JPH02195896A - 融合タンパク質の選択的切断方法 - Google Patents
融合タンパク質の選択的切断方法Info
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- JPH02195896A JPH02195896A JP1285089A JP28508989A JPH02195896A JP H02195896 A JPH02195896 A JP H02195896A JP 1285089 A JP1285089 A JP 1285089A JP 28508989 A JP28508989 A JP 28508989A JP H02195896 A JPH02195896 A JP H02195896A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、トリズシン様エンドペプチダーゼを用いて融
合タンパク質を酵素的に切断することによるポリペプチ
ドまたはタンパク質の製造方法に関する。
合タンパク質を酵素的に切断することによるポリペプチ
ドまたはタンパク質の製造方法に関する。
ポリペプチドおよびタンパク質の取得のため組換えＤＮ
Ａ技術の重要性が増大するに従い、（新しい）出発原料
に適した生成物の濃縮および精製のための新しい方法の
開発が求められている。
Ａ技術の重要性が増大するに従い、（新しい）出発原料
に適した生成物の濃縮および精製のための新しい方法の
開発が求められている。
糖尿病の治療に用いられるヒトインスリンのいわゆる２
段階方法による半合成的製造に際しては、８３６位にお
けるアミノ酸エステルの置換（ブタインスリン＝ Ａｌ
ａ→ヒトインスリン＝ Ｔｈｒ）は２つの別個の連続し
た反応段階によって行われる。第一の反応段階では、ブ
タインスリンのＢ５０−Ａｌａ残基を、トリプシン様プ
ロテアーゼを用いて酵素的に除去し、ついで第二の反応
段階でスレオニン誘導体、たとえばスレオニンｔａｒｔ
−ブチルエステル（ＴｈｒＯＢｕｔ）を連結する。これ
も同様にトリプシン様酵素の存在下に起こる。
段階方法による半合成的製造に際しては、８３６位にお
けるアミノ酸エステルの置換（ブタインスリン＝ Ａｌ
ａ→ヒトインスリン＝ Ｔｈｒ）は２つの別個の連続し
た反応段階によって行われる。第一の反応段階では、ブ
タインスリンのＢ５０−Ａｌａ残基を、トリプシン様プ
ロテアーゼを用いて酵素的に除去し、ついで第二の反応
段階でスレオニン誘導体、たとえばスレオニンｔａｒｔ
−ブチルエステル（ＴｈｒＯＢｕｔ）を連結する。これ
も同様にトリプシン様酵素の存在下に起こる。
２つの反応段階に用いられる酵素の例にはＫ。
Ｍｏｒｉｈａｒａら（Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ
、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、、９２（２） ： ３９６〜
４０２．１９８０）によって記載されたＡｃｈ−ｒｏｍ
ｏｂａｃｔｅｒプロテアーゼＩがある。これは、アミノ
酸Ｌｙｓのカルボキシル側でペプチド鎖を特異的に切断
し、また場合によりそれらを再構築するいわゆるエンド
ペプチダーゼである。
、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、、９２（２） ： ３９６〜
４０２．１９８０）によって記載されたＡｃｈ−ｒｏｍ
ｏｂａｃｔｅｒプロテアーゼＩがある。これは、アミノ
酸Ｌｙｓのカルボキシル側でペプチド鎖を特異的に切断
し、また場合によりそれらを再構築するいわゆるエンド
ペプチダーゼである。
アラニンの除去およびスレオニン誘導体の連結が完了し
たのち、スレオニン誘導体によって導入された保護基を
再び除去して、保護基をもたないヒトインスリンを得る
。このためには様々な方法が知られているが、中でもＣ
Ｆ、Ｃ０ＯＨを用いる保護基の除去が場合によっては好
ましい。
たのち、スレオニン誘導体によって導入された保護基を
再び除去して、保護基をもたないヒトインスリンを得る
。このためには様々な方法が知られているが、中でもＣ
Ｆ、Ｃ０ＯＨを用いる保護基の除去が場合によっては好
ましい。
ブタインスリンからのＢ”−Ａｌａ残基の除去およびス
レオニン誘導体の連結は単一の反応工程でも実施できる
（ｌ工程法）、この場合も酵素を存在させることが必要
で、適当な酵素は実際上もっばらトリプシンおよびトリ
プシン様エンドペプチダーゼである（たとえばＥＰ−Ｂ
５６．９５１参照）。「ペプチド転移反応」の完了後、
スレオニンとともに導入された保護基を再び除去しなけ
ればならない。
レオニン誘導体の連結は単一の反応工程でも実施できる
（ｌ工程法）、この場合も酵素を存在させることが必要
で、適当な酵素は実際上もっばらトリプシンおよびトリ
プシン様エンドペプチダーゼである（たとえばＥＰ−Ｂ
５６．９５１参照）。「ペプチド転移反応」の完了後、
スレオニンとともに導入された保護基を再び除去しなけ
ればならない。
当然ながら、ヒトインスリンの製造にあたり、天然の出
発原料、ブタインスリンの使用を回避する試みも行われ
てきた。この方法も、少なくとも部分的には遺伝子操作
の発展により成功している。すなわち、たとえば、イン
スリンとくにヒトインスリンを、遺伝子操作で得られる
プレグロインスリン類縁体から製造する方法がＥＰ−Ｂ
８９００７に記載されている。この方法では、プレプロ
インスリン類縁体を、関連インスリンの等電点以下のｐ
Ｈにおいて、トリプシンまたはトリプシン様エンドペプ
チダーゼを用い、天然アミノ酸のエステルまたは保護基
を含有するその誘導体と反応させ（ペプチド転移反応）
、ついで存在するエステル基および保護基を必要に応じ
て除去する。この反応でのヒトインスリンの製造に用い
られる好ましいアミノ酸誘導体はＴｈｒ（Ｂｕｔ）−０
Ｂｕｔである。
発原料、ブタインスリンの使用を回避する試みも行われ
てきた。この方法も、少なくとも部分的には遺伝子操作
の発展により成功している。すなわち、たとえば、イン
スリンとくにヒトインスリンを、遺伝子操作で得られる
プレグロインスリン類縁体から製造する方法がＥＰ−Ｂ
８９００７に記載されている。この方法では、プレプロ
インスリン類縁体を、関連インスリンの等電点以下のｐ
Ｈにおいて、トリプシンまたはトリプシン様エンドペプ
チダーゼを用い、天然アミノ酸のエステルまたは保護基
を含有するその誘導体と反応させ（ペプチド転移反応）
、ついで存在するエステル基および保護基を必要に応じ
て除去する。この反応でのヒトインスリンの製造に用い
られる好ましいアミノ酸誘導体はＴｈｒ（Ｂｕｔ）−０
Ｂｕｔである。
上記ＥＰ−Ｂに特定されている出発原料のプレプロイン
スリン類縁体はプロインスリンのＮ末端にリジンもしく
はアルギニンまたはそのアシルアミノアシル基をプレ配
列のカルボキシル末端゛として有する類縁体である。
ＥＰ−Ｈによるこれらのプレプロインスリン類縁体の式
は次のとおりである。
スリン類縁体はプロインスリンのＮ末端にリジンもしく
はアルギニンまたはそのアシルアミノアシル基をプレ配
