KR100251285B1 - 재조합 인간성장호르몬의 정제방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 재조합 인간성장호르몬(human growth hormone: hGH)의 효율적인 정제방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 hGH 융합단백질(GST-UK-hGH) 발현벡터를 포함하는 재조합 대장균에서 발현된 융합단백질의 봉입체(inclusion body)로부터, 젤 여과 칼럼에 의한 재중첩(refolding) 과정, 적절한 조건에서의 유로키나제(urokinase) 절단과정 및 산침전 과정 등의 일련의 과정을 통한, 효율적이면서도 경제적인 재조합 hGH의 정제방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 재조합 인간성장호르몬(human growth hormone: hGH)의 효율적인 정제방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 hGH 융합단백질(GSTUKhGH) 발현벡터를 포함하는 재조합 대장균에서 발현된 융합단백질의 봉입체(inclusion body)로부터, 젤 여과 칼럼에 의한 재중첩(refolding) 과정, 적절한 조건에서의 유로키나제(urokinase) 절단과정 및 산침전 과정 등의 일련의 과정을 통한, 효율적이면서도 경제적인 재조합 hGH의 정제방법에 관한 것이다.
재조합 DNA, 발효 및 정제기술이 발전되면서 재조합 단백질의 대량생산을 통한 산업화 공정이 개발되고 있으며, 특히 간단하면서도 경제적인 정제 및 생산공정은 산업화에 큰 영향을 준다. 각각의 단백질마다 경제적인 생산공정이 다르고, 그 나름대로의 대량생산을 위한 정제방법 또한 다르다.
융합형태로 발현되는 재조합 단백질의 정제시 일반적으로 사용되는 재중첩 방법에는 재조합 단백질의 봉입체를 화학물질로 용해한 후의 투석 방법이나 단백질의 희석방법이 있는데, 투석방법은 투석용 여과체(membrance)를 사용하므로 대량생산에 도입하기에는 경제성이 떨어지는 단점이 있고, 단백질 희석방법은 전체 단백질 의 부피가 많아져 그 다음 단계인 융합단백질로부터 목적단백질을 절단하기 위해서는 단백질을 농축해야 하는 단점이 있다.
단백질의 재중첩 후 다음 정제단계인, 융합단백질로부터 목적단백질을 분리하는 방법에는 화학물질(chemical cleavage)을 이용한 방법 또는 여러 가지 효소를 이용하여 절단하는 방법들이 있다. 화학적 방법들은 일반적으로 절단부위에 대한 특이성이 낮으며, 효소를 이용한 방법들은 절단부위에 대한 특이성은 높으나 효소 가격이 비싸므로 경제적이지 못한 문제점 등이 있다.
이상과 같은 융합단백질로부터의 목적단백질의 절단도 중요하나, 정제공정에 있어서 다른 여러 가지 단백질로부터 절단된 목적단백질을 간단하게 분리하는 방법은 전체 정제공정의 생산성 및 순도에 높은 비중을 차지한다. 각각의 재조합 단백질의 특성에 따라 분리하는 방법이 상이하나, 일반적으로 사용되는 방법에는 융합파트너에 특이적으로 결합하는 친화성 레진(예를 들면, GST친화성 칼럼)을 이용한 방법 또는 물질크기에 따른 분리 칼럼인 겔 여과(gel filtration) 방법이 있는데, 친화성 칼럼은 이에 사용되는 레진의 가격이 비싸 대량생산용으로 사용하기에는 적합하지 못하다는 단점이 있고, 겔 여과 방법은 시간이 많이 걸리는 단점이 있다.
상기에서 상술한 바와 같이 발현된 단백질의 특성에 따라, 종래 정제방법으로는 경제적인 대량생산을 수행하기 어려운 재조합 단백질은 정제공정의 최적화를 통하여 생산성을 향상시킬 수 있다.
