NO157506B - Fremgangsmaate for fremstilling av human-insulin eller treoninb30-derivater av human-insulin eller et salt eller kompleks derav. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for frem-

B3 0

stilling av humaninsulin eller treonin -derivater av human-insulin eller et salt eller kompleks derav.

Man kjenner allerede forskjellige prosesser for fremstilling

av humaninsulin. Eksempler på slike prosesser er bl.a. ekstraksjon fra human-pankreaskjertler, syntese fra de til grunn liggende amino-syrer, gen-spleising og omdannelse av svineinsulin til humaninsulin. Noen av prosessene for omdannelse av svineinsulin til humaninsulin foregår via svine-des-oktapeptid-(B23-B-30)-insulin, og noen foregår via des (AlaB^)-insulin.

Mer konkret angår foreliggende oppfinnelse omdannelsen av

B3 0 B3 0 svine-des(Ala )-insulin til humaninsulin via et treonin derivat av humaninsulin.

Til behandling av diabetes mellitus har det vanligvis vært anvendt insulinpreparater inneholdende svine- eller okseinsulin. Okse-, svine- og humaninsulin oppviser mindre forskjeller med

hensyn til aminosyresammensetning, idet forskjellen mellom human- og svineinsulin er begrenset til en enkelt aminosyre, dvs. at B30-amino-syren i humaninsulin er treonin, mens den i svineinsulin er alanin.

En fremgangsmåte for fremstilling av humaninsulin fra

B3 0

des(AlaOJU)- insulin er beskrevet i europeisk patentsøknad 80.101.966, se også Nature 280 (1979), 412. Ifølge denne patentsøknad utføres amideringen fortrinnsvis i et medium som inneholder 0 til 65%, fortrinnsvis 40 til 60%, av et organisk oppløsningsmiddel. Dessuten er den foretrukne reaksjonstemperatur mellom 20 og 40°C, idet temperaturen 37°C blir brukt i alle eksemplene. Utbyttet av koblingen var ifølge de tre eksempler ved HPLC (high pressure liquid chromatography) bestemt til 75, 80 og ca. 50%. Ifølge Nature-tidsskriftet var utbyttet omkring 73%.

En ytterligere fremgangsmåte for fremstilling av human-

insulin fra des(Ala B3 0)-insulin er beskrevet i Proceedings of the 2nd International Insulin Symposium, Aachen, Federal Republic of Germany, 1979. Ifølge det omtalte tidsskrift ble amideringen

utført i en blanding som inneholdt ca. 60% organisk oppløsnings-middel, og omsetningen ble foretatt ved 38°C. Utbyttet av kobling ble ved HPLC fastlagt til 67%.

Ytterligere en fremgangsmåte for fremstilling av humaninsulin 330

fra des(Ala )-insulin er beskrevet i Proceedings of the 16th European Peptide Symposium, Helsingør, Denmark, 1980. Ifølge denne

publikasjon ble prosessen utført i en blanding som inneholdt omkring 60% organisk oppløsningsmiddel. Reaksjonstemperaturen var efter all sannsynlighet 37°C. Efter en reaksjonstid på 30 minutter var utbyttet 85%; imidlertid var utbyttet redusert til 70% efter 22 timer.

En av grunnene til det lavere utbytte ved de kjente fremgangsmåter er tapet av insulin som følge av uønskede bireaksjoner, f.eks. dannelsen av DOI-Thr(R 2 )-OR 1, hvor DOI betyr svine-des-oktapeptid-(B23-B30)-insulin, og R 1 og R 2 er som angitt nedenfor.

Formålet med foreliggende oppfinnelse var å finne en fremgangsmåte ved hvilken utbyttet av reaksjonsproduktet var meget høyt, fortrinnsvis over 90%.

Det har overraskende vist seg at et slikt utbytte kan oppnås ved bruk av en meget lavere konsentrasjon av vann i reaksjonsblandingen enn ved de tidligere kjente fremgangsmåter, og dessuten at det foretrekkes å utføre prosessen ved en betydelig lavere reaksjonstemperatur enn ved de tidligere kjente fremgangsmåter .