列のカルボキシル末端゛として有する類縁体である。
ＥＰ−Ｈによるこれらのプレプロインスリン類縁体の式
は次のとおりである。
Ｃ鎖
Ｂ鎖
式中、ＹはＬｙｓまたはＡｒｇを意味し、Ｒ１は水素、
Ｌ−アミノ酸または以下に述べるベグチド残基Ｘである
。Ｘはシグナル配列として作用する任意のペプチドとす
ることができる。適当なプロインスリン部分は、天然の
または公知のヌクレオチド製造方法によって合成的に修
飾されたプロインスリン遺伝子によってコードされるす
べての生成物である。たとえばブタＣペプチドと比較し
たときのウシＣペプチドの場合のように、短縮化Ｃペプ
チドセグメントをもつプレプロインスリン類縁体も同様
にこの方法に適している。
Ｌ−アミノ酸または以下に述べるベグチド残基Ｘである
。Ｘはシグナル配列として作用する任意のペプチドとす
ることができる。適当なプロインスリン部分は、天然の
または公知のヌクレオチド製造方法によって合成的に修
飾されたプロインスリン遺伝子によってコードされるす
べての生成物である。たとえばブタＣペプチドと比較し
たときのウシＣペプチドの場合のように、短縮化Ｃペプ
チドセグメントをもつプレプロインスリン類縁体も同様
にこの方法に適している。
ヒト−プレプロインスリンもまた適当である。Ｃペプチ
ド構造については、塩基性Ｌ−アミノ酸Ｙ＝Ｌ−Ａｒｇ
またはＬ−Ｌｙｓを介してインスリンＡ鎖のグリシンに
連結していること、すなわち構造Ｙ−（ＡＡ）ｎ−ＹＣ
式中、ＡＡはすべてのコード可能なアミノ酸を意味し、
ｎは０〜３５である）の存在することが必須である。ア
ミノ酸エステルおよび／またはその遊離アミノ基を有す
る誘導体も、非天然配列を有するインスリン類縁体の製
造を所望の場合の方法には選択できる。
ド構造については、塩基性Ｌ−アミノ酸Ｙ＝Ｌ−Ａｒｇ
またはＬ−Ｌｙｓを介してインスリンＡ鎖のグリシンに
連結していること、すなわち構造Ｙ−（ＡＡ）ｎ−ＹＣ
式中、ＡＡはすべてのコード可能なアミノ酸を意味し、
ｎは０〜３５である）の存在することが必須である。ア
ミノ酸エステルおよび／またはその遊離アミノ基を有す
る誘導体も、非天然配列を有するインスリン類縁体の製
造を所望の場合の方法には選択できる。
酵素反応においてプレ部分Ｒ＋−ｙｍｏとＣ鎖ｙＡ。
Ｂ″＠が除去され、適当なアミノ酸誘導体がＢｓ０の位
置に連結される。
置に連結される。
この場合、適当なアミノ酸誘導体の付加を行わなければ
、ｄｅ−Ｂ”−インスリンが得られることも想定できる
ところである。
、ｄｅ−Ｂ”−インスリンが得られることも想定できる
ところである。
この方法は、と＜ｌ；出発原料として動物インスリンに
依存しないことからかなり有利ではあるが反応生成物の
カラムクロマトグラフィーによる精製を必要とし、それ
に伴う物質のロスを避けることができないという欠点が
ある。カラムクロマトグラフィーによる精製の必要性は
、ペプチド切断生成物が酵素反応によって生成される場
合が多く、それらを所望のインスリン（誘導体）から分
離することは、とくに分子の鎖長が類似することから困
難だからである。
依存しないことからかなり有利ではあるが反応生成物の
カラムクロマトグラフィーによる精製を必要とし、それ
に伴う物質のロスを避けることができないという欠点が
ある。カラムクロマトグラフィーによる精製の必要性は
、ペプチド切断生成物が酵素反応によって生成される場
合が多く、それらを所望のインスリン（誘導体）から分
離することは、とくに分子の鎖長が類似することから困
難だからである。
本発明の目的は、上述のＥＰ−８８９００７号の方法を
、ポリペプチドまたはタンパク質好ましくはｄｅ−Ｂ”
−インスリンまたはインスリンが得られ、所望の生成物
が、容易に精製が可能で精製時のロスが少ない形で得ら
れるように改良することであった。
、ポリペプチドまたはタンパク質好ましくはｄｅ−Ｂ”
−インスリンまたはインスリンが得られ、所望の生成物
が、容易に精製が可能で精製時のロスが少ない形で得ら
れるように改良することであった。
この目的は、本発明により、トリプシン様エンドペプチ
ダーゼを用いて特定の融合タンパク質を切断することに
よって達成された。この特定の融合タンパク質は次式ｌ
で表される。
ダーゼを用いて特定の融合タンパク質を切断することに
よって達成された。この特定の融合タンパク質は次式ｌ
で表される。
Ｒ−Ｌｙｓ−Ｐ−（Ｌｙｓ−Ｒ’）ｍ−（Ｌｙｓ）ｎ
（Ｉ ）式中、Ｒは−（ＡＡ）。−（ペプチド
様σ−アミラーゼインヒビター）（ただし、ＡＡは遺伝
子によりコード可能なＬｙｓ以外のアミノ酸であり、０
は０〜２００、好ましくは５〜１００、とくに１０−１
２の整数であり、ペプチド様α−アミラーゼインヒビタ
ーは文献公知のσ−アミラーゼインヒビターの残基であ
る）を意味し、 Ｐは所望のポリペプチドまたはタンパク質を意味し、 Ｒ宜は−（ＡＡ）Ｉ）−（ただし、ＡＡはＲの場合と同
じ意味で、遺伝子によりコード可能なＬｙｓ以外のアミ
ノ酸であり、ｐは１〜３５、好ましくは１〜１０゜とく
に１〜３の整数である）を意味し、ｍは０またはｌ≧ｎ
を意味する。
（Ｉ ）式中、Ｒは−（ＡＡ）。−（ペプチド
様σ−アミラーゼインヒビター）（ただし、ＡＡは遺伝
子によりコード可能なＬｙｓ以外のアミノ酸であり、０
は０〜２００、好ましくは５〜１００、とくに１０−１
２の整数であり、ペプチド様α−アミラーゼインヒビタ
ーは文献公知のσ−アミラーゼインヒビターの残基であ
る）を意味し、 Ｐは所望のポリペプチドまたはタンパク質を意味し、 Ｒ宜は−（ＡＡ）Ｉ）−（ただし、ＡＡはＲの場合と同
じ意味で、遺伝子によりコード可能なＬｙｓ以外のアミ
ノ酸であり、ｐは１〜３５、好ましくは１〜１０゜とく
に１〜３の整数である）を意味し、ｍは０またはｌ≧ｎ
を意味する。
すなわち、本発明は、トリプシン様エンドペプチダーゼ
を用いる融合タンパク質の酵素的切断によるポリペプチ
ドまたはタンパク質の製造方法において、上記式ＣＩ）
の特異的融合タンパク質を使用する方法である。
を用いる融合タンパク質の酵素的切断によるポリペプチ
ドまたはタンパク質の製造方法において、上記式ＣＩ）
の特異的融合タンパク質を使用する方法である。
この酵素反応で生成するポリペプチドまたはタンパク質
、たとえば好ましくはｄｅ−Ｂ”〜インスリンまたはヒ
トインスリンのようなインスリンは、とくに融合タンパ
ク質中のσ−アミラーゼインヒビター残基のために精製
が容易である。
、たとえば好ましくはｄｅ−Ｂ”〜インスリンまたはヒ
トインスリンのようなインスリンは、とくに融合タンパ
ク質中のσ−アミラーゼインヒビター残基のために精製
が容易である。
この化合物は水性媒体に易溶性で、容易に結晶化し、こ
の性質がまたそれ自体の分離に利用できる。たとえばｄ
ｅ−Ｂ”−インスリンは、ＥＰ−Ｂ８９００７の方法の
反応生成物の場合よりも労力が少なくまたロスも少なく
精製できる。好都合な場合には、反応混合物の後処理は
単に結晶化だけで実施できることもある。すなわち、カ
ラムクロマトグラフィーによる精製を要しない。文献公
知のα−アミラーゼインヒビターの残基が本発明による
反応でトリプシン様エンドペプチダーゼによって切断さ