한편, 인간 성장호르몬(hGH)은 뇌하수체전엽 호르몬 중 가장 많이 분비되는 단일쇄(single chain)의 단백질 호르몬으로서, 191개의 아미노산 잔기로 구성되는 분자량 약 21,500Da의 호르몬이다. 성장호르몬은 뇌와 눈을 제외한 거의 모든 체내 조직 장기의 세포를 증식시켜 균형잡힌 성장을 촉진하며, 골성장으로 키가 커지고 골격근이 비대해지는 생리학적 작용을 가지고 있어 임상적으로는 뇌하수체 기능 부전성 왜소증 치료에 사용되고 있다. 이전에는 주로 교통사고나 질병으로 사망한 인간의 뇌하수체로부터 인간 성장호르몬을 추출 정제하여 사용하여 왔으나, 그 양이 크게 제한되어 있고, 또한 고도로 정제된 사람의 뇌하수체 호르몬만을 사용하여야하는 점때문에 모든 왜소증 환자에게 공급되지 못하였으며, 가격 또한 높아 사용에 많은 어려움이 있었다. 더욱이, 추출 정제한 인간 성장호르몬을 투여받은 어린이가 괴질의 바이러스에 감염되어 사망한 사고가 발생하는 등, 그 사용에 문제점이 있어 미국 식품 의약국(FAD)에서는 사망한 인간의 뇌하수체로부터 추출정제한 인간 성장호르몬의 사용을 금지시켰다. 추출 이외에도 화학적 합성이나 조직 배양 방법 등도 있으나, 이들 역시 수율이 낮은 단점을 가지고 있어 생산 방법의 개선이 제기되어 왔다.
상기한 hGH를 대량 생산하기 위하여, 본 발명자들은 이미 L아라비노즈 오페론을 이용한 유도성의 hGH 융합단백질(hGHUKGST) 발현벡터 ΔpG2를 제조하였는 바, 이 발현벡터에 사용된 융합파트너는Schistosoma japonicum유래의 GST( glutathione Stransferase) 중 아미노 말단부터 69번째 아미노산에 해당하는 단편이고, 또한 발현벡터에는 융합된 부분을 절단하기 위해서 우수한 기질 특이성을 갖는 유로키나제(UK)의 절단 인식부위가 포함되어 있다(참조: 대한민국 특허출원 제 97-40321호). 이후, hGH의 대량생산을 위해서, 전기 발현벡터 ΔpG2로 형질전환된 재조합 대장균(MC1061:ΔpG2)의 DO-stat 유가식 배양방법을 확립하였으나(참조: 동일한 출원하는 "인간성장호르몬의 대량생산을 위한 DO-stat 유가식 배양방법"), 최적의 정제공정이 없이는 만족할 만할 수준의 재조합 hGH를 생산할 수 없었다.
이에, 본 발명자들은 정제공정의 최적화를 통하여 hGH의 생산성을 향상시키고자 예의 연구노력한 결과, 재조합 대장균(MC1061:ΔpG2, KFCC-10976)의 DO-stat 유가식 배양방법을 통하여 얻은 hGH 융합단백질의 봉입체를 용해시키고, Sephadex G-25 칼럼을 이용하여 재중첩(refolding)시킨 다음, pH 8∼9 및 25∼37℃의 반응조건에서 유로키나제와 반응시킴으써 최소량의 유로키나제로 최대의 절단효율을 높이고, pH 4∼6에서의 산침전 과정을 통해, 융합단백질로부터 절단된 hGH을 간단하면서도 경제적으로 대량 정제할 수 있음을 발견하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
결국, 본 발명의 목적은 젤 여과 칼럼에 의한 단백질 재중첩 과정, 적절한 반응조건에서 유로키나제에 의한 절단과정 및 산침전 과정을 채용하는, 재조합 hGH의 효율적인 정제방법을 제공하는 것이다.
도 1은 인간성장호르몬 융합단백질의 봉입체를 용해한 후, 재중첩(refolding)의 목적으로 사용한 Sephadex G-25 크로마토그래피의 크로마토그램이다.
도 2는 유로키나제의 반응 조건에 따른 인간성장호르몬의 수율을 나타내는 그래프이다.
도 3은 융합단백질을 유로키나제로 처리한 후, 각 pH에 의한 산침전에 따른 인간성장호르몬의 수율을 나타내는 그래프이다.
도 4는 본 발명의 정제과정 중 각 단계에서 회수된 인간성장호르몬을 비환원성 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동한 결과를 나타내는 사진이다.
