DE3229674C2 - - Google Patents
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Description
Die Erfindung betrifft ein gattungsgemäßes Verfahren nach dem
Oberbegriff von Anspruch 1.
Es sind verschiedene Verfahren zur Herstellung von Humaninsulin
bekannt. Beispiele solcher Verfahren sind in Extraktion aus
Humanpancreas, die Synthese aus entsprechenden Aminosäuren,
gentechnische Prozesse und die Umwandlung von Schweineinsulin in
Humaninsulin. Einige der Verfahren zur Umwandlung von Schweineinsulin
in Humaninsulin verlaufen über Schweine-des-octapeptid-
(B23-B30)-Insulin, andere verlaufen über das (AlaB30)-Insulin.
Speziell betrifft nun diese Erfindung die Umwandlung von Schweine-
des(AlaB30)-Insulin in Humaninsulin über ein ThreoninB30-Derivat
von Humaninsulin.
Bei der Behandlung von Diabetes melitus werden
im allgemeinen Insulinpräparate auf der Basis
von Schweine- oder Rinder-Insulin eingesetzt.
Rinder-, Schweine- und Human-Insulin zeigen
kleinere Differenzen hinsichtlich ihres Aminosäureaufbaus.
Die Differenz zwischen Human- und
Schweine-Insulin ist auf eine einzige Aminosäure
begrenzt: Die B30-Aminosäure von Humaninsulin ist
Threonin, während die gleiche Aminosäure bei
Schweineinsulin Alanin ist.
Ein Verfahren zur Herstellung von Human-Insulin
aus des (AlaB30)-Insulin wird in der EP-A 17 938
beschrieben. Gemäß der genannten Patentanmeldung
wird die Amidierung in einem Medium durchgeführt, das 0 bis 65%,
bevorzugt 40 bis 60%, eines organischen Lösungsmittels
enthält. Weiter liegt die bevorzugte Reaktionstemperatur
zwischen 20 und 40°C, wobei in allen Beispielen
eine Temperatur von 37° eingehalten wird. Die
Ausbeuten der Umsetzung von des(AlaB30)-Insulin zum
ThreoninB30-Ester liegen in allen drei Beispielen bei
ungefähr 50%.
Ein weiteres Verfahren für die Herstellung von Humaninsulin
aus des(AlaB30)-Insulin ist beschrieben in
"Proceedings of the 2nd International Insulin Symposium",
Aachen, Verlag de Gruyter, Berlin, 1980, Seiten 117-123.
Gemäß dieser Veröffentlichung wurde die Amidierung in einem
Medium ausgeführt, welches ungefähr 60% organisches
Lösungsmittel enthält. Die Reaktionstemperatur lag bei
38°C. Die Ausbeute, welche mittels HPLC bestimmt wurde,
lag bei 67%.
Einer der Gründe für die niedrigen Ausbeuten der bekannten
Verfahren liegt im Verlust von Insulin aufgrund
unerwünschter Nebenreaktionen, beispielsweise der
Bildung von DOI-Thr(R²)-OR¹. In dieser Formel bezeichnet
DOI Schweine-des-Octapeptid-(B23-B30)-Insulin und
R¹ und R² die weiter unten beschriebenen Substituenten.
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren
zu schaffen, bei dem die Ausbeute an Reaktionsprodukten extrem,
d. h. im Normalfall auf über 90%, gesteigert werden kann.
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch die im Kennzeichen
des Anspruchs 1 aufgeführten Merkmale gelöst.
Vorteilhafte Ausführungsformen der Erfindung ergeben sich
aus den Unteransprüchen.
Überraschenderweise hat sich also erwiesen, daß die gewünschten
hohen Ausbeuten dann erreichbar sind, wenn der Wassergehalt
der Reaktionsmischung bedeutend tiefer liegt als derjenige
bei den bekannten Verfahren und wenn die Umsetzung bei
niedrigeren Temperaturen als üblich durchgeführt werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird so durchgeführt,
daß des(AlaB30)-Insulin, ein
L-Threoninderivat der Formel (I) und Trypsin
zusammen in einer Mischung aus Wasser und
mindestens einem mit Wasser mischbaren organischen
Lösungsmittel gelöst werden, gegebenenfalls
in Anwesenheit einer Säure.