れないことは驚くべきことである。これらのα−アミラ
ーゼインヒビタ−はそのペプチド鎖内にリジン残基を有
するからである。ここでは、たとえば前述の出発化合物
ｄａ−Ｂ”−インスリンのＡｏ、Ｂｔ′およびＢ■の位
置におけるＬｙｓ残基とは異なり切断が起こらない。
の性質がまたそれ自体の分離に利用できる。たとえばｄ
ｅ−Ｂ”−インスリンは、ＥＰ−Ｂ８９００７の方法の
反応生成物の場合よりも労力が少なくまたロスも少なく
精製できる。好都合な場合には、反応混合物の後処理は
単に結晶化だけで実施できることもある。すなわち、カ
ラムクロマトグラフィーによる精製を要しない。文献公
知のα−アミラーゼインヒビターの残基が本発明による
反応でトリプシン様エンドペプチダーゼによって切断さ
れないことは驚くべきことである。これらのα−アミラ
ーゼインヒビタ−はそのペプチド鎖内にリジン残基を有
するからである。ここでは、たとえば前述の出発化合物
ｄａ−Ｂ”−インスリンのＡｏ、Ｂｔ′およびＢ■の位
置におけるＬｙｓ残基とは異なり切断が起こらない。
この種類の切断が起こるとｄａ−Ｂ”−インスリンから
の分離にかなりの労力を必要とする７ラグメントを生成
することがある。
の分離にかなりの労力を必要とする７ラグメントを生成
することがある。
ＡＡとして適当な遺伝子によりコード可能なアミノ酸（
Ｌｙｓ以外）は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖ
ａｌ、Ｌｅｕ。
Ｌｙｓ以外）は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖ
ａｌ、Ｌｅｕ。
＋１ｅ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｃｙｓ、Ｍ
ｅｔ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｔｙｒ。
ｅｔ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｔｙｒ。
Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｐｒ四、（中性アミノ酸には下線を付
した）である。
した）である。
基Ｐは、ヒト、ブタまたはウシインスリンのＡおよびＢ
ペプチド鎖であることが好ましく、とくにヒトまたはブ
タインスリンのＡおよびＢ鎖であることが好ましい。
ペプチド鎖であることが好ましく、とくにヒトまたはブ
タインスリンのＡおよびＢ鎖であることが好ましい。
基Ｒ２はアミノ酸ＡｌａまたはＴｈｒのみ、とくにＴｈ
ｒのみからなることが好ましい。
ｒのみからなることが好ましい。
基Ｒのとくに好ましい−（ＡＡ）。一部分は、−Ｇｌｙ
−ＡｓｒｒＳａｒ−Ａｓｎ−Ｇ ｌｙ−Ｔｈｒ−Ａｌａ
−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ａｓｎ−−Ｐｈｅ−２で示されるペ
プチド鎖である。
−ＡｓｒｒＳａｒ−Ａｓｎ−Ｇ ｌｙ−Ｔｈｒ−Ａｌａ
−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ａｓｎ−−Ｐｈｅ−２で示されるペ
プチド鎖である。
Ｒ中のペプチド様ａ−アミラーゼインヒビター残基とし
ては、文献公知の、たとえばり。
ては、文献公知の、たとえばり。
Ｖ６ｒｔｅｓＹら： Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ１１
４１ ： ５０５〜５１２（１９８４） ； Ｌ、Ｖ６
ｒｔｅｓｙ ＆ Ｄ、Ｔｒｉｐｉｅｒ ： ＦＥＢＳ
Ｌｅｔｔ、。
４１ ： ５０５〜５１２（１９８４） ； Ｌ、Ｖ６
ｒｔｅｓｙ ＆ Ｄ、Ｔｒｉｐｉｅｒ ： ＦＥＢＳ
Ｌｅｔｔ、。
１８５ ： １８７〜１９０（１９８５） ； Ｏ，Ｈ
ｏｆ ｆ＋ａａｎｎら：Ｂｉｏｌ。
ｏｆ ｆ＋ａａｎｎら：Ｂｉｏｌ。
Ｃｈｅｍ、Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒｓ、３６６ ：
１１６１〜１１６８（１９８５） ；Ｈ，Ｍｕｒａｏら
： Ａｇｒｉｃ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ＋ｍ、、４９ ：
１０７〜ｌｌ。
１１６１〜１１６８（１９８５） ；Ｈ，Ｍｕｒａｏら
： Ａｇｒｉｃ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ＋ｍ、、４９ ：
１０７〜ｌｌ。
（１９８５）および４９ ： ７９３〜７９７（１９８
５） ； Ｈ，Ｇｏｔｏら二日本公開公報７５／ ７７
５９４（１９７３年１１月２０日）に記載されているσ
−アミラーゼインヒビターの事実上すべての残基が適当
である。
５） ； Ｈ，Ｇｏｔｏら二日本公開公報７５／ ７７
５９４（１９７３年１１月２０日）に記載されているσ
−アミラーゼインヒビターの事実上すべての残基が適当
である。
好ましいペプチド様σ−アミラーゼインヒビター残基は
次式で表される。
次式で表される。
とくに好ましい生成物は、式Ｉにおいて、Ｐがヒトまた
はブタインスリンのペプチド配列、Ｒ１がＴｈｒｌＲが
上述のペプチド配列の化合物である。
はブタインスリンのペプチド配列、Ｒ１がＴｈｒｌＲが
上述のペプチド配列の化合物である。
式Ｉの融合タンパク質は、所望のポリペプチドまたはタ
ンパク質のアミノ酸配列の前部に異種タンパク質（σ−
アミラーゼインヒビター）の配列を挿入することにより
、−膜内に公知の方法を用い、微生物内で製造される（
たとえばＦ、Ａ、Ｏ，Ｈａｒｓｔｏｎ：Ｂｉｏｃｈｅｍ
−Ｊ、、２４０ ： １〜１２＋ １９８６参照）。好
ましいプレグロインスリン類縁体、式ＩにおいてＰがヒ
ト、ブタまたはウシインスリンのＡおよびＢペプチド鎖
である融合タンパク質は遺伝子操作により、好ましくは
同時出願の特許出願“ストレプトミセテス中のインスリ
ン前駆体の製造方法” （Ａ ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ
ｔｈｅ ｐｒ−ｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ １
ｎｓｕｌｉｎ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｉｎ Ｓｔｒｅ−
ｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ） （ＨＯＥ８８／Ｆ３１３）
に記載の方法によって製造される。通常、培養培地中に
分泌されるインスリン前駆体は好ましくは醗酵液体のが
液から単離される。式Ｉによって定義された化合物の多
くの性質は上述のσ−アミラーゼインヒビターの挙動と
類似することが明らかにされている。すなわち、上述の
微生物アミラーゼインヒビターの単離および精製に際し
ての多くの工程が、融合タンパク質前駆体とくにインス
リン前駆体を得るために使用できる。
ンパク質のアミノ酸配列の前部に異種タンパク質（σ−
アミラーゼインヒビター）の配列を挿入することにより