이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.
살모넬라 균주의 L-아라비노즈 오페론을 이용한 유도성의 hGH 융합단백질 발현벡터를 포함하는 재조합 대장균 MC1061:ΔpG2(KFCC-10976)(참조: 대한민국 특허출원 제 97-40321호)로부터 재조합 hGH만을 순수하게 대량 제조하기 위하여, 이 융합단백질의 특성에 맞는 간단하고도 경제적인 방법을 도입하였다.
즉, 전기 형질전환체의 DO-stat 유가식 배양방법(참조: 동일한 출원하는 "인간성장호르몬의 대량생산을 위한 DO-stat 유가식 배양방법")으로 얻은 hGH 융합단백질(hGHUKGST)의 봉입체를 화학물질, 바람직하게는 6 내지 8M 요소(urea)를 사용하여 용해한 후, 젤 여과 칼럼, 가장 바람직하게는 Sephadex G-25 칼럼을 이용하여 재중첩시켰다. Sephadex G-25 칼럼은 주로 완충용액을 교체할 때 사용하는 칼럼인데, 봉입체를 요소 등의 화학물질로 용해한 후 대량의 화학물질을 손쉽게 제거할 수 있는 장점이 있다. 이때, 사용되는 바람직한 이동상의 완충용액은 10 내지 100mM 트리스 완충용액(pH 9 내지 12)이다.
단백질의 재중첩 후, hGH 융합단백질(hGHUKGST)로부터 hGH를 분리하기 위하여 세린계 단백질 분해효소인 유로키나제를 pH 8∼9, 25∼37℃의 반응조건에서 처리하였다. 전술한 반응조건은 적은 양의 유로키나제로서 최대한의 절단 효과를 얻을 수 있는 가장 효율적인 유로키나제의 작용 조건이다.
다음 단계로서, 세포내 물질이나 융합단백질 및 유로키나제를 포함한 여러 가지 단백질로부터 hGH을 간단하게 순수분리하기 위하여, pH 4∼6에서의 산침전 방법을 사용하였는데, 90% 이상의 순도를 갖는 hGH 단백질을 분리할 수 있었다. 융합단백질이 pH 4∼6 사이의 산에서 침전되는 특성을 이용하여, 유로키나제에 의하여 절단된 hGH를 간단하게 분리할 수 있는 방법이다.
상술한 일련의 과정을 통하여, hGH 융합단백질(hGHUKGST)로부터 재조합 hGH만을 효율적이고도 경제적으로 대량 분리할 수 있었다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 이들 실시예에 의해 본 발명의 범위가 한정되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자들에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: hGH 융합단백질 봉입체의 용해 및 재중첩
hGH 융합단백질 발현균주(MC1061:ΔpG2, KFCC-10976)(참조: 대한민국 특허출원 제 97-40321호)를 DO-stat 유가식으로 배양하여(참조: 동일한 출원하는 "인간성장호르몬의 대량생산을 위한 DO-stat 유가식 배양방법") 얻은 배양액으로부터 연속원심기를 사용하여 세포침전물을 수거하였다. 이를 EDTA와 NaCl이 첨가된 트리스 완충용액에 용해시킨 다음, 세포파쇄기로 세포를 파쇄하였다. 여기에 라이소자임 및 DNA 절단효소(DNase I)을 첨가하여 교반한 후, 이를 원심분리하여 상층액을 버리고 침전물을 EDTA가 첨가된 트리스 완충용액으로 세척하고 다시 원심분리하였다. 이 과정을 두 번 반복하여 얻은 침전물을 디옥시콜릭산이 첨가된 트리스 완충용액으로 세척하고 원심분리하였다. 이 과정을 세번 번복하고 얻어진 봉입체는 트리스 완충용액으로 세척하고 원심분리하였고, 이 과정 또한 세 번 반복하였다. 이렇게 얻어진 침전물은 hGH 융합단백질(hGHUKGST)의 봉입체로서, 8M 요소와 EDTA가 함유된 트리스 완충용액에 용해시켰다. 이를 Sephadex G-25 칼럼 크로마토그래피하면서 탈염과 재중첩 과정을 진행시켰다(참조: 도 1). 칼럼 크로마토그래피시 사용되는 이동상의 완충용액은 50mM 트리스 완충용액(pH 10)이었다.
