KR100371865B1 - 고정화아미노펩티다제엠을이용한천연형인간성장호르몬의제조방법 - Google Patents
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Abstract
메치오닐 인간성장호르몬의 N-말단 메치오닌을 제거함으로써 천연형 인간성장호르몬을 제조하는데 있어서, 메치오닐 인간성장호르몬을 돼지 신장으로부터 분리된 아미노펩티다제 엠을 셀루핀에 고정화시킨 고정화 아미노펩티다제 엠으로 처리하여 천연형 인간성장호르몬을 제조하는 방법은 전환율, 전환속도가 매우 우수하며 제조원가가 저렴하다.
Description
[산업상 이용분야]
본 발명은 유전자재조합 의해 생산한 메치오닐 인간성장호르몬(methionyl human growth hormone)으로부터 고정화 아미노펩티다제 엠을 이용하여 N-말단 메치오닌을 제거함으로써 천연형과 동일한 아미노산 배열을 갖는 재조합 인간성장호르몬을 제조하는 방법에 관한 것이다.
[종래 기술]
인간성장호르몬은 사람의 뇌하수체에서 생성되는 191개의 아미노산으로 구성된 분자량 약 22,000의 펩타이드호르몬으로 주로 소아의 뇌하수체성 왜소증 치료에 사용되어 왔다(Endocrinol. Rev. 4, 155, 1983).
종래에는 뇌하수체에서 추출한 인간성장호르몬이 사용되었으나, 그 양이 제한되어 치료를 받을 수 있는 사람이 극히 제한되었다. 또한 뇌하수체 유래인간성장호르몬을 사용한 환자중 치명적 신경계 질환인 Creutzfeldt-Jacob 질병이 발생된 예가 보고되어 뇌하수체 유래 인간성장호르몬의 사용은 중단되었다(Neuropathol. Applied Neurobiol. 12, 509, 1986).
최근에는 유전공학기술이 발전함에 따라 대장균, 효모 등에서 인간성장호르몬의 생산에 성공하였으며(Nature 281, 544, 1979; Proc. Nat. Acad. Sci. USA 81, 5956, 1984; Gene 39, 117, 1985), 유전공학방법으로 대장균에서 생산된 재조합 인간성장호르몬은은 독성 및 임상시험을 거쳐 1985년 미국의 Genentech사가 FDA의 허가를 획득하여 시판하였다.
그러나 이와 같이 대장균 또는 효모에서 생산된 인간성장호르몬은 N-말단에 단백질 합성 개시코돈(codon)인 AUG에서 유래한 메치오닌이 하나 더 첨가된 메치오닐 인간성장호르몬이 생산된다. 메치오닐 인간성장호르몬은 왜소중 치료효과에서 뇌하수체 유래 인간성장호르몬과 생물학적 활성이 동등하였으며 심각한 부작용은 나타내지 않았으나, 성장호르몬에 대한 항체의 생성 정도가 비교적 높게 나타났다 (Lancet i, 697, 1986; Archiv. Disease in Childhood, 62, 776,, 1987; Acta Paediatr. Scand. 337 (suppl.), 130, 1987).
따라서 재조합 인간성장호르몬의 제조과정에서 N-말단의 메치오닌이 없는 천연형 인간성장호르몬을 제조하고자 하는 많은 시도가 있었다. 상기한 바와 같이 N-말단에 부수적인 아미노산이 없는 천연형 인간성장호르몬을 생산하기 위한 방법으로는, 'Ala-Glu-hGH' 형태 또는 'Ile-Glu-Gly-Arg-hGH' 형태의 인간성장호르몬의 N-말단에 수개의 아미노산이 추가된 형태로 인간성장호르몬을 생산한 후 디펩티딜아미노펩티다제 IV 또는 Factor Xa와 같은 특수한 프로테아제(protease)를 이용하여 부수적인 아미노산을 절단하는 방법(WO 86/04609; Biotechnology 5, 161, 1987; J. Biotechnol. 18, 41, 1991), 성장호르몬이 세포 내에서 생합성된 후 세포의 주변질 또는 배양액 중으로 분비되면서 N-말단의 메치오닌이 제거되도록 하여 천연형 인간성장호르몬을 제조하는 방법(USP 4755465; Biotechnology 4, 991, 1986: Gene 55, 189, 1987; Gene 54, 197, 1987), 메치오닐 인간성장호르몬에 아미노펩티다제를 작용시켜 N-말단 메치오닌온 제거하여 천연형 인간성장호르몬을 제조하는 방법 등이 제시되었다(WO 86/01229; EP 204527 Al; KP 출원 92-25910).
