JPH09234076A - ヒトｃｇｒｐ前駆体およびその調製方法 - Google Patents
ヒトｃｇｒｐ前駆体およびその調製方法Info
- Publication number
- JPH09234076A JPH09234076A JP8068990A JP6899096A JPH09234076A JP H09234076 A JPH09234076 A JP H09234076A JP 8068990 A JP8068990 A JP 8068990A JP 6899096 A JP6899096 A JP 6899096A JP H09234076 A JPH09234076 A JP H09234076A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cgrp
- fusion protein
- protein
- formula
- gly
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 ヒトカルシトニン関連遺伝子（ＣＧＲＰ）の
効率的な生産を可能にする手段の提供。 【解決手段】 特定鎖長のペプチド配列をＣＧＲＰのＮ
末端側に残存するように発現できる融合タンパク質をコ
ードするＤＮＡ、その発現、およびＣＧＲＰの製造方
法。
効率的な生産を可能にする手段の提供。 【解決手段】 特定鎖長のペプチド配列をＣＧＲＰのＮ
末端側に残存するように発現できる融合タンパク質をコ
ードするＤＮＡ、その発現、およびＣＧＲＰの製造方
法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ヒトカルシトニン
遺伝子関連ペプチド（以下、ヒトＣＧＲＰという）を有
利に製造できる、ヒトＣＧＲＰを含む融合タンパク質、
その融合タンパク質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを用
いる前記融合タンパク質の製造方法に関する。さらに、
本発明は、ヒトＣＧＲＰを含むヒトＣＧＲＰ中間体およ
びその調製方法、ならびに該中間体からのヒトＣＧＲＰ
の製造方法に関する。
遺伝子関連ペプチド（以下、ヒトＣＧＲＰという）を有
利に製造できる、ヒトＣＧＲＰを含む融合タンパク質、
その融合タンパク質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを用
いる前記融合タンパク質の製造方法に関する。さらに、
本発明は、ヒトＣＧＲＰを含むヒトＣＧＲＰ中間体およ
びその調製方法、ならびに該中間体からのヒトＣＧＲＰ
の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ヒトＣＧＲＰは、配列番号：１に示され
る３７個のアミノ酸残基からなり、かつＮ末端がアミド
化されている化合物であって、血管拡張作用等を有し、
高血圧の治療等の用途が検討されている興味深いペプチ
ドである。特表昭６０−５０１５６２号公報には、ヒト
ＣＧＲＰの組換えＤＮＡ技術の製造方法が記載されてい
る。記載された方法によれば、Ｃ末端に付加的アミノ酸
残基を有するヒトＣＧＲＰのＮ末端を選択的に化学また
は酵素分解しうる結合、例えばメチオニンもしくはグル
タミン酸残基、を介してクロラムフェコールアセチルト
ランスフェラーゼタンパク質もしくはβ−ガラクトシダ
ーゼタンパク質を結合させた融合タンパク質をコードす
るＤＮＡの発現に成功している。
る３７個のアミノ酸残基からなり、かつＮ末端がアミド
化されている化合物であって、血管拡張作用等を有し、
高血圧の治療等の用途が検討されている興味深いペプチ
ドである。特表昭６０−５０１５６２号公報には、ヒト
ＣＧＲＰの組換えＤＮＡ技術の製造方法が記載されてい
る。記載された方法によれば、Ｃ末端に付加的アミノ酸
残基を有するヒトＣＧＲＰのＮ末端を選択的に化学また
は酵素分解しうる結合、例えばメチオニンもしくはグル
タミン酸残基、を介してクロラムフェコールアセチルト
ランスフェラーゼタンパク質もしくはβ−ガラクトシダ
ーゼタンパク質を結合させた融合タンパク質をコードす
るＤＮＡの発現に成功している。
【０００３】しかし、記載された組換えプラスミドで形
質転換された大腸菌は、必ずしも満足すべき前記融合タ
