand von Beispielen weiter erläutert. Diese Beispiele sind nicht
als Limitierung des Erfindungsgedankens zu betrachten, sondern zeigen nur einige bevorzugte
Ausführungsformen der Erfindung.
B30
10 mg Schweine-des (Ala )-Insulin wurden in 100 μΐ einer 10 M-Essigsäurelösung gelöst. Zu 50 pj. dieser Lösung wurden gegeben: 100 μΐ einer 2 M Thr-OMe (Me steht für Methyl)-Lösung in N,N-DimethyIacetamid, 60 μΐ N7N-Dimethy1acetamid, 15 pl Wasser und 10 μΐ einer Lösung von Trypsin (8 % Gew./Vol.) in einer 0,05 M Calciumchloridlösung. Die Mischung wurde 24 Stunden lang bei 4 C inkubiert. Anschliessend wurde das Produkt mit 8 ml Aceton ausgefällt, mittels Zentrifugierung isoliert, mit 8 ml Aceton gewaschen, mittels Zentrifugierung wieder isoliert und dann in vacpo getrocknet. Die Ausbeute an
10 mg Schweine-des (Ala )-Insulin wurden in 100 μΐ einer 10 M-Essigsäurelösung gelöst. Zu 50 pj. dieser Lösung wurden gegeben: 100 μΐ einer 2 M Thr-OMe (Me steht für Methyl)-Lösung in N,N-DimethyIacetamid, 60 μΐ N7N-Dimethy1acetamid, 15 pl Wasser und 10 μΐ einer Lösung von Trypsin (8 % Gew./Vol.) in einer 0,05 M Calciumchloridlösung. Die Mischung wurde 24 Stunden lang bei 4 C inkubiert. Anschliessend wurde das Produkt mit 8 ml Aceton ausgefällt, mittels Zentrifugierung isoliert, mit 8 ml Aceton gewaschen, mittels Zentrifugierung wieder isoliert und dann in vacpo getrocknet. Die Ausbeute an
B30
Thr-OMe -h-In wurde mittels HPLC bestimmt.
Thr-OMe -h-In wurde mittels HPLC bestimmt.
Das Produkt wurde anschliessend in 2 ml.einer
1 M Essigsäurelösung gelöst. 100 μΐ dieser Lösung wurden auf eine Säule von 4 χ 200 mm gegeben,
die mit "Nucleosil 5 C1" beschickt war. Das Material
Ib
wurde einer Umkehrphasen-HPLC unterworfen, wobei als
Eluent eine 0,2 M Amrnoniumsulphat-Pufferlösung verwendet wurde, die auf einen pH-Wert von 3,5
eingestellt war. Die gleiche Lösung enthielt 26,8 Vol.-% Acetonitril. Bei einer Durchflussgeschwindigkeit
von 1 ml/Min, wurde nach 18 Minuten
B30
des (AIa )-Insulin eluiert und, nach 24 Minuten,
des (AIa )-Insulin eluiert und, nach 24 Minuten,
B30
Thr-OMe Hh-In. Das Nebenprodukt der Reaktion, d.h.
Thr-OMe Hh-In. Das Nebenprodukt der Reaktion, d.h.
das Thr-OMe -des-heptapeptid-(B24-B30)-Insulin wurde nach 7 Minuten eluiert. Die qualitative und
quantitative Bestimmung der Proteine wurde ausgeführt aufgrund der Extinktion der verschiedenen
Lösungen bei 2 80 nm. Die Analyse ergab die folgende Verteilung der Verbindungen:
-κ-
B3 O (Thr-OMe) · -h-In: , y. · 97,1 %
B3 0 des(Ala )-Insulin: 2,5 %
B2 ^ (Thr-OMe) ~-des-heptapeptid (B24-B30)-
0,4 %
Insulxn:
Die Beispiele 2 bis 16, deren Parameter und Resultate
in der folgenden Tabelle 1 zusammengestellt sind, wurden analog dem Beispiel 1 ausgeführt. Die Reaktionsparameter,
die gegenüber dem Beispiel 1 verschieden sind, sind in der genannten Tabelle aufgeführt. In
allen Beispielen wurden 10 μΐ einer 8 %-igen Trypsinlösung
in Wasser, 100 pl eines organischen -Lösungsmittels
mit dem Threonin-Derivat der Formel (I) und
B30
50 ul Essigsäure mit 20 % des (AIa )-Insulin zugegeben.