그러나, 상기한 'Ala-Glu' 또는 'Ile-Glu-Gly-Arg'의 아미노산이 추가된 형태의 인간성장호르몬은 숙주 세포에서 발현시킬 경우 그 발현 수율이 전체 단백질에 대하여 각각 20 % 및 5 %로 그 수율이 N-말단에 메치오닌이 추가된 형태의 인간성장호르몬의 경우에 비하여 매우 낮다는 문제점이 있으며, 분비되면서 천연형 인간성장호르몬을 생산하는 방법 역시 발현 수율이 6내지 10 %로 낮다는 문제점이 있다.
상기한 바와 같이 메치오닌이 첨가된 형태가 아닌 인간성장호르몬을 생산할 경우 수율이 낮음에 따라 N-말단에 메치오닌이 추가된 형태의 인간성장호르몬으로부터 메치오닌을 제거하는 방법이 많이 개발되었는데, 그와 같은 방법으로는 아미노펩티다제로 처리하는 방법 또는 아미노펩티다제 엠으로 처리하는 방법이 알려져 있다(Biotechnology 5, 824, 1987; EP 204 527 Al). 그러나 상기한 아미노펩티다제 또는 아미노펩티다제 엠으로 처리하는 방법 역시 만족할 만한 처리 효율을 얻을 수 없다는 단점이 있고, 또 상기의 아미노펩티다제를 이용하는 방법들은 용해된(soluble) 상태로 아미노펩티다제를 이용하기 때문에 효소의 재사용을 위해서는 반응액에서 효소를 분리하거나 반응결과 생성된 천연형 인간성장호르몬의 정제시 효소를 제거해야하는 부가적 노력이 필요하여 정제비용이 증가한다는 단점이 있다.
[본 발명이 해결하려 하는 과제]
본 발명은 상기와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 천연형 인간성장호르몬을 고효율로 제조하는 방법을 제공하며, 아울러 아미노펩티다제 엠을 재사용함으로써 생산 원가가 저렴한 인간성장호르몬의 제조방법을 제공한다.
[과제를 해결하기 위한 수단]
일반적으로 적당한 담체에 고정화된 효소는 효소를 재사용하여 효소를 경제적으로 이용할 수 있으며 효소와 생성물과의 분리가 용이하다는 장점이 있다.
본 발명자들은 돼지신장에서 분리한 아미노펩티다제 엠(aminopeptidase M)을 적당한 담체에 고정화하여 고정화 아미노펩티다제 엠을 천연형 인간성장호르몬의 제조에 이용하기 위하여 효소의 고정화 최적조건을 찾던 중, 특정조건에서 메치오닐 인간성장호르몬의 N-말단 메치오닌을 제거하는 활성이 최대로 되며 고정화 아미노 펩티다제 엠을 25회 이상 반복 사용할 때까지 효소활성이 그대로 유지되어 고정화 아미노펩티다제 엠을 사용하는 것이 유리하다는 것을 발견하게 되어 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
상기한 본 발명의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, 유전자재조합을 이용하여 메치오닐 인간성장호르몬을 생산하고, 상기 메치오닐 인간성장호르몬의 N-말단 메치오닌을 제거하는 공정을 포함하는 천연 인간성장호르몬과 동일한 아미노산 배열을 갖는 천연형 인간성장 호르몬의 제조방법에 있어시, 상기한 메치오닐 인간성장호르몬의 N-말단 메치오닌을 제거하는 공정은 상기한 메치오닐 인간성장호르몬을 돼지 신장으로부터 분리된 아미노펩티다제 엠을 겔에 고정화시킨 고정화 아미노펩티다제 엠과 반응시켜 제거하는 것을 특징으로 하는 천연형 인간성장호르몬의 제조방법을 제공한다.
상기한 본 발명에 있어서, 상기 고정화 아미노펩티다제 엠과의 반응은 pH 6.5 내지 7.5 범위의 반응완충용액에서 수행하는 것이 바람직하며, 상기 반응 완충용액은 150mM의 염화칼륨과 1mM의 염화코발트를 더욱 포함하는 것이 더욱 바람직하다. 그리고 상기한 본 발명에 있어서, 상기 고정화 아미노펩티다제 엠과의 반응은 반응온도를 45℃ 내지 55℃ 범위에서 수행하는 것이 바람직하다.