ンパク質の産生能を示さないようである。
質転換された大腸菌は、必ずしも満足すべき前記融合タ
ンパク質の産生能を示さないようである。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明の
目的は、より効率のよいヒトＣＧＲＰの製造方法を提供
できる改良した組換えＤＮＡ技術を提供することにあ
る。
目的は、より効率のよいヒトＣＧＲＰの製造方法を提供
できる改良した組換えＤＮＡ技術を提供することにあ
る。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、Ｃ末端に
付加的アミノ酸残基を有するヒトＣＧＲＰ前駆体のＮ末
端に、特定のスペーサーペプチド部分を介して一定のタ
ンパク質を結合した融合タンパク質が、それらを酵素処
理してヒトＣＧＲＰを製造する上で、極めて有利に使用
できることを見い出した。より具体的には、融合タンパ
ク質を前記一定のタンパク質に対するアフィニティーク
ロマトグラフィー処理中に、一定のタンパク質を開裂し
た、ヒトＣＧＲＰ前駆体が、そのＮ末端に特定のスペー
サーペプチドが結合していることによって、得られる中
間体の物理的性質が安定化されることを見い出した。そ
のため、その後の酵素処理等を有利に実施でき、ヒトＣ
ＧＲＰ（成熟型）を効率よく製造できることが確認でき
た。
付加的アミノ酸残基を有するヒトＣＧＲＰ前駆体のＮ末
端に、特定のスペーサーペプチド部分を介して一定のタ
ンパク質を結合した融合タンパク質が、それらを酵素処
理してヒトＣＧＲＰを製造する上で、極めて有利に使用
できることを見い出した。より具体的には、融合タンパ
ク質を前記一定のタンパク質に対するアフィニティーク
ロマトグラフィー処理中に、一定のタンパク質を開裂し
た、ヒトＣＧＲＰ前駆体が、そのＮ末端に特定のスペー
サーペプチドが結合していることによって、得られる中
間体の物理的性質が安定化されることを見い出した。そ
のため、その後の酵素処理等を有利に実施でき、ヒトＣ
ＧＲＰ（成熟型）を効率よく製造できることが確認でき
た。
【０００６】したがって、本発明によれば、前記中間体
の出発原料となる融合タンパク質が提供される。かかる
融合タンパク質は、例えば、式 Ｐ−Ｓ−ＣＧＲＰ(ＮＨ2 -)−Ｘ （Ｉ） 式中、Ｐは原核細胞または真核細胞で発現可能なタンパ
ク質部分を表し、Ｓは、前記式で表される融合タンパク
質をある種の酵素で消化したとき、少なくとも６個のア
ミノ酸残基からなる配列をＣＧＲＰ(ＮＨ2 -）のＮ末端
に残存させてＨ−Ｓ′−ＣＧＲＰ(ＮＨ2 -)−Ｘ（ここ
で、Ｓ′はＳ部分またはＰ−Ｓ部分よりある種の酵素で
消化された後のペプチド残部である）を形成し、次いで
別の酵素で消化したとき、Ｈ−ＣＧＲＰ(ＮＨ2 -)−Ｘを
形成するスペーサーペプチド部分を表し、ＣＧＲＰ(Ｎ
Ｈ2 -）はヒトカルシトニン遺伝子関連ペプチドのＣ末端
がアミド化されていない部分を表し、そしてＸはＮ
Ｈ2、ＧｌｙまたはＧｌｙ−Ｙで表されるペプチド残基
（ここで、ＹはＧｌｙをＣＧＲＰ(ＮＨ2 -）のＣ末端に
残存させたまま開裂することのできるペプチド残基であ
る）を表す、で表すことができる。
の出発原料となる融合タンパク質が提供される。かかる
融合タンパク質は、例えば、式 Ｐ−Ｓ−ＣＧＲＰ(ＮＨ2 -)−Ｘ （Ｉ） 式中、Ｐは原核細胞または真核細胞で発現可能なタンパ
ク質部分を表し、Ｓは、前記式で表される融合タンパク
質をある種の酵素で消化したとき、少なくとも６個のア
ミノ酸残基からなる配列をＣＧＲＰ(ＮＨ2 -）のＮ末端
に残存させてＨ−Ｓ′−ＣＧＲＰ(ＮＨ2 -)−Ｘ（ここ
で、Ｓ′はＳ部分またはＰ−Ｓ部分よりある種の酵素で
消化された後のペプチド残部である）を形成し、次いで
別の酵素で消化したとき、Ｈ−ＣＧＲＰ(ＮＨ2 -)−Ｘを
形成するスペーサーペプチド部分を表し、ＣＧＲＰ(Ｎ
Ｈ2 -）はヒトカルシトニン遺伝子関連ペプチドのＣ末端
がアミド化されていない部分を表し、そしてＸはＮ
Ｈ2、ＧｌｙまたはＧｌｙ−Ｙで表されるペプチド残基
（ここで、ＹはＧｌｙをＣＧＲＰ(ＮＨ2 -）のＣ末端に
残存させたまま開裂することのできるペプチド残基であ
る）を表す、で表すことができる。
【０００７】また、前記（Ｉ）で示される融合タンパク
