NO830178L - Fremgangsmaate ved fremstilling av insulinderivater - Google Patents

Description

Fareliggeride oppfinnelse vedrører en ny fremgangsmåte ved fremstilling av insulinderivater. ~~~~

I mange år er sukkersyke behandlet med insulin. Det vill 2 være naturlig å behandle mennesker med menneskeinsulin, men det er imidlertid umulig på grunn av det foreliggende store<1>behov. Derfor brukes av praktiske grunner insulin fra storfe og svin. Imidlertid gir disse insuliner i større eller mindre, grad dannelse av antistoffer i det menneskelige legeme som bl.a. medfører en redusert virkning av den videre insuliibe-handling.

Denne ulempe antas delvis å skyldes såkalte "urenheter" i storfe/svininsulin, delvis av fremmed natur. Det siste mani-festerer seg ved at i menneskeinsulinmolekylet som adskillex -seg fira andre animalske insulinmolekylex i visse mindre ulik-heter i aminosyresekvensen. -Store forbedringer er oppnådimed hensyn til insulinpreparat-eae etter innføring av de siste rensemetoder, men.dannelse av antistoffer i det menneskelige legeme kan ennu f orekonime. Det antas at dette kan avhjelpes ved å bruke menneskeinsulin istedet for annet animalsk insulin.

US patent nr. 3.276.961, Bodanszky et al, 1963, beskriver er fremgangsmåte ved fremstilling av menneskeinsulin fra andre dyreinsuliner ved innvirkning av et enzym, dvs. karboksypeptidase A eller trypsin i nærvær av et overskudd treonin.

"Ved å bruke denne tidligere kjente prosess kan imidlertid

ikke menneskeinsulin fremstilles i noen nevneverdig mengde. Det'skyldes trolig at trypsin og karboksypeptidase A ikke

bare hydrolyserer lysyl-alanin peptidbindingen (B29-B30), men også de andre stillinger i insulin under arbeidsbetingelsene.

Trypsin hydrolyserer f ortrinnsvis . arginyl-^glycinpeptid-blndingen (B-2 2-B2 3) fremfor lysyl-alaninbindingen (B29-B|30) , _m|en s karboks ypeptidase A ikke Jean spalte av alaninet vedj C-enden av B-kjeden alene uten å spalte av aspargin ved C-enden av A-kjeden. Det siste har vist seg a være én" spesifikk tilstand, dvs. reaksjon i en ammonium bikarbonat-p jf f erløsning er nødvendig for å hindre asparginf rig jøri:ig , jfr, Hoppe-Seyler<1>s Z. Physiol.Chem., 359, 799-802 (1978). Videre forekommer knapt noen betydelig peptiddannelse, da hydrolysereaksjonens hastighet er høyere enn peptidsyntesen under arbeidsbetingelsene. Det. er trolig grunnen til at ... ~ Bpdanszky i eksemplene i US. patent nr. 3.276.961 beskriver

det resulterende produkt som omdannet sink insulin og ikxe menneskeinsulin.

Hittil er ingen fremgangsmåte kjent hvori den uønskede aminosyre (B-30 Ala) utbyttes med B-30 Thr i ett pg samme trinn. -Inidlertid er fremgangsmåter for fremstilling av menneskeinsulin som omfatter flere adskilte trinn kjent, sammenljign US patent nr. 3.903.068, Ruttenberg 1975, og Hoppe-Seyler's -Z. Physiol.Chem., 357, 759-767 (1967), Obermeier et al.

Med hensyn til det ovenstående foretrekker disse metoder å vjirke på arginyl-glycin peptidbindingen og omfatter derfpr kondensasjon av et desoctapeptid-(B23-30) svineinsulin med et syntetisk oktapeptid tilsvarende stillingene B-23-30 i menneskeinsulin. I den første fremgangsmåten utføres imidler-tjid en alkalisk hydrolyse som følges av ugunstige bireaks joner. Djen andre fremgangsmåten omfatter en ikke-spesifikk reaksjon sbm gir opphav til mange bireaksjoner og krever kompliserte J "fjensemetoder. Følgelig er ingen av disse fremgangsmåter egnet fjor bruk i industriell skala.