그리고 상기한 본 발명에 있어서, 고정화 아미노펩티다제 엠은 셀루핀 겔g 당 1.1 내지 11.2mg의 아미노펩티다제 엠이 고정화된 것이 바람직하며, 상기 메치오닐 인간성장호르몬 mg당 0.1 내지 5 단위의 고정화 아미노펨티다제 엠으로 반응시키는 것이 바람직하다.
또 상기한 본 발명에서, 상기 고정화 아미노펩티다제 엠을 회수하여 재사용하는 것이 바람직하다.
[실시예]
이하 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 메치오닐 인간성장호르몬을 반응 완충액 중에서 아미노펩티다제 엠(aminopeptidase M)을 셀루핀 포르밀(cellufine formyl)에 고정화시킨 고정화 아미노펩티다제 엠으로 처리하는 천연형 인간성장호르몬의 제조방법을 제공하는 것이다.
상기 메치오닐 인간성장호르몬은 통상의 정제방법으로 얻어진 모든 메치오닐 인간성장호르몬을 사용할 수 있으며, 메치오닐 인간성장호르몬 mg당 0.1 내지 5 단위(unit)의 고정화 아미노펨티다제 엠을 처리하는 것이 바람직하다. 고정화 아미노 펩티다제 엠 단위의 정의는 50mM 테스·염산염 완충액(pH7.0)에 용해된 알라닌-파라 니트로아닐리드(Alanine-pNA)를 기질로 한 용액 1ml에 고정화 아미노펩티다제엠을 가하여 37℃에서 반응시켰을 때 분당 1μmol의 파라니트로아닐리드(p-nitroanilide)를 생성시킬 수 있는 효소의 양을 말한다.
본 발명에 따르면, 고정화 아미노펩티다제 엠은 셀루핀 포르밀 g당 1.1 내지 11.2mg의 아미노펩티다제 엠이 고정화된 것이 바람직하다. 상기한 범위를 벗어날 경우 고정화 효율이 저하될 수 있다. 반응완충용액의 pH는 6.5내지 7.5가 바람직하며, 반응완충용액에는 염화코발트를 1mM, 염화칼륨을 0.15M 되게 첨가하는 것이 좋다. 반응온도는 45℃ 내지 55℃로 하는 것이 바람직하다. 상기한 범위를 벗어날 경우 전환율 및 수율이 저하될 수 있다.
이하 본 발명의 바람직한 실시예 및 참조예를 기재한다. 그러나 하기한 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 본 발명의 바람직한 일 실시예일 뿐 본 발명이 하기한 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
메치오닐 인간성장호르몬의 고정화 아미노페티다제 엠에 의한 천연형 인간성장호르몬으로의 전환
시험관에 참조예 1에서 얻은 고정화 아미노펩티다제 엠 0.4ml을 넣고 완충액 (50mM 테스, pH 7.0, 150mM KCl, 1mM CoCl2)으로 5회 세척한 후 참조예 2에서 얻은 메치오닐 인간성장호르몬을 같은 완충액으로 투석하여 3.0mg을 섞은 후 완충액을 최종부피가 1.5ml이 되도록 첨가한 후 45℃에서 약하게 교반하면서 반응시켰다. 반응시작 후 0시간, 6시간, 18시간, 40시간 후 시료를 취하여 실온에 약 5분간 세워두어 고정화 아미노펩티다제 엠 겔을 가라앉힌 후 반응 상등액을 취하여 분석하였다. 반응 상등액에 존재하는 아미노산은 비들링마이어(Bidlingmeyer) 등의 방법(J. Chromatogr. 336, 93, 1984)에 따라 LKB사의 HPLC로 분석하였으며 그 결과를 (표1)에 나타내었다. (표1)에서와 같이 반응시간이 증가함에 따라 반응 상등액 중에 메치오닌의 양이 증가하였으며 다른 아미노산은 검출되지 않았다. 메치오닐 인간성장호르몬으로부터 천연형 인간성장호르몬으로 전환되는 과정은 릭긴(Riggin) 등의 방법(Anal. Biochem. 167, 199, 1987)에 따라 RP-HPLC로 분석하여 제1도얘 나타내었다. 반응시간이 경과함에 따라 메치오닐 인간성장호르몬의 피크(피크2)의 크기 비율이 감소하고 천연형 인간성장호르몬의 피크(피크1)의 크기 비율이 증가하였으며 40시간 경과시 메치오닐 인간성장호르몬의 피크는 거의 나타나지 않고 천연형 인간성장호르몬의 피크와 자연적으로 생성되는 디스아미드화 변이체가 관찰되었다. 피크1이 천연형 인간성장호르몬의 아미노산 서열과 일치하는지를 확인하기 위하여 피크1을 분획하여 워터스 모델 Milligen 660B로 N-말단 아미노산서열을 분석한 결과 'Phe-Pro-Thr-' 으로 확인되어 천연형 인간성장호르몬의 N-말단 아미노산 서열과 일치함을 알 수 있었다. 이러한 결과들로부터 참조예 1의 고정화 아미노펩티다제 엠으로 메치오닐 인간성장호르몬을 처리하면 N-말단의 메치오닌이 제거되어 천연형 인간성장호르몬으로 전환된다는 사실을 알 수 있었다.
