JPH02195896A - 融合タンパク質の選択的切断方法 - Google Patents
融合タンパク質の選択的切断方法Info
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Abstract
め要約のデータは記録されません。
Description
合タンパク質を酵素的に切断することによるポリペプチ
ドまたはタンパク質の製造方法に関する。
A技術の重要性が増大するに従い、(新しい)出発原料
に適した生成物の濃縮および精製のための新しい方法の
開発が求められている。
段階方法による半合成的製造に際しては、836位にお
けるアミノ酸エステルの置換(ブタインスリン= Al
a→ヒトインスリン= Thr)は2つの別個の連続し
た反応段階によって行われる。第一の反応段階では、ブ
タインスリンのB50−Ala残基を、トリプシン様プ
ロテアーゼを用いて酵素的に除去し、ついで第二の反応
段階でスレオニン誘導体、たとえばスレオニンtart
−ブチルエステル(ThrOBut)を連結する。これ
も同様にトリプシン様酵素の存在下に起こる。
、Res、Commun、、92(2) : 396〜
402.1980)によって記載されたAch−rom
obacterプロテアーゼIがある。これは、アミノ
酸Lysのカルボキシル側でペプチド鎖を特異的に切断
し、また場合によりそれらを再構築するいわゆるエンド
ペプチダーゼである。
たのち、スレオニン誘導体によって導入された保護基を
再び除去して、保護基をもたないヒトインスリンを得る
。このためには様々な方法が知られているが、中でもC
F、C0OHを用いる保護基の除去が場合によっては好
ましい。
レオニン誘導体の連結は単一の反応工程でも実施できる
(l工程法)、この場合も酵素を存在させることが必要
で、適当な酵素は実際上もっばらトリプシンおよびトリ
プシン様エンドペプチダーゼである(たとえばEP−B
56.951参照)。「ペプチド転移反応」の完了後、
スレオニンとともに導入された保護基を再び除去しなけ
ればならない。
発原料、ブタインスリンの使用を回避する試みも行われ
てきた。この方法も、少なくとも部分的には遺伝子操作
の発展により成功している。すなわち、たとえば、イン
スリンとくにヒトインスリンを、遺伝子操作で得られる
プレグロインスリン類縁体から製造する方法がEP−B
89007に記載されている。この方法では、プレプロ
インスリン類縁体を、関連インスリンの等電点以下のp
Hにおいて、トリプシンまたはトリプシン様エンドペプ
チダーゼを用い、天然アミノ酸のエステルまたは保護基
を含有するその誘導体と反応させ(ペプチド転移反応)
、ついで存在するエステル基および保護基を必要に応じ
て除去する。この反応でのヒトインスリンの製造に用い
られる好ましいアミノ酸誘導体はThr(But)−0
Butである。
スリン類縁体はプロインスリンのN末端にリジンもしく
はアルギニンまたはそのアシルアミノアシル基をプレ配
列のカルボキシル末端゛として有する類縁体である。
EP−Hによるこれらのプレプロインスリン類縁体の式
は次のとおりである。
L−アミノ酸または以下に述べるベグチド残基Xである
。Xはシグナル配列として作用する任意のペプチドとす
ることができる。適当なプロインスリン部分は、天然の
または公知のヌクレオチド製造方法によって合成的に修
飾されたプロインスリン遺伝子によってコードされるす
べての生成物である。たとえばブタCペプチドと比較し
たときのウシCペプチドの場合のように、短縮化Cペプ
チドセグメントをもつプレプロインスリン類縁体も同様
にこの方法に適している。
ド構造については、塩基性L−アミノ酸Y=L−Arg
またはL−Lysを介してインスリンA鎖のグリシンに
連結していること、すなわち構造Y−(AA)n−YC
式中、AAはすべてのコード可能なアミノ酸を意味し、
nは0〜35である)の存在することが必須である。ア
ミノ酸エステルおよび/またはその遊離アミノ基を有す
る誘導体も、非天然配列を有するインスリン類縁体の製