Die organischen Lösungsmittel, die im erfindungsgemäßen
Verfahren eingesetzt werden können,
sind polare Lösungsmittel, die mit Wasser mischbar
sind. Es sind zugleich bevorzugt solche
Lösungsmittel, die Insulinverbindungen und
Threoninester in hoher Konzentration zu lösen
vermögen. Beispiele solcher geeigneten organischen
Lösungsmittel sind aprotische Lösungsmittel, wie
N,N-Dimethylformamid, N,N-Dimethylacetamid, N-
Methylpyrrolidon, Hexamethylphosphortriamid,
Dimethylsulfoxid, Dioxan, Aceton, Tetrahydrofuran,
Formamid und Acetonitril und protische Lösungsmittel,
wie Ethanol, Methanol, 2-Propanol und 1,2-Ethandiol.
Die Natur des Lösungsmittels beeinflußt
das System als Ganzes und ein Zusammenhang zwischen
einem bestimmten Lösungsmittel und einem hohen
Amidierungsgrad kann nicht auf ein anderes Lösungsmittel
übertragen werden. Die besten Ausbeuten wurden
mit aprotischen Lösungsmitteln erhalten.
Je nach verwendetem organischen Lösungsmittel, nach
gewählter Reaktionstemperatur und ob Säure anwesend
ist oder nicht, beträgt der Wassergehalt in der
Reaktionsmischung zwischen 10 und 30 Vol.-%, bevorzugt
zwischen 15 und 25 Vol.-%.
Ein Vorteil des verringerten Wassergehaltes in der
Reaktionsmischung ist die Vermeidung von Nebenreaktionen.
Auch durch Erhöhen des Säuregehaltes
in der Reaktionsmischung wird der gleiche Effekt
erreicht. Die Erhöhung der Ausbeute korreliert positiv
mit einem niedrigen Wassergehalt in der Reaktionsmischung.
Um die Denaturierung des Enzyms in der
Reaktionsmischung aufgrund dieses niedrigen Wassergehalts
zu verhindern, liegt die Reaktionstemperatur um
einiges tiefer als die Reaktionstemperatur
von bekannten Verfahren in der Peptidsynthese mit
Trypsin, d. h. tiefer als 37°C.
Der Trypsintyp ist nicht kritisch für die Ausführung
des erfindungsgemäßen Verfahrens. Trypsin ist ein
gut charakterisiertes Enzym, welches in hoher Reinheit
kommerziell erhältlich ist und zwar vor allem
aus Rinder- oder Schweinepräparaten. Es kann aber
auch Trypsin mikrobieller Herkunft eingesetzt
werden. Zudem ist auch die Form des Trypsins für die
Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens nicht
kritisch, d. h. der Enzym kann kristallin (lösliche Form),
immobilisiert oder sogar als Derivat (solange die
Trypsinaktivität beibehalten wird) vorliegen. Der
Ausdruck "Trypsin" wird hier verwendet, um Trypsine
jeglicher Herkunft und Form zu bezeichnen,
welche die Amidierungsaktivität beibehalten haben. Der
Ausdruck umfaßt also auch Proteasen mit trypsinähnlicher
Spezifität, beispielsweise Achromabacter
lyticus protease; siehe dazu Agric. Biol. Chem. 42,
Seite 1443.
Als Beispiele für aktive Trypsinderivate können die
folgenden genannt werden: acetyliertes Trypsin,
succinyliertes Trypsin, mit Glutaraldehyd behandeltes
Trypsin und immobilisierte Trypsinderivate. Falls
ein immobilisiertes Trypsin verwendet wird, wird
es im Reaktionsraum suspendiert.
Organische oder anorganische Säuren wie Salzsäure, Ameisensäure,
Essigsäure, Propionsäure und Buttersäure und/oder
Basen wie Pyridin, TRIS (Tris-(hydroxymethyl)amino
methan), N-Methylmorpholin und N-Ethylmorpholin können
dem Reaktionsmedium zugegeben werden, um ein geeignetes
Puffersystem zu schaffen. Organische Säuren werden dabei
bevorzugt. Die Reaktion kann jedoch auch ohne solche
Zusätze durchgeführt werden. Die Menge der zugegebenen
Säure ist normalerweise kleiner als ungefähr 10
Äquivalente pro Äquivalent L-Threoninderivat der
Formel (I). Bevorzugterweise beträgt die Menge an
Säure zwischen 0,5 und 5 Äquivalente pro Äquivalent
L-Threoninderivate der Formel (I). Ionen, welche Trypsin
zu stabilisieren vermögen, wie beispielsweise Calciumionen,
können ebenfalls in Form ihrer Salze zugegeben
werden.