Ifølge oppfinnelsen tilveiebringes en fremgangsmåte for

B3 0

fremstilling av humaninsulin eller treonin -derivater av human-insulin eller et salt eller kompleks derav, ved reaksjon mellom

B3 0

svine-des(Ala )-insulin eller et salt eller kompleks derav, og et L-treonin-derivat med den generelle formel I

hvor R <1> betyr en karboksylbeskyttelsesgruppe og R <2>betyr hydrogen eller en hydroksylbeskyttelsesgruppe, eller et salt derav, i en blanding av vann, et vannblandbart, organisk oppløsningsmiddel og trypsin. Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen karakteriseres ved at det anvendes en reaksjonsblanding med et vanninnhold mellom 30 og 10% (volum/volum), at det anvendes en reaksjonstemperatur lavere enn 37°C og over reaksjonsblandingens frysepunkt, og at reaksjonen eventuelt finner sted i nærvær av en syre, hvorefter det resulterende derivat om ønsket avblokkeres for å danne humaninsulin. Den foretrukne reaksjonstemperatur er mellom ca. 0°C og romtemperatur, dvs. ca. 25-20°C.

Fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse kan utføres ved å oppløse svine-des(Ala B3 0)-insulin, et L-treonin-derivat med formel I og trypsin i en blanding av vann og minst ett vannblandbart, organisk oppløsningsmiddel, eventuelt i nærvær av en syre.

De organiske oppløsningsmidler som er egnet til bruk

ved denne oppfinnelse, er polare oppløsningsmidler som er blandbare med vann, og fortrinnsvis slike som kan inneholde høye konsentrasjoner av insulin-forbindelser og treoninestere. Eksempler på slike egnede organiske oppløsningsmidler er aprotiske oppløsningsmidler som f.eks. N,N-dimetylformamid, N,N-dimetylacetamid, N-metylpyrrolidon, heksametylfosfortriamid, dimetylsulfoksyd, dioksan, aceton, tetrahydrofuran, formamid og acetonitril, og protiske oppløsningsmidler som f.eks. etanol, metanol, 2-propanol og 1,2-etandiol. Oppløsningsmidlet på-virker hele systemet som sådant, og de betingelser som passer til ett oppløsningsmiddelsystem med høyt amideringsutbytte, passer ikke nødvendigvis for et annet oppløsningsmiddel.

De beste resultater med hensyn til utbytte er oppnådd med aprotiske oppløsningsmidler, og aprotiske oppløsningsmidler er de mest foretrukne ved utførelsen av denne oppfinnelse.

Avhengig av hvilket vannblandbart, organisk oppløsnings-middel som anvendes, av den valgte reaksjonstemperatur og av tilstedeværelsen av en syre i reaksjonsblandingen, er inn-holdet av vann i reaksjonsblandingen fortrinnsvis mindre enn ca. 25% (volum/volum), og fortrinnsvis over ca. 15%

(volum/volum).

En fordel ved å redusere mengden av vann i reaksjonsblandingen er at dannelsen av biprodukter derved reduseres.

I likhet med dette er det ved å øke mengden av syre i reaksjonsblandingen mulig å redusere dannelsen av biprodukter. Økning i utbytte er positivt korrelert med et lavt vanninnhold i reaksjonsblandingen. For å hindre denaturering av enzymet i reaksjonsblandinger med lavt vanninnhold bør reaksjonstemperaturen fortrinnsvis være vesentlig lavere enn de reaksjonstemperaturer som tradisjonelt benyttes i peptid-synteser med trypsin, nemlig lavere enn ca. 37°C.

