JP2877253B2 - 融合タンパク質の選択的切断方法 - Google Patents

融合タンパク質の選択的切断方法

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、トリプシン様エンドペプチダーゼを用いて
融合タンパク質を酵素的に切断することによるポリペプ
チドまたはタンパク質の製造方法に関する。
ポリペプチドおよびタンパク質の取得のため組換えDN
A技術の重要性が増大するに従い、（新しい）出発原料
に適した生成物の濃縮および精製のための新しい方法の
開発が求められている。
糖尿病の治療に用いられるヒトインスリンのいわゆる
２段階方法による半合成的製造に際しては、Ｂ30位にお
けるアミノ酸エステルの置換（ブタインスリン＝Ala→
ヒトインスリン＝Thr）は２つの別個の連続した反応段
階によって行われる。第一の反応段階では、ブタインス
リンのＢ30-Ala残基を、トリプシン様プロテアーゼを用
いて酵素的に除去し、ついで第二の反応段階でスレオニ
ン誘導体、たとえばスレオニンtert−ブチルエステル
（ThrOBut）を連結する。これも同様にトリプシン様酵
素の存在下に起こる。２つの反応段階に用いられる酵素
の例にはK.Moriharaら（Biochem.Biophys.Res.Commun.,
92（２）:396〜402,1980）によって記載されたAch-romo
bacterプロテアーゼＩがある。これは、アミノ酸Lysの
カルボキシル側でペプチド鎖を特異的に切断し、また場
合によりそれらを再構築するいわゆるエンドペプチダー
ゼである。
アラニンの除去およびスレオニン誘導体の連結が完了
したのち、スレオニン誘導体によって導入された保護基
を再び除去して、保護基をもたないヒトインスリンを得
る。このためには様々な方法が知られているが、中でも
CF3COOHを用いる保護基の除去が場合によっては好まし
い。
ブタインスリンからのＢ30-Ala残基の除去およびスレ
オニン誘導体の連結は単一の反応工程でも実施できる
（１工程法）。この場合も酵素を存在させることが必要
で、適当な酵素は実際上もっぱらトリプシンおよびトリ
プシン様エンドペプチダーゼである（たとえばEP-B56,9
51参照）。「ペプチド転移反応」の完了後、スレオニン
とともに導入された保護基を再び除去しなければならな
い。
当然ながら、ヒトインスリンの製造にあたり、天然の
出発原料、ブタインスリンの使用を回避する試みも行わ
れてきた。この方法も、少なくとも部分的には遺伝子操
作の発展により成功している。すなわち、たとえば、イ
ンスリンとくにヒトインスリンを、遺伝子操作で得られ
るプレプロインスリン類縁体から製造する方法がEP-B89
007に記載されている。この方法では、プレプロインス
リン類縁体を、関連インスリンの等電点以下のpHにおい
て、トリプシンまたはトリプシン様エンドペプチダーゼ
を用い、天然アミノ酸のエステルまたは保護基を含有す
るその誘導体と反応させ（ペプチド転移反応）、ついで
存在するエステル基および保護基を必要に応じて除去す
る。この反応でのヒトインスリンの製造に用いられる好
ましいアミノ酸誘導体はThr（But）-OButである。
上記EP−Ｂに特定されている出発原料のプレプロイン
スリン類縁体はプロインスリンのＮ末端にリジンもしく
はアルギニンまたはそのアシルアミノアシル基をプレ配
列のカルボキシル末端として有する類縁体である。EP−
Ｂによるこれらのプレプロインスリン類縁体の式は次の
とおりである。
式中、ＹはLysまたはArgを意味し、Ｒ1は水素、Ｌ−ア
ミノ酸または以下に述べるペプチド残基Ｘである。Ｘは
シグナル配列として作用する任意のペプチドとすること
ができる。適当なプロインスリン部分は、天然のまたは
公知のヌクレオチド製造方法によって合成的に修飾され
たプロインスリン遺伝子によってコードされるすべての
生成物である。たとえばブタＣペプチドと比較したとき
のウシＣペプチドの場合のように、短縮化Ｃペプチドセ
グメントをもつプレプロインスリン類縁体も同様にこの
方法に適している。ヒトプレプロインスリンもまた適当
である。Ｃペプチド構造については、塩基性Ｌ−アミノ