造を所望の場合の方法には選択できる。
置に連結される。
、de−B”−インスリンが得られることも想定できる
ところである。
依存しないことからかなり有利ではあるが反応生成物の
カラムクロマトグラフィーによる精製を必要とし、それ
に伴う物質のロスを避けることができないという欠点が
ある。カラムクロマトグラフィーによる精製の必要性は
、ペプチド切断生成物が酵素反応によって生成される場
合が多く、それらを所望のインスリン(誘導体)から分
離することは、とくに分子の鎖長が類似することから困
難だからである。
、ポリペプチドまたはタンパク質好ましくはde−B”
−インスリンまたはインスリンが得られ、所望の生成物
が、容易に精製が可能で精製時のロスが少ない形で得ら
れるように改良することであった。
ダーゼを用いて特定の融合タンパク質を切断することに
よって達成された。この特定の融合タンパク質は次式l
で表される。
(I )式中、Rは−(AA)。−(ペプチド
様σ−アミラーゼインヒビター)(ただし、AAは遺伝
子によりコード可能なLys以外のアミノ酸であり、0
は0〜200、好ましくは5〜100、とくに10−1
2の整数であり、ペプチド様α−アミラーゼインヒビタ
ーは文献公知のσ−アミラーゼインヒビターの残基であ
る)を意味し、 Pは所望のポリペプチドまたはタンパク質を意味し、 R宜は−(AA)I)−(ただし、AAはRの場合と同
じ意味で、遺伝子によりコード可能なLys以外のアミ
ノ酸であり、pは1〜35、好ましくは1〜10゜とく
に1〜3の整数である)を意味し、mは0またはl≧n
を意味する。
を用いる融合タンパク質の酵素的切断によるポリペプチ
ドまたはタンパク質の製造方法において、上記式CI)
の特異的融合タンパク質を使用する方法である。
、たとえば好ましくはde−B”〜インスリンまたはヒ
トインスリンのようなインスリンは、とくに融合タンパ
ク質中のσ−アミラーゼインヒビター残基のために精製
が容易である。
の性質がまたそれ自体の分離に利用できる。たとえばd
e−B”−インスリンは、EP−B89007の方法の
反応生成物の場合よりも労力が少なくまたロスも少なく
精製できる。好都合な場合には、反応混合物の後処理は
単に結晶化だけで実施できることもある。すなわち、カ
ラムクロマトグラフィーによる精製を要しない。文献公
知のα−アミラーゼインヒビターの残基が本発明による
反応でトリプシン様エンドペプチダーゼによって切断さ
れないことは驚くべきことである。これらのα−アミラ
ーゼインヒビタ−はそのペプチド鎖内にリジン残基を有
するからである。ここでは、たとえば前述の出発化合物
da−B”−インスリンのAo、Bt′およびB■の位
置におけるLys残基とは異なり切断が起こらない。
の分離にかなりの労力を必要とする7ラグメントを生成
することがある。
Lys以外)は、Gly、Ala、Ser、Thr、V
al、Leu。
et、Arg、His、Tyr。
した)である。
ペプチド鎖であることが好ましく、とくにヒトまたはブ
タインスリンのAおよびB鎖であることが好ましい。
rのみからなることが好ましい。
−AsrrSar−Asn−G ly−Thr−Ala
−Met−Ala−Asn−−Phe−2で示されるペ
プチド鎖である。
ては、文献公知の、たとえばり。
41 : 505〜512(1984) ; L、V6
rtesy & D、Tripier : FEBS
Lett、。
of f+aannら:Biol。
1161〜1168(1985) ;H,Muraoら
: Agric、Biol、Che+m、、49 :
107〜ll。
5) ; H,Gotoら二日本公開公報75/ 77
594(1973年11月20日)に記載されているσ
−アミラーゼインヒビターの事実上すべての残基が適当
である。
次式で表される。
はブタインスリンのペプチド配列、R1がThrlRが
上述のペプチド配列の化合物である。
ンパク質のアミノ酸配列の前部に異種タンパク質(σ−
アミラーゼインヒビター)の配列を挿入することにより