質をコードするＤＮＡも提供される。このＤＮＡは、組
換えＤＮＡ技術により、該融合タンパク質を生産するの
に使用できるので融合タンパク質の生産方法も提供でき
る。
質をコードするＤＮＡも提供される。このＤＮＡは、組
換えＤＮＡ技術により、該融合タンパク質を生産するの
に使用できるので融合タンパク質の生産方法も提供でき
る。
【０００８】さらに、該融合タンパク質は、適当なアフ
ィニティークロマトグラフィーの担体上で、酵素処理す
ることにより、式（ＩＩ） Ｓ′−ＣＧＲＰ(ＮＨ2 -)−Ｘ （ＩＩ） 式中、ＣＧＲＰ(ＮＨ2 -）およびＸは請求項１の定義に
同じであり、Ｓ′はＳ部分またはＰ−Ｓ部分からある種
の酵素で消化された後のペプチド残部である、で示され
るヒトカルシトニン遺伝子関連ペプチド中間体を融合タ
ンパク質から容易に開裂させて、単離できる。したがっ
てまた、該中間体も提供される。
ィニティークロマトグラフィーの担体上で、酵素処理す
ることにより、式（ＩＩ） Ｓ′−ＣＧＲＰ(ＮＨ2 -)−Ｘ （ＩＩ） 式中、ＣＧＲＰ(ＮＨ2 -）およびＸは請求項１の定義に
同じであり、Ｓ′はＳ部分またはＰ−Ｓ部分からある種
の酵素で消化された後のペプチド残部である、で示され
るヒトカルシトニン遺伝子関連ペプチド中間体を融合タ
ンパク質から容易に開裂させて、単離できる。したがっ
てまた、該中間体も提供される。
【０００９】さらにまた、かかる中間体をＣ末端アミド
化酵素で処理して、ＣＧＲＰ(ＮＨ2 -）のＣ末端をアミ
ド化（成熟型に）し、次いで、ペプチド残部Ｓ′を適当
な酵素で処理することにより、そのＣ末端で開裂脱離せ
しめるヒトＣＧＲＰの製造方法も提供される。
化酵素で処理して、ＣＧＲＰ(ＮＨ2 -）のＣ末端をアミ
ド化（成熟型に）し、次いで、ペプチド残部Ｓ′を適当
な酵素で処理することにより、そのＣ末端で開裂脱離せ
しめるヒトＣＧＲＰの製造方法も提供される。
【００１０】
【発明の具体的な記述】式（Ｉ）で示される融合タンパ
ク質中のタンパク質「Ｐ」部分は、β−ガラクトシダー
ゼ、Ｔ７ファージの gene １０遺伝子産物、グルタチオ
ン−Ｓ−トランスフェラーゼ、プロテインＡのＩｇＧ結
合ドメイン、γ−インターフェロンのＮ末端６０アミノ
酸、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ
およびマルトース結合タンパク質からなる群より選ばれ
るものが好ましい。これらのタンパク質は、これらのタ
ンパク質をコードし、さらにマルチクローニング部位を
備えたそれらの発現ベクターが容易に入手または作製で
き、本発明の融合タンパク質を組換えＤＮＡ技術により
生産するのに都合がよいからである。
ク質中のタンパク質「Ｐ」部分は、β−ガラクトシダー
ゼ、Ｔ７ファージの gene １０遺伝子産物、グルタチオ
ン−Ｓ−トランスフェラーゼ、プロテインＡのＩｇＧ結
合ドメイン、γ−インターフェロンのＮ末端６０アミノ
酸、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ
およびマルトース結合タンパク質からなる群より選ばれ
るものが好ましい。これらのタンパク質は、これらのタ
ンパク質をコードし、さらにマルチクローニング部位を
備えたそれらの発現ベクターが容易に入手または作製で
き、本発明の融合タンパク質を組換えＤＮＡ技術により
生産するのに都合がよいからである。
【００１１】このような発現ベクターのうち、宿主とし
て原核細胞、特に大腸菌（Ｅ.ｃｏｌｉ）を使用する場
合に適する市販されているものとしては、例えば、グル
タチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（以下、ＧＳＴとい
う）をコードするｐＧＥＸ系のｐＧＥＸ−２Ｔ、ｐＧＥ
Ｘ−３Ｘなど（ファルマシア社、プロテインＡをコード
するｐＲＩＴ２Ｔ（ファルマシア社）、Ｔ７ファージの
gene １０遺伝子産物をコードするｐＧＥＭＥＸ−２
（プロメガ社）、β−ガラクトシダーゼをコードするｐ
ＥＸ１、ｐＥＸ２など（クロンテック社）、およびその
他マルトース バインデイグ プロテインをコードするｐ
ＭＡＬ系のベクターが挙げられる。また、本発明の融合
タンパク質をコードするＤＮＡは、宿主細胞としてそれ
自体既知の真核細胞およびベクターを用いて発現するこ