Die Molarität des Threoninderivates der
Formel (I) im genannten organischen Lösungsmittel und in der Essigsäurelösung ist ebenfalls in Tabelle
angegeben. Die Reaktionsdauer betrug 24 Stunden. In Tabelle 1 werden die folgenden Abkürzungen verwendet:
HOAc ist Essigsäure, DMAA ist N,N-Dimethylacetamid,
DMF ist N,N-Dimethylformamid, DMSO ist Dimethylsulfoxid,
NMP ist N-Methy!pyrrolidon und THF ist Tetrahydrofuran.
-Vf-
In demjenigen Fall/ in dem Thr-OBut) ..-* -h-In
synthetisiert wurde (Beispiel 15), wurde eluiert unter Verwendung eines Acetonitril-Gradienten
von 26,8 bis 4 0 Vol.-% Acetonitril. » ·'■
Beisp. Nr. |
organ. Lösungs mittel |
Molarität an Threo- ninderivat |
Molarität an HOAc /"M./ |
Zusätzliche Zugabe von organ. Lö sungsmittel /.'pi 7 |
H2O //il/ |
Temp. /oc7 |
Aus- Deute /■%7 |
R1 ^ | V | Ungefährer Wasserge halt in der Reaktions mischung |
2 | DMAA | 2 | 10 | 60 | 15 ■ | 12 | 97 | Me | H | 20 |
3 | DMAA | 2 | 10 | 60 | 15 | 25 | 97 | Me | H | 20 |
4 | DMAA | 2 | ■ 10 | 75 | 0 " | 4 | 93 | Me | H | 13 |
5 | DMF | 2 | 10 . | 60 | 15 | 4 | 97 | Me | .H | 20 |
6 | DMF | 2 | 10 | 60 | 15 | 12 | 97 | Me | H | 20 |
7 | DMF | 2 | 1.0 | 60 | 15 | 25 | 97 | Me | H | 20 |
8 | DMSO | 2 | lü | 60 | 15 | 4 | 97 | Me | H | 20 |
9 | DMSO | 2 | 10 | 60 | 15 | 12 | 94 | Me | H | 20 |
10 | NMP' | 2 | 10 | 60 | 15 | 4 | 96 | Me | H | 20 |
11 | NMP | 2 | 10 | 60 | 15 | 12 | 97 | Me | H | 20 |
12 | DMAA | 2 | 4 | 60 | 15 | 12 | 88 | Me | H | Ί· 27 |
13 | DMAA | 2 | 4 | 75 | 0 | 12 | 94 | Me | H | 21 |
14 | DMF | 2 | 4 | 60 | 15 | -22 | 90 | Me | H | 27 |
15 | DMAA | 2 | 10 | 60 | 15 | 12 | 97 | But | H | 20., |
16 | DMAA | 2 | • 10 | 60 | 15 | 12 | 91 | But | But | 20 |
/r
Beispiele 17 bis 34
N
Diese Beispiele wurden analog den Beispielen 1 bis 16 ausgeführt mit der Ausnahme, dass die Reaktionsdauer
nur 4 Stunden betrug. In allen diesen Beispielen wurden jedoch praktisch die gleichen Ausbeuten erreicht
wie diejenigen der Beispiele 1 bis 16. Daraus folgt, dass das erfindungsgemasse Verfahren
unter anderem sich von den bekannten Verfahren· dadurch unterscheidet, dass die Zeitabhängigkeit der
Ausbeute ausgeschaltet wird.
250 mg kristallines(Thr-OMe) -h-In wurden in 25 ml
Wasser dispergiert und durch Zugabe von 1 N Natriumhydroxidlösung bis zu einem pH-Wert von 10,0 in
Lösung gebracht. Der pH-Wert wurde 24 Stunden lang konstant auf 10,0 gehalten; die Temperatur betrug
25 C. Das dabei gebildete Humaninsulin kristallisierte nach Zugabe von 2 g Natriumchlorid, 350 mg Natriumacetattrihydrat
und 2,5 mg Zinkacetatdihydrat und einer anschliessenden Zugabe von 1 N Salzsäurelösung,
um einen pH-Wert von 5,52 zu erhalten, aus. Nach Lagerung des Produktes während 24 Stunden bei 4 C wurden
die rhombohedralen Kristalle mittels Zentrifugierung abgetrennt, mit 3 ml Wasser gewaschen, durch Zentrifugierung
isoliert und in vacuo getrocknet. Die Ausbeute betrug 220 mg Humaninsulin - Kristalle, welche angenähert
