JPH0665318B2 - ヒト成長ホルモンの製造方法 - Google Patents

ヒト成長ホルモンの製造方法

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JPH0665318B2
JPH0665318B2 JP61501206A JP50120686A JPH0665318B2 JP H0665318 B2 JPH0665318 B2 JP H0665318B2 JP 61501206 A JP61501206 A JP 61501206A JP 50120686 A JP50120686 A JP 50120686A JP H0665318 B2 JPH0665318 B2 JP H0665318B2
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ジペプチジル アミノペプチダーゼI(DA
PI)(E.C.3.4.14.1)を使用してアミノ
末端が延長された(amino terminal extended)ヒト成
長ホルモンからヒト成長ホルモン(hGH)を製造する
方法に関する。
米国特許第4342832号明細書から、メチオニンと
関連したhGHのコードである組換え体の宿主細胞、特
に大腸菌(Escherichia coli)中での醗酵によって生
合成のhGHを製造する方法が知られている。しかし、
この既知の方法では、N末端が、成熟(ripe)hGHに
は存在しないアミノ酸であるメチオニンに結合したhG
Hが得られる。
hGHと完全には同一でない成長ホルモンの使用におい
ては抗原反応や他の副作用の危険があるので、正しいア
ミノ酸配列を有する生合成のhGHを製造できる方法が
強く望まれている。この問題に対する解決手段がUS
SN 488232(DK特許出願2046/84)明
細書に提出されている。これは緑膿菌(Pseudomonas a
eruginosa)また大腸菌等の組換え体原核微生物中でプ
レhGHからhGHを製造する方法に関したものであ
る。
しかし、治療に使用するためのメチオニンを伴わないh
GHの製造に緑膿菌を使用することは、この細菌および
多くの他のシュードモナス属(Pseudomonas)の細菌
が、潜在的に病原性であり、hGHの精製では除去が困
難な毒性のトキシンを合成する危険があるために、製造
方法としての価値を損われている。
プレhGHの発現(expression)の後に、たんぱく質分
解性(proteolytic)の開裂によって大腸菌(これは病
原性ではない)中で成熟hGHを得ることが、DK特許
出願2046/84明細書に示されているが、たんぱく
質分解性の開裂によって必ず成熟hGH、つまり正しい
アミノ酸配列を有するhGHが形成されることは、この
明細書には記述されていない。
上述したように、Met−hGHの使用には危険が伴う可
能性がある。アミノペプチダーゼによってメチオニン基
を酵素開裂する方法が提出されているが、この型の既知
の酵素法では100%の変換は起きないので、これによ
ってこの問題が解決されたわけではない。通常の製造的
な(preparative)精製法では完全には分離できないh
GHとMet−hGHの混合物が生じる。
本発明は、高い収率で酵素開裂できるプレ配列に結合し
ており、クロマトグラフィー等の既知の精製法によって
満足に分離できる生成物を酵素開裂によって与える生合
成のhGHを製造することは可能であるという考えに基
づいている。このように、治療に適している均質な真正
の(authentic)hGHを商業的規模の量で得ることが
可能である。
請求の範囲第1項の特徴部分に定められている特性を特
徴とする本発明の方法では、酵素ジペプチジル アミノ
ペプチダーゼ(DAP I)(E.C.3.4.14.