For utførelsen av oppfinnelsen er det ikke vesentlig hvilken type trypsin som anvendes. Trypsin er et godt karakterisert enzym som er kommersielt tilgjengelig i høy renhet, særlig fra okse- og svinekilder. Det kan videre anvendes trypsin av mikrobiell opprinnelse. Videre er trypsinformen, f.eks. krystallinsk trypsin (oppløselig form), immobilisert trypsin eller til og med trypsinderivater (så lenge trypsinaktiviteten bibeholdes), ikke vesentlig for ut-

førelsen av oppfinnelsen. Den her anvendte betegnelse trypsin skal omfatte trypsiner av enhver opprinnelse og alle trypsinformer som har bibeholdt amiderende aktivitet,

herunder proteaser med trypsinlignende spesifisitet, f.eks. Achromobacter lyticus-protease, jfr. Agric. Biol. Chem. 42,

1443.

Som eksempler på aktive trypsinderivater kan angis

acetylert trypsin, succinylert trypsin, glutaraldehydbehandlet trypsin og immobiliserte trypsinderivater.

Hvis det anvendes et immobilisert trypsin, suspenderes

dette i mediet.

For å oppnå et egnet buffersystem kan det tilsettes

organiske eller uorganiske syrer så som saltsyre, maursyre, eddiksyre, propionsyre og smørsyre og/eller baser så som pyridin, TRIS, N-metylmorfolin og N-etylmorfolin. Organiske syrer foretrekkes. Omsetningen, kan imidlertid utføres uten slike tilsetninger. Den tilsatte mengde syre er normalt mindre enn ca. 10 ekvivalenter pr. ekvivalent L-treonin-

derivat med formel I. Mengden av syre er fortrinnsvis mellom 0,5 og 5 ekvivalenter pr. ekvivalent L-treonin-derivat med formel I. Det kan tilsettes ioner som stabiliserer trypsin,

så som kalsiumioner.

Fremgangsmåten kan utføres ved en temperatur på mellom

37°C og reaksjonsblandingens frysepunkt. For å oppnå til-

strekkelig reaksjonshastighet utføres enzymatiske reaksjoner med trypsin vanligvis ved 37°C. For å unngå inaktivering av trypsin er det imidlertid fordelaktig å utføre fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse ved en temperatur under romtemperatur. I praksis foretrekkes reaksjonstemperaturer på

„o„

over ca. 0 C.

Avhengig av reaksjonstemperaturen, den tilsatte mengde

trypsin og andre reaksjonsbetingelser er reaksjonstiden vanligvis mellom noen få timer og noen få dager.

Trypsinets virkning reguleres i høy grad av forholdet mellom vann og oppløsningsmiddel, av forholdet mellom syre og base og av.reaksjonstemperaturen for å fremme dets amiderings-virkning og for å hindre uønskede trypsinkatalyserte bireaksjoner. Ved å redusere konsentrasjonen av vann i reaksjonsblandingen oppnår man begge deler, men man øker derved også

den hastighet med hvilken irreversibel trypsin-denaturering finner sted. Trypsindenatureringen kan - i hvert fall delvis - motvirkes ved å senke reaksjonstemperaturen. En senkning av reaksjonstemperaturen nedsetter også amideringshastigheten,

men det kan kompenseres for en slik nedsettelse ved å øke reaksjonstiden.

B 30

Vektforholdet mellom trypsin og des(Ala )-insulin i reaksjonsblandingen er normalt over ca. 1:200, fortrinnsvis over ca. 1:50 og under ca. 1:1.

B30

De treonin -derivater av humaninsulin som er et resultat av amideringen, kan angis ved den generelle formel II

hvor h-In betyr human-des (ThrB^°) -insulindelen, og R^" og

2

R er som angitt ovenfor.

Anvendelige L-treoninderivater med formel I er slike hvor R^" er en karboksylbeskyttelsesgruppe som kan fjernes \

' B30 ' fra treonin -esteren av humaninsulin (formel II) under j betingelser som ikke forårsaker vesentlig, irreversibel endring i insulinmolekylet. Som eksempler på slike karboksyl-beskyttelsesgrupper kan nevnes lavere alkyl, f.eks. metyl, etyl og tert.butyl, substituert benzyl så som p-metoksybenzyl og 2,4,6-trimetylbenzyl og di fénylmetyl, og grupper med den generelle formel -CH2CH2S02R 3 , hvor R 3 betyr lavere alkyl så som metyl, etyl, propyl og n-butyl. Egnede hydroksyl-beskyttelsesgrupper R^ er slike som kan fjernes fra treoninB^-derivater av humaninsulin (formel II) under omstendigheter som ikke forårsaker vesentlig, irreversibel■endring i insulinmolekylet. Som eksempel på en slik gruppe (R 2) kan angis tert.butyl.