Das Verfahren wird bei Temperaturen zwischen
37°C und dem Gefrierpunkt der Reaktionsmischung
durchgeführt. Enzymatische
Reaktionen mit Trypsin werden normalerweise bei
ungefähr 37°C durchgeführt, um so eine genügend hohe
Umsatzgeschwindigkeit zu erreichen. Um jedoch die
Inaktivierung von Trypsin zu erreichen, ist es von
Vorteil, das erfindungsgemäße Verfahren bei Temperaturen
unterhalb der Umgebungstemperatur durchzuführen.
Praktisch werden Reaktionstemperaturen von
oberhalb ungefähr 0°C bevorzugt.
Die Reaktionszeit liegt normalerweise zwischen
einigen Stunden und einigen Tagen, je nach Reaktionstemperatur
und je nach Menge zugesetzten Trypsins.
Auch andere Reaktionsparameter können auf die Reaktionsdauer
einen Einfluß haben.
Zu einem großen Teil wird die Wirkung von Trypsin
durch die gegenseitige Beeinflussung von Wasser und
Lösungsmittel kontrolliert. Die gleiche Wirkung hängt
aber auch vom Säure/Base-Verhältnis und von der
Reaktionstemperatur ab. Die Reaktionsbedingungen
werden so gewählt, daß die Amidierungswirkung begünstigt
wird und unerwünschte Nebenreaktionen, die
ebenfalls durch das Trypsin katalysiert werden, unterdrückt
werden. Die Verringerung des Wassergehaltes in
der Reaktionsmischung zeigt die beiden zuletzt genannten
positiven Wirkungen, führt aber auch zu einer
Erhöhung der Geschwindigkeit, welche zur irreversiblen
Denaturierung von Trypsin führt. Der zuletztgenannten
Einwirkung kann jedoch zumindest teilweise dadurch ent
gegengewirkt werden, daß die Reaktionstemperatur
erniedrigt wird. Durch die Erniedrigung der Reaktionstemperatur
wird zwar auch die Amidierungsgeschwindigkeit
kleiner, aber dieser Nachteil
wird einfach durch Verlängerung der Reaktionsdauer
wiedergutgemacht.
Das Gewichtsverhältnis zwischen eingesetztem Trypsin
und des (AlaB30)-Insulin in der Reaktionsmischung
liegt normalerweise oberhalb 1 : 200,
bevorzugt oberhalb 1 : 50 und unterhalb 1 : 1.
Die ThreoninB30-Derivate von Humaninsulin, welche
aus der genannten Amidierung resultieren, können
durch die folgende allgemeine Formel (II) dargestellt
werden:
(Thr(R²)-OR¹)B30-h-In (II).
Darin steht h-In für den Human-des(ThrB30)-Insulinrest
und R¹ und R² sind ebenso definiert wie weiter oben.
Einsetzbare L-Threoninderivate der Formel (I) sind solche,
in denen R¹ eine Carboxylrest-Schutzgruppe ist, die
vom ThreoninB30--Ester des Humaninsulin (Verbindung der
Formel II) entfernt werden kann, ohne daß β dabei das
Insulinmolekül irreversibel und wesentlich geändert werden.
Beispiele solcher Carboxylrest-Schutzgruppen
sind folgende: Niederalkyl wie Methyl, Ethyl und tert-
Butyl, substituiertes Benzyl wie p-Methoxybenzyl und
2,4,6-Trimethylbenzyl und Diphenylmethyl sowie
Gruppen der allgemeinen Formel -CH₂CH₂SO₂R³,
mit R³ Niederalkyl wie Methyl, Ethyl, Propyl
und n-Butyl. Geeignete Hydroxylrest-Schutzgruppen
R² sind solche, welche vom ThreoninB30-Derivat
von Humaninsulin (Verbindung der Formel II) so
abgespalten werden können, daß dabei keine
irreversible und wesentliche Änderung im
Insulinmolekül auftritt. Ein Beispiel einer
solchen Gruppe R² ist tert-Butyl.
