MXPA01011057A - Polipeptidos con aminopeptidasa de aeromonas. - Google Patents

Abstract

La invencion describe un metodo para eliminar residuos de alanina N-terminal de polipeptidos, de preferencia proteinas recombinantes, utilizando un derivado de aminopeptidasa de la bacteria marina Aeromonas profeolytica; en consecuencia, la aminopeptidasa de Aeromonas (AAP; E.C. 3.4.11.10) puede utilizarse para eliminar residuos de alanil N-terminal de derivados de somatotropina humana (hST, hormona de crecimiento humano o hGH), somatotropina porcina (pST) y somatotropina bovina (bST), por ejemplo, para producir proteinas que tiene secuencias de aminoacidos nativos; las reacciones enzimaticas pueden llevarse a cabo en solucion libre o la AAP puede inmovilizarse en un soporte solido para reacciones que se llevan a cabo in vitro; un metodo eficiente para convertir Ala-hGH a hGH, por ejemplo, comprende la expresion de Ala-hGH en E. coli, la recuperacion de cuerpos de inclusion, solubilizacion y repliegue en detergente, eliminacion de detergente por ultrafiltracion, precipitacion selectiva, separacion enzimatica, seguida de dos pasos de cromatografia de columna.

Description

MÉTODO PARA ELIMINAR RESIDUOS DE ALANINA N-TERMINAL A PARTIR DE POLIPEPTIDOS CON AMINOPEPTIDASA DE AEROMONAS PRIORIDAD La presente solicitud reclama prioridad bajo el Título 35, Código de Estados Unidos, § 119 de la Solicitud Provisional de Estados Unidos Serie No. 60/132,062, emitida el 30 de abril de 1999.

CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención describe un método para eliminar residuos de alanina N-terminal de polipéptidos, de preferencia proteínas recombinantes, utilizando una aminopeptidasa derivada de la bacteria marina Aeromonas proteolytica. En consecuencia, la aminopeptidasa de Aeromonas (AAP; E.C. 3.4.11.10) puede utilizarse para eliminar residuos de alanina N-terminal de derivados de somatotropina humana (hST, hormona de crecimiento humano, o hGH), somatotropina porcina (pST), y somatotropina bovina (bST), por ejemplo, para producir proteínas que tienen secuencias de aminoácidos nativos. Las reacciones enzimáticas pueden llevarse a cabo en solución libre, o la AAP puede Inmovilizarse en un soporte sólido, para reacciones llevadas a cabo in vitro. Un método eficiente para convertir Ala-hGH a hGH, por ejemplo, comprende la expresión de Ala-hGH en E. coli, la recuperación de cuerpos de inclusión, solubilización y repliegue en detergente, detergente eliminado por ultrafiltración, precipitación selectiva, separación enzimática, seguida por dos pasos de cromatografía de columna.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las proteínas recombinantes que simulan o tienen la misma estructura como las proteínas nativas son altamente deseadas para utilizarse en aplicaciones terapéuticas, como componentes en vacunas y equipos de pruebas diagnósticas, y como reactivos para estudios de estructura/función. Las células de mamíferos, bacterias e insectos se usan comúnmente para expresar proteínas recombinantes para tales aplicaciones. Los sistemas de expresión bacteriana, sin embargo, se usan frecuentemente cuando se necesitan grandes cantidades de proteínas para estudios experimentales o clínicos, y la proteína es capaz de replegarse a su propia conformación. Los sistemas bacterianos, en particular, ofrecen ventajas significativas de costo sobre otros sistemas de expresión del vector cuando las modificaciones post-traduccionales eucarióticas (por ejemplo, glicosilación) no se requieren, o se desean en el producto de la proteína final. Las proteínas recombinantes expresadas en bacterias, tal como E. coli, son apartadas con frecuencia en cuerpos de inclusión insolubles. Las proteínas heterólogas recolectadas de cuerpos de inclusión con frecuencia conservan un residuo de aminoácido adicional tal como metionina en su amino terminal. Este residuo de metionina (codificado por el codón de inicio ATG) no está presente con frecuencia, sin embargo, en proteínas nativas o recombinantes recolectadas de células eucarióticas hospederas. El amino terminal de muchas proteínas hechas en el citoplasma de E. coli, sin embargo, son procesadas por enzimas, tales como metionina aminopeptidasa (Ben Bassat et al., J. Bacteriol. 169: 751-757, 1987), de modo que la expresión de la metionina es separada del N-terminal. La composición de aminoácido de proteínas terminales son predilectas de diferentes maneras (Berezovsky et al., Protein Engineering 12(1): 23-30, 1999). La examinación sistemática de actividades N-exopeptidasa conduce al descubrimiento del 'N-terminal'- o 'N-dominio extremo': el N-terminal (f)Met se separa si el aminoácido siguiente es Ala, Cis, Gli, Pro, Ser, Tre o Val. Si el aminoácido siguiente es Arg, Asp, Asn, Glu, Gln, He, Lis o Met, la Met inicial (f)se mantiene como el primer aminoácido de la proteína completa. Los radios de hidratación de las cadenas laterales del aminoácido se propusieron como bases físicas para estas observaciones (Bachmain et al., Science, 234: 179-186, 1986; Varshavsky, Cell, 69: 725-735, 1992). La vida media de una proteína (de 3 min a 20 horas), es influenciada dramáticamente por la estructura química del aminoácido N-terminal (Stewart et al., J. Biol. Chem., 270: 25-28, 1995; Griegoryev et al., J. Biol., Chem., 271 : 28521-28532, 1996). La mutagénesis dirigida a sitio se usó subsecuentemente para confirmar el 'N-dominio extremo' por monitoreo de la vida útil de proteínas recombinantes que contienen secuencias de aminoácidos N-terminal alteradas (Varshavsky, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 12142-12149, 1996). Un análisis estadístico de las secuencias de aminoácidos terminales de proteínas sugieren que residuos de Met y Ala se representan sobre la primera posición, mientras en las posiciones +2 y +5, se prefiere la Tre (Berezovsky et al., Protein Engineering 12(1 ): 23-30, 1999). Las predilecciones C terminal, sin embargo, muestran una preferencia para aminoácidos cargados y residuos Cis (Berezovsky et al., Protein Engineering, 12(1 ): 23-30, 1999). Las proteínas recombinantes que conservan la metionina N-terminal, en algunos casos, tienen características biológicas que difieren de las especies nativas carentes de la metionina N-terminal. La hormona de crecimiento humano que conserva su metionina N-terminal (Met-hGH), por ejemplo, puede promover la inducción de anticuerpos indeseables, comparados a la hGH purificada de fuentes naturales o hGH recombinante que se prepara de tal forma que tiene la misma secuencia primaria como hGH nativa (carente de una metionina N-terminal). Los métodos de bajo costo de generación de proteínas recombinantes que simulan la estructura de proteínas nativas son extremadamente deseadas con frecuencia para aplicaciones terapéuticas (Sandman et al., Biol. Technology 13:504-6 (1995)). Un método para preparar proteínas nativas en bacterias es expresar la proteína deseada como parte de una gran proteína de fusión que contiene un sitio de reconocimiento para una endoproteasa que separa específicamente hacia el extremo 5' el inicio de las secuencias de aminoácidos nativos. El reconocimiento y los sitios de separación pueden ser aquellos reconocidos por la señal de peptidasas nativas, la cual sujeta específicamente la señal péptido del extremo N-terminal de una proteína seleccionada para liberar a una membrana o para secreción a partir de la célula. En otros casos, el reconocimiento y los sitios de separación pueden manejarse en el gen codificando una proteína de fusión por lo que la proteína recombinante es susceptible a otras endoproteasas no nativas in vitro o in vivo. El factor de coagulación sanguínea Xa, colagenasa, y la enzima enterocinasa, por ejemplo, pueden usarse para liberar diferentes fragmentos de fusión de una variedad de proteínas. Las consideraciones económicas, sin embargo, generalmente evitan el uso de endoproteasas en una gran escala para uso farmacéutico. Otro método de preparación de proteínas nativas en bacterias es usar la enzima metionina aminopeptidasa (MAP) para procesar la metionina N-terminal de proteínas recombinantes derivadas de E. coli. La Met-hGH, por ejemplo, pueden tratarse con MAP para generar hGH. Las patentes de Estados Unidos 4,870,017 y 5,013,662 describen la clonación, expresión y el uso de E. coli metionina aminopeptidasa para eliminar Met de una variedad de péptidos y Met-IL-2. La habilidad para liberar aminoácidos de una variedad de sustratos de péptidos se analizó, revelando que MAP separa solo metionina N-terminal en péptidos que son por lo menos tres aminoácidos de largo. La naturaleza en los aminoácidos en las posiciones segunda y tercera también parece ser significante. La metionina se liberó, por ejemplo, de Met- Ala-Met; Met-Gli-Met, Met-Ala-Pro-Thr-Ser-Ser-Ser-Thr-Lys-Lys-Thr-Gln-Leu (SEQ ID NO. 1), y Met-Pro-Thr-Ser-Ser-Ser-Thr-Lys-Lys-Gln-Cys (SEQ ID NO. 2), pero no Met-Phe-Gly, Met-Leu-Phe, Met-Met-Met, entre otros. Los no aminoácidos se liberaron de Leu-Ala-Pro-Thr-Ser-Ser-Ser-Thr-Lys-LysThr-Gln-Leu (SEQ ID NO. 3), Ala-Pro-Thr-Ser-Ser-Ser-Thr-Lys-Lys-Thr-Gln-Leu (SEQ ID No. 4), o Pro-Thr-Ser-Ser-Ser-Thr-Lys-Lys-Gln-Cys (SEQ ID NO. 5). WO 84/02351 describe un proceso para preparar proteínas maduras (nativas) tales como hormona de crecimiento humano o proinsulina humana de proteínas de fusión que usan leucina aminopeptidasa. Una proteína de fusión que tiene la secuencia de aminoácidos (Ym---Y2Y?)-(Pro)p-(X?X2...Xn) en la cual (Ym---Y2Y?H ro)p es la pro-secuencia y el resto es la proteína madura, m es un número entero mayor que 2, Y es un aminoácido arbitrario, p es 0, si Xi o X2 es Pro, y 1 si bien X-i o X2 es diferente de Pro, X es un aminoácido arbitrario, y n es un número entero mayor o igual a 4, se convierte por separación gradual con aminopeptidasa eliminando aminoácidos Ym...Y2 si p = o X2 = Pro o los grupos Ym --Y2-Y? si bien X2 = Pro y entonces los dos aminoácidos Y Pro si p=1 son separados enzimáticamente en uno o dos pasos de una forma conocida per se, y similarmente Y-i sola se separa, si X?=Pro. La Solicitud de Patente Europea EP 0 204 527 A1 describe un método de eliminación de metionina N-terminal de proteínas de la fórmula H-Met-X-Pro-Y-OH para producir una proteína representada por la fórmula H-X-Pro-Y-OH, donde X es un aminoácido diferente a prolina y Y es una cadena de péptido. La aminopeptidasa M se prefiere, pero la leucina aminopeptidasa, aminopeptidasa PO, o aminopeptidasa P pueden usarse también. La metionina N-terminal se eliminó de derivados de interleucina-2 humana y hormona de crecimiento humano. Aeromonas aminopeptidasa (AAP), una exo-peptidasa aislada de la bacteria marina Aeromonas proteolytica, se puede usar también para facilitar la liberación de aminoácidos N-terminal de péptidos y proteínas (Wilkes et al., Eur. J. Biochem. 34(3), 459-66, 1973). La secuencia más favorable es X-//-Y- mientras que Y es un residuo hidrofóbico, preferiblemente un aminoácido aromático, tal como fenilalanina. Los residuos susceptibles a hidrólisis incluyen todos los aminoácidos hidrofóbicos, aromáticos y básicos, más prolina. Los residuos de aspartilo, glutamilo y ácido cisteico no se eliminaron del amino terminal de cualquiera de los sustratos probados, aun a concentraciones altas de enzimas. La asparragina, glutamina y cisteína aminoetilada, sin embargo, se liberaron de sustratos oligopéptido. La glicina generalmente fue resistente a hidrólisis, pero fue liberada lentamente de algunos sustratos, dependiendo de los residuos adyacentes. La actividad de APP sobre los sustratos péptido puede aumentarse también por el cambio de los iones de metal contrarios, tales como Cu2+ y Ni2+ para enzimas AAP libres (Prescott et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 114(2): 646-652, 1983). La AAP es una metaloenzima de 29.5 kDa que contiene dos enlaces disulfida. La patente Europea EP 0191827 y la patente U.S. 5,763,215 describe la eliminación secuencial de aminoácidos N-terminal de análogos de proteínas eucarióticas, formadas en un hospedero extraño, por el uso de Aeromonas aminopeptidasa. Cuando 8 mg de metionil-hormona de crecimiento humano (Met-hGH) (disuelta en 1 mL pH 9.5 10 mM regulaor de pH borato de Na) se mezcló con Aeromonas aminopeptidasa (disuelto a 0.4725 mg/mL en regulador de pH Tris pH 9.5) a una relación de 900 a 19 e incubado a 37°C, la separación de metionina se completó en 15 min. La separación del nuevo aminoácido leucina N-terminal, fue insuficiente después de 22 h. La metionina N-terminal de Met-pST, Met-lnterferón, Met-IGF-1 , Met-interleucina-2 (Met-IL-2), y Met-Apolipoproteína E se eliminó por AAP. Una alanina N-terminal, sin embargo, no se eliminó de la superóxido dismutasa madura. Métodos más complicados pueden usarse también para generar proteínas recombinantes con un amino terminal nativo. La patente de Estados Unidos 5,783,413, por ejemplo, describe el uso simultáneo o secuencial de (a) una o más aminopeptidasas, (b) glutamina ciclotransferasa, y (c) piroglutamina aminopeptidasa para tratar proteínas amino terminalmente extendidas de la fórmula NH2-A-glutamina-Protein-COOH para producir una proteína nativa deseada. La primer aminopeptidasa(s) (seleccionada del grupo que consiste de dipeptidilaminopeptidasa I, Aeromonas aminopeptidasa, aminopeptidasa P y prolina aminopeptidasa) cataliza la eliminación de residuos amino terminal a la glutamina. La glutamina ciclotransferasa cataliza la conversión de la glutamina a piroglutamina, y la piroglutamina aminopeptidasa cataliza la eliminación de piroglutamina a producir el producto de proteína deseado. Las patentes de Estados Unidos 5,565,330 y 5,573,923 describen métodos de eliminación de dipéptidos del amino terminal de los polipéptidos precursores que comprenden el tratamiento del precursor con dipeptidilaminopeptidasa (dDAP) de la cubierta de moho Dictostelium descoideum, el cual tiene una masa de alrededor de 225 kDa y un pH óptimo de alrededor de 3.5. Los precursores de insulina humana, análogos de insulina humana y hormona de crecimiento humano que contienen extensiones de dipéptidos se procesaron por dDAP cuando el dDAP estaba en solución libre y cuando éste se inmovilizó sobre una superficie de apoyo sólida apropiada. Estrategias más eficientes para procesar aminoácidos del amino terminal de proteínas recombinantes se desean para reducir el costo de la generación de proteínas terapéuticas que simulan la estructura de proteínas nativas. Los métodos que aumentan los niveles de expresión o facilitan el procesamiento hacia 3' de proteínas recombinantes acelerarán también la selección y el desarrollo de moléculas químicas pequeñas y otras moléculas basadas en proteínas destinadas a ensayos clínicos de gran escala.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Un objeto de la invención es describir un método de eliminación de un grupo alanil N-terminal de una proteína recombinante la cual comprende el contacto de dicha proteína recombinante con Aeromonas aminopeptidasa del tal forma que dicho grupo alanil N-terminal se elimina y recupera la proteína recombinante resultante. Preferiblemente, la proteína recombinante es de origen eucariótico. Aun más preferiblemente, la proteína recombinante se selecciona del grupo que consiste de hormona de crecimiento humano (hGH), somatotropina bovina (bST), somatotropina porcina (pST) e inhibidor de la vía del factor tisular (TFPI). Más preferiblemente, la proteína recombinante es hGH. Preferiblemente, el proceso de contacto se lleva a cabo a un pH de alrededor de 7 a aproximadamente un pH de 11. Aun más preferiblemente, el proceso de contacto se lleva a cabo a un pH de alrededor de 8 a aproximadamente un pH de 10. Más preferiblemente, el proceso de contacto se lleva a cabo a un pH de alrededor de 8.0 a aproximadamente un pH de 9.5. Preferiblemente, el proceso de contacto se lleva a cabo en la presencia de un regulador de pH seleccionado del grupo que consiste de borato, CHES, bicarbonato de sodio, fosfato de sodio y Tris-HCl. Más preferiblemente, el regulador de pH es borato, fosfato o Tris-HCl.