、−膜内に公知の方法を用い、微生物内で製造される（
たとえばＦ、Ａ、Ｏ，Ｈａｒｓｔｏｎ：Ｂｉｏｃｈｅｍ
−Ｊ、、２４０ ： １〜１２＋ １９８６参照）。好
ましいプレグロインスリン類縁体、式ＩにおいてＰがヒ
ト、ブタまたはウシインスリンのＡおよびＢペプチド鎖
である融合タンパク質は遺伝子操作により、好ましくは
同時出願の特許出願“ストレプトミセテス中のインスリ
ン前駆体の製造方法” （Ａ ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ
ｔｈｅ ｐｒ−ｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ １
ｎｓｕｌｉｎ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｉｎ Ｓｔｒｅ−
ｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ） （ＨＯＥ８８／Ｆ３１３）
に記載の方法によって製造される。通常、培養培地中に
分泌されるインスリン前駆体は好ましくは醗酵液体のが
液から単離される。式Ｉによって定義された化合物の多
くの性質は上述のσ−アミラーゼインヒビターの挙動と
類似することが明らかにされている。すなわち、上述の
微生物アミラーゼインヒビターの単離および精製に際し
ての多くの工程が、融合タンパク質前駆体とくにインス
リン前駆体を得るために使用できる。
このような精製工程としては、塩たとえば食塩、とくに
硫酸アンモニウム、酸たとえばメタリン酸、タンニン、
トリクロロ酢酸、硫酸等、重金属塩および他の沈澱剤た
とえばポリエチレンイミン、ベントナイト等による沈澱
がある。
硫酸アンモニウム、酸たとえばメタリン酸、タンニン、
トリクロロ酢酸、硫酸等、重金属塩および他の沈澱剤た
とえばポリエチレンイミン、ベントナイト等による沈澱
がある。
遺伝子操作によって得られるタンパク質は望ましくない
溶解性の挙動を示すことが多く、したがって処理が難し
い場合があるが、プレプロインスリン類縁体のような式
■の化合物は澄明な溶液を与え、たとえば、限外濾過に
よってきわめて筒単に濃縮することができ、同時に塩も
除去される。たとえば市販のセルロース膜が限外か過に
適している。
溶解性の挙動を示すことが多く、したがって処理が難し
い場合があるが、プレプロインスリン類縁体のような式
■の化合物は澄明な溶液を与え、たとえば、限外濾過に
よってきわめて筒単に濃縮することができ、同時に塩も
除去される。たとえば市販のセルロース膜が限外か過に
適している。
同様に、式Ｉの化合物の前駆体たとえばインスリン前駆
体の濃縮および精製には吸着性樹脂を使用することもで
きる。ポリスチレンまたはスチレン／ジビニルベンゼン
共重合体ヲペースとした吸着性樹脂は、とくにＡｍｂｅ
ｒｌｉｔｅ＠ＸＡＤ（Ｒｏｈ＋ｍ ＆ Ｈａａｓ、 Ｕ
ＳＡ）、Ｄｉａｉｏｎ＠ＨＰ−２０（Ｍｉｔｓｕ−ｂｉ
ｓｈｉ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ、）の商品名で市
販されていて、購入できる。
体の濃縮および精製には吸着性樹脂を使用することもで
きる。ポリスチレンまたはスチレン／ジビニルベンゼン
共重合体ヲペースとした吸着性樹脂は、とくにＡｍｂｅ
ｒｌｉｔｅ＠ＸＡＤ（Ｒｏｈ＋ｍ ＆ Ｈａａｓ、 Ｕ
ＳＡ）、Ｄｉａｉｏｎ＠ＨＰ−２０（Ｍｉｔｓｕ−ｂｉ
ｓｈｉ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ、）の商品名で市
販されていて、購入できる。
たとえばＤｉａｉｏｎ ＨＰ−２０のような吸着性樹脂
を用いるタンパク質の単離はすでにドイツ公開特許３０
３８１３０に記載されている。しかしながら、遺伝子操
作によって得られたタンパク質、たとえばインスリン前
駆体の吸着性樹脂を用いる濃縮は不可能であるかまたは
著しくロスが太きかった。これは、とくに、支持体に対
する所望の物質の吸着が強すぎることによった。これら
の吸着樹脂も、材料の結合性を緩和にし、減らすことを
配慮すれば驚くべきことに有利に使用できることが明ら
かにされた。この不活性化は、たとえば支持体の処理お
よび／または分離すべき材料への適当な添加剤によって
達成できる。
を用いるタンパク質の単離はすでにドイツ公開特許３０
３８１３０に記載されている。しかしながら、遺伝子操
作によって得られたタンパク質、たとえばインスリン前
駆体の吸着性樹脂を用いる濃縮は不可能であるかまたは
著しくロスが太きかった。これは、とくに、支持体に対
する所望の物質の吸着が強すぎることによった。これら
の吸着樹脂も、材料の結合性を緩和にし、減らすことを
配慮すれば驚くべきことに有利に使用できることが明ら
かにされた。この不活性化は、たとえば支持体の処理お
よび／または分離すべき材料への適当な添加剤によって
達成できる。
支持体の処理としては水性有機溶媒（２〜７０％好まし
くは５〜３０％の溶媒含有）による洗浄を挙げることが
できる。適当な溶媒は水混和性溶媒であり、低級アルコ
ールおよびアセトンが好ましい、また、支持体の前処理
を界面活性剤水溶液、たとえば０．０２〜３％濃度、好
ましくは０．１−１％濃度のＴｒｉｔｏｎ＠ Ｘ−１０
０溶液による洗浄によって行うこともできる。多数の他
の界面活性剤ももちろん同様に適している。
くは５〜３０％の溶媒含有）による洗浄を挙げることが
できる。適当な溶媒は水混和性溶媒であり、低級アルコ
ールおよびアセトンが好ましい、また、支持体の前処理
を界面活性剤水溶液、たとえば０．０２〜３％濃度、好
ましくは０．１−１％濃度のＴｒｉｔｏｎ＠ Ｘ−１０
０溶液による洗浄によって行うこともできる。多数の他
の界面活性剤ももちろん同様に適している。
分離すべき材料の溶液および／または溶出液への適当な
添加剤の添加も同様に適当である。
添加剤の添加も同様に適当である。
この種類の添加剤は、いずれも上述した濃度の低級水混
和性有機溶媒および界面活性剤、またはいわゆるカオト
ロピック物質、たとえばとくに過塩素酸カリウム（０，
１〜３％）、尿素（１〜８モル）もしくはグアニジン塩
酸塩である。
和性有機溶媒および界面活性剤、またはいわゆるカオト
ロピック物質、たとえばとくに過塩素酸カリウム（０，
１〜３％）、尿素（１〜８モル）もしくはグアニジン塩
酸塩である。
必要に応じて濃縮し、塩を除去した融合タンパク質前駆
体（たとえばインスリン前駆体）は、陽イオン交換樹脂
または陰イオン交換樹脂上イオン交換クロマトグラフィ
ーによってさらに精製することもできる。適当な陽イオ
ン交換樹脂の例には、５Ｐ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ＠（Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ、Ｓｗｅｄｅｎ）、ＣＭ−セルロース、
Ｓ−５ｅｐｈａｒｏｓｅ■（Ｐｈａｒ＋ｍａｃ ｆａ
。
体（たとえばインスリン前駆体）は、陽イオン交換樹脂
または陰イオン交換樹脂上イオン交換クロマトグラフィ
ーによってさらに精製することもできる。適当な陽イオ