Der Ausdruck "Niederalkyl" steht hier für solche
Gruppen mit weniger als 7 C-Atomen, bevorzugterweise
weniger als 5 C-Atomen.
Weitere mögliche Schutzgruppen sind beschrieben in
"Wünsch: Methoden der Organischen Chemie" (Houben-Weyl),
Band XV/1, herausgegeben von Eugen Müller, Georg Thieme
Verlag, Stuttgart, 1974.
Ein Verfahren für die Herstellung von des(AlaB30)-
Insulin ist in "Hoppe-Seyler's Zeitschrift
für Physiol. Chemie 359", (1978), Seite 799, ff.
beschrieben.
Einige der L-Threonin-Derivate der Formel (I) sind
bekannte Verbindungen; die anderen L-Threonin-
Verfahren können mittels analoger Verfahren dargestellt
werden.
Die L-Threonin-Derivate der Formel (I) können
entweder als freie Basen vorliegen oder als Salze
geeigneter organischer oder anorganischer Säuren.
Bevorzugt sind dabei Acetate, Propionate, Butyrate und
Hydrohalogenide, beispielsweise Hydrochloride.
Bevorzugt werden die Reaktanden, d. h. das des (AlaB30)-
Insulin und die L-Threoninderivate der Formel (I) in hohen
Konzentrationen eingesetzt. Das Molverhältnis zwischen
dem L-Threoninderivat der Formel (I) und dem des (AlaB30)-
Insulin liegt vorzugsweise oberhalb 5 : 1.
Die Konzentration des L-Threoninderivats der Formel (I)
in der Reaktionsmischung ist vorzugsweise höher als
0,1 molar.
Von den ThreoninB30-Derivaten von Humaninsulin
(Verbindungen der Formel II) kann das Humaninsulin
mittels Entfernung der Schutzgruppen R¹ und
ggf. vorhandener Schutzgruppen R² erhalten werden
und zwar mittels an und für sich bekannter Methoden.
Falls R¹ Methyl, Ethyl oder eine der Gruppen
-CH₂CH₂SO₂R³ mit R³ gemäß obiger Definition ist,
kann die genannte Schutzgruppe in schwach basischen
Bedingungen in einem wäßrigen Medium entfernt
werden. Bevorzugterweise wird dabei bei einem pH-Wert
zwischen 8 bis 12, speziell bei etwa 9,5
gearbeitet. Als Basen können eingesetzt werden:
Ammoniak, Triäthylamin, Biscarbonat/Carbonat-
Puffer oder Hydroxide von Alkalimetallen wie
Natriumhydroxid. Falls R¹ tert-Butyl, substituiertes
Benzyl wie p-Methoxybenzyl oder 2,4,6-
Trimethylbenzyl oder Diphenylmethyl ist, kann
die genannte Schutzgruppe mittels Acidolyse
entfernt werden, und zwar bevorzugterweise mit
Trifluoressigsäure. Die Trifluoressigsäure kann
Wasser enthalten oder auch nicht; sie kann aber
auch mit einem organischen Lösungsmittel verdünnt
sein wie beispielsweise Dichlormethan. Wenn R²
tert-Butyl ist, kann diese Schutzgruppe ebenfalls
mittels der oben beschriebenen Acidolyse entfernt
werden.
Bevorzugte ThreoninB30-Derivate von Humaninsulin
der Formel (II) sind diejenigen Verbindungen, in
denen R² Wasserstoff ist. Diese Verbindungen werden
hergestellt aus L-Threoninderivate der Formel
(I), in denen R² schon Wasserstoff ist.
Als Beispiele für Komplexe oder Salze von des(AlaB30)-
Insulin kann das Zinksalz oder der Zinkkomplex davon
genannt werden.
Wenn die Reaktionsbedingungen gemäß dem oben Gesagten
ausgewählt werden, und wenn auch die Angaben der
folgenden Beispiele dabei berücksichtigt werden, ist
es möglich, eine Ausbeute von ThreoninB30-Derivat
von Humaninsulin (Verbindung der Formel II) zu erhalten,
welche über 90%, ja sogar über 95% liegt.