1)が、hGHの特定のアミノ末端の延長を開裂するた
めに使用される。この酵素は特異的であり、次に示す条
件で特にペプチドおよびたんぱく質のN末端からジペプ
チジルを開裂する。
a)たんぱく質/ペプチドのN末端アミノ酸がLysまたは
Argではない。
b)たんぱく質/ペプチドのN末端から2番目または3番
目のアミノ酸がProではない。
hGHのN末端配列は、 Phe−Pro−Thr−Ile であり、このことはDAP Iが1と2で示したhGH
の結合を開裂できないことを意味している。
DAP Iはジペプチドを開裂するので、アミノ末端が
延長されたhGHが余分のアミノ酸を伴わないhGHに
変換されるためには、この延長が偶数のアミノ酸からな
るものでなければならないことは明らかである。
この酵素が上に述べた特異性を有しているので、ジペプ
チドの開裂が延長の全体が開裂される前に止まらないた
めには、この伸長が奇数部位にLysまたはArgを含んで
はならないことと、Proがある場合はそれはN末端アミ
ノ酸としてのみ位置できることが明らかである。
いずれの酵素反応も100%の変換を行うことは期待で
きないので、真正のhGHをアミノ酸末端が延長された
hGHから分析的かつ製造的に分離できるアミノ酸を延
長に導入することが必要である。これは荷電した側鎖を
有するアミノ酸、即ち、GluまたはAsp(負に荷電した
側鎖)またはArg、LysまたはHis(正に荷電した側
鎖)を選ぶことで成される。そして、荷電に関して互い
に中和するような正と負に荷電したアミノ酸残基の組合
せが延長の中に選ばれていないことを条件として、アニ
オン交換とカチオン交換(分析的または製造的)によっ
てまたはアニオン電気泳動とカチオン電気泳動によっ
て、アミノ末端が延長されたhGHを(真正の)hGH
から分離することが可能である。
アミノ末端の延長の全体が開裂されたかどうかを観測で
きるので、hGHのN末端に直接結合しているジペプチ
ド成分中に少なくとも一つの荷電したアミノ酸が含まれ
ると有利である。しかし、延長の最後のアミノ酸残基が
荷電した側鎖を有するアミノ酸であることが最も望まし
い。これは、体中の微生物がN末端メチオニン残基を部
分的にのみ開裂する場合に特に重要である。
hGHに対するアミノ末端の延長の中の荷電した側鎖を
有するアミノ酸が、全く正にのみ荷電しているか、また
は全く負にのみ荷電していることが最も望ましい。この
ことは、アミノ末端が延長されたhGHと、部分的に酵
素変換されたアミノ末端が延長されたhGHと、真正の
hGHとが、常に同じ正味の荷電を持つことを防ぐ。
hGHでは、一定のGln残基とAsn残基の脱アミノ化が
起きる。つまり、GlnとAsnは、負に荷電した側鎖を有
するアミノ酸であるGluとAspにそれぞれ変換される。
この理由のために、アミノ末端の延長の荷電したアミノ
酸が負に荷電したGluおよび/またはAspであることが
最も望ましい。というのは、これによって、hGHの中
の一つまたはそれ以上の脱アミノ化が延長に存在する正
の荷電を中和する状況を避けることができるからであ
る。そのような荷電の中和は、多分に未反応の脱アミノ
化されたアミノ末端が延長されたhGHを、イオン交換
によって、酵素的に形成されたhGHから分離すること
を不可能にする。
DAP Iを用いて開裂される特に適したアミノ末端の
延長の例を次に示す。
1. Met−Glu−Ala−Glu 2. (Ala−Glu)、式中rは1からまでの 整数 3. Met−Phe−Glu−Glu 4. Thr−Glu−Ala−Glu 5. Met−Asp−Ala−Asp 6. Met−Glu−Ala−Asp これらおよび他の適当なアミノ末端の延長は、これらの
結合したアミノ末端の延長を有するヒト成長ホルモンの
コードであるプラスミドで形質転換した微生物を、適当
な基質中で醗酵させることにより得ることができる。
いくつかの特定のプレ配列では、メチオニンは、これは
大腸菌中で形成される全てのたんぱく質のN末端アミノ
酸であるが、たんぱく質の発現後に微生物中で酵素開裂
される。このようにして、例えば、上に述べたアミノ末
端が延長されたhGHたんぱく質が得られる。
これらのたんぱく質は通常の精製法によって精製され
る。アミノ末端の延長は選択的に高収率で開裂され、そ
の後、形成されたhGHはアニオン交換によって、残り
の部分的に変換されたアミノ末端が延長されたhGHか
ら容易に分離される。
本発明の方法を次の幾つかの作業例によってより詳しく
説明する。
例1 活性酵素または酵素複合体の製造 シグマ(Sigma)からのロイシン アミノペプチダーゼ
試料が、活性酵素または酵素複合体の製造のための出発
物質として使用され、活性酵素はロイシン アミノペプ
チダーゼ(LAP)と共に分別された。活性酵素は、フ
ァルマシア(Pharmacia)からの高度に可溶性のモノQ
(monoQ)上でのIE−HPLC(イオン交換HPL
C)によりLAPから分別できた。
分別 カラム:0.196cm2 x5cm。モノQ(ファル マシア)を詰めた。10μm±0.2μm。
緩衝液A:20mMトリス−Cl、5mM MgCl pH=8.5。
緩衝液B:20mMトリス−Cl、5mM MgCl、500mM NaCl pH=8.5。
流速:1ml/分。
注入容積:500μl。
検出:280nm、0.5AUFS。
温度:20℃ 勾配の表: 分画:1min-1
10mgのLAP/mlと12U/mgを含む使用したロイシ
ン アミノペプチダーゼ試料(シグマ、L−1503、
ロット番号14F−8155)を緩衝液Aを用いて2.