ン交換樹脂の例には、５Ｐ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ＠（Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ、Ｓｗｅｄｅｎ）、ＣＭ−セルロース、
Ｓ−５ｅｐｈａｒｏｓｅ■（Ｐｈａｒ＋ｍａｃ ｆａ
。
５ｖｅｄｅｎ）、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ＠ＴＳＫ ＣＭ
（Ｅ、Ｍｅｒｃｋ、Ｄａｒ＋ｍ５−ｔａｄｔ）、Ｆｒａ
ｃｔｏｇｅｌ＠ＴＳＫ ５Ｐ（Ｅ、Ｍｅｒｃｋ、Ｄａｒ
＋１ｓＬａｄｔ）等がある。適当な陰イオン交換樹脂の
例には、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ＠ ＴＳＫ ＤＥＡＥ （
Ｅ、Ｍｅｒｃｋ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ）、ＤＥＡＥ−セ
ルロース、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ＠ （Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ。
（Ｅ、Ｍｅｒｃｋ、Ｄａｒ＋ｍ５−ｔａｄｔ）、Ｆｒａ
ｃｔｏｇｅｌ＠ＴＳＫ ５Ｐ（Ｅ、Ｍｅｒｃｋ、Ｄａｒ
＋１ｓＬａｄｔ）等がある。適当な陰イオン交換樹脂の
例には、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ＠ ＴＳＫ ＤＥＡＥ （
Ｅ、Ｍｅｒｃｋ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ）、ＤＥＡＥ−セ
ルロース、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ＠ （Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ。
Ｓｗｅｄｅｎ）、Ｑ−５ｅｐｈａｒｏｓｅ、ＱＡＥ−５
ｅｐｂａｄｅｘ、 ＱＡＥ−セルロース等がある。分離
はそれ自体公知の方法により水溶液中で行われる。しか
しながら、場合によっては、水に可溶化剤および／また
はカオトロピック物質を添加すると分離に有利なことが
明らかにされている。この種類の添加剤は２〜８モルの
尿素、ベタイン、低級アルコールたとえばメタノール、
インプロパツール、エタノール、エチレンゲルコール等
でアル。サラに、適当な精製操作としては、たとえばフ
ェニル−５ｅｐｈａｒｏｓｅ上疎水性クロマトグラフイ
ー、たとえばＢｉｏｇｅｌを使用するモルキュラーシー
ブクロマトグラフイー、調製高圧液体クロマトグラフィ
ーまたはａ−アミラーゼインヒビターに対する抗体を負
荷したカラム上でのクロマトグラフィーがある。
ｅｐｂａｄｅｘ、 ＱＡＥ−セルロース等がある。分離
はそれ自体公知の方法により水溶液中で行われる。しか
しながら、場合によっては、水に可溶化剤および／また
はカオトロピック物質を添加すると分離に有利なことが
明らかにされている。この種類の添加剤は２〜８モルの
尿素、ベタイン、低級アルコールたとえばメタノール、
インプロパツール、エタノール、エチレンゲルコール等
でアル。サラに、適当な精製操作としては、たとえばフ
ェニル−５ｅｐｈａｒｏｓｅ上疎水性クロマトグラフイ
ー、たとえばＢｉｏｇｅｌを使用するモルキュラーシー
ブクロマトグラフイー、調製高圧液体クロマトグラフィ
ーまたはａ−アミラーゼインヒビターに対する抗体を負
荷したカラム上でのクロマトグラフィーがある。
Ｃ−アミラーゼインヒビターの性質と類似するインスリ
ン前駆体の性質により、結晶化による精製も可能である
。特定の等電点付近でまた酸性媒体中、所望により添加
剤たとえば食塩等、を用いて、いずれの結晶化も可能で
ある。結晶化促進剤たとえばＺｎ”、Ｃｕ”等のような
重金属イオン、またはピクリン酸等を添加して水溶液か
ら結晶化することもできる。
ン前駆体の性質により、結晶化による精製も可能である
。特定の等電点付近でまた酸性媒体中、所望により添加
剤たとえば食塩等、を用いて、いずれの結晶化も可能で
ある。結晶化促進剤たとえばＺｎ”、Ｃｕ”等のような
重金属イオン、またはピクリン酸等を添加して水溶液か
ら結晶化することもできる。
さらに、式Ｉのタンパク質またはその切断生成物のσ−
アミラーゼ阻害活性を精製に利用することもきわめて有
利である。これは、遺伝子操作によって得られ、インヒ
ビターのアミノ酸配列をもつタンパク質が、複合体の生
成によってσ−アミラーゼを同様に阻害することが明ら
かにされたからである。インヒビター／α−アミラーゼ
複合体は出発成分よりも溶解性が低く、したがって分離
に使用できる。支持体にアミラーゼを固定化して用い、
ついで生成した複合体をｐＨや塩勾配のような適当な試
剤を使用して、式１の化合物を培養液のか液から選択的
に分離することもできる。この種類の操作はまた、式■
の化合物のタンパク分解加水分解物の後処理にも有利で
ある。この場合は、もはや必要ではないインヒビターの
切断生成物を固定化ａ−アミラーゼを用いて反応混合物
から除去する。残った生成物（式Ｉの化合物、とくにｄ
ｅ−Ｂ”−ヒトインスリン）はすでに十分純粋で、つい
でそのまま結晶化に付される。結晶化はそれ自体公知の
方法によって行われる。
アミラーゼ阻害活性を精製に利用することもきわめて有
利である。これは、遺伝子操作によって得られ、インヒ
ビターのアミノ酸配列をもつタンパク質が、複合体の生
成によってσ−アミラーゼを同様に阻害することが明ら
かにされたからである。インヒビター／α−アミラーゼ
複合体は出発成分よりも溶解性が低く、したがって分離
に使用できる。支持体にアミラーゼを固定化して用い、
ついで生成した複合体をｐＨや塩勾配のような適当な試
剤を使用して、式１の化合物を培養液のか液から選択的
に分離することもできる。この種類の操作はまた、式■
の化合物のタンパク分解加水分解物の後処理にも有利で
ある。この場合は、もはや必要ではないインヒビターの
切断生成物を固定化ａ−アミラーゼを用いて反応混合物
から除去する。残った生成物（式Ｉの化合物、とくにｄ
ｅ−Ｂ”−ヒトインスリン）はすでに十分純粋で、つい
でそのまま結晶化に付される。結晶化はそれ自体公知の
方法によって行われる。
式Ｉに相当する化合物の酵素的切断には、精製された前
駆体を使用するが、部分精製しただけの出発原料を使用
することも可能である。
駆体を使用するが、部分精製しただけの出発原料を使用
することも可能である。
反応混合物中における式Ｉの出発原料の濃度は比較的広
範囲に変動させることができる。好ましい濃度は総反応
混合物に対して約０．０２〜１５重量％、とくに約０．
０５〜５重量％である。
範囲に変動させることができる。好ましい濃度は総反応
混合物に対して約０．０２〜１５重量％、とくに約０．
０５〜５重量％である。
適当なトリプシン様エンドペプチダーゼは、トリプシン
様として、すなわちペプチド結合を塩基性アミノ酸のカ
ルボキシル末端で選択的に切断する酵素として文献公知