ともできる。なお、この場合、融合タンパク質のＣ末端
がアミド化された形態で得られる場合もある。
て原核細胞、特に大腸菌（Ｅ.ｃｏｌｉ）を使用する場
合に適する市販されているものとしては、例えば、グル
タチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（以下、ＧＳＴとい
う）をコードするｐＧＥＸ系のｐＧＥＸ−２Ｔ、ｐＧＥ
Ｘ−３Ｘなど（ファルマシア社、プロテインＡをコード
するｐＲＩＴ２Ｔ（ファルマシア社）、Ｔ７ファージの
gene １０遺伝子産物をコードするｐＧＥＭＥＸ−２
（プロメガ社）、β−ガラクトシダーゼをコードするｐ
ＥＸ１、ｐＥＸ２など（クロンテック社）、およびその
他マルトース バインデイグ プロテインをコードするｐ
ＭＡＬ系のベクターが挙げられる。また、本発明の融合
タンパク質をコードするＤＮＡは、宿主細胞としてそれ
自体既知の真核細胞およびベクターを用いて発現するこ
ともできる。なお、この場合、融合タンパク質のＣ末端
がアミド化された形態で得られる場合もある。
【００１２】本発明の融合タンパク質中の「Ｓ」部分ま
たはＰ−Ｓ部分は、該融合タンパク質をある種の酵素で
処理したとき、少なくとも６個のアミノ酸残基からなる
配列を有していて、「ＣＧＲＰ(ＮＨ2 -）」で表わされ
るペプチドのＮ末端にＳ′ペプチド残部としてそのまま
残存でき、その後、別の酵素で処理して該Ｓ′部分を前
記Ｎ末端から脱離できるペプチド部分である。前記の酵
素としては、トリプシン、Ｘａ因子、プロテアーゼＩ、
コラゲナーゼ、エンテロペプチダーゼ、トロンビン、Ｖ
８プロテアーゼ（プロテアーゼＧｌｕ−Ｃとも称され
る）、等が挙げられ、ヒトＣＧＲＰのペプチド鎖に対し
ては実質的に作用しない２種の酵素を「ある種の酵素」
と「別の酵素」の組み合わせとして使用する。
たはＰ−Ｓ部分は、該融合タンパク質をある種の酵素で
処理したとき、少なくとも６個のアミノ酸残基からなる
配列を有していて、「ＣＧＲＰ(ＮＨ2 -）」で表わされ
るペプチドのＮ末端にＳ′ペプチド残部としてそのまま
残存でき、その後、別の酵素で処理して該Ｓ′部分を前
記Ｎ末端から脱離できるペプチド部分である。前記の酵
素としては、トリプシン、Ｘａ因子、プロテアーゼＩ、
コラゲナーゼ、エンテロペプチダーゼ、トロンビン、Ｖ
８プロテアーゼ（プロテアーゼＧｌｕ−Ｃとも称され
る）、等が挙げられ、ヒトＣＧＲＰのペプチド鎖に対し
ては実質的に作用しない２種の酵素を「ある種の酵素」
と「別の酵素」の組み合わせとして使用する。
【００１３】したがって、「Ｓ′」部分のアミノ酸配列
は、使用する酵素に応じて、その配列を選ぶことができ
るので限定されない。
は、使用する酵素に応じて、その配列を選ぶことができ
るので限定されない。
【００１４】例えば、「Ｐ」部分としてＧＳＴを選び、
前記融合タンパク質の発現ベクターとして、上述のｐＧ
ＥＸ−２Ｔを選ぶ場合には、少なくとも６個のアミノ酸
残基からなる配列は、アミノ酸の一文字記号により表す
と、ＬＶＰＲＧＳＲＰＡＥ（配列番号：２参照）からな
るアミノ酸配列を「Ｓ」部分のスペーサーペプチド部分
として選ぶことが好ましい。なお、ＬＶＰＲＧＳ（配列
番号：３参照）は、ｐＧＥＸ−２Ｔの発現産物に由来
し、ＲＰＡＥ（配列番号：４参照）は本発明者らが設計
したオリゴヌクレオチドに由来する部分である。
前記融合タンパク質の発現ベクターとして、上述のｐＧ
ＥＸ−２Ｔを選ぶ場合には、少なくとも６個のアミノ酸
残基からなる配列は、アミノ酸の一文字記号により表す
と、ＬＶＰＲＧＳＲＰＡＥ（配列番号：２参照）からな
るアミノ酸配列を「Ｓ」部分のスペーサーペプチド部分
として選ぶことが好ましい。なお、ＬＶＰＲＧＳ（配列
番号：３参照）は、ｐＧＥＸ−２Ｔの発現産物に由来
し、ＲＰＡＥ（配列番号：４参照）は本発明者らが設計
したオリゴヌクレオチドに由来する部分である。
【００１５】このようなスペーサーペプチドを「Ｓ」部
分として選ぶと、融合タンパク質をトロンビンで処理す
ることにより、ＧＳＲＰＡＥ（配列番号：５参照）から
なるアミノ酸配列が「ＣＧＲＰ(ＮＨ2 -）」のＮ末端に
残存した、式 Ｓ′−ＣＧＲＰ(ＮＨ2 -)−Ｘ （ＩＩ） で示され、例えば配列表の配列番号：６（式中、ＸはＧ
ｌｕである）に示されるようなヒトＣＧＲＰ中間体が提