Eine bevorzugte Methode für die Herstellung von
Human-Insulin, ausgehend von einem ThreoninB30-
Derivat von Humaninsulin, ist die folgende:
- 1. Falls igendwelche Rest-Trypsinaktivitäten nach der Amidierung vorliegen, ist es von Vorteil, wenn diese entfernt werden. Dies kann beispielsweise so geschehen, daß Trypsin inaktiviert wird. Praktisch bedeutet das, daß man zum Beispiel in einem sauren Medium, und zwar unterhalb eines pH-Werts von 3, arbeitet. Trypsin kann aber auch mittels Abtrennmethoden entfernt werden, die aufgrund des Molekulargewichtes wirken, beispielsweise mittels Gelfiltration an "Sephadex® G-50"-Gel oder an "Bio-Gel®P-30"-Gel in Essigsäure; siehe dazu Nature 280 (1979), Seite 412.
- 2. Unreinheiten wie nicht umgesetztes des(AlaB30)- Insulin können mittels Anionen- und/oder Kationen-Austausch-Chromatographie entfernt werden.
- 3. Anschließend wird das ThreoninB30-Derivat von Humaninsulin (Verbindung der Formel II) deblockiert und das Humaninsulin isoliert, beispielsweise mittels Kristallisierung und zwar gemäß Methoden, die an und für sich bekannt sind.
Das so erhaltene Humaninsulin ist schon von
einer annehmbaren pharmazeutischen Reinheit;
es kann aber gemäß bekannter Methoden weiter
gereinigt werden.
Abkürzungen in dieser Beschreibung sind im
Sinne der IUPAC-IUB Rules, Commission on Biochemical
Nomenclature, 2nd Edition, Maryland
1975, eingesetzt und sollen auch entsprechend
verstanden werden.
10 mg Schweine-des (AlaB30)-Insulin wurden in 100 µl
einer 10 M-Essigsäurelösung gelöst. Zu 50 µl dieser
Lösung wurden gegeben: 100 µl einer 2 M Thr-OMe
(Me steht für Methyl)-Lösung in N,N-Dimethylacetamid,
60 µl N,N-Dimethylacetamid, 15 µl Wasser und 10 µl
einer Lösung von Trypsin (8% Gew./Vol.) in einer
0,05 M Calciumchloridlösung. Die Mischung wurde
24 Stunden lang bei 4°C inkubiert. Anschließend
wurde das Produkt mit 8 ml Aceton ausgefällt,
mittels Zentrifugierung isoliert, mit 8 ml Aceton
gewaschen, mittels Zentrifugierung wieder isoliert
und dann in vacuo getrocknet. Die Ausbeute an
Thr-OMeB30-h-In wurde mittels HPLC bestimmt.
Das Produkt wurde anschließend in 1 ml einer
1 M Essigsäurelösung gelöst. 100 µl dieser Lösung
wurden auf eine Säule von 4×200 mm gegeben,
die mit "Nucleosil®5C₁₈" beschickt war. Das Material
wurde einer Umkehrphasen-HLC unterworfen, wobei als
Eluent eine 0,2 M Ammoniumsulfat-Pufferlösung
verwendet wurde, die auf einen pH-Wert von 3,5
eingestellt war. Die gleiche Lösung enthielt
26,8 Vol.-% Acetonitril. Bei einer Durchflußgeschwindigkeit
von 1 ml/Min. wurde nach 18 Minuten
das (AlaB30)-Insulin eluiert und, nach 24 Minuten,
Thr-OMeB30-h-In. Das Nebenprodukt der Reaktion, d. h.
des Thr-OMeB23-des-heptapeptid-(B24-B30)-Insulin
wurde nach 7 Minuten eluiert. Die qualitative und
quantitative Bestimmung der Proteine wurde ausgeführt
aufgrund der Extinktion der verschiedenen
Lösungen bei 280 nm. Die Analyse ergab die folgende
Verteilung der Verbindungen:
(Thr-OMe)B30-h-In:|97,1% | |
des(AlaB30)-Insulin: | 2,5% |
(Thr-OMe)B30-des-heptapeptid (B24-B30)-Insulin: | 0,4% |
Die Beispiele 2 bis 16, deren Parameter und Resultate
in der folgenden Tabelle 1 zusammengestellt sind,
wurden analog dem Beispiel 1 ausgeführt. Die Reaktionsparameter,
die gegenüber dem Beispiel 1 verschieden
sind, sind in der genannten Tabelle aufgeführt. In
allen Beispielen wurden 10 µl einer 8%igen Trypsinlösung
in Wasser, 100 µl eines organischen Lösungsmittels
mit dem Threonin-Derivat der Formel (I) und
50 µl Essigsäure mit 20% des (AlaB30)-Insulin zugegeben.