Lavere alkylgrupper inneholder mindre enn 7 karbonatomer, fortrinnsvis mindre enn 5 karbonatomer.

Ytterligere vanlig anvendte beskyttelsesgrupper er beskrevet av Wunsch: Methoden der Organischen Chemie (Houben-Weyl), vol. XV/l, utg. Eugen Muller, Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1974.

En fremgangsmåte for fremstilling av des(Ala B30)-insulin

er beskrevet i. Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 359 (1978),

799 ff.

Noen L-treoninderivater med formel I er kjente forbindelser, og de resterende L-treoninderivater kan fremstilles analogt med fremstillingen av kjente forbindelser.

L-treonin-derivatene med formel I kan være frie baser

eller egnede organiske eller uorganiske salter derav, fortrinnsvis acetater, propionater, butyrater og hydrogen-halogenider så som hydrogenklorider.

Det er ønskelig å anvende reaktantene> dvs. des(Ala B30)-insulin og L-treoninderivater med formel I i høye konsentrasjoner. Det molare forhold mellom L-treoninderivater med

B30

formel I og des(Ala )-insulin er fortrinnsvis over ca. 5:1.

Det er ønskelig at konsentrasjonen av L-treonin-

derivater med formel I i reaksjonsblandingen overstiger 0,1 molar.

B 30

Humaninsulin kan fås fra treonin -derivater av human-insulin (formel II) ved å fjerne beskyttelsesgruppen R"<*>" og en eventuell beskyttelsesgruppe R <2> ved allerede kjente metoder eller analogt med allerede kjente metoder. I de tilfeller R1 er metyl, etyl eller en gruppe -CH2CH2S02R<3>, hvor R3 er som angitt ovenfor, kan nevnte beskyttelsesgruppe fjernes under milde, basiske betingelser i et vandig medium, fortrinnsvis ved en pH-verdi på mellom ca. 8 og ca. 12, f.eks. ca. 9,5,

Som base kan anvendes ammoniakk, trietylamin, bikarbonat/ karbonat-buffere eller hydroksyder av alkalimetaller så som natriumhydroksyd. I de tilfeller R^" er tert.butyl, substituert, benzyl så som p-metoksybenzyl eller 2,4,6-trimetylbenzyl,

eller difenylmetyl, kan omtalte gruppe fjernes ved acidolyse, fortrinnsvis med trifluoreddiksyre. Trifluoreddiksyren kan være ikke-vandig eller kan inneholde noe vann, eller den kan være fortynnet med et organisk oppløsningsmiddel så som diklor-metan. Når R 2 er tert.butyl kan nevnte gruppe fjernes ved acidolyse, kfr. ovenfor.

B30

Foretrukne treonin -derivater av human-insulin med formel II er forbindelser hvor R 2 er hydrogen, og disse kan fremstilles fra L-treoninderivater med formel I hvor R 2 er hydrogen.

Som eksempler på et kompleks eller et salt av

B30

des(Ala )-insulin kan nevnes et sinkkompleks eller sinksalt.

Hvis man velger reaksjonsbetingelsene i henhold til ovennevnte forklaring og tar reaksjonsbetingelsene i de følgende eksempler i betraktning, er det mulig å oppnå et utbytte av

B30 treonin -derivater av humaninsulin (formel II) som er høyere enn 90% eller til og med høyere enn 95%.