のエンドペプチダーゼである。一部の適当な引例は上述
のＥＰ−Ｂ８９００７に示されている。またリジンの後
部で選択的に切断する例については、たとえばＥＰ−Ａ
０９２８２９およびＵＳ−Ａ４，４１４，３３２が参考
になる。好マシいトリズシン様エンドペプチダーゼは、
ペプチド結合を塩基性アミノ酸リジンのカルボキシル末
端で特異的に切断するＬｙｓｏｂａｃｔｅｒ ａｎｚｙ
−ｍｏｇｅｎｅｓからのリジルエンドペプチダーゼであ
る。リジルエンドペプチダーゼについての関連文献とし
ては、たとえばＰ、Ａ、Ｊｅｃｋａｌら：Ａｎａｌ。
様として、すなわちペプチド結合を塩基性アミノ酸のカ
ルボキシル末端で選択的に切断する酵素として文献公知
のエンドペプチダーゼである。一部の適当な引例は上述
のＥＰ−Ｂ８９００７に示されている。またリジンの後
部で選択的に切断する例については、たとえばＥＰ−Ａ
０９２８２９およびＵＳ−Ａ４，４１４，３３２が参考
になる。好マシいトリズシン様エンドペプチダーゼは、
ペプチド結合を塩基性アミノ酸リジンのカルボキシル末
端で特異的に切断するＬｙｓｏｂａｃｔｅｒ ａｎｚｙ
−ｍｏｇｅｎｅｓからのリジルエンドペプチダーゼであ
る。リジルエンドペプチダーゼについての関連文献とし
ては、たとえばＰ、Ａ、Ｊｅｃｋａｌら：Ａｎａｌ。
Ｂｉｏｃｈｅｍ、、 １３４ ： ３４７〜３５４（１
９８３）およびＴ、Ｍａｓａｋｉら： Ｂｉｏｃｈｅｍ
、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｋａｄ、、６６０ ： ４４ｆ〜
５１ｆ（１９８１）がある。
９８３）およびＴ、Ｍａｓａｋｉら： Ｂｉｏｃｈｅｍ
、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｋａｄ、、６６０ ： ４４ｆ〜
５１ｆ（１９８１）がある。
反応混合物のトリズシン様エンドペプチダーゼの濃度は
、式Ｉの融合タンパク質の重量に対して約１１５０〜１
／１０，０００、好ましくは０．５〜１．５％（ｗ／ｖ
）、とくに約１／１．０００に適宜調整する。
、式Ｉの融合タンパク質の重量に対して約１１５０〜１
／１０，０００、好ましくは０．５〜１．５％（ｗ／ｖ
）、とくに約１／１．０００に適宜調整する。
式Ｉの化合物の酵素的切断は水溶液中、所望により可溶
化剤（たとえば尿素、イソプロパツール等のような）の
存在下、約５〜１１（７）ｐＨ，好ましくは約７．５〜
９．５のｐＨで行われる。慣用の緩衝系、Ｉ；とえばリ
ン酸緩衝剤、Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ２、Ｎａ！ｃｏｓ／ Ｎ
ａＨＣＯ，のひとつを、一定のｐＨに調整し、それを維
持するために適宜使用する。
化剤（たとえば尿素、イソプロパツール等のような）の
存在下、約５〜１１（７）ｐＨ，好ましくは約７．５〜
９．５のｐＨで行われる。慣用の緩衝系、Ｉ；とえばリ
ン酸緩衝剤、Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ２、Ｎａ！ｃｏｓ／ Ｎ
ａＨＣＯ，のひとつを、一定のｐＨに調整し、それを維
持するために適宜使用する。
酵素的切断の温度は約１〜６０℃とすることができる。
約１５〜４０℃の温度が好ましい。
切断は一般的に約０．１〜２時間で完結するが、特定の
反応条件に応じて所要時間は短縮または延長される。
反応条件に応じて所要時間は短縮または延長される。
酵素的切断の完結はたとえばクロマトグラフィーによっ
て証明できる。切断完結後、さらに望ましくない切断が
起こることを、公知の方法で反応媒体を変化させること
によりたとえばｐＨの変更、冷却、阻害剤の添加等によ
って停止させ、生成しｆ：ｄｅ−Ｂ”−インスリンをそ
れ自体公知の方法で単離する。単離は、公知の関連方法
の場合と同様にクロマトグラフィーで実施することもで
きるが、本発明の場合には、ｄｅ−Ｂ”・−インスリン
が副生成物と鎖長したがって分子量の点でかなり異なる
ことから、原理的に結晶化による単離も可能である。
て証明できる。切断完結後、さらに望ましくない切断が
起こることを、公知の方法で反応媒体を変化させること
によりたとえばｐＨの変更、冷却、阻害剤の添加等によ
って停止させ、生成しｆ：ｄｅ−Ｂ”−インスリンをそ
れ自体公知の方法で単離する。単離は、公知の関連方法
の場合と同様にクロマトグラフィーで実施することもで
きるが、本発明の場合には、ｄｅ−Ｂ”・−インスリン
が副生成物と鎖長したがって分子量の点でかなり異なる
ことから、原理的に結晶化による単離も可能である。
「ペプチド転移反応」は、あらゆる混合比の好ましくは
ｌ：４〜１：ｌ （溶媒：水）の水／有機溶媒溶液（た
とえば水： ＤＭＦ、水： ＤＭＳＯ）中で行われる。
ｌ：４〜１：ｌ （溶媒：水）の水／有機溶媒溶液（た
とえば水： ＤＭＦ、水： ＤＭＳＯ）中で行われる。
ｐＨは４〜８でなければならない。
好ましくは５〜６である。温度は１〜５０℃、好ましく
は１５〜３０℃である。
は１５〜３０℃である。
酵素的「ペプチド転移反応」の完結後（たとえばＨＰＬ
Ｃによって証明できる）、たとえばｄｅ−Ｂ３＠−イン
スリンへの逆反応が起こる可能性を防止するため、イン
ヒビターたとえばアプロチニン、ブチルアミンまたはト
シル−Ｌ−リジンクロロメチルケトンのような阻害剤を
添加する。
Ｃによって証明できる）、たとえばｄｅ−Ｂ３＠−イン
スリンへの逆反応が起こる可能性を防止するため、イン
ヒビターたとえばアプロチニン、ブチルアミンまたはト
シル−Ｌ−リジンクロロメチルケトンのような阻害剤を
添加する。
ついで調製カラムクロマトグラフィーによって容易に、
希釈、精製すること、すなわち未反応出発原料から分離
することも可能である。この場合は同様に結晶化も可能
である。保護基の除去は文献公知の方法で実施できる。
希釈、精製すること、すなわち未反応出発原料から分離
することも可能である。この場合は同様に結晶化も可能
である。保護基の除去は文献公知の方法で実施できる。
本発明の方法を以下の実施例によりさらに詳細に説明す
る。本発明の実施例に続き、さらに、ＥＰ−Ｂ８９００
７における一般式のプレプロインスリン類縁体を、リジ
ルエンドペプチダーゼを用いて酵素的に切断した場合に
は、後処理が困難でロスの大きい反応生成物が得られる
ことを示す比較例を掲げる。
る。本発明の実施例に続き、さらに、ＥＰ−Ｂ８９００
７における一般式のプレプロインスリン類縁体を、リジ
ルエンドペプチダーゼを用いて酵素的に切断した場合に
は、後処理が困難でロスの大きい反応生成物が得られる
ことを示す比較例を掲げる。
実施例 ｌ
構築体ｐＧＦ２を得るために醗酵を行った培養培地３０
Ｑを遠心分離し、ついで再び滅菌濾過した。
Ｑを遠心分離し、ついで再び滅菌濾過した。
溶液のｐＨを７．２に調整し、インプロパツール３ａを
加えたのち、予め１０％濃度のインプロパツールで洗浄
したＤｉａｉｏｎ＠ ＨＰ−２０（４Ｑ）のカラム上に
負荷する。新たに構築されＩ；タンパク質ｐＧＦ２を、
１０〜５０％濃度のインプロパツール勾配を適用するこ
とによってカラムから溶出させる。所望の生成物を含む