Die Molarität des Threoninderivates der
Formel (I) im genannten organischen Lösungsmittel
und in der Essigsäurelösung ist ebenfalls in Tabelle 1
angegeben. Die Reaktionsdauer betrug 24 Stunden.
In Tabelle 1 werden die folgenden Abkürzungen verwendet:
HOAc ist Essigsäure, DMAA ist N,N-Dimethylacetamid, DMF ist N,N-Dimethylformamid, DMSO ist Dimethylsulfoxid, NMP ist N-Methylpyrroldon und THF ist Tetrahydrofuran.
HOAc ist Essigsäure, DMAA ist N,N-Dimethylacetamid, DMF ist N,N-Dimethylformamid, DMSO ist Dimethylsulfoxid, NMP ist N-Methylpyrroldon und THF ist Tetrahydrofuran.
In demjenigen Fall, in dem Thr-OBut)B30-h-In
synthetisiert wurde (Beispiel 15), wurde eluiert
unter Verwendung eines Acetonitril-Gradienten
von 26,8 bis 40 Vol.-% Acetonitril.
Diese Beispiele wurden analog den Beispielen 1 bis 16
ausgeführt mit der Ausnahme, daß die Reaktionsdauer
nur 4 Stunden betrug. In allen diesen Beispielen
wurden jedoch praktisch die gleichen Ausbeuten erreicht
wie diejenigen der Beispiele 1 bis 16.
Daraus folgt, daß das erfindungsgemäße Verfahren
unter anderem sich von den bekannten Verfahren dadurch
unterscheidet, daß die Zeitabhängigkeit der
Ausbeute ausgeschaltet wird.
250 mg kristallines (Thr-OMe)B30-h-In wurden in 25 ml
Wasser dispergiert und durch Zugabe von 1 N Natrium
hydroxidlösung bis zu einem pH-Wert von 10,0 in
Lösung gebracht. Der pH-Wert wurde 24 Stunden lang
konstant auf 10,0 gehalten; die Temperatur betrug
25°C. Das dabei gebildete Humaninsulin kristallisierte
nach Zugabe von 2 g Natriumchlorid, 350 g Natriumacetattrihydrat
und 2,5 mg Zinkacetatdihydrat und
einer anschließenden Zugabe von 1 N Salzsäurelösung,
um einen pH-Wert von 5,52 zu erhalten, aus. Nach Lagerung
des Produktes während 24 Stunden bei 4°C wurden
die rhombohedralen Kristalle mittels Zentrifugierung
abgetrennt, mit 3 ml Wasser gewaschen, durch Zentrifugierung
isoliert und in vacuo getrocknet. Die Ausbeute
betrug 220 mg Humaninsulin-Kristalle, welche angenähert
4 Zn2+ pro Insulin-Hexameres enthalten.
Claims (7)
1. Verfahren zur Herstellung von Humaninsulin oder
ThreoninB30-Derivaten, Salzen oder Komplexen davon, mittels
Umsetzung von Schweine-des(AlaB30)-Insulin oder eines Salzes
oder eines Komplexes davon mit einem L-Threonin-Derivat der
allgemeinen Formel (I)
Thr(R²)-OR¹ (I),oder mit einem Salz davon,
worin R¹ für eine Carboxylschutzgruppe und R² für Wasserstoff oder eine Hydroxylschutzgruppe steht,
in einer Mischung aus Wasser, aus einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel und aus Trypsin,
dadurch gekennzeichnet, daß man die Umsetzung mit einem Gehalt an Wasser in der Reaktionsmischung zwischen 10 und 30 Vol.-% und bei einer Reaktionstemperatur unter 37°C, gegebenenfalls in Anwesenheit einer organischen oder anorganischen Säure, durchführt und gegebenenfalls vom so erhaltenen ThreoninB30-Derivat des Humaninsulins die Schutzgruppen in an sich bekannter Weise abspaltet.