Preferiblemente, el proceso de contacto puede llevarse a cabo en donde se inmoviliza a la aminopeptidasa. Preferiblemente, la aminopeptidasa se inmoviliza en una resina de cromatografía, superficie de cromatografía o gel de cromatografía. Preferiblemente, la proteína recombinante se pasa a través de una columna que contiene la aminopeptidasa inmovilizada en una resina de cromatografía. Alternativamente, el proceso de contacto puede llevarse a cabo en donde la aminopeptidasa no es inmovilizada (por ejemplo, en solución libre). También se concibe que Aeromonas aminopeptidasa pueda permitir el procesamiento de proteínas que contienen dos o más residuos alanil colocados cercanamente en las regiones N-terminal de los polipéptidos. Las aminopeptidasas pueden procesarse secuencialmente del N-terminal del polipéptido o quizá reconoce residuos de alanina adicionales dentro de una distancia corta de residuos de polipéptidos N-terminal expuestos. La explicación de una secuencia consenso para el reconocimiento específico de alanina y los sitios de separación se puede evaluar en una variedad de sustratos de proteínas y de péptidos. La Aeromonas aminopeptidasa puede facilitar también el procesamiento de residuos no-alanil en las regiones N-terminal de proteínas bajo las condiciones descritas en ésta solicitud. La explicación de una secuencia general para el reconocimiento y separación de estos sitios se puede evaluar en una variedad de sustratos de proteínas y péptidos. Otro objeto de la invención es describir un método de eliminación de aminoácidos amino terminal de un polipéptido precursor de la fórmula X-Y-Pro-Z con Aeromonas aminopeptidasa para producir un polipéptido de la fórmula Y-Pro-Z, en donde X es uno o más aminoácidos excepto prolina, Y es cualquier aminoácido excepto prolina y Z es uno o más aminoácidos. Preferiblemente, X es alanina. Preferiblemente, Y se selecciona del grupo que consiste de fenilalanina, metionina, treonina y ácido aspártico. Más preferiblemente, Y es fenilalanina. Preferiblemente, el polipéptido precursor es Ala-hGH.

Definiciones La siguiente es una lista de abreviaturas y los significados correspondientes como se usó intercambiablemente en la presente invención: g = gramo(s), HPLC = cromatografía líquida de alto rendimiento, kb = kilobase(s), mb = megabase(s), mg = miligramo(s), ml, mL = mililitro(s), HPLC-RP = cromatografía líquida de alto rendimiento fase reversa, ug, µg = microgramo(s), ul, uL, µl, µL = microlitro(s).

La siguiente es una lista de definiciones de varios términos y los significados correspondientes como se usó intercambiablemente en la presente invención: Los términos "aap" y "AAP" se refieren a Aeromonas aminopeptidasa. Los términos "ap" y "AP" se refieren a aminopeptidasa. El término "aminoácido(s)" se refiere a todos los L-aminoácidos dados naturalmente, incluyendo norleucina, norvalina, homocisteína y ornitina. El término "molécula de fusión" se refiere a una molécula que codifica para proteína o fragmentos de ella que sobre la expresión, produce una proteína de fusión. El término "proteína de fusión" se refiere a una proteína o fragmento de ella que comprende una o más regiones de péptidos adicionales no derivados de esa proteína. El término "promotor" se usa en sentido extenso para referirse a la secuencia(s) regulatoria que controla la producción de RNAm. El término "fragmento de proteína" se refiere a una molécula péptido o polipéptido cuya secuencia de aminoácidos comprende un subset de la secuencia de aminoácidos de esa proteína. El término "molécula de proteína/molécula de péptido" se refiere a cualquier molécula que comprende cinco o más aminoácidos.

El término "recombinante" se refiere a cualquier agente (por ejemplo, DNA, péptido, etc.), que es o resulta de, sin embargo indirectamente, manipulación humana de una molécula de ácido nucleico. El término "específicamente enlazado" se refiere a que la unión de un anticuerpo o péptido no se inhibe competitivamente por la presencia de moléculas no relacionadas. El término "purificado sustancialmente" se refiere a una o más moléculas que están o pueden estar presentes en una preparación naturalmente dada que contiene la molécula seleccionada que habrá de ser eliminada o reducida en concentración.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Fiqura 1 - Estructura de Ala-hGH v hGH La hormona de crecimiento humano (derecha) es un polipéptido de cadena simple (22kDa) con cuatro residuos cisteína comprendidas en dos ligaduras de enlace. La secuencia correcta N-terminal puede lograrse por la separación enzimática in vitro de Ala-hGH (izquierda) con Aeromonas aminopeptidasa. Figura 2 - Proceso para Producción de hGH a partir de Ala-hGH Un proceso general para la purificación de hGH a partir de Ala-hGH comprende purificación de Ala-hGH de cuerpos de inclusión bacterianos, repliegue de Ala-hGH en detergente, eliminación de detergente, precipitación de ácido, tratamiento con aminopeptidasa, y purificación de la hGH nativa por intercambio de catión y anión en la cromatografía en columna.