酸Ｙ＝Ｌ−ArgまたはＬ−Lysを介してインスリンＡ鎖の
グリシンに連結していること、すなわち構造Ｙ−（AA）
n−Ｙ（式中、AAはすべてのコード可能なアミノ酸を意
味し、ｎは０〜35である）の存在することが必須であ
る。アミノ酸エステルおよび／またはその遊離アミノ基
を有する誘導体も、非天然配列を有するインスリン類縁
体の製造を所望の場合の方法には選択できる。
酵素反応においてプレ部分Ｒ1−ＹBOとＣ鎖ＹAO-Ｂ30
が除去され、適当なアミノ酸誘導体がＢ30の位置に連結
される。
この場合、適当なアミノ酸誘導体の付加を行わなけれ
ば、de-Ｂ30−インスリンが得られることも想定できる
ところである。
この方法は、とくに出発原料として動物インスリンに
依存しないことからかなり有利ではあるが反応生成物の
カラムクロマトグラフイーによる精製を必要とし、それ
に伴う物質のロスを避けることができないという欠点が
ある。カラムクロマトグラフィーによる精製の必要性
は、ペプチド切断生成物が酵素反応によって生成される
場合が多く、それらを所望のインスリン（誘導体）から
分離することは、とくに分子の鎖長が類似することから
困難だからである。
本発明の目的は、上述のEP-B89007号の方法を、ポリ
ペプチドまたはタンパク質好ましくはde-Ｂ30−インス
リンまたはインスリンが得られ、、所望の生成物が、容
易に精製が可能で精製時のロスが少ない形で得られるよ
うに改良することであった。
この目的は、本発明により、トリプシン様エンドペプ
チダーゼを用いて特定の融合タンパク質を切断すること
によって達成された。この特定の融合タンパク質は次式
Ｉで表される。
式中、Ｒは−（AA）o−（ペプチド様α−アミラーゼイ
ンヒビター）（ただし、AAは遺伝子によりコード可能な
Lys以外のアミノ酸であり、ｏは０〜200、好ましくは５
〜100、とくに10〜12の整数であり、ペプチド様α−ア
ミラーゼインヒビターは文献公知のα−アミラーゼイン
ヒビターの残基である）を意味し、 Ｐは所望のポリペプチドまたはタンパク質を意味し、 Ｒ2は−（AA）p−（ただし、AAはＲの場合と同じ意味
で、遺伝子によりコード可能なLys以外のアミノ酸であ
り、ｐは１〜35、好ましくは１〜10、とくに１〜３の整
数である）を意味し、 ｍは１を意味し、ｎは０または１を意味する。
すなわち、本発明は、トリプシン様エンドペプチダー
ゼを用いる融合タンパク質の酵素的切断によるポリペプ
チドまたはタンパク質の製造方法において、上記式
（Ｉ）の特異的融合タンパク質を使用する方法である。
この酵素反応で生成するポリペプチドまたはタンパク
質、たとえば好ましくはde-Ｂ30−インスリンまたはヒ
トインスリンのようなインスリンは、とくに融合タンパ
ク質中のα−アミラーゼインヒビター残基のために精製
が容易である。この化合物は水性媒体に易溶性で、容易
に結晶化し、この性質がまたそれ自体の分離に利用でき
る。たとえばde-Ｂ30−インスリンは、EP-B89007の方法
の反応生成物の場合よりも労力が少なくまたロスも少な
く精製できる。好都合な場合には、反応混合物の後処理
は単に結晶化だけで実施できることもある。すなわち、
カラムクロマドグラフイーによる精製を要しない。文献
公知のα−アミラーゼインヒビターの残基が本発明によ
る反応でトリプシン様エンドペプチダーゼによって切断
されないことは驚くべきことである。これらのα−アミ
ラーゼインヒビターはそのペプチド鎖内にリジン残基を
有するからである。ここでは、たとえば前述の出発化合
物de-Ｂ30−インスリンのＡ0、Ｂ0およびＢ29の位置に
おけるLys残基とは異なり切断が起こらない。この種類
の切断が起こるとde-Ｂ30−インスリンからの分離にか
なりの労力を必要とするフラグ・メントを生成すること
がある。
AAとして適当な遺伝子によりコード可能なアミノ酸
（Lys以外）は、Gly，Ala，Ser，Thr，Val，Leu，Ile,A
sp,Asn,Glu,Gln,Cys,Met,Arg,His,Tyr，Phe,Trp,Pro
（中性アミノ酸には下線を付した）である。
基Ｐは、ヒト、ブタまたはウシインスリンのＡおよび