Tjil slutt beskriver Nature, Vol. 280, 2. august 1979, 412-413 o'g Biochem. & Biophys. Res. Commun. , 29. januar 1980 92(2), 3,96-402 (begge Morihara et al.) en fremgangsmåte for utskif-ting av B-30 aminosyren hvori behandling av svineinsulin med karboksypeptidase A ved 25°C i 8 timer i nærvær av ammonjium-j-bikarbonat buffer fører til et desalanininsulin (DAL) som ijsoleres. Deretter utføres koplingen ved tilsetning av j trypsin til en løsning av DÅI og treoninbutylester (ThIr. 01i<ut>) i et organisk løsningsmiddel omfattende det ofganisTe løsningsmiddel i en mengde på ca. 60%, hvoretter reaksjonen forløper ved 37°C i 20 timer under dannelse av (B30-Thr-OBut) svineinsulin som så isoleres. Tilslutt avspaltes beskyttllses-g::uppen (butylester) med trifluoreddikksyre i nærvær av anisol.

Det er nå funnet at det er mulig i en industriell skala o.g vid bruk av kort reaksjonstid å utskifte B-30 aminosyren med en annen aminosyre i et trinn uten forutgående isolering av e-; des-B30 insulin ved å behandle et insulin med et proteolytisk enzym i nærvær av et overskudd av en aminosyre med be-ski yttet karboksylgruppe • o■g i nærvær av et organisk løsnings-middel, og deretter om ønsket avspalte den karboks.ylbesky;-tende gruppe.

Følgelig er fremgangsmåten ifølge oppfinnelsenkarakterisertvid behandling av et insulin med et proteolytisk enzym i nær--vær av et overskudd av en aminosyre med beskyttet karboksyl-gr! uppe og i nærvær av et organisk løsningsmiddel under daIn-neise av et B-30-Thr-insulin derivat i et akseptabelt utbytte og med høy renhet. Reaksjonen kan fullføres i løpet av ca.

1 time, selv.om lengre reaksjonstider kan anvendes.

Som proteolytisk enzym ifølge fremgangsmåten ved oppfinnelsen kan trypsin eller et dertil beslektet enzym anvendes.

Det er overraskende at fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen 'kan utføres direkte i et trinn, at det resulterende insuLin-derivat lett kan skilles fra ikke omsatt utgangsinsulin, samt ai ingen nevneverdig spaltning av insulinet forekommer ved b\- 22 arginin når man bruker trypsin som proteolytisk enzym, sammenlign Hoppe-Seyler's Z. Fhysiol. Cehm., 357, 759-767 (1-976).

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er egnet for fremstilling^av menneskeinsulin fra svineinsulin. Som utgangsmateriale i] fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan selv et urent insu^- _ • i ; linprodukt anvendes. Videre erholdes det ikke omtalte injsulin-utgangsprodukt i en ren form som kan brukes i in sul iTipr ©pi-rater for terapeutisk bruk. Selvfølgelig kan ikke omsatt insulin utgangsprodukt også brukes på nytt som utgangsmateriale. Videre oppnås det. fremstilte menneskeinsulin med høy renhet og i et tilfredsstillende utbytte i et trinn fra et ikke renset svineinsulinprodukt. Følgelig er fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen egnet for fremstilling av insulin i<*>"'industriell skala.

I fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen dannes omdannet insuliiji ired beskyttet karbpksylgruppe og dette omdannede insulin kan isoleres fra reaksjonsblandingen og adskilles fra ikke omsatt insulin ved kjente kromatografiske metoder. Ved ettler-I følgende avspalting av karboksylbéskyttende grupper oppnås -det omdannede insulin i.ren form. -knKaåan r rbmbokean sskyvylegttrlguepes pr ei n difosi rsm e ambaiv ønr osfmyorarn eskn tjea solm hleignie nsynn eføsrtteeirl s e i iong Bsu-al3mi0n-idesettrs il, slmtinaebngeinli-

tet ved betingelsene som skal brukes, for fjerning av beskyt--telsesgruppen. T-butylesteren er spesielt egnet, ettersom avspaltning kan utføres ved hjelp av trifluoreddiksyre, men

andre estere eller amidgrupper kan også fjernes ved for-siktig, e• v■entuelt enzymatisk katalysert hydrolyse,