供できる。
分として選ぶと、融合タンパク質をトロンビンで処理す
ることにより、ＧＳＲＰＡＥ（配列番号：５参照）から
なるアミノ酸配列が「ＣＧＲＰ(ＮＨ2 -）」のＮ末端に
残存した、式 Ｓ′−ＣＧＲＰ(ＮＨ2 -)−Ｘ （ＩＩ） で示され、例えば配列表の配列番号：６（式中、ＸはＧ
ｌｕである）に示されるようなヒトＣＧＲＰ中間体が提
供できる。
【００１６】このトロンビン処理は、前記融合タンパク
質を、適当な緩衝溶液中で行うこともできるが、適当な
アフィニティークロマトグラフィーの担体上に、式
（Ｉ）で示されるＰ部分のＧＳＴを介して固定した状態
で処理することもできる。
質を、適当な緩衝溶液中で行うこともできるが、適当な
アフィニティークロマトグラフィーの担体上に、式
（Ｉ）で示されるＰ部分のＧＳＴを介して固定した状態
で処理することもできる。
【００１７】アフィニティークロマトグラフィー担体上
（例えば、グルタチオンアガロースゲル）に固定したま
まトロンビン処理すると、トロンビン溶液またはトロン
ビン不含溶液により、式（ＩＩ）で示される中間体ペプ
チドを融合タンパク質およびＧＳＴ切断部分から容易に
分離することができる。こうして本発明に従う中間体が
効率よく得られる。
（例えば、グルタチオンアガロースゲル）に固定したま
まトロンビン処理すると、トロンビン溶液またはトロン
ビン不含溶液により、式（ＩＩ）で示される中間体ペプ
チドを融合タンパク質およびＧＳＴ切断部分から容易に
分離することができる。こうして本発明に従う中間体が
効率よく得られる。
【００１８】また、本発明に従えば、驚くべきことに、
Ｓ′−ＣＧＲＰ(ＮＨ2 -)Ｘは、そのＮ末端にＳ′として
６個のアミノ酸残基からなるペプチド鎖が結合している
ことによって安定化され、続く酵素処理等によるＳ′−
ＣＧＲＰ(ＮＨ2 -)Ｘからの成熟ＣＧＲＰ（Ｃ末端がアミ
ド化されている）への変換収率を有意に高めうることが
見い出された。Ｓ′−ＣＧＲＰ(ＮＨ2 -)Ｘから成熟ＣＧ
ＲＰを得るための酵素処理としては、例えばＳ′が上記
ＧＳＲＰＡＥからなり、ＸがＧ(Ｇｌｙ）である場合に
は、ペプチドＣ末端アミド化酵素を用いるＣ末端Ｇｌｙ
残基からのアミド（ＮＨ2）化段階、或いはＧＳＲＰＡ
ＥのＶ８プロテアーゼによるＣＧＲＰ部分からの開裂段
階のいずれを先行させるかまたは同時に行うこともでき
るが、ＣＧＲＰのＳ′残部による安定化を考慮すると、
Ｖ８プロテアーゼ処理を先行させることが好ましい。
Ｓ′−ＣＧＲＰ(ＮＨ2 -)Ｘは、そのＮ末端にＳ′として
６個のアミノ酸残基からなるペプチド鎖が結合している
ことによって安定化され、続く酵素処理等によるＳ′−
ＣＧＲＰ(ＮＨ2 -)Ｘからの成熟ＣＧＲＰ（Ｃ末端がアミ
ド化されている）への変換収率を有意に高めうることが
見い出された。Ｓ′−ＣＧＲＰ(ＮＨ2 -)Ｘから成熟ＣＧ
ＲＰを得るための酵素処理としては、例えばＳ′が上記
ＧＳＲＰＡＥからなり、ＸがＧ(Ｇｌｙ）である場合に
は、ペプチドＣ末端アミド化酵素を用いるＣ末端Ｇｌｙ
残基からのアミド（ＮＨ2）化段階、或いはＧＳＲＰＡ
ＥのＶ８プロテアーゼによるＣＧＲＰ部分からの開裂段
階のいずれを先行させるかまたは同時に行うこともでき
るが、ＣＧＲＰのＳ′残部による安定化を考慮すると、
Ｖ８プロテアーゼ処理を先行させることが好ましい。
【００１９】こうして、生物活性を示すＣＧＲＰが融合
タンパク質から有利に調製されるが、融合タンパク質の
生産は、それをコードするＤＮＡを有するプラスミドを
適当な宿主で発現させることにより行うことができる。
このようなプラスミドの調製は、配列表：１に示される
アミノ酸配列をコードするＤＮＡ（ＣＧＲＰ遺伝子とい
う）を用い、それ自体既知の遺伝子操作法によって行う
ことができる。
タンパク質から有利に調製されるが、融合タンパク質の
生産は、それをコードするＤＮＡを有するプラスミドを
適当な宿主で発現させることにより行うことができる。
このようなプラスミドの調製は、配列表：１に示される
アミノ酸配列をコードするＤＮＡ（ＣＧＲＰ遺伝子とい
う）を用い、それ自体既知の遺伝子操作法によって行う
ことができる。
【００２０】使用するＣＧＲＰ遺伝子は、既知のｃＤＮ
Ａ由来のものを使用してもよいが、配列表：１のアミノ
酸配列に基づき、化学合成したものを使用してもよい。