Ｂペプチド鎖であることが好ましく、とくにヒトまたは
ブタインスリンのＡおよびＢ鎖であることが好ましい。
基Ｒ2はアミノ酸AlaまたはThrのみ、とくにThrのみか
らなることが好ましい。
基Ｒのとくに好ましい−（AA）o−部分は、 で示されるペプチド鎖である。
Ｒ中のペプチド様α−アミラーゼインヒビター残基と
しては、文献公知の、たとえばL.Vrtesyら:Eur.J.Bio
chem.,141:505〜512（1984）;L.Vrtesy ＆ D.Tripie
r:FEBS Lett.,185:187〜190（1985）;O.Hoffmannら:Bio
l.Chem.Hoppe-Seylers,366:1161〜1168（1985）;H.Mura
oら:Agric.Biol.Chem.,49:107〜110（1985）および49:7
93〜797（1985）;H.Gotoら：日本公開公報75/77594（19
73年11月20日）に、記載されているα−アミラーゼイン
ヒビターの事実上すべての残基が適当である。
好ましいペプチド様α−アミラーゼインヒビター残基
は次式で表される。
とくに好ましい生成物は、式Ｉにおいて、Ｐがヒトま
たはブタインスリンのペプチド配列、Ｒ2がThr、Ｒが上
述のペプチド配列の化合物である。
式Ｉの融合タンパク質は、所望のポリペプチドまたは
タンパク質のアミノ酸配列の前部にこ異種タンパク質
（α−アミラーゼインヒビター）の配列を挿入すること
により、一般的に公知の方法を用い、微生物内で製造さ
れる（たとえばF.A.O.Harston:Biochem.J.,240:1〜12,1
986参照）。好ましいプレプロインスリン類縁体、式Ｉ
においてＰがヒト、ブタまたはウシインスリンのＡおよ
びＢペプチド鎖である融合タンパク質は遺伝子操作によ
り、好ましくは同時出願の特許出願“ストレプトミセテ
ス中のインスリン前駆体の製造方法”（A process for
the preparation of an insulin precursor in Strepto
mycetes）（HOE88/F313）に記載の方法によって製造さ
れる。通常、培養培地中に分泌されるインスリン前駆体
は好ましくは醗酵液体の液から単離される。式Ｉによ
って定義された化合物の多くの性質は上述のα−アミラ
ーゼインヒビターの挙動と類似することが明らかにされ
ている。すなわち、上述の微生物アミラーゼインヒビタ
ーの単離および精製に際しての多くの工程が、融合タン
パク質前駆体とくにインスリン前駆体を得るために使用
できる。
このような精製工程としては、塩たとえば食塩、とく
に硫酸アンモニウム、酸たとえばメタリン酸、タンニ
ン、トリクロロ酢酸、硫酸等、重金属塩および他の沈澱
剤たとえばポリエチレンイミン、ベントナイト等による
沈澱がある。
遺伝子操作によって得られるタンパク質は望ましくな
い溶解性の挙動を示すことが多く、したがって処理が難
しい場合があるが、プレプロインスリン類縁体のような
式Ｉの化合物は澄明な溶液を与え、たとえば、限外過
によってきわめて簡単に濃縮することができ、同時に塩
も除去される。たとえば市販のセルロース膜が限外過
に適している。
同様に、式Ｉの化合物の前駆体たとえばインスリン前
駆体の濃縮および精製には吸着性樹脂を使用することも
できる。ポリスチレンまたはスチレン／ジビニルベンゼ
ン共重合体をベースとした吸着性樹脂は、とくにAmberl
ite XAD（Rohm ＆ Haas,USA）、Diaion HP-20（Mitsu
bishi Chemical Corp.）の商品名で市販されていて、購
入できる。
たとえばDiaion HP-20のような吸着性樹脂を用いるタ
ンパク質の単離はすでにドイツ公開特許3038130に記載
されている。しかしながら、遺伝予操作によって得られ
たタンパク質、たとえばインスリン前駆体の吸着性樹脂
を用いる濃縮は不可能であるかまたは著しくロスが大き
かった。これは、とくに、支持体に対する所望の物質の
吸着が強すぎることによった。これらの吸着樹脂も、材
料の結合性を緩和にし、減らすことを配慮すれば驚くべ
きことに有利に使用できることが明らかにされた。この