worin R¹ für eine Carboxylschutzgruppe und R² für Wasserstoff oder eine Hydroxylschutzgruppe steht,
in einer Mischung aus Wasser, aus einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel und aus Trypsin,
dadurch gekennzeichnet, daß man die Umsetzung mit einem Gehalt an Wasser in der Reaktionsmischung zwischen 10 und 30 Vol.-% und bei einer Reaktionstemperatur unter 37°C, gegebenenfalls in Anwesenheit einer organischen oder anorganischen Säure, durchführt und gegebenenfalls vom so erhaltenen ThreoninB30-Derivat des Humaninsulins die Schutzgruppen in an sich bekannter Weise abspaltet.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
man es mit einer Konzentration an L-Threonin-Derivat der Formel
(I) in der Reaktionsmischung von mehr als 0,1 molar und
mit einer Menge an Säure in der Reaktionsmischung von nicht mehr
als 10 Äquivalenten pro Äquivalent L-Threonin-Derivat
der Formel (I) durchführt.
3. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, daß man es bei einer Reaktionstemperatur
zwischen 20°C bis 25°C und 0°C durchführt.
4. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, daß man es mit einem Gehalt an Wasser
in der Reaktionsmischung zwischen 15 bis 25 Vol.-% durchführt.
5. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, daß man es mit einem Gewichtsverhältnis
von Trypsin zu des(AlaB30)-Insulin in der Reaktionsmischung
oberhalb 1 : 200, bevorzugterweise oberhalb 1 : 50 und unterhalb
1 : 1, durchführt.
6. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, daß man es mit einer Menge an
Säure in der Reaktionsmischung zwischen 0,5 und 5 Äquivalenten
pro Äquivalent L-Threonin-Derivat der Formel (I) durchführt.
7. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, daß man es in Anwesenheit von
Calciumionen durchführt.
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US20080085298A1 (en) * | 2004-03-12 | 2008-04-10 | Biodel, Inc. | Rapid Mucosal Gel or Film Insulin Compositions |
US20080096800A1 (en) * | 2004-03-12 | 2008-04-24 | Biodel, Inc. | Rapid mucosal gel or film insulin compositions |
US20080090753A1 (en) | 2004-03-12 | 2008-04-17 | Biodel, Inc. | Rapid Acting Injectable Insulin Compositions |
US7713929B2 (en) * | 2006-04-12 | 2010-05-11 | Biodel Inc. | Rapid acting and long acting insulin combination formulations |
US8084420B2 (en) | 2005-09-29 | 2011-12-27 | Biodel Inc. | Rapid acting and long acting insulin combination formulations |
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US9060927B2 (en) | 2009-03-03 | 2015-06-23 | Biodel Inc. | Insulin formulations for rapid uptake |
CA2766571A1 (en) * | 2009-07-09 | 2011-02-24 | Biocon Limited | A preparative non-linear gradient based chromatographic method and purified products thereof |
EP2525808A2 (de) | 2010-01-19 | 2012-11-28 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Osteocalcin als behandlungsmittel für männliche fortpflanzungsstörungen |
US10052364B2 (en) | 2013-03-15 | 2018-08-21 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Osteocalcin as a treatment for cognitive disorders |
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Family Cites Families (9)
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US3276961A (en) * | 1963-04-08 | 1966-10-04 | Squibb & Sons Inc | Process for preparing human insulin |
US3903068A (en) * | 1972-12-26 | 1975-09-02 | Us Health Education & Welfare | Facile synthesis of human insulin by modification of porcine insulin |
JPS55138392A (en) * | 1979-04-13 | 1980-10-29 | Shionogi & Co Ltd | Semisynthesis of insulin |
JPS55138393A (en) * | 1979-04-13 | 1980-10-29 | Shionogi & Co Ltd | Semisynthesis of insulin |
EP0017938B1 (de) * | 1979-04-13 | 1983-08-03 | Shionogi & Co., Ltd. | Verfahren zur Herstellung von B30-Threonin-Insulin |
JPS55138391A (en) * | 1979-04-13 | 1980-10-29 | Shionogi & Co Ltd | New synthetic method of peptide derivative |
US4343898A (en) * | 1980-02-11 | 1982-08-10 | Novo Industri A/S | Process for preparing esters of human insulin |
DK319780A (da) * | 1980-07-24 | 1982-01-25 | Forenede Bryggerier As | Fremgangsmaade til enzymatisk udskiftning af b-30 aminosyren i insuliner |
WO1983002772A1 (en) * | 1982-02-08 | 1983-08-18 | Robin Ewart Offord | An improved method for preparing human insulin from non-human insulin |
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