En foretrukket fremgangsmåte for fremstilling av human-B30

insulin fra treonin -derivater av humaninsulin er som følger:

1) Hvis det er noe trypsinaktivitet igjen efter amideringen, foretrekkes det å fjerne denne, f.eks. under betingelser hvor trypsinet er inaktivt, f.eks. i surt medium ved en pH-verdi på under 3. Trypsin kan fjernes ved adskillelse i henhold til molekylvekt, f.eks. ved gelfiltrering på en "Sephadex G-50"-gel eller på en "Bio-gel P-30"-gel i eddiksyre, kfr. Nature 2 80 nevnt ovenfor. 2) Urenheter så som uomsatt des (Ala B 30)-insulin- kan fjernes ved anvendelse av anion- og/eller kationbytter-kromatografi. 3) Treonin B30-derivatet av humaninsulin (formel II) spaltes derefter, og humaninsulin isoleres, f.eks. krystalliseres, på

i og for seg kjent måte.

På denne måte kan man få humaninsulin med en akseptabel farmasøytisk renhet, og humaninsulinet kan om ønsket renses ytterligere.

Anvendte forkortelser er i overensstemmelse med de regler som ble godkjent (197 4) av IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature, kfr. Collected Tentative Rules & Recommendations of the Commission on Biochemical Nomenclature IUPAC-IUB, 2nd ed., Maryland 1975.

Fremgangsmåten for fremstilling av humaninsulin-derivater og humaninsulin illustreres ved de følgende eksempler,

som imidlertid ikke skal betraktes som begrensende. Eksemplene illustrerer noen foretrukne utføreIses former for fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen.

Eksempel 1

10 mg svine-des(Ala <B30>)-insulin ble oppløst i 100 pl 10M eddiksyre. Til 50 ul av denne oppløsning ble tilsatt: 100 pl 2M Thr-OMe (Me betyr metyl) i N,N-dimetylacetamid, 60 m1 N,N-dimetylacetamid, 15 pl vann og 10 \ il av en oppløsnii av trypsin '8% vekt/volum) i 0,05M kalsiumklorid. Efter inkubering ved 4°C i 2 4 timer ble produktet utfelt med 8 ml aceton, isolert ved sentrifugering, vasket med 8 ml aceton, isolert ved sentrifugering og tørret i vakuum. Utbyttet av (Thr-OMe)<B30->h-In ble bestemt ved HPLC.

Produktet ble oppløst i 2 ml IM eddiksyre, og 100 pl av oppløsningen ble satt på en 4 x 200 mm "Nucleosil 5 C^g koloni for motstrøms-HPLC, idet man benyttet en 0,2M ammoniumsulfat-buffer innstilt på en pH-verdi på 3,5 og inneholdende 26,8%

(volum/volum) acetonitril.som elueringsmiddel. Ved en strømningshastighet på 1 ml/min ble des-(Ala<B30>^-insulin eluei efter 18 minutter og (Thr-OMe) Bi30-h-In efter 24 minutter.

B2 3

Biproduktet fra reaksjonen, nemlig (Thr-OMe) -des-heptapepti (B24-B30)-insulin, eluerte efter 7 minutter. Påvisning og mengdebestemmelse av proteinene var basert på ekstinksjon ved 280 nm. Analysen ga følgende fordeling av forbindelser:

Eksempler 2 til 16

De følgende eksempler 2 til 16 i tabell 1 ble utført analogt med eksempel 1, idet man endret reaksjonsparametrene som angitt i tabellen. Det ble imidlertid i alle eksempler tilført IQ m1 8% trypsin i en vannholdig oppløsning, 100 ul organisk oppløsningsmiddel inneholdende et treoninderivat med

B 30 formel I samt 50 pl eddiksyre inneholdende 20% des(Ala )-insulin. Molariteten av treoninderivatet med formel I i det organiske oppløsningsmidlet og av den omtalte eddiksyren fremgår av tabell 1. Reaksjonstiden var 24 timer. I tabell 1

er det benyttet følgende forkortelser:

HOAc er eddiksyre, DMAA er N,N-dimetylacetamid,

DMF er N,N-dimetylformamid, DMSO er dimetylsulfoksyd, NMP er N-metylpyrrolidon og THF er tetr.ahydrof uran.

Ved syntetiseringen av (Thr-OBu<t>)<B30->h-In, kfr. eksempel 15, ble elueringen utført under anvendelse av en gradient i acetonitril fra 26,8% til 40% (volum/volum).