不活性化は、たとえば支持体の処理および／または分離
すべき材料への適当な添加剤によって達成できる。支持
体の処理としては水性有機溶媒（２〜70％好ましくは５
〜30％の溶媒含有）による洗浄を挙げることができる。
適当な溶媒は水混和性溶媒であり、低級アルコールおよ
びアセトンが好ましい。また、支持体の前処理を界面活
性剤水洗液、たとえば0.02〜３％濃度、好ましくは0.1
〜１％濃度のTriton Ｘ-100溶液による洗浄によって行
うこともできる。多数の他の界面活性剤ももちろん同様
に適している。
分離すべき材料の溶液および／または溶出液への適当
な添加剤の添加も同様に適当である。この種類の添加剤
は、いずれも上述した濃度の低級水混和性有機溶媒およ
び界面活性剤、またはいわゆるカオトロピツク物質、た
とえばとくに過塩素酸カリウム（0.1〜３％）、尿素
（１〜８モル）もしくはグアニジン塩酸塩である。
必要に応じて濃縮し、塩を除去した融合タンパク質前
駆体（たとえばインスリン前駆体）は、陽イオン交換樹
脂または陰イオン交換樹脂上イオン交換クロマトグラフ
ィーによってさらに精製することもできる。適当な陽イ
オン交換樹脂の例には、SP-Sephadex （Pharmacia,Swe
den）、CM−セルロース、Ｓ−Sepharose （Pharmacia,
Sweden）、Fractogel TSK CM（E.Merck,Darmstadt）、
Fractogel TSK SP（E.Merck,Darmstadt）等がある。適
当な陰イオン交換樹脂の例には、Fractogel TSK DEAE
（E.Merck,Darmstadt）、DEAE−セルロース、DEAE-Seph
adex （Pharmacia,Sweden）、Ｑ−Sepharose、QAE-Sep
hadex、QAE−セルロース等がある。分離はそれ自体公知
の方法により水溶液中で行われる。しかしながら、場合
によっては、水に可溶化剤および／またはカオトロピツ
ク物質を添加すると分離に有利なことが明らかにされて
いる。この種類の添加剤は２〜８モルの尿素、ベタイ
ン、低級アルコールたとえばメタノール、イソプロパノ
ール、エタノール、エチレングルコール等である。さら
に、適当な精製操作としては、たとえばフエニル−Seph
arose上疎水性クロマトグラフィー、たとえばBiogelを
使用するモルキユラーシーブクロマトグラフイー、調製
高圧液体クロマトグラフイーまたはα−アミラーゼイン
ヒビターに対する抗体を負荷したカラム上でのクロマト
グラフイーがある。
α−アミラーゼインヒビターの性質と類似するインス
リン前駆体の性質により、結晶化による精製も可能であ
る。特定の等電点付近でまた酸性媒体中、所望により添
加剤たとえば食塩等を用いて、いずれの結晶化も可能で
ある。結晶化促進剤たとえばZn2+、Cu2+等のような重金
属イオン、またはビクリン酸等を添加して水溶液から結
晶化することもできる。
さらに、式Ｉのタンパク質またはその切断生成物のα
−アミラーゼ阻害活性を精製に利用することもきわめて
有利である。これは、遺伝子操作によって得られ、イン
ヒビターのアミノ酸配列をもつタンパク質が、複合体の
生成によってα−アミラーゼを同様に阻害することが明
らかにされたからである。インヒビター／α−アミラー
ゼ複合体は出発成分よりも溶解性が低く、したがって分
離に使用できる。支持体にアミラーゼを固定化して用
い、ついで生成した複合体をpHや塩勾配のような適当な
試剤を使用して、式Ｉの化合物を培養液の液から選択
的に分離することもできる。この種類の操作はまた、式
Ｉの化合物のタンパク分解加水分解物の後処理にも有利
である。この場合は、もはや必要ではないインヒビター
の切断生成物を固定化α−アミラーゼを用いて反応混合
物から除去する。残った生成物（式Ｉの化合物、とくに
de-Ｂ30−ヒトインスリン）はすでに十分純粋で、つい
でそのまま結晶化に付される。結晶化はそれ自体公知の
方法によって行われる。
式Ｉに相当する化合物の酵素的切断には、精製された
前駆体を使用するが、部分精製しただけの出発原料を使
用することも可能である。
反応混合物中における式Ｉの出発原料の濃度は比較的