6mg/mlに希釈した。500μlがカラムに適用され
た。図に表わした分別のUVプロフィールは、この試料
が不均質であることを示していた。17の分画が集めら
れ、ロイシン アミノペプチダーゼ活性とAla−Glu−
hGHをhGHへ変換する比活性とを調べられた。
ロイシン アミノペプチダーゼ活性は、文献1(E.M
er ck:Analytisches Zentrallab.Pruefungsvorsch
rift code NO.AZL 0526675)に記述される
ように、L−ロイシンアミドをL−ロイシンとアンモニ
アに変換することにより、分光光度計で238nm、pH=
8.5で測定された。それぞれの分画の300μlが、
活性測定の前に40℃で2時間予備インキュベーション
された。活性測定の結果を図に示した。
Ala−Glu−hGHのhGHへの変換に対する比活性は
次の方法で測定された。個々の分画の100μlを、後
に記述するようにした生成されたAla−Glu−hGH
(5mM MgCl 10mMトリス pH=8.5中
に1mg/ml)の100μlと混合し、pHを4.2に調節
した。反応混合物は2時間後に、10%ゲル上でのポリ
アクリルアミドゲル電気泳動によって分析された。変換
の度合いははゲルのレーザースキャンによって測定し
た。結果を図に示した。
個々の分画のロイシン アミノペプチダーゼ活性を図に
示した。LAP活性は分画13と分画14にのみ存在し。L
AP活性のバランス計算は、全ての適用したLAP活性
がこれらの二つの分画に溶出されたことを示した。
Ala−Glu−hGHのhGHへの変換に対する活性は、
分画12を最大として分画9から分画15までに存在し、そ
れから活性は急速に減少した。このように、二つの酵素
活性が存在することと、これを一定の分別法によって分
離することが可能であることは明らかとなった。Ala−
Glu−hGHの変換に対する比活性は酵素DAP Iの
存在によるものであることが証明された。
生合成によるAla−Glu−hGHの製造 ヒト成長ホルモン hGH(191アミノ酸残基、その
最初の4つのアミノ酸はPhe−Pro−Thr−Ileであ
る)のようなアミノ酸配列を有するたんぱく質のコード
であるクローニングされたDNA配列が、以下で合成的
に生成された二重らせんDNA配列と、+ストランドの
3′末端が上に述べた遺伝子の+5′末端と結合し、合
成DNA配列ストランドの5′末端が上に述べた遺伝子
の3′末端と結合するように、次のブラントエンド結合
によって結合された。
+5′ CGATG GCT GAA −3′ TAC CGA CTT ここで、+ストランドの最初の二つのヌクレオチドはC
laI制限部位のオーバーハング(overhang)であり、
その後に続くヌクレオチド配列がアミノ酸配列Met−A
la−Glu−に対するコードである。
上に述べた遺伝子が通常の遺伝子クローニング技術によ
って、融合したTrp−Lacプロモータ並びにSD配列A
GGAを含む発現プラスミドへ導入された。この構造は
Met−Ala−Glu−hGHを発現するはずのものであっ
た。
それから、このプラスミド構造が従来の技術によって大
腸菌細胞に導入された。上述の構造を含む適当なクロー
ンが単離され、5スケールで培養された。細胞は遠心
分離によって収穫され、小容積に懸濁され、いわゆる
「フレンチプレス(Erench press)」を使用して溶菌