、−膜内に公知の方法を用い、微生物内で製造される(
たとえばF、A、O,Harston:Biochem
−J、、240 : 1〜12+ 1986参照)。好
ましいプレグロインスリン類縁体、式IにおいてPがヒ
ト、ブタまたはウシインスリンのAおよびBペプチド鎖
である融合タンパク質は遺伝子操作により、好ましくは
同時出願の特許出願“ストレプトミセテス中のインスリ
ン前駆体の製造方法” (A process for
the pr−eparation of an 1
nsulin precursor in Stre−
ptomycetes) (HOE88/F313)
に記載の方法によって製造される。通常、培養培地中に
分泌されるインスリン前駆体は好ましくは醗酵液体のが
液から単離される。式Iによって定義された化合物の多
くの性質は上述のσ−アミラーゼインヒビターの挙動と
類似することが明らかにされている。すなわち、上述の
微生物アミラーゼインヒビターの単離および精製に際し
ての多くの工程が、融合タンパク質前駆体とくにインス
リン前駆体を得るために使用できる。
硫酸アンモニウム、酸たとえばメタリン酸、タンニン、
トリクロロ酢酸、硫酸等、重金属塩および他の沈澱剤た
とえばポリエチレンイミン、ベントナイト等による沈澱
がある。
溶解性の挙動を示すことが多く、したがって処理が難し
い場合があるが、プレプロインスリン類縁体のような式
■の化合物は澄明な溶液を与え、たとえば、限外濾過に
よってきわめて筒単に濃縮することができ、同時に塩も
除去される。たとえば市販のセルロース膜が限外か過に
適している。
体の濃縮および精製には吸着性樹脂を使用することもで
きる。ポリスチレンまたはスチレン/ジビニルベンゼン
共重合体ヲペースとした吸着性樹脂は、とくにAmbe
rlite@XAD(Roh+m & Haas、 U
SA)、Diaion@HP−20(Mitsu−bi
shi Chemical Corp、)の商品名で市
販されていて、購入できる。
を用いるタンパク質の単離はすでにドイツ公開特許30
38130に記載されている。しかしながら、遺伝子操
作によって得られたタンパク質、たとえばインスリン前
駆体の吸着性樹脂を用いる濃縮は不可能であるかまたは
著しくロスが太きかった。これは、とくに、支持体に対
する所望の物質の吸着が強すぎることによった。これら
の吸着樹脂も、材料の結合性を緩和にし、減らすことを
配慮すれば驚くべきことに有利に使用できることが明ら
かにされた。この不活性化は、たとえば支持体の処理お
よび/または分離すべき材料への適当な添加剤によって
達成できる。
くは5〜30%の溶媒含有)による洗浄を挙げることが
できる。適当な溶媒は水混和性溶媒であり、低級アルコ
ールおよびアセトンが好ましい、また、支持体の前処理
を界面活性剤水溶液、たとえば0.02〜3%濃度、好
ましくは0.1−1%濃度のTriton@ X−10
0溶液による洗浄によって行うこともできる。多数の他
の界面活性剤ももちろん同様に適している。
添加剤の添加も同様に適当である。
和性有機溶媒および界面活性剤、またはいわゆるカオト
ロピック物質、たとえばとくに過塩素酸カリウム(0,
1〜3%)、尿素(1〜8モル)もしくはグアニジン塩
酸塩である。
体(たとえばインスリン前駆体)は、陽イオン交換樹脂
または陰イオン交換樹脂上イオン交換クロマトグラフィ
ーによってさらに精製することもできる。適当な陽イオ
ン交換樹脂の例には、5P−Sephadex@(Ph
armacia、Sweden)、CM−セルロース、
S−5epharose■(Phar+mac fa
。
(E、Merck、Dar+m5−tadt)、Fra
ctogel@TSK 5P(E、Merck、Dar
+1sLadt)等がある。適当な陰イオン交換樹脂の
例には、Fractogel@ TSK DEAE (
E、Merck、Darmstadt)、DEAE−セ
ルロース、DEAE−Sephadex@ (Phar
macia。
epbadex、 QAE−セルロース等がある。分離