化学合成したＣＧＲＰ遺伝を含むＤＮＡの代表的なもの
としては、本発明者らが設計し合成した配列表：７で示
される遺伝子を使用するのが安定な発現が達成できる点
で好ましい。
Ａ由来のものを使用してもよいが、配列表：１のアミノ
酸配列に基づき、化学合成したものを使用してもよい。
化学合成したＣＧＲＰ遺伝を含むＤＮＡの代表的なもの
としては、本発明者らが設計し合成した配列表：７で示
される遺伝子を使用するのが安定な発現が達成できる点
で好ましい。
【００２１】以下、説明を簡略化する目的で、配列番
号：７のＤＮＡ、発現ベクターとしてｐＧＥＸ−２Ｔを
使用する場合について説明するが、他のＤＮＡおよび発
現ベクターも同様に使用できることは、当業者にとって
明らかであろう。
号：７のＤＮＡ、発現ベクターとしてｐＧＥＸ−２Ｔを
使用する場合について説明するが、他のＤＮＡおよび発
現ベクターも同様に使用できることは、当業者にとって
明らかであろう。
【００２２】ＣＧＲＰ(ＮＨ2 -）発現プラスミドの構築 大腸菌を宿主とし、遺伝子組換え技術によりヒトＣＧＲ
Ｐを生産するために、図１の操作手順に従って発現プラ
スミド（図２参照）を構築した。
Ｐを生産するために、図１の操作手順に従って発現プラ
スミド（図２参照）を構築した。
【００２３】まず、ＣＧＲＰ(ＮＨ2 -）のＮ末端にグル
タミン酸、Ｃ末端にグリシンを付加し、グルタチオン−
Ｓ−トランスフェラーゼとの融合タンパク質として生産
するベクターを構築する。
タミン酸、Ｃ末端にグリシンを付加し、グルタチオン−
Ｓ−トランスフェラーゼとの融合タンパク質として生産
するベクターを構築する。
【００２４】５′側にＰｓｔＩサイト、３′側にＢａｍ
ＨＩサイトを付加した合成ＤＮＡ（ヒトＣＧＲＰ遺伝子
をコード）をＰｓｔＩ、ＢａｍＨＩで二重消化後、ｐＵ
Ｃｌ９ベクターのＰｓｔＩとＢａｍＨＩサイトの間にＴ
４リガーゼにより連結して、プラスミドｐＵＣｌ９−Ｃ
ＧＲＰを得た。一方、大腸菌発現ベクターｐＧＥＸ−２
Ｔ（ファルマシア）のＳｍａＩサイトにＨｉｎｄＩＩＩ
リンカーを連結したベクターｐＧＥＸ−２ＴＨを得た。
こうして得られたｐＵＣｌ９−ＣＧＲＰおよびｐＧＥＸ
−２ＴＨをＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩで二重消化後、
Ｔ４リガーゼにより両プラスミド連結した。得られたプ
ラスミドをＢａｍＨＩ、ＳａｌＩで二重消化後、Klenow
fragment によりＤＮＡの両端を平滑化し、Ｔ４リガー
ゼにより再環化させてヒトＣＧＲＰ(ＮＨ2 -）発現プラ
スミドを構築した。
ＨＩサイトを付加した合成ＤＮＡ（ヒトＣＧＲＰ遺伝子
をコード）をＰｓｔＩ、ＢａｍＨＩで二重消化後、ｐＵ
Ｃｌ９ベクターのＰｓｔＩとＢａｍＨＩサイトの間にＴ
４リガーゼにより連結して、プラスミドｐＵＣｌ９−Ｃ
ＧＲＰを得た。一方、大腸菌発現ベクターｐＧＥＸ−２
Ｔ（ファルマシア）のＳｍａＩサイトにＨｉｎｄＩＩＩ
リンカーを連結したベクターｐＧＥＸ−２ＴＨを得た。
こうして得られたｐＵＣｌ９−ＣＧＲＰおよびｐＧＥＸ
−２ＴＨをＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩで二重消化後、
Ｔ４リガーゼにより両プラスミド連結した。得られたプ
ラスミドをＢａｍＨＩ、ＳａｌＩで二重消化後、Klenow
fragment によりＤＮＡの両端を平滑化し、Ｔ４リガー
ゼにより再環化させてヒトＣＧＲＰ(ＮＨ2 -）発現プラ
スミドを構築した。
【００２５】この結果、得られたヒトＣＧＲＰ(Ｎ
Ｈ2 -）発現プラスミドのグルタチオンＳ−トランスフェ
ラーゼ遺伝子のＣ末端には、以下の配列からなるトロン
ビン（ＬＶＰＲＧＳのＲＧの間を切断）およびＶ８プロ
テアーゼ（ＥのＣ末端側を切断）切断部位に相当する塩
基配列が存在する。
Ｈ2 -）発現プラスミドのグルタチオンＳ−トランスフェ
ラーゼ遺伝子のＣ末端には、以下の配列からなるトロン
ビン（ＬＶＰＲＧＳのＲＧの間を切断）およびＶ８プロ
テアーゼ（ＥのＣ末端側を切断）切断部位に相当する塩
基配列が存在する。
【００２６】 制限酵素によるＤＮＡの消化は、３７℃で２４時間反応
を行った。Ｔ４リガーゼによるＤＮＡの連結は１６℃で