された。
予測した融合たんぱく質を、hGH抗体を使用する免疫
学的方法によって上に述べた細菌抽出物中に証明するこ
とができた。これは培養基中200mg/の濃度に対応
していた。融合たんぱく質は常法に従い、アニオン交
換、硫酸アンモニウム沈澱および疎水クロマトグラフィ
ーによって精製された。
精製した(予測の)Met−Ala−Glu−hGHはSDS
電気泳動から、純度が99%以上であると計算された。
アミノ末端配列決定により、精製したhGH物質はAla
−Glu−hGHの配列を持つことが示された。これは、
Metが大腸菌の酵素によって開裂されたことを示してい
た。
Ala−Glu−hGHからhGHへの酵素開裂 20mMトリス−Cl、pH4.2中の100mgのAla−
Glu−hGH(1.5mg/ml)を、ブタ腎臓から上述の
ようにして単離されたDAP I活性を有する酵素分画
の7mgと混合した。
それから、反応混合物は40℃でインキュベーションさ
れた。4.5時間後、混合物は4℃に冷却された。冷却
された反応混合物はアニオン交換によって分別され、そ
の後、主ピーク(hGH生成物)が単離された。収率は
90%であった。
hGH生成物はSDS電気泳動から、純度が99%以上
であると計算された。アミノ末端決定(エドマン(Edma
n)分解)により、hGH生成物のアミノ末端配列はPh
e−Pro−Thr−Ile−Pro−であり、真正のhGHに
対するものと同じであることが示された。
hGH生成物の生物学的活性が脛骨(tibia)試験によ
り測定され、2.5IU/mgであることが見出された。
これはまた真正のhGHの場合と同じであった。
例2 ジペプチジル アミノペプチダーゼIを用いるMet−G
lu−Ala−Glu−hGHからのhGHの製造 原則的に例1に記述した遺伝子技術によって、Met−G
lu−Ala−Glu−hGHが製造された。Met−Glu−A
la−Glu−hGHは、アニオン交換と疎水相互作用クロ
マトグラフィーによって醗酵生成物から精製された。
精製されたMet−Glu−Ala−Glu−hGHは、IE−
HPLCとSDS電気泳動から、純度が99%以上であ
ると計算された。
アミノ末端配列決定により、精製されたhGHはMet−
Glu−Ala−Glu−Phe−Pro−Thr−Ile−Pro−L
euの持つことが示された。ここで、最後の6のアミノ酸
はhGHのN末端に対応している。20mMトリス、1
0nMクエン酸、25mM NaCl、pH4.2中のM
et−Glu−Ala−Glu−hGH(2.0mg/ml)の20
0mlが、ベーリンガーマンハイム(Boehringer Mann
heim)からのジペプチジル アミノペプチダーゼI
(E.C.3.4.14.1)の10,000mU
(3.3mgに相当)と混合された。他の標品も同様に使
用できる。場合によっては、pHの値を再び4.2に調節
する。
それから、反応混合物は40℃で60分間インキュベー
ションされ、その結果、Met−Glu−Ala−Glu−hG
Hの98%が以上がhGHへ変換された。反応が完了し
た後、反応混合物は4℃に冷却された。更にその後の精
製は、イソプレシピテーション(isoprecipitaion)、
ゲルろ過およびアニオン交換を含む。
hGH生成物はIE−HPLCとSDS電気泳動から、
純度が99%以上であると計算された。エドマン分解に