실시예 2: 유로키나제를 이용한 hGH 융합단백질의 절단
실시예 1에서 얻은 재중첩된 hGH 융합단백질의 수용액에, 단백질양의 1/500의 비율에 해당하는 만큼의 유로키나제를 첨가하여 융합단백질의 절단 인식부위만을 특이적으로 절단하도록 하였다(참조: 도 2). 이때, 온도 30℃ 및 pH 8의 반응조건에서 교반하면서 15시간 정도 절단 반응을 진행하였다.
실시예 3: 산침전을 통한 hGH의 1단계 정제
실시예 2의 방법에 의하여 절단된 hGH 수용액을 50% 염산을 사용하여 산침전 과정을 진행하였다(참조: 도 3). 절단된 hGH 수용액의 pH을 5.0로 조정하여 유로키나제의 반응을 중지시키면서, 융합파트너 GST와 대장균 유래 단백질 및 절단되지 않은 hGH 융합단백질 등이 침전되도록 유도한 후, 원심분리하여 상층액을 수득하였다. 이 상층액을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분석한 결과, hGH가 단일 밴드로서 90% 이상의 순도를 보일 만큼 상당량의 불순물이 제거되는 정제효과를 확인하였다(참조: 도 4). 도 4에서, 제 1레인은 Sephadex G-25 겔 여과 칼럼에서 얻은 용출액, 제 2레인은 유로키나제 처리액, 제 3레인은 산침전후의 상층액, 제 4 및 5레인은 산침전후의 상층액을 음이온 교환수지 칼럼 크로마토그래피하여 얻은 용출액, 제 6레인은 산침전후의 상층액을 소수성 수지 칼럼 크로마토그래피하여 얻은 용출액을 각각 나타낸다.
이상에서 설명하고 입증하였듯이, hGH 융합단백질(hGH-UK-GST)의 봉입체를 용해시키고, Sephadex G-25 칼럼을 이용하여 재중첩시킨 다음, pH 8∼9 및 25∼37℃의 반응조건에서 유로키나제를 반응시켜 절단효율을 높이고, pH 4∼6에서의 산침전 과정을 통해, 전기 융합단백질로부터 hGH을 간단하면서도 경제적으로 대량 정제한다.
Claims (7)
- 융합파트너와 목적단백질인 인간성장호르몬 사이에 유로키나제 절단부위를 갖는 융합단백질의 봉입체(inclusion body)를 용해한 후, 겔 여과 칼럼을 사용하여 재중첩(refolding)하고, 유로키나제를 사용하여 융합단백질로부터 인간성장호르몬을 절단한 다음, 산 침전 과정을 채용하는 재조합 인간성장호르몬의 정제방법.
- 제 1항에 있어서,융합단백질의 봉입체는 대장균 MC1061:ΔpG2(KFCC-10976)에서 생산된 봉입체인 것을 특징으로 하는재조합 인간성장호르몬의 정제방법.
- 제 1항에 있어서,용해는 6∼8M 요소에 의해 수행되고, 겔 여과 칼럼은 Sephadex G-25인 것을 특징으로 하는재조합 인간성장호르몬의 정제방법.
- 제 3항에 있어서,칼럼 크로마토그래피시 사용되는 이동상 완충용액은 10 내지 100mM 트리스 완충용액인 것을 특징으로 하는재조합 인간성장호르몬의 정제방법.
- 제 3항에 있어서,칼럼 크로마토그래피시 사용되는 이동상 완충용액의 pH는 9 내지 12인 것을 특징으로 하는재조합 인간성장호르몬의 정제방법.
- 제 1항에 있어서,유로키나제는 pH 8∼9 및 25∼37℃의 조건에서 융합단백질과 반응시키는 것을 특징으로 하는재조합 인간성장호르몬의 정제방법.
- 제 1항에 있어서,산 침전은 pH 4∼6에서 진행시키는 것을 특징으로 하는재조합 인간성장호르몬의 정제방법.
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