広範囲に変動させることができる。好ましい濃度は総反
応混合物に対して約0.02〜15重量％、とくに約0.05〜５
重量％である。
適当なトリプシン様エンドペプチダーゼは、トリプシ
ン様として、すなわちペプチド結合を塩基性アミノ酸の
カルボキシル末端で選択的に切断する酵素として文献公
知のエンドペプチダーゼである。一部の適当な引例は上
述のEP-B89007に示されている。またリジンの後部で選
択的に切断する例については、たとえばEP-A092829およ
びUS-A4,414,332が参考になる。好ましいトリプシン様
エンドペプチダーゼは、ペプチド結合を塩基性アミノ酸
リジンのカルボキシル末端で特異的に切断するLysobact
er enzymogenesからのリジルエンドペプチダーゼであ
る。リジルエンドペプチダーゼについての関連文献とし
ては、たとえばP.A.Jeckelら:Anal.Biochem.,134:347〜
354（1983）およびT.Masakiら:Biochem.Biophys.Akad.,
660:44f〜51f（1981）がある。
反応混合物のトリプシン様エンドペプチダーゼの濃度
は、式Ｉの融合タンパク質の重量に対して約1/50〜1/1
0,000、好ましくは0.5〜1.5％（w/w）、とくに約1/1,00
0に適宜調整する。
式Ｉの化合物の酵素的切断は水溶液中、所望により可
溶化剤（たとえば尿素、イソプロパノール等のような）
の存在下、約５〜11のpH、好ましくは約7.5〜9.5のpHで
行われる。慣用の緩衝系、たとえばリン酸緩衝剤、Tris
/HCl、Na2CO3/NaHCO3のひとつを、−定のpHに調整し、
それを維持するために適宜使用する。
酵素的切断の温度は約１〜60℃とすることができる。
約15〜40℃の温度が好ましい。
切断は一般的に約0.1〜２時間で完結するが、特定の
反応条件に応じて所要時間は短縮または延長される。
酵素的切断の完結はたとえばクロマトグラフィーによ
って証明できる。切断完結後、さらに望ましくない切断
が起こることを、公知の方法で反応媒体を変化させるこ
とによりたとえばpHの変更、冷却、阻害剤の添加等によ
って停止させ、生成したde-Ｂ30−インスリンをそれ自
体公知の方法で単離する。単離は、公知の関連方法の場
合と同様にクロマトグラフイーで実施することもできる
が、本発明の場合には、de-Ｂ30−インスリンが副生成
物と鎖長したがって分子量の点でかなり異なることか
ら、原理的に結晶化による単離も可能である。
「ペプチド転移反応」は、あらゆる混合比の、好まし
くは1:4〜1:1（溶媒：水）の水／有機溶媒溶液（たとえ
ば水:DMF、水:DMSO）中で行われる。pHは４〜８でなけ
ればならない。好ましくは５〜６である。温度は１〜50
℃、好ましくは15〜30℃である。
酵素的「ペプチド転移反応」の完結後（たとえばHPLC
によって証明できる）、たとえばde-Ｂ30−イシスリン
への逆反応が起こる可能性を防止するため、インヒビタ
ーたとえばアプロチニン、ブチルアミンまたはトシル−
Ｌ−リジンクロロメチルケトンのような阻害剤を添加す
る。ついで調製カラムクロマトグラフイーによって容易
に、希釈、精製すること、すなわち未反応出発原料から
分離することも可能である。この場合は同様に結晶化も
可能である。保護基の除去は文献公知の方法で実施でき
る。
本発明の方法を以下の実施例によりさらに詳細に説明
する。本発明の実施例に続き、さらに、EP-B89007にお
ける一般式のプレプロインスリン類縁体を、リジルエン
ドペプチダーゼを用いて酵素的に切断した場合には、後
処理が困難でロスの大きい反応生成物が得られることを
示す比較例を掲げる。
実施例 １ 構築体pGF2を得るために醗酵を行った培養培地30lを
遠心分離し、ついで再び滅菌過した。溶液のpHを7.2
に調整し、イソプロパノール3lを加えたのち、予め10％
濃度のイソプロパノールで洗浄したDiaion HP-20（4
l）のカラム上に負荷する。新たに構築されたタンパク
質pGF2を、10〜50％濃度のイソプロパノール勾配を適用
することによってカラムから溶出させる。所望の生成物
を含む分画をついで直接、調製DEAE-Sepharose （Phar