分画をついで直接、調製ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
＠ （Ｐｈａｒｍａｃ ｉａ 、 Ｓｗｅｄｅｎ）高
速カラム、ｐＨ７，２，３００嘗ａに負荷し、リン酸緩
衝液で洗浄し、最後に０〜０．５モル食塩勾配ｓ ｐＨ
７−２で溶出する。
加えたのち、予め１０％濃度のインプロパツールで洗浄
したＤｉａｉｏｎ＠ ＨＰ−２０（４Ｑ）のカラム上に
負荷する。新たに構築されＩ；タンパク質ｐＧＦ２を、
１０〜５０％濃度のインプロパツール勾配を適用するこ
とによってカラムから溶出させる。所望の生成物を含む
分画をついで直接、調製ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
＠ （Ｐｈａｒｍａｃ ｉａ 、 Ｓｗｅｄｅｎ）高
速カラム、ｐＨ７，２，３００嘗ａに負荷し、リン酸緩
衝液で洗浄し、最後に０〜０．５モル食塩勾配ｓ ｐＨ
７−２で溶出する。
タンパク質ｐＧＦ２は溶液の伝導度２０〜３０ｍ５の分
画に見出される。この分画を合し、硫酸アンモニウム（
３５％飽和）で沈殿させる。生成した沈殿を１６時間後
に遠心分離で除き、水に溶解し、ｐＨ４，６に調整して
再沈殿させ、この場合はわずかに２時間に遠心分離して
沈殿を集める。これはすでに著しく濃縮されたタンパク
質ｐＧＦ２を含有する＠最終の精製はＭａｃｒｏｂｏｒ
ｅ Ｎｕｃ１ｅｏｓｉｌ＠（Ｍａｃｈｅｒａｙ ａｎｄ
Ｎａｇｅｌ、Ｄ（ｌｒｅｎ）１２０−１０ｃ４上、カ
ラム容量１００ｔＱで１００１１９のｐＧＦ２が分離さ
れるようにカラムの大きさを選んで実施する。製造ＨＰ
ＬＣカラムは同様に、０．１）リフルオロ酢酸／アセト
ニトリル系を用いて展開する。融合タンパク質は３３％
濃度のアセトニトリルで溶出される。真空中で乾燥する
と固体物質が得られる。
画に見出される。この分画を合し、硫酸アンモニウム（
３５％飽和）で沈殿させる。生成した沈殿を１６時間後
に遠心分離で除き、水に溶解し、ｐＨ４，６に調整して
再沈殿させ、この場合はわずかに２時間に遠心分離して
沈殿を集める。これはすでに著しく濃縮されたタンパク
質ｐＧＦ２を含有する＠最終の精製はＭａｃｒｏｂｏｒ
ｅ Ｎｕｃ１ｅｏｓｉｌ＠（Ｍａｃｈｅｒａｙ ａｎｄ
Ｎａｇｅｌ、Ｄ（ｌｒｅｎ）１２０−１０ｃ４上、カ
ラム容量１００ｔＱで１００１１９のｐＧＦ２が分離さ
れるようにカラムの大きさを選んで実施する。製造ＨＰ
ＬＣカラムは同様に、０．１）リフルオロ酢酸／アセト
ニトリル系を用いて展開する。融合タンパク質は３３％
濃度のアセトニトリルで溶出される。真空中で乾燥する
と固体物質が得られる。
実施例 ２
実施例１のようにして得られた融合タンパク質１０１１
９を酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５，３，０−４＊（１
およびＤＭＦｏ、１ｍｆｆに溶解する。これに１４０１
１ｇのＴｈｒ（Ｂｕ’）ＯＢｕｔ＃よび５０ＩＩＩ２の
リジルエンドペプチダーゼ（２，７ｍｇ／ ｍ、（１、
水に溶解）を加える。コノ混合物を室温に放置する。反
応はＨＰＬＣ分析（実施例３の場合のような系）で追跡
する。
９を酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５，３，０−４＊（１
およびＤＭＦｏ、１ｍｆｆに溶解する。これに１４０１
１ｇのＴｈｒ（Ｂｕ’）ＯＢｕｔ＃よび５０ＩＩＩ２の
リジルエンドペプチダーゼ（２，７ｍｇ／ ｍ、（１、
水に溶解）を加える。コノ混合物を室温に放置する。反
応はＨＰＬＣ分析（実施例３の場合のような系）で追跡
する。
様々な時間経過後にサンプルを採取し、２倍容のメタノ
ールとｌＯ０倍容メチルｔ−ブチルエーテルを用いて沈
殿させる。沈殿をｌθ０倍容０．１％濃度トリフルオロ
酢酸に取り、ＨＰＬＣで分析する。４０時間後に約５５
％のヒトインスリンエステルが生成した。残部は主とし
てｄｅ−Ｂ”−インスリンである。
ールとｌＯ０倍容メチルｔ−ブチルエーテルを用いて沈
殿させる。沈殿をｌθ０倍容０．１％濃度トリフルオロ
酢酸に取り、ＨＰＬＣで分析する。４０時間後に約５５
％のヒトインスリンエステルが生成した。残部は主とし
てｄｅ−Ｂ”−インスリンである。
実施例 ３
実施例１におけるようにして得られた沈澱を最小量の０
．１％濃度トリフルオロ酢酸に取り、製造ＨＰＬＣに付
す。使用した固定相は、大きさ４．６Ｘ１５０ｔａのＢ
ａｋｅｒｂｏｎｄ Ｗｉｄｅ−Ｐｏｒｅ”Ｃｍ／ Ｆｌ
ｕである。移動相は次の組成とする。
．１％濃度トリフルオロ酢酸に取り、製造ＨＰＬＣに付
す。使用した固定相は、大きさ４．６Ｘ１５０ｔａのＢ
ａｋｅｒｂｏｎｄ Ｗｉｄｅ−Ｐｏｒｅ”Ｃｍ／ Ｆｌ
ｕである。移動相は次の組成とする。
Ａ ： ０．１％ＴＦＡ
Ｂ ： Ａ／ＣＨ３ＣＮ １０／９０
流速は１．３ｍＱ／分である。勾配は以下の組成とする
。
。
ｔ ％Ｂ
ｄｅ−Ｂ”−インスリンは１５−１４分に溶出し、イン
スリンエステルは２０．９２分に溶出する。溶媒を分画
から真空中で除去し、ついで固体をアセトニトリルで洗
浄し、溶媒を真空中で除去する。
スリンエステルは２０．９２分に溶出する。溶媒を分画
から真空中で除去し、ついで固体をアセトニトリルで洗
浄し、溶媒を真空中で除去する。
実施例 ４
タンパク質ｐＧＦ２．１００ｍｇをＴｒｉｓ／ ＨＣ４
緩衝液、ｐＨ８、ｌｏｍＱｌ：溶解し、５Ｑ＋Ｕ（７）
リジルエンドペプチダーゼとともにインキュベートする
。２．５時間後に混合物をトリプルオロ酢酸でｐＨ３の
酸性にして反応を停止し、反応混合物を逆相分画化に付
す。３０％濃度のアセトニトリルで溶出する鋭いピーク
がカラム溶出液中のＢ３＠〜ｄｅ−Ｔｈｒヒトインシュ
リンの出現を示す。溶媒を除去した生成物の重量は３５
讃９で、理論量の９５％に相当した。
緩衝液、ｐＨ８、ｌｏｍＱｌ：溶解し、５Ｑ＋Ｕ（７）
リジルエンドペプチダーゼとともにインキュベートする
。２．５時間後に混合物をトリプルオロ酢酸でｐＨ３の
酸性にして反応を停止し、反応混合物を逆相分画化に付
す。３０％濃度のアセトニトリルで溶出する鋭いピーク
がカラム溶出液中のＢ３＠〜ｄｅ−Ｔｈｒヒトインシュ
リンの出現を示す。溶媒を除去した生成物の重量は３５
讃９で、理論量の９５％に相当した。
実施例 ５
ブタ膵臓からのａ−アミラーゼ９０肩９を３５ｍｇの０
．５Ｍリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７，８に溶解し、同
じ緩衝液に対して透析する。
．５Ｍリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７，８に溶解し、同
じ緩衝液に対して透析する。
５０ｇのＡｆｆｉｇｓｌ＠ １０（ＢｉｏＲａｄ １５
３−６０４６）を製造業者の指示に従って洗浄し、０．
５Ｍリン酸カリウム緩衝液（上述）で平衡化する。この
方法で得られた湿潤ゲルを、酵素溶液と室温で２時間積
やかに振盪して反応させる。ついで吸引濾過し、結合緩
衝液で手短かに洗浄する。次に支持体を０．１Ｍエタノ
ールアミン、ｐＨ８，０で、０．５時間不活性化し、最