はそれ自体公知の方法により水溶液中で行われる。しか
しながら、場合によっては、水に可溶化剤および/また
はカオトロピック物質を添加すると分離に有利なことが
明らかにされている。この種類の添加剤は2〜8モルの
尿素、ベタイン、低級アルコールたとえばメタノール、
インプロパツール、エタノール、エチレンゲルコール等
でアル。サラに、適当な精製操作としては、たとえばフ
ェニル−5epharose上疎水性クロマトグラフイ
ー、たとえばBiogelを使用するモルキュラーシー
ブクロマトグラフイー、調製高圧液体クロマトグラフィ
ーまたはa−アミラーゼインヒビターに対する抗体を負
荷したカラム上でのクロマトグラフィーがある。
ン前駆体の性質により、結晶化による精製も可能である
。特定の等電点付近でまた酸性媒体中、所望により添加
剤たとえば食塩等、を用いて、いずれの結晶化も可能で
ある。結晶化促進剤たとえばZn”、Cu”等のような
重金属イオン、またはピクリン酸等を添加して水溶液か
ら結晶化することもできる。
アミラーゼ阻害活性を精製に利用することもきわめて有
利である。これは、遺伝子操作によって得られ、インヒ
ビターのアミノ酸配列をもつタンパク質が、複合体の生
成によってσ−アミラーゼを同様に阻害することが明ら
かにされたからである。インヒビター/α−アミラーゼ
複合体は出発成分よりも溶解性が低く、したがって分離
に使用できる。支持体にアミラーゼを固定化して用い、
ついで生成した複合体をpHや塩勾配のような適当な試
剤を使用して、式1の化合物を培養液のか液から選択的
に分離することもできる。この種類の操作はまた、式■
の化合物のタンパク分解加水分解物の後処理にも有利で
ある。この場合は、もはや必要ではないインヒビターの
切断生成物を固定化a−アミラーゼを用いて反応混合物
から除去する。残った生成物(式Iの化合物、とくにd
e−B”−ヒトインスリン)はすでに十分純粋で、つい
でそのまま結晶化に付される。結晶化はそれ自体公知の
方法によって行われる。
駆体を使用するが、部分精製しただけの出発原料を使用
することも可能である。
範囲に変動させることができる。好ましい濃度は総反応
混合物に対して約0.02〜15重量%、とくに約0.
05〜5重量%である。
様として、すなわちペプチド結合を塩基性アミノ酸のカ
ルボキシル末端で選択的に切断する酵素として文献公知
のエンドペプチダーゼである。一部の適当な引例は上述
のEP−B89007に示されている。またリジンの後
部で選択的に切断する例については、たとえばEP−A
092829およびUS−A4,414,332が参考
になる。好マシいトリズシン様エンドペプチダーゼは、
ペプチド結合を塩基性アミノ酸リジンのカルボキシル末
端で特異的に切断するLysobacter anzy
−mogenesからのリジルエンドペプチダーゼであ
る。リジルエンドペプチダーゼについての関連文献とし
ては、たとえばP、A、Jeckalら:Anal。
983)およびT、Masakiら: Biochem
、Biophys、Akad、、660 : 44f〜
51f(1981)がある。
、式Iの融合タンパク質の重量に対して約1150〜1
/10,000、好ましくは0.5〜1.5%(w/v
)、とくに約1/1.000に適宜調整する。
化剤(たとえば尿素、イソプロパツール等のような)の
存在下、約5〜11(7)pH,好ましくは約7.5〜
9.5のpHで行われる。慣用の緩衝系、I;とえばリ
ン酸緩衝剤、Tris/HCl2、Na!cos/ N
aHCO,のひとつを、一定のpHに調整し、それを維
持するために適宜使用する。
反応条件に応じて所要時間は短縮または延長される。
て証明できる。切断完結後、さらに望ましくない切断が
起こることを、公知の方法で反応媒体を変化させること
によりたとえばpHの変更、冷却、阻害剤の添加等によ
って停止させ、生成しf:de−B”−インスリンをそ
れ自体公知の方法で単離する。単離は、公知の関連方法
の場合と同様にクロマトグラフィーで実施することもで