Fiqura 3 - Cinética de eliminación de Ala a partir de Ala-hGH por AAP La cinética de eliminación de Ala a partir de Ala-hGH por AAP se ilustra en la Figura 3. Ala-hGH se presentó a 3 mg/ml y AAP se presentó a 0.5, 1.0, 2.0, 3.0 y 4.0 unidades/ml en un volumen total de 6 ml. Las reacciones se llevaron a cabo a temperatura del lugar y las muestras recolectadas por 25 horas y los productos analizados por ES/MS. La mayoría de las reacciones para las tres concentraciones más altas de AAP se completaron en 6 horas. Figura 4 - Opciones del proceso de separación enzimática -Modo en columna Se ¡lustra una comparación esquemática de los modos de proceso de separación de flujo estable y flujo continuo.

Figura 5 - Separación en modo intermitente de Ala-hGH La Figura 5 ilustra un curso de tiempo de separación aumentada de Ala-hGH por Cu-AAP comparado a Zn-AAP en el modo intermitente.

Figura 6 - Separación en modo de recirculación de Ala-hGH La Figura 6 ilustra un curso de tiempo de Ala-hGH por Cu-AAP comparado a Zn-AAP llevado a cabo en el modo de recirculación en columna.

Figura 7 - Rendimiento de separación analizada por HPLC La Figura 7 ilustra perfiles HPLC de Ala-hGH antes de la separación con AAP, separación incompleta y después la reacción se completa.

Figura 8 - Comparación del producto por RP-HPLC La Figura 8 ilustra el perfil HPLC de hGH preparado por tratamiento de Ala-hGH con AAP, y dos preparaciones comerciales de hGH (Humatrope y Zomacton).

Figura 9 - Productos de Ala-hGH tratados con AAP analizado por mapeo tríptico Las Figuras 9-12 ilustran perfiles típicos de mapa tríptico. La Figura 9 ilustra los trazos de perfil que ilustran la diferencia en movilidad del péptido Ala-T1 comparado al péptido T1.

Figura 10 - Análisis cuantitativo de Ala-hGH residual en hGH por digestión tríptica La Figura 10 muestra un trazo del perfil expandido verticalmente, que ilustra las diferencias en las áreas pico bajo las posiciones de elusión para Ala-T1 y T1.

Figura 11 - Comparación del producto por mapeo tríptico La Figura 11 ilustra los mapas trípticos de hGH purificada después del tratamiento de Ala-hGH con AAP comparado a mapas trípticos de hGH de fuentes comerciales (Humatrope y Zomacton).

Figura 12 - Niveles residuales de Ala-hGH en el producto final por mapeo tríptico } La Figura 12 muestra un trazo del perfil expandido verticalmente que ilustra la presencia o ausencia de Ala-T1 en una preparación cruda de hGH, el volumen final de la preparación de hGH, y hGH de dos fuentes comerciales (Humatrope y Zomacton).

Figura 13 - Rendimiento de separación analizada por ES/MS La Figura 13 ilustra los perfiles ES/MS de Ala-hGH antes de la separación con AAP, separación incompleta, y después la reacción se completa. La Figura 8 ilustra el perfil HPLC de hGH preparado por tratamiento de Ala-hGH con AAP, y dos preparaciones comerciales de hGH (Humatrope y Zomacton).

Figura 14 - Análisis del producto por RP-HPLC, SE-HPLC v ES/MS La Figura 14 ilustra un perfil ES/MS sobrepuesto de Ala-hGH y hGH (panel final) junto con trazos HPLC del producto final resuelto en columnas RP-HPLC y SE-HPLC. Figura 15 - Producto analizado por secuenciación N-terminal La Figura 15 ¡lustra trazos de productos liberados después del ciclo 1 y el ciclo 2 de un secuenciador de proteínas automatizado. La fenilalanina (18.3 min) es el único residuo significativo detectado después de un ciclo (panel izquierdo). La prolina (14.2 min) es el único residuo significativo detectado en el ciclo 2. La cantidad de alanina (*) es insignificante en ambos ciclos, indicando la falta de residuos alanina N-terminal en el producto final purificado.

Reactivos Aeromonas aminopeptidasa y todas las especies químicas, a menos que se mencione lo contrario, se obtuvieron en Sigma Chemical Company (St. Louis, MO). Humatrope se obtuvo en Eli Lilly. Zomacton se obtuvo en Gentechnisch.

Purificación de proteínas La purificación de proteínas se puede realizar usando cualquiera de una variedad de métodos cromatográf icos tales como: intercambio de iones, filtración en gel, cromatografía hidrofóbica o fase HPLC inversa. Este y otros métodos de purificación de proteínas se describen con detalle en Methods in Enzymology, Volume 182 "Guide to Protein Purification" editada por Murray Deutscher, Academic Press, San Diego, California, 1990. Las proteínas plegadas pueden también purificarse por afinidad usando reactivos de afinidad tales como anticuerpos monoclonales o subunidades receptoras unidas a una matriz apropiada. Las proteínas purificadas se pueden analizar por RP-HPLC, espectrometría de masas por electrospray y SDS-PAGE. La cuantificación de proteínas es realizada por composición de aminoácidos, RP-HPLC, y técnicas de determinación de proteínas de Bradford. El mapeo del péptido tríptico, llevado a cabo junto con la espectrometría de masas por electrospray, pueden también usarse para confirmar la identidad de proteínas.

EJEMPLO 1 : Preparación de hormona de crecimiento humano-Alanina (Ala- hGH) Ala-hGH (Figura 1 ) se expresó en E. coli usando un sistema de expresión cromosomal basado en mini-Mu (Weinberg et al., Gene 126: 25-33, 1933; patentes U.S. 5,395,763 y 5,514,483; solicitud de patente U.S. 09/044,369, emitida el 19 de marzo, 1998, cada una incorporada específicamente por referencia a la presente). Ala-hGH se expresó a niveles de alrededor de 1.5 a aproximadamente 2.0 g/litro.

Ala-hGH se purificó, replegó y procesó a una pureza de >90% basado en un análisis de Ala-hGH (por RP-HPLC) y la concentración de proteína total (por absorción a A2ßo)- Brevemente, los cuerpos de inclusión se aislaron y Ala-hGH se purificó y replegó usando métodos que se describen previamente (WO 98/29433). El replegamiento se llevó a cabo más comúnmente con un >85% producido a un pH 10 usando acil-glutamato como un detergente. El detergente se eliminó entonces de la mezcla de repliegue por ultrafiltración exhaustiva (10 TOVs) contra agua a pH 10. Esto se siguió por un paso de precipitación ácido para eliminar la mayoría de las proteínas E. coli recombinantes. El promedio de recuperación de Ala-hGH de éste paso de precipitación fue -80-85%. Esta Ala-hGH semi-purificada se infiltró en el regulador de pH de separación (10 mM fosfato, pH 8.0) antes de ser tratado con la enzima, preferiblemente en un modo inmovilizado. Después del paso de separación enzimática, hGH se purificó además por cromatografía de intercambio de iones a tamaño del polvo. Un principio del proceso general se ilustra en la Figura 2.