Eksempler 17 til 34

pisse eksempler ble utført analogt med eksemplene 1 til 16, med det forbehold at reaksjonstiden var 4 timer. I hvert av eksemplene var utbyttet det samme som det som ble oppnådd i eksemplene 1 til 16.

Det fremgår av en sammenligning av eksemplene 1 til 16 med eksemplene 17 til 34, at det samme utbytte ble oppnådd,,

og det er bl.a. dette som adskiller den nye fremgangsmåte fra den allerede kjente fremgangsmåte som er beskrevet i Proceedings of the 16th European Peptide Symposium, kfr. ovenfor.

Således er tidsavhengigheten blitt eliminert.

Eksempel 35

B 30

250 mg krystallinsk (Thr-OMe) -h-In ble suspendert i

25 ral vann og oppløst ved tilsetning av IN natriumhydroksyd-oppløsning til en pH-verdi på 10,0. pH-verdien ble holdt konstant ved 10,0 i 24 timer ved 25°C. Det humaninsulin som ble dannet, ble krystallisert ved tilsetning av 2 g natrium-klorid, 350 mg natriumacetattrihydrat og 2,5 mg sinkacetat-dihydrat, efterfulgt av tilsetning av IN saltsyre for å

oppnå en pH-verdi på 5,52. Efter henstand i 24 timer ved 4°C ble de romboedriske krystaller isolert ved sentrifugering, vasket med 3 ml vann, isolert ved sentrifugering og tørret i vakuum. Utbytte: 220 mg humaninsulin.

Claims (9)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av humaninsulin eller treonin<830->derivater av humaninsulin eller et salt eller kompleks derav, ved reaksjon mellom svine-des(Ala<B30>)-insulin eller et salt eller kompleks derav, og et L-treoninderivat med den generelle formel I hvor R<1> betyr en karboksylbeskyttelsesgruppe og R<2> betyr hydrogen eller en hydroksylbeskyttelsesgruppe, eller et salt derav, i en blanding av vann, et vannblandbart, organisk oppløsningsmiddel og trypsin, karakterisert ved at det anvendes en reaksjonsblanding med et vanninnhold mellom 30 og 10% (volum/volum), at det anvendes en reaksjonstemperatur lavere enn 37°C og over reaksjonsblandingens frysepunkt, og at reaksjonen eventuelt finner sted i nærvær av en syre, hvorefter det resulterende derivat om ønsket avblokkeres for å danne humaninsulin.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at L-treoninderivatene med formel I anvendes i en konsentrasjon som overstiger 0,1 molar i reaksjonsblandingen, og at det anvendes en reaksjonsblanding som ikke inneholder mer enn 10 ekvivalenter av en syre pr. ekvivalent L-treoninderivat med formel I.

3. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av de foreågende krav, karakterisert ved at det anvendes en reaksjonstemperatur under ca. 25°C og over ca. 0°C.

4. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at det anvendes en reaksjonsblanding med et vanninnhold under 25 % og over 15 % (volum/volum).

5. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at det som vannblandbart, organisk oppløsningsmiddel anvendes N,N-dimetylformamid, N,N-dimetylacetamid, N-metylpyrrolidon eller DMSO.

6. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst åv de foregående krav, karakterisert ved at det som syre anvendes en organisk syre, fortrinnsvis maursyre, eddiksyre, propionsyre eller smørsyre.

7. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at syren i reaksjonsblandingen anvendes i en mengde mellom 0,5 og 5 ekvivalenter pr. ekvivalent L-treoninderivat med formel I.

8. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at det anvendes et vektforhold mellom trypsin og des(Ala<B30>)-insulin i reaksjonsblandingen over 1:200, fortrinnsvis over 1:50, og under 1:1.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at avblokkeringen utføres i et vannholdig medium i nærvær av en base, fortrinnsvis ved en pH-verdi på mellom 8 og 12, eller ved acidolyse, fortrinnsvis med trifluoreddiksyre.