Enzymet som brukes ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen

må kunne spalte lysinkarbonyl peptidbindinger og derfor kan '""det anvendes trypsin eller dermed beslektede enzymer, f. eks. akromobakterprotease I, hvis fremstilling og egenskaper er beskrevet ved Masaki et al., Agric. Biol.Chem. £2 (1978),,

i ' sidene 1443-1445. Eventuelt er enzymet blitt behandlet med

■tiosyl-L-fenyl alanin klormetylketon (TPCK) for å fjerne en mulig forurensning av kymotrypsinlignende enzymer. Enzymet kan brukes i oppløst form, men kan også være bundet til en uløselig matrise, f.eks.'agarose eller polyacrylamid.eller lI ignende polymere substanser. . I -_l I Reaksjonen utføres under betingelser hvor den enzymmatiske I katalyserte hydrolyse dempes tilstrekkelig til at den- pep=-- . t:.ddannede reaksjon kan forløpe. pH må ligge mellom 5 og 10, fortrinnsvis mellom 6 og 9. Temperaturen bør ligge i omradet fra 4-50°C, fortrinnsvis 20-40°C.

Réaktantenes konsentrasjon, dvs. utgangsinsulin og aminosyre-esteren bør være høy, og videre bør den anvendte aminosyre- - eiter brukes i stort overskudd, opp til et molært f*orholdpå 200:1, fortrinnsvis i området fra 50:1 - 150:1.

Reaksjonen utføres i nærvær av et vannblandbart organisk løsningsmiddel, hvorved hydrolysereaksjonen hindres og réaktantenes oppløslighet forbedres. Organiske løsningsmidler kan

være dimetylformamid, acetamid, dimetylsulfoksyd, etanol, _g.Iycerin og lignende løsningsmidler, eventuelt i form av deres blandinger. Konsentrasjonen av organisk løsningsmiddel b^r velges i området fra 10-80%, fortrinnsvis 30-70%, beregnet .i. forhold til reaks jmsblandingens totale volum.

Reaksjonstiden velges avhengig av de foreliggende reaksjons-betingelser, men overskrider normalt ikke 24 timer, og er normalt ca. 1-4 timer.

U;førelsesf ormene for oppfinnelsen illustreres videre ved de følgende eksempler.

i—

EKSEMPLER

Eksempel 1

i (20! 0 g svineinsulin og 400 mg ' L-treonin t-butylesteracetat i ble oppløst i en blanding på 2,2 ml etanol og 1,4 ml 0,4 M i Itr' is-acetatpuffer (pH = 7,5). Til denne løsning ble tilsatt

■20 mg TPCK-behandlet trypsin, og blandingen ble holdt ved i37°C i 2 timer. Så ble reaksjonen avbrutt ved justering åv pH i t! il ca. 3 ved tilsetning av 10 N eddikksvre. ii !

I Høytrykksvæske kromagografianalyse av reaksjonsblandingen I viste en omsetning på 18%.

: IR: eaksjonsblandingen ble qelfiltrert Då en kolonne av Seph<i>a-

I ' fp\ ' I rdex^G-50 Superfine (2,6 x 90 cm) i 1 M eddikksyre. Reak-isjonen som inneholdt menneskeinsulinester og ikke omsatt' !svineinsulin ble lyofilisert. Ubytte: 180 mg produktblanding.

. ! ii n o'<!>1 Deretter ble produktblandingen ionekromatografert ved 4 C J

' 'p1 å en kolonne av DEAE cellulose (Whatmann DE-52) (5 x 2)I 1 I1i •ek; vilibrert med 75 ml pr. time av en p*" uffer bestående av; i 0,0!2 iM tris og 7 M urea, justert til en pH på 8,1 med saltsyre, j j Da påfylling av produktet var ferdig, ble kolonnen eluert i 'i! 2,5 timer ved bruk av ovennevnte pufferløsning, deretter

:L 2 timer ved bruk av ovennevnte buffer i blanding med 0,0045 ;mol natriumklorid pr. liter og tilslutt i 12 timer ved bruk!

a<y>tidligere puffer i blanding med 0,011 mol natriumklorid ; p'r. liter.