３時間反応を行った。また、Klenow fragmentによるＤ
ＮＡの末端平滑化はｄＮＴＰｓ存在下、３７℃で２時間
反応を行った。大腸菌はプラスミドの構築にはＪＭ１０
５株を、融合タンパク質の発現にはＨＢ１０１株を用
い、その形質転換は塩化カルシウム法により行った。さ
らに目的とするプラスミドの確認は、培養した大腸菌か
らフェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈殿
によりプラスミドを回収し、適当な制限酵素で消化した
後アガロースゲル電気泳動により分子量を確認すること
により行った。
を行った。Ｔ４リガーゼによるＤＮＡの連結は１６℃で
３時間反応を行った。また、Klenow fragmentによるＤ
ＮＡの末端平滑化はｄＮＴＰｓ存在下、３７℃で２時間
反応を行った。大腸菌はプラスミドの構築にはＪＭ１０
５株を、融合タンパク質の発現にはＨＢ１０１株を用
い、その形質転換は塩化カルシウム法により行った。さ
らに目的とするプラスミドの確認は、培養した大腸菌か
らフェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈殿
によりプラスミドを回収し、適当な制限酵素で消化した
後アガロースゲル電気泳動により分子量を確認すること
により行った。
【００２７】融合タンパク質の発現 上記で得られたＣＧＲＰ(ＮＨ2 -）発現プラスドで常法
により大腸菌（E. coli）ＨＢ１０１を形質転換し、形
質転換体 E. coli ＨＢ１０１（Ｅ−ＣＧＲＰ−Ｇｌ
ｙ）を得た。この形質転換体を、５０Ｌジャーファーメ
ンター（日立製作所製）を用い、Ｍ９ＺＢ培地（トリプ
トン１、塩化ナトリウム０.５、塩化アンモニウム０.
１、リン酸二水素カリウム０.３、リン酸一水素二ナト
リウム０.６、グルコース０.４、硫酸マグネシウム１ｍ
Ｍ、ＩＰＴＧ０.４ｍＭ、アンピリン１５０μｇ／ｍ
Ｌ：単位無記載の数は重量／容量％）３５Ｌ中で、通気
量１.８ｖｖｍ、温度３５℃、ｐＨ７.０、圧力１.５ｆ
ｋｇ／ｃｍ2および回転数９００ｒｐｍで１０時間培養
した。
により大腸菌（E. coli）ＨＢ１０１を形質転換し、形
質転換体 E. coli ＨＢ１０１（Ｅ−ＣＧＲＰ−Ｇｌ
ｙ）を得た。この形質転換体を、５０Ｌジャーファーメ
ンター（日立製作所製）を用い、Ｍ９ＺＢ培地（トリプ
トン１、塩化ナトリウム０.５、塩化アンモニウム０.
１、リン酸二水素カリウム０.３、リン酸一水素二ナト
リウム０.６、グルコース０.４、硫酸マグネシウム１ｍ
Ｍ、ＩＰＴＧ０.４ｍＭ、アンピリン１５０μｇ／ｍ
Ｌ：単位無記載の数は重量／容量％）３５Ｌ中で、通気
量１.８ｖｖｍ、温度３５℃、ｐＨ７.０、圧力１.５ｆ
ｋｇ／ｃｍ2および回転数９００ｒｐｍで１０時間培養
した。
【００２８】培養後集菌し、緩衝液［リン酸緩衝溶液
（ＰＢＳ）］を用いマントンゴーリンで菌体を破砕後、
遠心し、上清のＧＳＴ活性を測定した。
（ＰＢＳ）］を用いマントンゴーリンで菌体を破砕後、
遠心し、上清のＧＳＴ活性を測定した。
【００２９】なお、比較のため、リンカー（式（Ｉ）の
Ｓ部分に相当）をｐＧＥＸ−２ＴのＳｍａＩサイトに連
結して作製したｐＧＥＸ−２ＴＨおよびかかるリンカー
を連結することなく、ＣＧＲＰ(ＮＨ2 -）ＧｌｙのＮ末
端にＧｌｕを有するＧＳＴとの融合タンパク質の発現プ
ラスミドで、それぞれ E. coli ＨＢ１０１を形質転換
した形質転換体、E. coli（ｐＧＥＸ−２ＴＨ）および
E. coli（ＣＧＲＰ−Ｇｌｙ）を、上記と同様に培養処
理し、菌体破砕上清を得た。
Ｓ部分に相当）をｐＧＥＸ−２ＴのＳｍａＩサイトに連
結して作製したｐＧＥＸ−２ＴＨおよびかかるリンカー
を連結することなく、ＣＧＲＰ(ＮＨ2 -）ＧｌｙのＮ末
端にＧｌｕを有するＧＳＴとの融合タンパク質の発現プ
ラスミドで、それぞれ E. coli ＨＢ１０１を形質転換
した形質転換体、E. coli（ｐＧＥＸ−２ＴＨ）および
E. coli（ＣＧＲＰ−Ｇｌｙ）を、上記と同様に培養処
理し、菌体破砕上清を得た。
【００３０】各上清のＧＳＴ活性を、１００ｍＭリン酸
緩衝液（ｐＨ６.５）、１０ｍＭ１−クロロ−２，４−
ジニトロベンゼン（関東化学）および１０ｍＭ還元型グ
ルタチオン（Ｓｉｇｍａ）を含む反応液中で、３４０ｎ