표 1
실시예 2 고정화 아미노펩티다제 엠의 최적 반응 조건
시험관에 고정화 아미노펩티다제 엠 0.4ml을 넣고 150mM KCl과 1mM CoCl2가 첨가된 각 pH의 완충액(pH 5.0와 6.0은 50mM 구연산-인산나트륨 완충액, pH 6.5, 7.0, 7.5, 8.0은 50mM 테스-염산염 완충액)으로 5회 세척한 후 메치오널 인간성장호르몬 3.0mg을 섞고 각 pH의 완충액을 최종부피가 1.5ml이 되도록 첨가한 후 45℃에서 약하게 교반하면서 22시간동안 반응시켰다. 각 반응액을 실시예 1에서와 같이 RP-HPLC로 분석하여 메치오닐 인간성장호르몬의 천연형 인간성장호르몬으로의 전환율과 천연형 인간성장호르몬의 수율을 제2도에 나타내었다. 제2도에 나타난 것과 같이 pH 6.5 내지 pH 7.5 범위에서 전환율과 수율이 가장 높은 것을 알 수 있다.
또한 반응 온도의 영향을 조사하기 위하여 시험관에 고정화 아미노펩티다제 엠 0.4ml을 넣고 완충액(50mM 테스, pH 7.0, 150mM KCl, 1mM CoCl2)으로 5회 세척한 후 메치오닐 인간성장호르몬 3.0mg을 섞고 완충액을 최종부피가 1.5ml이 되도록 가한 후 각각 40, 45, 50, 55, 60℃에서 약하게 교반하면서 22시간 동안 반응시켰다. 각 반응액을 RP-HPLC로 분석하여 전환율과 수율을 제3도에 나타내었는데, 45℃내지 55℃의 범위에서 전환율과 수율이 가장 우수함을 알 수 있다.
실시예 3 고정화 아미노펩티다제 엠의 반복 사용
참조예 1의 고정화 아미노펩티다제 엠 약 5단위를 완충액(50mM테스, pH7.0, 150mM KCl, 1mM CoCl2)으로 5회 세척하고 메치오닐 인간성장호르몬 3.2mg과 같은 완충액을 가하여 1.6ml이 되도록 한 후 50℃에서 약하게 교반하면서 21시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후 반응용기를 실온에 약 5분간 세워두어 고정화 아미노펩티다제 엠 겔을 가라앉게 한 후 반응 상등액을 취하였다. 고정화아미노펩티다제 엠 겔은 같은 완충액으로 5회 세척한 후 메치오닐 인간성장호르몬 3.2mg과 완충액을 가하여 1.6ml이 되게 한 후 같은 조건으로 다시 반응시켰다. 위의 과정을 계속적으로 반복하여 반응 상등액들을 실시예1에서와 같이 수집하였다. 반응 상등액들을 실시예 1과 같이 RP-HPLC로 메치오닐 인간성장호르몬으로 부터 천연형 인간성장호르몬으로 전환되는 정도를 분석하여 제4도에 나타내었다. 제4도에서 보듯이 고정화 아미노펩티다제 엠을 25회 반복 사용하였을 때까지 메치오닐 인간성장호르몬으로부터 천연형 인간성장호르몬으로의 전환율이 일정한 값을 나타내 본 발명에서 제조한 고정화 아미노펩티다제 엠은 매우 안정하여 반복 사용할 수 있음을 알 수 있었다.