EJEMPLO 2: Procesamiento in vitro de hormona de crecimiento humano (Ala- hGH) con Aeromonas aminopeptidasa en solución libre Antes del paso de separación, Ala-hGH se ajustó a concentración de 3 mg por ml en 10 mM de borato, pH 9.5. A esto, se agregó Aeromonas aminopeptidasa en 3 unidades por ml y la reacción se dejó avanzar por 24-36 horas a temperatura ambiente o a un tiempo más corto a 37°C. El progreso de la reacción de separación puede monitorearse por RP-HPLC o por análisis de aminoácidos de la liberación alanina de Ala-hGH. Al final de la reacción, la solución se enfrió rápidamente por adición de ácido acético al 2% (1 :2.5 dilución w/w).

La cinética de eliminación de Ala de Ala-hGH por AAP se ilustra en la Figura 3. Ala-hGH se presentó a 3 mg/ml y AAP se presentó a 0.5, 1.0, 2.0, 3.0 y 4.0 unidades/ml en un volumen total de 6 ml. Las reacciones se llevaron a cabo a temperatura del lugar y las muestras se recogieron por 25 horas y los productos analizados por ES/MS. La mayoría de las reacciones para las tres concentraciones más altas de AAP se completaron en 6 horas.

EJEMPLO 3: Procesamiento in vitro de hormona de crecimiento humano-Ala (Ala-hGH) usando aminopeptidasa inmovilizada Preparación de aminopeptidasa inmovilizada Aeromonas aminopeptidasa (AAP) se acopló sobre resinas tales como Sepharose 4B mediante el químico bromido cianógeno (CNBr). La resina Sepharose 4B activada con CNBr comercial se lavó exhaustivamente con agua fría y luego suspendida en 0.1 M de regulador de pH carbonato de sodio, pH 8.5 ó 10 mM fosfato, pH 8. AAP se agregó (100 unidades por gramo de resina) y la mezcla se agitó suavemente a 4°C por la noche. Después del lavado con agua, la resina se cubrió con etanolamina (0.5-1 M) a temperatura del lugar por dos horas. La resina se lavó entonces con agua y equilibrada con la enzima reguladora de pH de separación, tal como 10 mM fosfato, pH 8. La actividad de ésta enzima inmovilizada se midió por el ensayo estándar, sugerida por Sigma, usando L-leucina-p-nitroanilida como un sustrato. La actividad promedio fue típicamente 10-20 unidades por ml de un lecho de resina.

Separación in vitro de hormona de crecimiento humano (hGH)- Ala Modo intermitente La aminopeptidasa inmovilizada se suspendió como mezcla 1 :1 en regulador de pH borato o fosfato. A un tubo de 7 ml que contiene 5 ml de Ala-hGH en regulador de pH borato o fosfato, se agregó un ml de resina. Esto dio un total de 6 ml con 3 mg/ml de concentración de proteínas. La mezcla se balanceó por 10-24 horas a 20-40°C. Al final de la reacción, la resina se filtró y la solución resultante se analizó por RP-HPLC. El restante de la solución se centrifugó usando un aparato de micro-filtración CentriCon. El filtrado se analizó por el analizador de aminoácidos para la liberación de alanina. El sobrante se intercambió 4-5 veces con ácido acético al 2% antes de secarse hasta polvo para análisis por espectrometría de masas. La Figura 1 ¡lustra el efecto de temperatura sobre la separación en modo intermitente de Ala-hGH usando AAP inmovilizada. La reacción se acelera a temperatura ambiente, y esencialmente se completa después de 54 horas.

CUADRO 1 Efecto de temperatuí 'a en la separación de modo intermitente de Ala-hGH usando AAP inmovilizada Temperatura Tiempo, hrs % de separación 4-6°C 16 48 54 65 89 75 Ambiente 16 82 54 >97 89 >97 Modo de flujo Ala-hGH en 10 mM de borato, pH 9.5 ó 10 mM de fosfato, pH 8.0 circuló sobre una columna Sepharose que se inmovilizó previamente con Aeromonas aminopeptidasa. El volumen del depósito es entre 100 ml a 700 ml dependiendo de la concentración de la proteína. Típicamente, Ala-hGH está en 5-10 mg por ml. La velocidad de flujo está entre 2-4 ml por minuto. Esto se llevó a cabo a 20°C por alrededor de 24 horas. La reacción se monitorizó por RP-HPLC. La rendimiento de separación se confirmó por espectrometría de masas y secuenciación N-terminal. El producto terminado se purificó además por cromatografía de intercambio de iones. La Figura 2 ilustra el efecto de velocidad de flujo en la separación de Ala-hGH usando AAP inmovilizada a 28°C en el modo de reflujo. Tiempos de permanencia más cortos, se asociaron generalmente con niveles más altos de sustrato no separado.

CUADRO 2 Separación en modo de flujo de Ala-hGH a 28°C Velocidad de Velocidad de Tiempo de % No flujo flujo permanencia separada* (ml/min) (ml/hr) (hrs) Digestión de tripsina 0.119 7.14 7.14 0.92 0.167 10.03 5.08 1.18 0.262 15.72 3.24 2.11 0.400 24.00 2.13 (1.65) 0.573 34.38 1.48 2.26 0.867 52.02 0.98 2.17 * El experimento se llevó a cabo a 28°C en un volumen de columna de 51 ml usando 10 mM de fosfato, pH 8 como regulador del pH usando Ala-hGH: 8 mg/ml (HPLC). La Figura 3 ilustra el efecto de la velocidad de flujo en la separación de Ala-hGH usando AAP inmovilizada a 20°C en modo de reflujo. Los tiempos de permanencia más cortos, correlacionados directamente con niveles más altos de sustrato no separado.

CUADRO 3 Separación en modo de flujo de Ala-hGH a 20°C Velocidad de Velocidad de Tiempo de % No separada* flujo flujo permanencia (ml/min) (ml/hr) (hrs) Digestión de tripsina 0.117 7.02 7.26 1.34 0.164 9.84 5.18 2.12 0.255 15.27 3.34 3.83 0.404 24.21 2.11 4.54 0.567 34.87 1.46 5.20 0.849 50.94 1.00 14.99 1.23 73.64 0.69 21.27 El experimento se llevó a cabo a 20°C con un volumen de columna de 51 ml, en 10 mM de regulador de pH fosfato, pH 8 usando Ala-hGH: 8 mg/ml (HPLC). * Aproximadamente el 1% son aductores de cisteína que co-eluyen con el péptido Ala-T1 no separado.

Modo por flujo Ala-hGH (concentración de 8 mg/ml) en 10 mM de borato, pH 9.5 ó 10 mM de fosfato, pH 8.0 se introdujo en una columna Sepharose (el volumen de columna es 50 ml) que fue inmovilizada previamente con Aeromonas aminopeptidasa. El flujo se ajustó a 15 ml por hora así el tiempo de permanencia es de alrededor de 3 horas. La rendimiento de separación se confirmó por RP-HPLC, digestión de tríptico, espectrometría de masas o secuenciación N-terminal. El eluyente se recogió y procesó para purificación cromatográfica hacia 3'. La Figura 4 ilustra el efecto de velocidad de flujo sobre la separación de Ala-hGH usando AAP inmovilizada a 28°C en el modo por flujo. La mayor parte de la Ala-hGH se procesó por AAP bajo estas condiciones.