よるアミノ末端配列により、hGH生成物のアミノ末端
配列はPhe−Pro−Thr−Ile−Pro−Leuであり、真
正のhGHに対するものと同じであることが示された。
hGH生成物の生物学的活性が脛骨試験により測定さ
れ、脳下垂体のhGHと等しい効力を有することが示さ
れた。
例3 ジペプチジル アミノペプチダーゼIを用いいるAla−
Glu−hGHからのhGHの製造 原則的に例1に記述した遺伝子技術によって、Met−A
la−Glu−hGHが製造された。醗酵によって形成され
たたんぱく質がAla−Glu−hGHとなるように、Met
は体中で開裂された。これは、常法に従って、アニオン
交換と疎水相互クロマトグラフィーによって精製され
た。
精製されたAla−Glu−hGHは、IE−HPLCとS
DS電気泳動から、純度が99%以上であると計算され
た。
アミノ末端配列分析により、精製されたhGH生成物は
Ala−Glu−Phe−Pro−Thr−Ile−Pro−Leuの配
列を持つことが示された。ここで、最後の6のアミノ酸
はhGHのN末端に対応している。
20mMトリス、10mMクエン酸、25mM NaC
l、pH4.2中のAla−Glu−hGH(2.2mg/ml)
の100mlが、ベーリンガーマンハイムからのジペプチ
ジル アミノベプチダーゼI(E.C.3.4.14.1)の
8800mU(2.9mgに相当)と混合された。他の標
品も同様に使用できる。場合によっては、pHの値を再び
4.2に調節する。
反応混合物は40℃で60分間インキュベーションさ
れ、その結果、Ala−Glu−hGHの98%以上が変換
された。反応が完了した後、反応混合物は4℃に冷却さ
れた。更にその後の精製は、イソプレシピテーション、
ゲルろ過およびアニオン交換を含む。
hGH生成物はIE−HPLCとSDSと電気泳動か
ら、純度が99%以上であると計算された。エドマン分
解によるアミノ酸配列決定で、hGHのアミノ末端配列
はPhe−Pro−Thr−Ile−Pro−Leuであり、真正の
hGHに対するものと同じであることが示された。
hGH生成物の生物学的活性が脛骨試験により測定さ
れ、脳下垂体のhGHと等しい効力を有することが示さ
れた。
例4 ジペプチジル アミノペプチダーゼIを用いるMet−P
he−Glu−Glu−hGHからのhGHの製造 原則的に例1に記述した遺伝子技術によって、Met−P
he−Glu−Glu−hGHが製造された。Met−Phe−G
lu−Glu−hGHは、アニオン交換と疎水相互作用クロ
マトグラフィーによって醗酵生成物から精製された。
精製されたMet−Phe−Glu−Glu−hGHは、IE−
HPLCとSDS電気泳動から、純度が99%以上であ
ると計算された。
アミノ末端配列決定により、精製されたhGHはMet−
Phe−Glu−Glu−Phe−Pro−Thr−Ile−Pro−L
euの配列を持つことが示された。ここで、最後の6のア
ミノ酸はhGHのN末端に対応している。
20mMトリス、10mMクエン酸、25mM NaC
l、1mM L−システイン pH4.2中のMet−Phe
−Glu−Glu−hGH(1.5mg/ml)の100mlが、
ベーリンガーマンハイムからのジペプチジル アミノペ
プチダーゼI(E.C.3.4.14.1)の15,0
00mU(5.0mgに相当)と混合された。他の標品も
同様に使用できる。場合によっては、pHの値を再び4.