4 Zn pro Insulin-Hexameres enthalten.
Claims (22)
- NXM 809Patentansprüche,Verfahren zur Herstellung von Human-Insulin oder T-hreoninderivaten, Salzen oder Komplexen davon,B30 mittels Umsetzung von Schweine-des (AIa ) Insulin oder eines Salzes oder eines Komplexes davon mit einem L-Threoninderivat der Formel (I)Thr(R2) - OR1 (I),oder mit einem Salz davon,worin R für eine Carboxylrest-Schutzgruppe undR für Wasserstoff oder eine Hydroxylrest-Schutzgruppe stehen,in einer Mischung aus Wasser, aus einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel und aus Trypsin, dadurch gekennzeichnet, dassder Gehalt an Wasser in der Reaktionsmischung zwischen 10 und 30 Vol.-% liegt und dass die Reaktionstemperatur unter 37 C liegt, wobei gegebenenfalls zusätzlich Säure in der Mischung vorhanden ist, wonach das resultierende Derivat, falls gewünscht, deblockiert wird,, um die Form des Human-Insulins zu erhalten.813
- 2. Verfahren gemäss Patentanspruch .If) dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration an L-Threoninderivat der Formel (I) in der Reaktionsmischung mehr als 0,1 molar ist, dass die Reaktibnstemperatur über dem Gefrierpunkt der Mischung liegt und dass die Reaktionsmischung nicht mehr als10 Aequivalente an Säure pro Aequivalent L-Threoninderivat der Formel (I) enthält.
- 3. Verfahren gemäss irgendeinem der vorangehenden Patentansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktionstemperatur unterhalb ungefähr der Raumtemperatur und oberhalb ungefähr 0 C liegt.
- 4. Verfahren gemäss irgendeinem der vorangehenden Patentansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Gehalt an Wasser in der Reaktionsmischung unterhalb 25 Vol.-% liegt.
- 5. Verfahren gemäss irgendeinem der vorangehenden Patentansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Gehalt an Wasser in der Reaktionsmischung oberhalb 15 Vol.-% liegt.
- 6. Verfahren gemäss irgendeinem der vorangehenden Patentansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das molare Verhältnis zwischen dem L-Threonin-B30 derivat der Formel (I) und des (AIa )-Insulin oberhalb 5:1 liegt.
- 7. Verfahren gemäss irgendeinem der vorangehenden Patentansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das mit Wasser mischbare organische Lösungsmittel eines aus der folgenden Gruppe ist: Methanol, Aethanol, 2-Propanol, 1,2-Aethandiol, Aceton, Dioxan, Tetrahydrofuran, Formamid, Ν,Ν-Dimethylformamid, N,N-Dimethy1acetamid, N-Methylpyrrolidon, Hexamethylphosphortriainid, Acetonitril oder DMSO-
- 8. Verfahren gemäss Patentanspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Lösungsmittel eines aus der folgenden Gruppe ist: Formamid, N,N-Dimethy^formamid, Ν,Ν-Dimethylacetamid,. N-Methylpyrrolidon, Hexamethylphosphortriamid, Acetonitril oder DMSO.
- 9. Verfahren gemäss irgendeinem der vorangehenden Patentansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Säure eine organische Säure ist und zwar bevorzugterweise eine aus der folgenden Gruppe: Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure oder Buttersäure.
- 10. Verfahren gemäss irgendeinem der vorangehenden Patentansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Menge an Säure in der Reaktionsmischung zwischen 0,5 und 5 Aequivalente auf 1 Aequivalent L-Threoninderivat der Formel (I) beträgt.
- 11. Verfahren gemäss irgendeinem der*vorangehenden Patentansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Gewichtsverhältnis zwischen Trypsin undB30 "des (AIa )-Insulin in der Reaktionsmischung oberhalb 1:·200 ist, bevorzugterweise oberhalb 1:50 und unterhalb 1:1.
- 12. Verfahren gemäss irgendeinem der vorangehenden Patentansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es in Anwesenheit von Kalziumionen durchgeführt wird.
- 13. Verfahren gemäss irgendeinem der vorangehenden Patentansprüche, dadurch gekennzeichnet, dasses in einem gepufferten System durchgeführt wird.
- 14. Verfahren gemäss irgendeinem der vorangehenden Patentansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das L-Threoninderivat der Formel (I) in Form eines Acetats, eines Propionate, eines Butyrats, eines Hydrohalogenides wie Hydrochlorid, zugegeben wird.