CUADRO 4 Separación en modo por flujo a 28°C Velocidad de flujo Tiempo de % no separado * (ml/hr) permanencia (hrs) (basado en digestión de Tripsina) 7.14 7.14 <0.92 10.03 5.08 <1.18 15.72 3.24 <2.11 24 2.13 NA 34.4 1.48 <2.26 52.02 0.98 NA Toda la información del tríptico se basa en la combinación de Ala-hGH no separada y un proceso impuro. El valor real de la Ala-hGH no separada se estima alrededor del 50% de los valores reportados.

EJEMPLO 4: Comparación de procesos de flujo estable y flujo continuo La separación en modo de columna se puede hacer a un velocidad de flujo mucho mas bajo en un paso siempre y cuando el tiempo de permanencia total se encuentre. El recorrido #1 fue un recorrido típico en el modo de recirculación. El recorrido #2 se operó a 1/10 día velocidad de flujo del recorrido #1. Sin embargo, el recorrido #2 se llevó a cabo a 175 min por paso comparado a 18 min por paso para el recorrido #1. El tiempo de permanencia total para ambos recorridos es aproximadamente el mismo, -180 minutos. Los dos modos se ilustran en la Figura 5.

CUADRO 5: Efecto de velocidad de flujo en actividad Recorrido Volumen Velocidad Pases Tiempo de Tiempo de # de de flujo, totales permanencia contacto columna, ml/hr por paso total ml tiempo de permanen cia 1 57 192 10 18 min 180 min 2 57 19.8 1 175 min 175 min La Figura 6 ¡lustra el efecto del número de pases en la separación de Ala-hGH usando AAP inmovilizada a 28°C en el modo de recirculación. La mayor parte de Ala-hGH se procesó por AAP bajo estas condiciones. CUADRO 6: Re-circulación a 28°C en regulador de pH fosfato Tiempo, hrs # pases % de separación Analizado por 2.92 1.06 >93 RP-HPLC 5.73 2.08 >96.1 Mapa tríptico 15.57 5.66 >98.6 Mapa tríptico 17.73 6.45 >98.6 Mapa tríptico 20.4 7.42 >98.6 Mapa tríptico 23.4 8.8 >98.8 Mapa tríptico 24.4 8.87 >98.8 Mapa tríptico 39.7 14.44 >99.2 Mapa tríptico *[Ala-hGH]=9.2 mg/ml; 500 ml carga La Figura 7 ilustra el efecto de temperatura y tiempo de permanencia en la separación de Ala-hGH. Una diferencia de diez grados en temperatura parece afectar el rendimiento de separación. Un tiempo de permanencia prolongado puede requerirse si un alto % de separación se necesita.

CUADRO 7: Efecto de la temperatura v tiempo de permanencia en el proceso de separación de flujo estable Recorrido # Temperatura, Velocidad de Tiempo de % de °C flujo, ml/hr permanencia, separación * min 1A 20 0.28 182 >98.5 1 B 30 0.28 182 >99.1 2A 20 0.51 100 >95.8 2B 30 0.51 100 >98.3 Los productos de separación se analizaron por el método de mapeo del péptido.

EJEMPLO 5: Aumento de la actividad de procesamiento alanil AAP con cobre Los efectos del sustituyente Cu2+ o Ni2+ para el cofactor catalítico Zn .2+ de AAP se examinaron en el sistema inmovilizado para procesamiento in vitro de Ala-hGH. Este Cu-AAP puede prepararse ya sea directamente del paso de proceso de purificación AAP o convertirse a las especies de cobre por reemplazamiento de los metales contrarios de zinc que está presente como en el material comercial. La conversión se puede hacer ya sea como la enzima libre o como la forma inmovilizada.

Cu-APP inmovilizada de Sepharose Zn-AAP Cu-APP se inmovilizó como se describe arriba. La pasta de resina (muestra A, 20 ml con 10 ml de volumen de lecho de resina) se colocó en un embudo de vidrio sintético de 250 ml y llevado casi a sequedad usando aparte vacío. A esto, se agregó 20 ml de 50 mM de Tricina/50 mM de KCl, pH 7.5 y 20 mM 1 ,10 fenantrolina y mezclado por 20 minutos. La solución se eliminó y colocó en un regulador de pH fresco que contiene 1 ,10-fenantrolina y mezclada por otras 2 horas. El regulador de pH se eliminó y la pasta de resina se lavó con agua y regulador de pH HEPES, pH 7.5. La resina resultante se dividió en dos tubos cada uno con un volumen total de 12 ml. A B se agregó, 0.2 mM de CuCI2 en 50 mM de HEPES, pH 7.5, y a C se agregó 0.2 mM de ZnCI2 en 50 mM de HEPES, pH 7.5. Ambos tubos se balancearon suavemente por 3 horas. Las pastas se lavaron extensamente con agua y contenidas en el regulador de pH deseado, tal como borato, pH 9.5.

CUADRO 8 Actividad de AAP metalo modificada contra Leu-pNA Muestras AAP Metalo Actividad del sustrato del lecho unidad/ml: Leu-pNA A (como es) Zn-AAP 8.94 B Zn-AAP 8.59 C Cu-AAP 5.47 La velocidad de separación de Ala-hGH por Cu-AAP y Zn-AAP se compararon en ambos lotes y modos de columna recirculante. En el ensayo de separación de lote, 0.5 ml de una pasta 1 :1 de cada resina (B o C) se agregó a 2.056 ml de 10 mM de regulador de pH borato, pH 9.5 antes de la adición de Ala-hGH a una concentración final de 0.8 mg/ml. Las reacciones fueron seguidas a través de 24 horas por colección de muestras que fueron enfriada rápidamente por filtración de la enzima inmovilizada por un filtro de 0.45 µm. El filtrado se analizó entonces por RP-HPLC para determinar la fracción de Ala-hGH que se separó. En el ensayo de separación de columna recirculante, columnas de 1 cm x 5 cm se vertieron conteniendo ya sea la resina Cu-AAP (B) o la resina control AAP (B). Estas columnas se equilibraron con 10 mM de fosfato y 50 ml de Ala-hGH 4.75 mg/ml se recircularon a través de cada columna a 2 CV por hora. Las alícuotas se recogieron y enfriaron rápidamente a 3 hr, 6 hr, 18 hr y 28 hr para análisis como arriba.

La figura 5 ilustra el curso de tiempo de separación aumentado de Ala-hGH por Cu-AAP comparado a Zn-AAP en el modo intermitente. La figura 6 ¡lustra un curso de tiempo de Ala-hGH por Cu-AAP comparado a Zn-AAP llevado a cabo en el modo de recirculación de columna. Bajo todas las condiciones de reacción examinadas, el AAP sustituido con Cu2+ fue el más activo contra Ala-hGH (Figuras 5 y 6), aunque el Cu-AAP es menos activo en la hidrólisis de los sustratos cromogénicos Leu-p-nitroanilida (pNA) (Figura 8).

EJEMPLO 6: Análisis estructural detallado del producto producido por tratamiento de Ala-hGH con Aeromonas aminopeptidasa Purificación de Ala-hGH Disolución / repliegue La pasta de cuerpo de inclusión (IB) se añadió a una solución pre-mezclada que contiene 34.5 gramos de bicarbonato de sodio, 156 gramos de detergente basado en aminoácidos (por ejemplo, sarcosina y/o ácido glutámico) y 826 ml de agua. La solución IB disuelta se mantuvo 20 minutos a temperatura del lugar y se agregó solución de cisteína (100 mM, pH 10.0). La solución se revolvió por 15 horas a temperatura del lugar antes de refrigerarla a 4°C. La mezcla de repliegue terminada se concentró entonces a 4 litros, antes de infiltrarse en agua a pH 10.