참조예 1 고정화 아미노펩티다제 엠의 제조
아미노펩티다재 엠을 200mM 인산염 완충액(pH7.0)에 투석시키고, 셀루핀 포르밀 겔(cellufine formyl gel, Amicon, USA)을 같은 완충액으로 수회 세척한 후 g 겔 당 적정한 비율로 아미노펩티다제 엠 용액과 섞는다. 이것을 28℃ 4시간동안 약하게 교반하면서 반응시킨 후 1g 겔 당 5mg의 NaBH3CN을 첨가하고 4℃에서 16시간동안 약하게 교반하면서 반응시켰다. 반응이 끝난 후 겔을 200mM 트리스 염산 완충액(pH7.0)으로 여러 번 씻은 후 g 겔 당 5mg의 NaBH3CN을 첨가하고 실온에서 5시간동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후 겔을 200mM 인산염 완충액(pH7.0)으로 씻은 후 완충액과 겔의 부피가 1:1이 되도록 완충액을 첨가한 후 고정화 아미노펩티다제 엠으로 사용하였다. 아미노펩티다제 엠과 셀루핀 포르밀 겔의 비율을 변화시켰을 때 고정화 효율과 아미노펩티다제 엠의 활성, 메치오닐 인간성장호르몬의 천연형 인간성장호르몬으로의 전환을 등을 비교하여 (표2)에 나타내었다. 고정화 효율은 가벨(Gabel) 등의 방법(Methods Enzymol. 44, 383, 1976)에 따라 결정하였고, 효소활성은 플라이더러(Pfleiderer)의 방법(Methods Enzymol. 19, 514, 1971)을 변형하여 측정하였으며 메치오닐 인간성장호르몬의 천연형 인간성장호르몬으로의 전환은 실시예에서와 같은 방법으로 측정하였다. (표2)에서와 같이 고정화 효율은 겔 g당 2.2, 4.5, 11.2g의 아미노펩티다제 엠을 첨가했을 때 모두 약 50∼51% 정도로 비슷하였다. 반면에 효소 활성은 g겔 당 2.2mg의 효소를 섞어준 것이 가장 높았으며, 메치오닐 인간성장호르몬의 천연형 인간성장호르몬으로의 전환율은 g겔 당 4.5mg의 효소를 섞어 고정화한 고정화 아미노펩티다제 엠이 가장 우수함을 알 수 있었다.
표 2
주) E는 효소량(mg)을, CF는 셀루핀 포르밀의 양(g)을 나타낸다.
참조예 2 메치오닐 인간성장호르몬의 생산
재조합 대장균 E. coli K12 W3110/pHGH401을 2.5g/L의 트립톤, 5g/L의 효모엑기스, 7g/L의 인산일수소칼륨, 2.46g/L의 황산암모늄을 포함하는 배지성분과 50mg/L의 암피실린이 포함된 배지 100ml이 들어있는 플라스크에 접종하고 37℃에서 7시간동안 교반하면서 배양한 후 배양액을 같은 조성의 배지 1L가 들어있는 플라스크에 접종하여 37℃에서 16시간동안 교반배양하였다. 이 배양액을 상기의 배지 성분에 10g/L의 포도당액, 3.78g/L의 황산마그네슘, 통상 사용하는 농도의 미량금속 이온들이 포함된 15L의 배지가 들어있는 발효기에 접종하고 37℃에서 교반배양하였다. 이때 용존산소의 농도가 포화농도의 40%로 유지되도록 공기를 공급하고 교반속도를 조절하였으며, 안티폼A를 첨가하여 거품을 제거하고 가성소다액을 가하여 pH를 6.9±0.1로 조절하면서 배양하였다. 약 6시간 배양 후 3-β-인돌 아크릴산을 최종농도가 약 50mg/L가 되도록 첨가하여 메치오닐 인간성장호르몬의 발현을 유도하였으며 세포성장이 정지기에 이를 때까지 배양하였다. 이 배양액을 원심분리하여 대장균 세포를 회수하고 가울린(Gaulin) 세포파쇄기를 이용하여 8,000psi의 압력으로 세포를 파쇄한 후 원심분리하여 메치오닐 인간성장호르몬이 포함된 봉입체를 회수하였다. 이 봉입체를 2M 요소용액에 현탁시키고 3N 가성소다액을 첨가하여 용해시킨 후 단백질 농도가 약 1.0mg/ml이 되도록 pH11.5로 조정된 증류수로 희석하여 실온에서 20시간 방치하여 메치오닐 인간성장호르몬이 활성화되도록 하였다. 활성화된 메치오닐 인간성장호르몬 액을 50mM 트리스-염산 완충액(pH8.2)으로 미리 평형화된 DEAE-세파로즈 패스트 플로우 컬럼(직경 10cm, 길이 60 cm)에 주입하고 같은 완충액으로 세척한 뒤 50mM 트리스·염산 완충액(pH 8.2)과 250mM 트리스·염산 완충액(pH 8.2) 각 10L씩을 트리스 염 선형농도구배가 형성되도록 흘리면서 메치오닐 인간성장호르몬을 시간당 1.2L의 유속으로 용출하였다. 용출액을 분획 당 200ml씩 나누어 받은 후 각 분획을 분석하여 메치오닐 인간성장호르몬에 해당되는 분획들을 수집하였다. 상기와 같이 생산된 메치오닐 인간성장호르몬은 에스디에스-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(SDS-PAGE)으로 분석했을 때 90% 이상의 순도를 가지며, 아미노산서열 분석 결과 N-말단 아미노산 서열이 'Met-Phe-Pro-'로 확인되었다.