: ! i i

■ E.luatet inneholdt to proteinaktige hovedf raks joner. Den i i : første eluerte fraksjon ble ved høytrykksvæske kromatogr,afi i<:>identifisert som menneskeinsulinester og fraksjonen som ble: ;eluert deretter som ikke omsatt svineinsulin. ,

! i

i Dé oppsamlede fraksjoner ble avsaltet på en kolonne av I

' : (r) 1 jSephadex^ G-25 i 0,1 M eddikksyre og lyofilisert, hvilkeT jga 28 mg menneskeinsulin t-butylester og 120 mg ikke omsatt I s i/ineinsulin. j

i Den resulterende insulin t-butylester (28 mg) ble oppløst i [ i 21 ml trifluoreddikksyre i blanding med 0,2 ml anisol, ogi

; ■ -1 ii i blandingen ble holdt ved romtemperatur i 25 min. Trifluor- ' _ i ejidikksyren ble fjernet i vakuum på en rotas jonsf ordamper, : og resten ble ekstrahert med 3 x 10 ml eter for å fjerne! ani1-;! so' let. Etter tørking i vakuum fikk man 25 mg rent mennesk'■ e- ;I!insulin identifisert ved aminosyre analyse og høytrykksvæské-i ■kr' omatografi. i i

i! i ! Eksempel 2 ;

200 mg svineinsulin og 400 mg L-treonin t-butyl esteracetat ble oppslemmet i 2,2 ml dimetylformamid og deretter tilsatt; il;, 4 ml 0,5 M tris-acetatpuf f er (pH 7,0) inneholdende 20 mg JTPCK-behandlet trypsin. Reaksjonsblandingen ble holdt ved j j 3;7°C i 3 timer, hvoretter reaksjonen ble avbrutt ved justering : ay pH til 3 ved tilsetning av 10 N eddikksyre. Høytrykksyæsk'e

.kromatografianalyse av reaksjonsblandingen viste en omset-j ning på 6%. Produktblandingen ble isolert og fraksjonert i111 I !v1 ed fremgangsmåten fra eksempel 1 og ga 10 mg menneskeih! su-I| i lin t-butylester og 140 mg ikke omsatt svineinsulin. !

Den isolerte menneskeinsulin t-butylester (10 mg) ble behand-I " let på samme måte som i eksempel 1 med trifluoreddikksyre og ; ia! nisol som ga 8,0 mg rent menneskeinsulin. j ! ;1

Eksempel 3 j

i 'Til 100 mg svineinsulin og 200 mg L-treonin metylester

[satte man 1,4 ml 96% etanol og 0,4 ml 0,25 M trisacetatbuf-• ' fer (pH = 6,5). Deretter ble 150 pliter 5N saltsyre og 5; mg j svineinsulin oppløst i 200 «liter 0,25 M tris-acetatpuffer (|pH = 6,5) tilsatt. |

BlI andingen ble holdt c* å 35°C i 1 time, hvoretter reaksjonIenble avbrutt ved tilsetning av 10 N saltsyre hvilket ga en """

pH på ca. 3.

HØytrykksvæske-kromatografi analyse av reaksjonsblandingen viste et utbytte av menneskeinsulin metylester på 45%. J

Reaksjonsblandingen ble renset på samme måte som beskrevet i" eksempel 1. Deretter ble eluatet fra ionebytteren som inneholdt en resulterende menneskeinsulin metylester identifiserjt vSeed phhadøyextr^ykGk-sv2 æ5s. kKeokrloomnnaten ogbrale fie, luavesrt alvteed t pbå ruk en akv ol0o.n0n5 e M av jj vandig ammoniumbikarbonatløsning, det resulterende eluat I ' 1

ble justert til en pH på 9,5 ved bruk av fortynnet ammoniakk-vai nn, hvoretter blandin' gen ble holdt ved 2 5■°C i 4 8 timer for

-f-ullstendig hydrolyse av esteren.

i Lyofilisering av hydrolyseblandingen førte til 37 mg rent menneskeinsulin, konstatert ved aminosyreanalyse og høytrykks-væskekromatograf i .

I Eksempel 4 j

ii lOOg mg svineinsulin og 200 mg L-tréonin metylester tilsettes l|ml dioksan og 0,5 ml 0,2M tris-acetat puffer (pH = 7,5).