Precipitación acida La solución infiltrada se diluyó con agua a pH 10.0 a una concentración Ala-hGH de -2.5 mg/ml. Una solución de ácido acético al 2% se agregó usando una bomba peristáltica hasta el pH alcanzado de -5.6 a 4-6°C. La solución acidificada se revolvió por 30 minutos adicionales. La solución se centrifugó entonces a 6000 RPM por 30 minutos usando una centrífuga Sorvall RC5C a 4°C. El sobrenadante se decantó y se infiltró entonces en 10 mM de fosfato de sodio, pH 8.0. La concentración de proteínas se ajustó entonces a 8 mg/ml.

Separación enzimática Aeromonas aminopeptidasa se acopló sobre resinas tal como resina Sepharose 4B mediante el químico bromido cianógeno (Hermanson, 1992). La actividad de esta enzima inmovilizada se midió por el ensayo estándar que sugiere Sigma usando L-leucina-p-nitroanilida (Leu-pNA) como un sustrato. La solución Ala-hGH fría (8 mg/ml) en 10 mM de fosfato, pH 8.0 se pasó a través de una columna de enzimas inmovilizada que se equipó con una cubierta de agua y mantenida a 25°C. La velocidad de flujo se ajustó a -8 ml/hr para asegurar un tiempo de contacto suficiente entre Ala-hGH y la enzima inmovilizada. El equipo de separación se intercambió el regulador de pH en 3 M de urea, 0.05 M de ácido acético, pH 5.0 (regulador de pH A) antes de cargarse sobre la columna de catión.

Columna de catión La carga del catión se introdujo sobre una columna Amicon de 2.2 x 20 cm llenada con resina Sepharose CM. La carga total de la columna era 2.0 g de Ala-hGH. Después del cargamento, la columna se lavó con 1 CV 5 (volumen de columna) de regulador de pH A, luego eluída con un gradiente de sal de 0-0.2 M de NaCI sobre un total de 54 CVs. La velocidad de flujo fue de 4 CCV/hora. El eluyente de columna se recogió en 0.2 fracciones CV y el eluyente se monitorizó con un detector de holocromo Gilson a 280 nm. Las fracciones se analizaron por intercambio de catión HPLC, y se reunieron * 10 fracciones con >95% de pureza.

Columna de anión El equipo de catión se cargó sobre una columna Amicon de 1.6 x 20 cm llenada con resina Sepharose-Pharmacia Q. Después del cargamento, 15 la columna se lavó con un CV del regulador de ph A. Se hizo un gradiente lineal de 40 CV de 0-0.15 M de NaCI en 0.05 M de Tris-Cl pH 7.5. El eluyente en columna se reunió como arriba. Las fracciones se analizaron por intercambio de aniones HPLC y se reunieron fracciones con >98% de pureza. í 20 Análisis estructural de los productos de separación El método más conveniente para el análisis de una reacción de separación es el método RP-HPLC. Sin embargo, el mejor análisis cuantitativo fiable es el método de digestión de péptido. En este método, el límite de detección para Ala-T1 es 0.25%.

Análisis de aminoácido Después de la reacción de separación, la solución se centrifugó usando un Centricon con una membrana de separación de 10kDa de peso molecular. La concentración de alanina en el filtrado se puede medir por un analizador de aminoácidos. El grado de separación puede calcularse entonces por la cantidad de alanina liberada de la reacción. Además, cualquier otro aminoácido detectado debe ser un indicador de separación no especifico.

Análisis RP-HPLC Un método ¡socrático que utiliza N-propanol (NPA)/0.25 M fosfato pH 6.5 (26:74) como la fase móvil se usó para analizar Ala-hGH y hGH en una columna Vydac 214ATP54. La separación se llevó a cabo a 40°C. Este método se usó principalmente en la monitorización de la formación de hGH mediante la separación enzimática de Ala-hGH. Esto también sirvió como una herramienta secundaria en la decisión de cuales fracciones secundarias recolectar de una columna de intercambio de cationes. Los Figuras 7 y 8 ilustran los perfiles típicos HPLC. La Figura 7 ¡lustra los perfiles HPLC de Ala-hGH antes del separación con AAP, separación incompleta, y después la reacción se completa. La Figura 8 ¡lustra el perfil HPLC de hGH preparada por tratamiento de Ala-hGH con AAP, y dos preparaciones comerciales de hGH (Humatrope y Zomacton).

Mapeo del péptido usando tripsina 5 Una solución de hGH se ajustó a pH 7.5 con 0.5 N de NaOH.

Esta solución se diluyó con base Tris (50 mM, pH 7.5) de tal forma que la concentración final fue 2 mg/ml. Luego se agregaron 15 mL de solución tripsina (1 mg/mL en 50 mM de base Tris, pH 7.5). La mezcla se mezcló e incubó a 37°C por 4 horas, luego enfriada rápidamente con 50 mL de HCl (0.5 10 M). Una alícuota de la solución digerida se ¡nyectó sobre RP-HPLC y los péptidos resueltos por un gradiente acetonitrilo con 0.1 % TFA. Este método provee información para la evaluación de la integridad estructural primaria y secundaria de hGH. De manera más importante, este es el mejor método para analizar niveles de seguimiento de 15 Ala-hGH no separada en la reacción de separación y en el producto final. La única diferencia entre las digestiones trípticas de hGH y Ala-hGH es el octapéptido N-terminal, T1 vs. Ala-T1. Estos dos péptidos son resueltos en la línea de base usando un método RP-HPLC ¡socrático. *• 20 T1 : FPTIPLSR (SEQ ID No: 6) Ala-T1 : AFPTIPLSR (SEQ ID No: 7) Los Figuras 9-12 ilustran perfiles típicos de mapeo tríptico. La figura 9 ilustra los trazos del perfil ilustrando la diferencia en movilidad del péptido Ala-T1 comparado al péptido T1. La figura 10 muestra un trazo del perfil expandido verticalmente, ¡lustrando las diferencias en las áreas pico bajo las posiciones de elusión para Ala-T1 y T1. La Figura 11 ¡lustra los mapas trípticos de hGH de las fuentes comerciales (Humatrope y Zomacton). La Figura 12 muestra un trazo del perfil expandido verticalmente ilustrando la presencia o ausencia de Ala-T1 en una preparación cruda de hGH, la preparación del volumen final de hGH, y hGH de dos fuentes comerciales (Humatrope y Zomacton). Espectrometría de masas por electrospray (ES/MS) La medida esta basada en la intensidad pico para hGH (22,125) y Ala-hGH (22,195). La presencia de otros picos es indicativa de separación enzimática no específica. La Figura 13 ¡lustra los perfiles ES/MS de Ala-hGH antes de la separación con AAP, separación incompleta, y después la reacción se completa. La Figura 8 ¡lustra el perfil HPLC de hGH preparado por tratamiento de Ala-hGH con AAP, y dos preparaciones comerciales de hGH (Humatrope y Zomacton). La Figura 14 ilustra un perfil ES/MS sobrepuesto de Ala-hGH y hGH (panel final) junto con trazos HPLC del producto final resueltos en columnas RP-HPLC Y SE-HPLC.I Secuenciación N-terminal La secuenciación de proteína N-terminal se llevó a cabo por métodos estándar normales. Las cantidades relativas de Ala (presente en Ala-hGH) y Fen (en hGH) como el aminoácido N-terminal son indicativas del grado de separación. La separación interna también se puede detectar por análisis de secuencia N-terminal. La Figura 15 ilustra los trazos de los productos liberados después del ciclo 1 y ciclo 2 de una secuenciador de proteína automatizado. La fenilalanina (18.3 min) es el único residuo significativo detectado después de un ciclo (panel izquierdo). La prolina (14.2 min) es el único residuo significativo detectado en el ciclo 2. La cantidad de alanina (*) es insignificante en ambos ciclos, indicando la falta de residuos de alanina N-terminal en el producto final purificado.