제 1도는 메치오닐 인간성장호르몬에 고정화 아미노펩티다제 엠을 반응시킨 시료를 반응시간의 경과에 따라 역상고압액체크로마토그라피(RP-HPLC)로 분석한 결과를 나타낸 크로마토그램들이고,
제 2도는 고정화 아미노펩티다제 엠과의 반응에서 pH 변화에 따른 메치오닐 인간성장호르몬의 천연형 인간성장호르몬으로의 전환율과 수율의 변화를 나타내는 그래프이고,
제 3도는 고정화 아미노펩티다제 엠과의 반응에서 온도변화에 따른 메치오닐 인간성장호르몬의 천연형 인간성장호르몬으로의 전환율과 수율의 변화를 나타내는 그래프이고,
제 4도는 고정화 아미노펩티다제 엠의 재사용 횟수에 따른 메치오닐 인간성장호르몬의 천연형 인간성장호르몬으로의 전환율 변화를 나타내는 그래프이다.
Claims (7)
- 유전자 재조합을 이용하여 메치오닐 인간 성장 호르몬을 생산하고,상기 메치오닐 인간 성장 호르몬의 N-말단 메치오닌을 제거하는 공정을 포함하는 천연 인간 성장 호르몬과 동일한 아미노산 배열을 갖는 천연형 인간 성장 호르몬의 제조 방법에 있어서,상기한 메치오닐 인간 성장 호르몬의 N-말단 메치오닌을 제거하는 공정은 상기한 메치오닐 인간 성장 호르몬을 돼지 신장으로부터 분리한 아미노펩티다제 엠을 셀루핀 겔에 고정화시킨 고정화 아미노펩티다제 엠과 반응시켜 제거하는 것을 특징으로 하는 천연현 인간 성장 호르몬의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 고정화 아미노펩티다제 엠과의 반응은 pH 6.5 내지 7.5 범위의 반응완층수용액에서 수행하는 제조방법.
- 제2항에 있어서, 상기 반응 완충용액은 150mM의 염화칼륨과 1mM의 염화코발트를 더욱 포함하는 것인 제조방법.
- 제1항에 있어서,상기 고정화 아미노펩티다제 엠과의 반응은 반응온도를 45℃ 내지 55℃ 범위에서 수행하는 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 고정화 아미노펩티다제 엠은 셀루핀 겔 g 당 1.1 내지 11.2mg의 아미노펩티다제 엠이 고정화된 것인 제조방법.
- 제1항에 있어서 , 상기 메치오닐 인간성장호르몬 mg당 0.1 내지 5 단위의 고정화 아미노펩티다에 엠으로 반응시키는 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 고정화 아미노펩티다제 엠을 회수하여 재사용하는 제조방법.
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| KR1019950023423A KR100371865B1 (ko) | 1995-07-31 | 1995-07-31 | 고정화아미노펩티다제엠을이용한천연형인간성장호르몬의제조방법 |
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|---|---|---|---|---|
| EP0204527A1 (en) * | 1985-06-04 | 1986-12-10 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Removal of the N-terminal methionine from methionylproteins |
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1995
- 1995-07-31 KR KR1019950023423A patent/KR100371865B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| KR970006494A (ko) | 1997-02-21 |
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