きるが、本発明の場合には、de−B”・−インスリン
が副生成物と鎖長したがって分子量の点でかなり異なる
ことから、原理的に結晶化による単離も可能である。
l:4〜1:l (溶媒:水)の水/有機溶媒溶液(た
とえば水: DMF、水: DMSO)中で行われる。
は15〜30℃である。
Cによって証明できる)、たとえばde−B3@−イン
スリンへの逆反応が起こる可能性を防止するため、イン
ヒビターたとえばアプロチニン、ブチルアミンまたはト
シル−L−リジンクロロメチルケトンのような阻害剤を
添加する。
希釈、精製すること、すなわち未反応出発原料から分離
することも可能である。この場合は同様に結晶化も可能
である。保護基の除去は文献公知の方法で実施できる。
る。本発明の実施例に続き、さらに、EP−B8900
7における一般式のプレプロインスリン類縁体を、リジ
ルエンドペプチダーゼを用いて酵素的に切断した場合に
は、後処理が困難でロスの大きい反応生成物が得られる
ことを示す比較例を掲げる。
Qを遠心分離し、ついで再び滅菌濾過した。
加えたのち、予め10%濃度のインプロパツールで洗浄
したDiaion@ HP−20(4Q)のカラム上に
負荷する。新たに構築されI;タンパク質pGF2を、
10〜50%濃度のインプロパツール勾配を適用するこ
とによってカラムから溶出させる。所望の生成物を含む
分画をついで直接、調製DEAE−Sepharose
@ (Pharmac ia 、 Sweden)高
速カラム、pH7,2,300嘗aに負荷し、リン酸緩
衝液で洗浄し、最後に0〜0.5モル食塩勾配s pH
7−2で溶出する。
画に見出される。この分画を合し、硫酸アンモニウム(
35%飽和)で沈殿させる。生成した沈殿を16時間後
に遠心分離で除き、水に溶解し、pH4,6に調整して
再沈殿させ、この場合はわずかに2時間に遠心分離して
沈殿を集める。これはすでに著しく濃縮されたタンパク
質pGF2を含有する@最終の精製はMacrobor
e Nuc1eosil@(Macheray and
Nagel、D(lren)120−10c4上、カ
ラム容量100tQで100119のpGF2が分離さ
れるようにカラムの大きさを選んで実施する。製造HP
LCカラムは同様に、0.1)リフルオロ酢酸/アセト
ニトリル系を用いて展開する。融合タンパク質は33%
濃度のアセトニトリルで溶出される。真空中で乾燥する
と固体物質が得られる。
9を酢酸ナトリウム緩衝液、pH5,3,0−4*(1
およびDMFo、1mffに溶解する。これに1401
1gのThr(Bu’)OBut#よび50III2の
リジルエンドペプチダーゼ(2,7mg/ m、(1、
水に溶解)を加える。コノ混合物を室温に放置する。反
応はHPLC分析(実施例3の場合のような系)で追跡
する。
ールとlO0倍容メチルt−ブチルエーテルを用いて沈
殿させる。沈殿をlθ0倍容0.1%濃度トリフルオロ
酢酸に取り、HPLCで分析する。40時間後に約55
%のヒトインスリンエステルが生成した。残部は主とし
てde−B”−インスリンである。
.1%濃度トリフルオロ酢酸に取り、製造HPLCに付
す。使用した固定相は、大きさ4.6X150taのB
akerbond Wide−Pore”Cm/ Fl
uである。移動相は次の組成とする。
。
スリンエステルは20.92分に溶出する。溶媒を分画
から真空中で除去し、ついで固体をアセトニトリルで洗
浄し、溶媒を真空中で除去する。
緩衝液、pH8、lomQl:溶解し、5Q+U(7)
リジルエンドペプチダーゼとともにインキュベートする
。2.5時間後に混合物をトリプルオロ酢酸でpH3の
酸性にして反応を停止し、反応混合物を逆相分画化に付
す。30%濃度のアセトニトリルで溶出する鋭いピーク
がカラム溶出液中のB3@〜de−Thrヒトインシュ
リンの出現を示す。溶媒を除去した生成物の重量は35
讃9で、理論量の95%に相当した。
.5Mリン酸カリウム緩衝液、pH7,8に溶解し、同
じ緩衝液に対して透析する。
3−6046)を製造業者の指示に従って洗浄し、0.