- 15. Verfahren gemäss irgendeinem der vorangehenden Patentansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktionstemperatur und die Gehalte an Wasser und Säure in der Reaktionsmischung soB30 gewählt werden, dass die Ausbeute an ThreoninDerivat von Humaninsulin: in der Reaktionsmischung über 9 0 %, bevorzugterweise über 95 %, beträgt.
- 16. Verfahren gemäss irgendeinem der 'Vorangehenden Patentansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass R Niederalkyl, substituiertes Benzyl oder Diphenylmethyl oder eine Gruppe der allgemeinen3 3
Formel -CH CB SO R mit R Niederalkyl bedeutet.£s £. £e - 17. Verfahren gemäss Patentanspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass R Methyl, Aethyl, tert-Butyl, p-Msethoxybenzyl, ?,4,6-Trimethylbenzy1 oder eine Gruppe der Formel -CH-CH SO-R , mit3
R Methyl, Aethyl, Propyl oder η-Butyl bedeutet.B30 - 18. Threonin -Derivate von Humaninsulin, hergestelltmittels den Verfahren gemäss Patentansprüchen 1 bis 17.
- 19. Threonin -Derivate von Humaninsulin, hergestellt gemäss den Beispielen 1 bis 34.
- 20. Verfahren gemäss Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Deblockierung in einem wässrigen Medium in Anwesenheit einer Säure, bevorzugterweise bei einem pH-Wert zwischen 8 und 12, ausgeführt wird.
- 21. Verfahren gemäss Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Deblockierung mittels Acidolyse , bevorzugterweise mit Trifluoressigsäure, ausgeführt wird.
- 22. Humaninsulin, erhalten mittels der Verfahren gemäss irgendeinem Patentanspruch von 1 bis 17 sowie gemäss Patentansprüchen 20 und.21.
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US7713929B2 (en) * | 2006-04-12 | 2010-05-11 | Biodel Inc. | Rapid acting and long acting insulin combination formulations |
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CA2766571A1 (en) * | 2009-07-09 | 2011-02-24 | Biocon Limited | A preparative non-linear gradient based chromatographic method and purified products thereof |
WO2011090971A2 (en) | 2010-01-19 | 2011-07-28 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Osteocalcin as a treatment for male reproductive disorders |
US10052364B2 (en) | 2013-03-15 | 2018-08-21 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Osteocalcin as a treatment for cognitive disorders |
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EP3581578A4 (de) * | 2017-02-10 | 2020-04-22 | Mitsubishi Chemical Corporation | Trennmittel zur reinigung von menschlichem insulin und verfahren zur reinigung von menschlichem insulin |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0017938A1 (de) * | 1979-04-13 | 1980-10-29 | Shionogi & Co., Ltd. | Verfahren zur Herstellung von B30-Threonin-Insulin |
Family Cites Families (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3276961A (en) * | 1963-04-08 | 1966-10-04 | Squibb & Sons Inc | Process for preparing human insulin |
US3903068A (en) * | 1972-12-26 | 1975-09-02 | Us Health Education & Welfare | Facile synthesis of human insulin by modification of porcine insulin |
JPS55138391A (en) * | 1979-04-13 | 1980-10-29 | Shionogi & Co Ltd | New synthetic method of peptide derivative |
JPS55138392A (en) * | 1979-04-13 | 1980-10-29 | Shionogi & Co Ltd | Semisynthesis of insulin |
JPS55138393A (en) * | 1979-04-13 | 1980-10-29 | Shionogi & Co Ltd | Semisynthesis of insulin |
IE50892B1 (en) * | 1980-02-11 | 1986-08-06 | Novo Industri As | Process for preparing insulin esters |
DK319780A (da) * | 1980-07-24 | 1982-01-25 | Forenede Bryggerier As | Fremgangsmaade til enzymatisk udskiftning af b-30 aminosyren i insuliner |
WO1983002772A1 (en) * | 1982-02-08 | 1983-08-18 | Robin Ewart Offord | An improved method for preparing human insulin from non-human insulin |
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1981
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Patent Citations (1)
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Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
BRANDENBURG, D., WOLLMER, A. (Herausgeber), Insulin Chemistry, Structure and Function of Insulin and Related Hormones, Proceedings of the Second International Insulin Symposium Aachen, Verlag de Gruyter, Berlin, 1980, S.117-123 * |
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