I i Deretter tilsattes 50 uliter 5N saltsyre samt 10 mg storfe-! trypsin oppløst i 0,5 ml 0,2 M tris-acetatpuf f er (pH = 7-, 5) .

' iI Blandingen ble holdt p<å>'35°C i 45 min., hvorpå reaksjonen ble avbrutt ved tilsetning av 10 N saltsyre hvilket ga en | pH på ca. 3.

i . ■ ' ■! ■

■ Høytrvkksvæskekromatograf i-analyse av reaks jonsblandingen ■• I {viI ste et utbytte av menneskeinsulin metylester på 40%. ii.

II M ■ ! '

I Rensing .av reaksjonsblandingen og hydrolyse av insulin- i metylesteren ble utført på samme måte som beskrevet i eksem-; pfel 1. Lyof ilisering av. hydrolyseblandingen ga 30 mg renjt mfenneskeinsulin bestemt ved aminosyreanalyse og høytrykkis-væskekromatografi.

Eksempel 5

130 mg svineinsulin og 200 mg L-treoninamid ble oppløst i'1,5 ml 65% etanol, hvoretter 5N saltsyre ble tilsatt forjå justere pH til 7,5. Deretter ble en løsning av 10 mg trypsiri" 1 0,5 ml vann tilsatt og blandingen ble holdt på 35°C i 1 time. Deretter ble reaksjonen stoppet ved tilsetning av 5N saltsyre til en pH på 3. HØytrykksvæske-kromatografi-ahalyse of reaksjonsblandingen viste en omsetning på ca. 37%.

Produktblandingen ble Isolert og fraksjonert ved bruk.av den metode som er beskrevet i eksempel 1. Ubytte: .30 mg i

-menneskeinsulinamid.

Eksempel 6

2 50 mg L-treonin metylester og 100 uliter iseddikk ble. opp-løi st i en blanding på 500 pliter dimetylformamid og 400 Ji alitIer vann. 60 mg svineinsulin ble oppløst i denne blanding, hvorpå en løsning av 3 mg trypsin i 700 uliter vann ble tilsatt under røring. Den klare løsning hvis pH var 6,5 ble så holdt på ' 20 o C i 3 timer, hvorp- å reaksjonsblandingen ble stoppej1t ve! d justering av pH til ca.. 3 ved bruk av 10 N eddikksyrej.

I

Høytrykksvæskekromatografi-analyse av reaksjonsblandingen viste en omsetning på 23%. "

Claims (1)

1i . Fremgangsmåte ved fremstilling av insulinderiviater ved å bytte ut den C-terminale aminosyre i B-kjeden under enzymatisk innflytelse, karakterisert ved behandling av et insulin med et proteolytisk enzym i nærvær av et overskudd av en aminosyre med beskyttet karboksylgruppe og i nærvær av et organisk lø sningsmiddel, og dere,ttér_ o:n ønsket avspaltning av den karboksylbeskyttende gruppe.j.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at man anvender trypsin eller et dermed beslektet enzym som proteolytisk enzym.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakter i-

-s e r t ved at man anvender trypsin som det proteolytiske ■" enzym.

■i

-'4. Fremgangsmåte ifølge krav 2,-karakterj i-j sert ved. at man anvender akromobakterprotease som ] det proteolytiske enzym.

5i. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakter, i- \ sert ved at mari utfører.reaksjonen ved et temperatur

på ca. 20-40°C over et tidsrom på ca. 1-4 timer.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at man utfører reaksjonen ved en pH i. om-rI ådet fra ca. 5-10.

■ 7,. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakter, i-s i e r t v e d at man anvender lavere mono-.eller polyht yd-. i;

roksyalkoholer, amider eller lavere karboksylsyrer eller di-t metylsulfoksyd som organisk løsningsmiddel. [ | I

—8I. Fremgangsmåte ifølge krav 1-7, karakterisert ved at man anvender svineinsulin som insulineTfT

9. Fremgangsmåte ifølge kravene 1-8, k a r a k-t|erisert ved at man anvender L-treonin som aminosyre med beskyttet karboksylgruppe.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 1-9, k-a r ak te.r i-_ sert v e d at man anvender t-butyl estergruppen, andre

lavere alkylestergrupper eller amidgrupper som kårbbksyl-béI sk<y> ttel ses <g> rup <pe>.