2に調節する。
それから、反応混合物は40℃で60分間インキュベー
ションされ、その結果、Met−Phe−Glu−Glu−hG
Hの98%以上がhGHへ変換された。反応が完了した
後、反応混合物は4℃に冷却された。更にその後の精製
は、イソプレシピテーション、ゲルろ過およびアニオン
交換を含む。
hGH生成物はIE−HPLCとSDS電気泳動から、
純度が99%以上であると計算された。エドマン分解に
よるアミノ末端配列決定で、hGH生成物のアミノ末端
配列はPhe−Pro−Thr−Ile−Pro−Leuであり、真
正のhGHに対するものと同じであることが示された。
hGH生成物の生物学的活性が脛骨試験により測定さ
れ、脳下垂体のhGHと等しい効力を有することが示さ
れた。
例5 ジペプチジル アミノペプチダーゼIを用いるAla−G
lu−Ala−Glu−hGHからのhGHの製造 原則的に例1に記述した遺伝子技術によってMet−Ala
−Glu−Ala−Glu−hGHが製造された。醗酵によっ
て形成されたたんぱく質がAla−Glu−Ala−Glu−h
GHになるように、Metは体中で開裂された。これは、
常法に従って、アニオン交換と疎水相互作用クロマトグ
ラフィーによって精製された。
精製されたAla−Glu−Ala−Glu−hGHは、 IE−HPLCとSDS電気泳動から、純度が99%以
上であると計算された。
アミノ末端配列分析により、精製されたhGH生成物は
Ala−Glu−Ala−Glu−Phe−Pro−Thr−Ile−P
ro−Leuの配列を持つことが示された。ここで、最後の
6のアミノ酸はhGHのN末端に対応している。
20mMトリス、10mMクエン酸、25mM NaC
l、pH4.2中のAla−Glu−Ala−Glu−hGH
(2.0mg/ml)の100mlが、ベーリンガーマンハイ
ムからのジペプチジル アミノペプチダーゼI(E.
C.3.4.14.1)の2000mU(6.7mgに相
当)と混合された。他の標品も同様に使用できる。場合
によっては、pHの値を再び4.2に調節する。
反応混合物は40℃で60分間インキュベーションさ
れ、その結果、Ala−Glu−Ala−Glu−hGHの98
%以上がhGHへ変換された。反応が完了した後、反応
混合物は4℃に冷却された。更にその後の精製は、イソ
プレシピテーション、ゲルろ過およびアニオン交換を含
む。
hGH生成物はIE−HPLCとSDS電気泳動から、
純度が99%以上であると計算された。エドマン分解に
よるアミノ末端配列決定で、hGHのアミノ末端配列は
Phe−Pro−Thr−Ile−Pro−Leuであり、真正のh
GHに対するものと同じであることが示された。
hGH生成物の生物学的活性が脛骨試験で測定され、脳
下垂体のhGHと等しい効力を有することが示された。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 クリステンセン,ソールキルド デンマ−ク国 デイ・ケイ−3450 アラー ロド,ベリスヴエジ 55 (72)発明者 ハンセン,ジオルリ,ウイニー デンマ−ク国 デイ・ケイ−2600 グロス トラツプ,クロベルホジ 20 (72)発明者 ジエツセン,トルベン,エーレルン デンマ−ク国 デイ・ケイ−4300 ホルベ ク,カルンドボルグヴエジ 216

Claims (4)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】生合成的に形成され且つアミノ末端の延長
    されたhGHがアミノペプチダーゼで消化される、真正
    なヒト成長ホルモン(hGH)の製造方法であって、 使用される前記アミノ末端の延長されたhGHは、式X
    −hGH(ここでXは、ジペプチド成分にAsp及びGlu
    から選択された少なくとも1のアミノ酸を有するアミノ
    酸配列であって、hGHのN末端に直接に結合され且つ
    偶数個のアミノ酸を有しており、N末端からみて第一番
    目はLys及びArgではなく、他の全ての奇数番目のアミ
    ノ酸はPro、Lys及びArgではなく、全ての偶数個のア
    ミノ酸はProではない)で表され、該X−hGHが酵素
    ジペプチジルアミノペプチダーゼI(E.C.3.4.14.1)と
    反応されることを特徴とする方法。
  2. 【請求項2】前記アミノ酸配列Xの最後のアミノ酸が、
    Asp又はGluであることを特徴とする特許請求の範囲第
    1項に記載の方法。
  3. 【請求項3】前記アミノ酸配列Xの最後から2番目のア
    ミノ酸が、Asp又はGluであることを特徴とする特許請
    求の範囲第1項に記載の方法。
  4. 【請求項4】前記アミノ酸配列Xの最後及び最後から2
    番目のアミノ酸が、Asp又はGluであることを特徴とす
    る特許請求の範囲第1項に記載の方法。
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