macia,Sweden）高速カラム、pH7.2、300mlに負荷し、リ
ン酸緩衝液で洗浄し、最後に０〜0.5モル食塩勾配、pH
7.2で溶出する。タンパク質pGF2は溶液の伝導度20〜30m
Sの分画に見出される。この分画を合し、硫酸アンモニ
ウム（35％飽和）で沈殿させる。生成した沈殿を16時間
後に遠心分離で除き、水に溶解し、pH4.6に調整して再
沈殿させ、この場合はわずかに２時間に遠心分離して沈
殿を集める。これはすでに著しく濃縮されたタンパク質
pGF2を含有する。最終の精製はMacrobore Nucleosil
（Macherey and Nagel,Dren）120-10C4上、カラム容
量100mlで100mgのpGF2が分離されるようにカラムの大き
さを選んで実施する。製造HPLCカラムは同様に、0.1ト
リフルオロ酢酸／アセトニトリル系を用いて展開する。
融合タンパク質は33％濃度のアセトニトリルで溶出され
る。真空中で乾燥すると固体物質が得られる。
実施例 ２ 実施例１のようにして得られた融合タンパク質10mgを
酢酸ナトリウム緩衝液、pH5.3、0.4mlおよびDMF0.1mlに
溶解する。これに140mgのThr（But）OButおよび50μｌ
のリジルエンドペプチダーゼ（2.7mg/ml、水に溶解）を
加える。この混合物を室温に放置する。反応はHPLC分析
（実施例３の場合のような系）で追跡する。
様々な時間経過後にサンプルを採取し、２倍容のメタ
ノールと10倍容のメチルｔ−ブチルエーテルを用いて沈
殿させる。沈殿を10倍容の0.1％濃度トリフルオロ酢酸
に取り、HPLCで分析する。40時間後に約55％のヒトイン
スリンエステルが生成した。残部は主としてde-Ｂ30−
インスリンである。
実施例 ３ 実施例１におけるようにして得られた沈澱を最小量の
0.1％濃度トリフルオロ酢酸に取り、製造HPLCに付す。
使用した固定相は、大きさ4.6×150mmのBakerbond Wide
-PoreTMＣ8/5μｍである。移動相は次の組成とする。
A:0.1％TFA B:A/CH3CN 10/90 流速は1.3ml/分である。勾配は以下の組成とする。
t %B 0 25 20 45 25 45 28 25 35 25 de-Ｂ30−インスリンは15.14分に溶出し、インスリン
エステルは20.92分に溶出する。溶媒を分画から真空中
で除去し、ついで固体をアセトニトリルで洗浄し、溶媒
を真空中で除去する。
実施例 ４ タンパク質pGF2、100mgをTris/HCl緩衝液、pH8、10ml
に溶解し、50mUのリジルエンドペプチダーゼとともにイ
ンキュベートする。2.5時間後に混合物をトリフルオロ
酢酸でpH3の酸性にして反応を停止し、反応混合物を逆
相分画化に付す。30％濃度のアセトニトリルで溶出する
鋭いピークがカラム溶出液中のＢ30-de-Thrヒトインシ
ユリンの出現を示す。溶媒を除去した生成物の重量は35
mgで、理論量の95％に相当した。
実施例 ５ ブタ膵臓からのα−アミラーゼ90mgを35mlの0.5Mリン
酸カリウム緩衝液、pH7.8に溶解し、同じ緩衝液に対し
て透析する。
50gのAffigel 10（BioRad 153-6046）を製造業者の
指示に従って洗浄し、0.5Mリン酸カリウム緩衝液（上
述）で平衡化する。この方法で得られた湿潤ゲルを、酵
素溶液と室温で２時間穏やかに振盪して反応させる。つ
いで吸引過し、結合緩衝液で手短かに洗浄する。次に
支持体を0.1Mエタノールアミン、pH8.0で、0.5時間不活
性化し、最後に再び吸引して過し、数回1M NaClおよ
び結合緩衝液で交互に洗浄する。湿潤ゲル約44gが得ら
れ、50mMリン酸カリウム緩衝液中0.02％アジド下、４℃
で保存する。得られる結合平衡は次のとおりである。
初 期 1004単位＝100％ 合した洗浄水 705単位＝ 70％ 支持体 181単位＝ 18％ 分析方法:Behring“Testomar"アツセイキツト、操作は
製造業者の指示に従う 実施例 ６ 実施例４のようにして固定化したアミラーゼ44gを、
水200ml中、プロテアーゼインヒビターを添加して、実