後に再び吸引して炉遇し、数回ＩＭＮａＯｆｆおよび結
合緩衝液で交互に洗浄する。湿潤ゲル約４４ｇが得られ
、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液中０．０２％アジド下
、４℃で保存する。
３−６０４６）を製造業者の指示に従って洗浄し、０．
５Ｍリン酸カリウム緩衝液（上述）で平衡化する。この
方法で得られた湿潤ゲルを、酵素溶液と室温で２時間積
やかに振盪して反応させる。ついで吸引濾過し、結合緩
衝液で手短かに洗浄する。次に支持体を０．１Ｍエタノ
ールアミン、ｐＨ８，０で、０．５時間不活性化し、最
後に再び吸引して炉遇し、数回ＩＭＮａＯｆｆおよび結
合緩衝液で交互に洗浄する。湿潤ゲル約４４ｇが得られ
、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液中０．０２％アジド下
、４℃で保存する。
得られる結合平衡は次のとおりである。
初 期 １００４単位−１００％合した洗
浄水 ７０５単位−７０％ 支持体 １８１単位−１８％ 分析方法： Ｂｅｈｒｉｎｇ″Ｔｅｓｔｏｍａｒ”アッ
セイキット、操作は製造業者の指示に従う 実施例 ６ ４４ｇを、水２００１２中、プロテアーゼインヒビター
を添加して、実施例４のようにして分解し、精製しない
ままのＶｐＧＦ２１０１Ａｇと撹拌する。！へ時間後に
混合物を吸引濾過し、澄明な液相を凍結乾燥する。得ら
れた無色の生成物５ｍ＋９を少量の水に取り、ｚｎ″″
を加えて結晶ｄｏ−Ｂ”−インスリンを生成させる。
浄水 ７０５単位−７０％ 支持体 １８１単位−１８％ 分析方法： Ｂｅｈｒｉｎｇ″Ｔｅｓｔｏｍａｒ”アッ
セイキット、操作は製造業者の指示に従う 実施例 ６ ４４ｇを、水２００１２中、プロテアーゼインヒビター
を添加して、実施例４のようにして分解し、精製しない
ままのＶｐＧＦ２１０１Ａｇと撹拌する。！へ時間後に
混合物を吸引濾過し、澄明な液相を凍結乾燥する。得ら
れた無色の生成物５ｍ＋９を少量の水に取り、ｚｎ″″
を加えて結晶ｄｏ−Ｂ”−インスリンを生成させる。
特許出願人 ヘキスト・アクチェンゲゼルシャフト外
２名
２名
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １）式 I Ｒ−Ｌｙｓ−Ｐ−（Ｌｙｓ−Ｒ＾２）＿ｍ−（Ｌｙｓ）
＿ｎ（ I ）〔式中、Ｒは−（ＡＡ）＿ｏ−（ペプチド
様α−アミラーゼインヒビター）（ただし、ＡＡは遺伝
子によりコード可能なＬｙｓ以外のアミノ酸であり、ｏ
は０〜２００、好ましくは５〜１００、とくに１０〜１
２の整数であり、ペプチド様α−アミラーゼインヒビタ
ーは文献公知のα−アミラーゼインヒビターの残基であ
る）を意味し、Ｐは所望のポリペプチドまたはタンパク
質 を意味し、 Ｒ＾２は−（ＡＡ）＿ｐ−（ただし、ＡＡはＲの場合と
同じ意味で、遺伝子によりコード可能なＬｙｓ以外のア
ミノ酸であり、ｐは１〜３５、好ましくは１〜１０、と
くに１〜３の整数である）を意味し、 ｍは０または１≧ｎを意味する〕 で示される化合物を融合タンパク質として使用すること
を特徴とするトリプシン様エンドペプチダーゼを用いる
融合タンパク質の酵素的切断によるポリペプチドまたは
タンパク質の製造方法。 ２）式 I においてＲ＾１がＡｌａまたはＴｈｒのみか
ら、とくにＴｈｒのみから構成され、ｍおよびｎはそれ
ぞれ１を意味する化合物を融合タンパク質として使用す
る請求項１記載の方法。 ３）式 I においてＲが式 ▲数式、化学式、表等があります▼ で示される化合物を融合タンパク質として使用する請求
項１または２記載の方法。 ４）式 I の融合タンパク質は全反応混合物に対して約
０．０２〜１５重量％、好ましくは約０．５〜５重量％
の濃度で使用される請求項１〜３の１または２以上に記
載の方法。 ５）リジルエンドペプチダーゼをトリプシン様エンドペ
プチダーゼとして使用する請求項１〜４の１または２以
上に記載の方法。 ６）トリプシン様エンドペプチダーゼは式（ I ）の融
合タンパク質の重量の約１／５０〜１／１０，０００の
濃度で使用する請求項１〜５の１または２以上に記載の
方法。 ７）酵素的切断は必要に応じて安定剤の存在下、ｐＨ５
〜１１好ましくは約７〜９．５の水性溶液中で実施する
請求項１〜６の１または２以上に記載の方法。 ８）反応混合物は酵素的切断の完了後、結晶化によって
後処理する請求項１〜７の１または２以上に記載の方法
。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3837271.1 | 1988-11-03 | ||
| DE3837271A DE3837271A1 (de) | 1988-11-03 | 1988-11-03 | Verfahren zur selektiven spaltung von fusionsproteinen |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02195896A true JPH02195896A (ja) | 1990-08-02 |
| JP2877253B2 JP2877253B2 (ja) | 1999-03-31 |
Family
ID=6366365
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1285089A Expired - Lifetime JP2877253B2 (ja) | 1988-11-03 | 1989-11-02 | 融合タンパク質の選択的切断方法 |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
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| JP (1) | JP2877253B2 (ja) |
| KR (1) | KR900007865A (ja) |
| AT (1) | ATE139538T1 (ja) |
| AU (1) | AU618420B2 (ja) |
| DE (2) | DE3837271A1 (ja) |
| DK (1) | DK546689A (ja) |
| ES (1) | ES2088883T3 (ja) |
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| HU (1) | HUT53677A (ja) |
| IL (1) | IL92179A0 (ja) |
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| NZ (1) | NZ231221A (ja) |
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1996
- 1996-06-20 GR GR960401606T patent/GR3020297T3/el unknown
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