EJEMPLO 7 Procesamiento in vitro del Inhibidor de la Vía del Factor Tisular (Ala- TFPI) usando amino peptidasa Ala-TFPI, aislada de E. coli (US 5,212,091 ), puede procesarse a TPFI usando AAP en solución. El Ala-TFPI replegado apropiadamente se ajusta a concentración de 0.5-3 mg por ml en 10 mM de fosfato, pH 8.0 ó 10 mM de borato, pH 9.5. A esto se agrega Aeromonas aminopeptidasa a una concentración de 3 unidades por ml y la reacción se permite que continúe por 24-36 horas a temperatura ambiente o por un tiempo más corto a 37°C. El curso de la reacción de separación se puede monitorizar por el método HPCL o por análisis de aminoácidos de la liberación de alanina de Ala-TPFI. Al final de la reacción, la solución se enfría rápidamente por adición de ácido acético al 2% (1 :1.5 dilución w/w). El grado de separación se determina por análisis HPLC de los fragmentos del péptido tríptico y por ES/MS del producto aislado. Ala-TPFI también se puede procesar a TFPI usando una AAP inmovilizada como se describe arriba. El grado de separación se determina por análisis HPCL de los fragmentos del péptido tríptico y por ES/MS del producto aislado. Todas las referencias, patentes, o solicitudes de patente citadas en la presente invención están incorporadas por referencia en su totalidad, como si escribieran la presente invención.

Listado de secuencias <110> Tou, Jacob Taylar . Douglas 120> Método para remover residuos de N-termmal alamna de los polipéptidos con aeromonas aminopeptidasa «130* SG3XD8-00-ÜS <150> 60/132,062 <15i> 19S5-04-30 <1S0> 7 1?Q> FastSEQ para versión i 0 Windows <310> 1 <211» 13 <213> secuencia Artificial <22£» Péptido sintético para probar el carácter específico del sustrato de metionina <223> Aminopeptidasa de E. Coli -c400> 1 Mße Ala Pro Thx Ser Ser Ser Thr Lyß Lys Thr Gln Leu 1 S 10 <21Q> 2 < 211> 11 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> Péptido sintético para probar el carácter específico del sustrato de metionina Aminopeptidaea de E. Coli <4O0> 2 iStít tro Thr Ser Ser Ser Thr I*yß I»ys Ola Cyß 1 5 10 210> 3 <2U> 13 <212> PRT ' 2*'> Secuencia Artificial 2?0> <i% 3 > pépt?jo sintético para probar el carácter específico del sustrato de melionma ammopeptidasa de E Coli -?4Ü0> 3 Leu Al* pro Thr Sßar Ser Ser Tfar Lys lyß Thr Gln Leu a s 10 «;2i0» 4 «211» 12 *e212> *8T "*213* Secuencia Artificial "<!223s- Paptido sintético para probar el carácter específico del sustrato de metiomna aminopßpt idasa de E Coil <400> 4 Xla Pro Tía Ser Ser Ser Thr Lys Lyß Thr ßln ten 1 5 10 21?> 5 «2U> 10 <212» PRT <213> Secuencia Artificial <220> <233? péptido sintético para probar el carácter específico del sustrato de metionma aminopeptidasa de E Cotí Pro Thr ser ser Ser Thr Lys Lys Gln Cys 1 5 10 <210> 6 <211> s <212> PRT <213* Secuencia Artificial <220> <223> T1 es el péptido tríptico N-terminal del hGH humano nativo «400» 6 *-!*« Pro Thr He Pro Leu Ser Arg 1 5 «2ie> 7 <Z11> 9 <212> PR <213> Secuencia Artificial <22©> <223> Ala-T1 es el péptido tríptico N-termmal de Ala-hGH <400> 7 Ala f»h* Pro Tbx He Pro Lea» ser ?xg l 5

Claims (21)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un método para eliminar un grupo alanil N-terminal de una proteína recombinante caracterizado porque comprende el contacto de dicha proteína recombinante con aminopeptidasa de Aeromonas de tal forma que dicho grupo alanil N-terminai se elimina y recupera la proteína recombinante resultante.

2.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicha proteína recombinante es de origen eucariótico.

3.- El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque dicha proteína recombinante se selecciona del grupo que consiste de hormona de crecimiento humano (HGH), somatotropina bovina (bST), somatotropina porcina (pST) e inhibidor de la vía del factor tisular humano (TFPIO.

4.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho contacto se lleva a cabo a un pH de alrededor de pH de 7 a aproximadamente pH de 11.

5.- El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque dicho contacto se lleva a cabo a un pH de alrededor de pH de 8 a aproximadamente pH de 10.

6.- El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque dicho contacto se lleva a cabo a un pH de alrededor de pH de 8.0 a aproximadamente pH de 9.5.

7.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho contacto se lleva a cabo en presencia de un regulador de pH seleccionado del grupo que consiste de borato, CHES, bicarbonato de sodio, fosfato de sodio y Tris-HCl.

8.- El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque dicho regulador de pH es borato.

9.- El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque dicho regulador de pH es fosfato de sodio.

10.- El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque dicho regulador de pH es Tris-HCl.

11.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicha aminopeptidasa está inmovilizada.

12.- El método de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque dicha aminopeptidasa está inmovilizada sobre una resina de cromatografía, superficie de cromatografía o gel de cromatografía.

13.- El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque dicha proteína recombinante se pasa a través de una columna que contiene dicha aminopeptidasa inmovilizada o una resina de cromatografía.

14.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicha aminopeptidasa no está inmovilizada (llevada a cabo en solución libre).

15.- Una proteína recombinante carente de una alanina N-terminal preparado por el método de la reivindicación 1.

16.- Un método para eliminar aminoácidos N-terminal de un poiipéptido precursor de la fórmula X-Y-Pro-Z con Aeromonas aminopeptidasa para producir un polipéptido de la fórmula Y-Pro-Z, en donde X es uno o más aminoácidos excepto prolina, Y es cualquier aminoácido excepto prolina, y Z es uno o más aminoácidos.

17.- El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque X es alanina.

18.- El método de conformidad con la reivindicación 16 caracterizado además porque Y se selecciona del grupo que consiste de fenilalanina, metionina, treonina y ácido aspártico.

19.- El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado además porque Y es fenilalanina.

20.- El método de conformidad con la reivindicación 16, en donde X es alanina y Y es fenilalanina.

21.- El método de conformidad con la reivindicación 19 o la reivindicación 20, caracterizado además porque el polipéptido precursor es Ala-hGH.