5Mリン酸カリウム緩衝液(上述)で平衡化する。この
方法で得られた湿潤ゲルを、酵素溶液と室温で2時間積
やかに振盪して反応させる。ついで吸引濾過し、結合緩
衝液で手短かに洗浄する。次に支持体を0.1Mエタノ
ールアミン、pH8,0で、0.5時間不活性化し、最
後に再び吸引して炉遇し、数回IMNaOffおよび結
合緩衝液で交互に洗浄する。湿潤ゲル約44gが得られ
、50mMリン酸カリウム緩衝液中0.02%アジド下
、4℃で保存する。
浄水 705単位−70% 支持体 181単位−18% 分析方法: Behring″Testomar”アッ
セイキット、操作は製造業者の指示に従う 実施例 6 44gを、水20012中、プロテアーゼインヒビター
を添加して、実施例4のようにして分解し、精製しない
ままのVpGF2101Agと撹拌する。!へ時間後に
混合物を吸引濾過し、澄明な液相を凍結乾燥する。得ら
れた無色の生成物5m+9を少量の水に取り、zn″″
を加えて結晶do−B”−インスリンを生成させる。
2名
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1)式 I R−Lys−P−(Lys−R^2)_m−(Lys)
_n( I )〔式中、Rは−(AA)_o−(ペプチド
様α−アミラーゼインヒビター)(ただし、AAは遺伝
子によりコード可能なLys以外のアミノ酸であり、o
は0〜200、好ましくは5〜100、とくに10〜1
2の整数であり、ペプチド様α−アミラーゼインヒビタ
ーは文献公知のα−アミラーゼインヒビターの残基であ
る)を意味し、Pは所望のポリペプチドまたはタンパク
質 を意味し、 R^2は−(AA)_p−(ただし、AAはRの場合と
同じ意味で、遺伝子によりコード可能なLys以外のア
ミノ酸であり、pは1〜35、好ましくは1〜10、と
くに1〜3の整数である)を意味し、 mは0または1≧nを意味する〕 で示される化合物を融合タンパク質として使用すること
を特徴とするトリプシン様エンドペプチダーゼを用いる
融合タンパク質の酵素的切断によるポリペプチドまたは
タンパク質の製造方法。 2)式 I においてR^1がAlaまたはThrのみか
ら、とくにThrのみから構成され、mおよびnはそれ
ぞれ1を意味する化合物を融合タンパク質として使用す
る請求項1記載の方法。 3)式 I においてRが式 ▲数式、化学式、表等があります▼ で示される化合物を融合タンパク質として使用する請求
項1または2記載の方法。 4)式 I の融合タンパク質は全反応混合物に対して約
0.02〜15重量%、好ましくは約0.5〜5重量%
の濃度で使用される請求項1〜3の1または2以上に記
載の方法。 5)リジルエンドペプチダーゼをトリプシン様エンドペ
プチダーゼとして使用する請求項1〜4の1または2以
上に記載の方法。 6)トリプシン様エンドペプチダーゼは式( I )の融
合タンパク質の重量の約1/50〜1/10,000の
濃度で使用する請求項1〜5の1または2以上に記載の
方法。 7)酵素的切断は必要に応じて安定剤の存在下、pH5
〜11好ましくは約7〜9.5の水性溶液中で実施する
請求項1〜6の1または2以上に記載の方法。 8)反応混合物は酵素的切断の完了後、結晶化によって
後処理する請求項1〜7の1または2以上に記載の方法
。
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