施例４のようにして分解し、精製しないままのpGF2 10m
gと撹拌する。1/4時間後に混合物を吸引過し、澄明な
液相を凍結乾燥する。得られた無色の生成物5mgを少量
の水に取り、Zn2+を加えて結晶de-Ｂ30−インスリンを
生成させる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 エーベルハルト・エーラース ドイツ連邦共和国デー‐6238 ホフハイ ム・アム・タウヌス．ロルスバヘルシユ トラーセ54ベー (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12P 21/06 ＣＡ（ＳＴＮ)

Claims (13)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】式Ｉ 〔式中、Ｒは−（AA）o−（ペプチド様α−アミラーゼ
    インヒビター）（ただし、AAは遺伝子によりコード可能
    なLys以外のアミノ酸であり、ｏは０〜200の整数であ
    り、ペプチド様α−アミラーゼインヒビターは文献公知
    のα−アミラーゼインヒビターの残基である）を意味
    し、 Ｐはペプチド鎖内にLysを有しない所望のポリペプチド
    またはタンパク質を意味し、 Ｒ2は−（AA）p−（ただし、AAはＲの場合と同じ意味
    で、遺伝子によりコード可能なLys以外のアミノ酸であ
    り、ｐは１〜35の整数である）を意味し、 ｍは１を意味し、 ｎは０または１を意味する〕 で示される化合物を融合タンパク質として使用すること
    を特徴とするペプチド結合をリジンのカルボキシル末端
    で特異的に切断するトリプシン様エンドペプチダーゼを
    用いる融合タンパク質の酵素的切断による式Ｐ−Lysを
    有するポリペプチドまたはタンパク質の製造方法。
  2. 【請求項２】ｏが５〜100の整数であり、ｐが１〜10の
    整数である請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】ｏが10〜12の整数であり、ｐが１〜３の整
    数である請求項２に記載の方法。
  4. 【請求項４】式ＩにおいてＲ2がAlaまたはThrのみから
    構成され、ｍおよびｎはそれぞれ１を意味する化合物を
    融合タンパク質として使用する請求項１に記載の方法。
  5. 【請求項５】式ＩにおいてＲ2がThrのみから構成され、
    ｍおよびｎはそれぞれ１を意味する化合物を融合タンパ
    ク質として使用する請求項４に記載の方法。
  6. 【請求項６】式ＩにおいてＲが式 で示される化合物を融合タンパク質として使用する請求
    項１〜５のいずれかの項に記載の方法。
  7. 【請求項７】式Ｉの融合タンパク質は全反応混合物に対
    して0.02〜15重量％の濃度で使用される請求項１〜６の
    いずれかの項に記載の方法。
  8. 【請求項８】式Ｉの融合タンパク質は全反応混合物に対
    して0.5〜５重量％の濃度で使用される請求項７に記載
    の方法。
  9. 【請求項９】リジルエンドペプチダーゼをトリプシン様
    エンドペプチターゼとして使用する請求項１〜８のいず
    れかの項に記載の方法。
  10. 【請求項１０】トリプシン様エンドペプチダーゼは式
    （Ｉ）の融合タンパク質の重量の1/50〜1/10,000の濃度
    で使用する請求項１〜９のいずれかの項に記載の方法。
  11. 【請求項１１】酵素的切断は必要に応じて安定剤の存在
    下、pH5〜11の水性溶液中で実施する請求項１〜10のい
    ずれかの項に記載の方法。
  12. 【請求項１２】酵素的切断は必要に応じて安定剤の存在
    下、pH7〜9.5の水性溶液中で実施する請求項11に記載の
    方法。
  13. 【請求項１３】反応混合物は酵素的切断の完了後、結晶
    化によって後処理する請求項１〜12のいずれかの項に記
    載の方法。
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