ｍの吸光度増加を分光光度計（島津製作所）により測定
（Habig W.H.ら;j.Biol.Chem.249,7130,1974、参照）し
たところ、各形質転換体は下記のような活性、タンパク
質濃度および比活性を示した。
緩衝液（ｐＨ６.５）、１０ｍＭ１−クロロ−２，４−
ジニトロベンゼン（関東化学）および１０ｍＭ還元型グ
ルタチオン（Ｓｉｇｍａ）を含む反応液中で、３４０ｎ
ｍの吸光度増加を分光光度計（島津製作所）により測定
（Habig W.H.ら;j.Biol.Chem.249,7130,1974、参照）し
たところ、各形質転換体は下記のような活性、タンパク
質濃度および比活性を示した。
【００３１】 活 性 タンパク質 比 活 性 (△A340/分mL) 濃度(mg/mL) (△A340/分/mg) ブランク 0.95 0.00 E.coli HB101(E-CGRP-Gly) 90.18 8.56 10.53 E.coli HB101(pGEX-2TH) 54.60 8.50 6.42 E.coli HB101(CGRP-Gly) 34.35 9.89 3.47 融合タンパク質の精製およびＧＳＴの開裂 グルタチオンアガロースゲル（Ｓｉｇｍａ製）を用いる
アフィニティークロマトグラフィーカラム（５ｃｍ×１
５ｃｍ）に、E. coli ＨＢ１０１（Ｅ−ＣＧＲＰ−Ｇｌ
ｙ）由来の上清をかけ融合タンパク質をバインディング
させた。このカラムに、トロンビン（持田製薬）を緩衝
液（０.１Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ、ｐＨ８.０）に溶解し
た溶液（３.３Ｕ／ｍＬ）を流し、中間体ＧＳＲＰＡＥ
−ＣＧＲＰ(ＮＨ2 -）Ｇｌｙを溶離した。
アフィニティークロマトグラフィーカラム（５ｃｍ×１
５ｃｍ）に、E. coli ＨＢ１０１（Ｅ−ＣＧＲＰ−Ｇｌ
ｙ）由来の上清をかけ融合タンパク質をバインディング
させた。このカラムに、トロンビン（持田製薬）を緩衝
液（０.１Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ、ｐＨ８.０）に溶解し
た溶液（３.３Ｕ／ｍＬ）を流し、中間体ＧＳＲＰＡＥ
−ＣＧＲＰ(ＮＨ2 -）Ｇｌｙを溶離した。
【００３２】溶離液を、ブフナーロート上に敷いたＣＡ
ＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ８（資生堂）２０ｇに吸着した後、
１５％アセトニトリル水溶液１００ｍＬで洗浄し、次い
で６０％アセトン水溶液で処理した。さらにＨＰＬＣ
（島津製作所）により精製して［精製ＧＳＲＰＡＥ−Ｃ
ＧＲＰ(ＮＨ2 -）Ｇｌｙ １００ｍｇ融合タンパク質１.
２ｇ（中間体１７２ｍｇ：１００％）から５８％］を得
た。
ＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ８（資生堂）２０ｇに吸着した後、
１５％アセトニトリル水溶液１００ｍＬで洗浄し、次い
で６０％アセトン水溶液で処理した。さらにＨＰＬＣ
（島津製作所）により精製して［精製ＧＳＲＰＡＥ−Ｃ
ＧＲＰ(ＮＨ2 -）Ｇｌｙ １００ｍｇ融合タンパク質１.
２ｇ（中間体１７２ｍｇ：１００％）から５８％］を得
た。
【００３３】Ｎ末端アミド化 ＧＳＲＰＡＥ−ＣＧＲＰ(ＮＨ2 -）Ｇｌｙ→ＧＳＲＰＡ
Ｅ−ＣＧＲＰ 上記で得られた中間体１ｍｇ、ならびに３ｍＭアスコル
ビン酸、１０ｍＭ ＫＩ、０.２５ｍｇ／ｍＬカタラーゼ
（Sigma）および２００ｎＭ ＣｕＳＯ4を含む５０ｍＭ
Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ６.４）緩衝液中にＮ末端ア
ミド化酵素（資生堂：２.０ｕｎｉｔ）を加え、３７℃
で一晩反応させた。反応混合液を、Capcell Pak Ｃ８
（６×３５ｍｍ：資生堂）により、溶出液として０.１
Ｍ ＮａＣｌＯ4および０.１％Ｈ2ＰＯ4水溶液（ＮａＯ
ＨでｐＨ７.０に調整）、次いでアセトニトリル濃度を
１％から６０％まで直線的に変化させるグレージェント
を用いるＨＰＬＣ（流速：１.５ｍＬ／分、検出：２１
４ｎｍ）を行った。ＧＳＲＰＡＥ−ＣＧＲＰ画分を集
め、目的生成物７０ｍｇ（収率：中間体から４１％、Ｎ
−末端Ｇｌｙから７０％）を得た。
Ｅ−ＣＧＲＰ 上記で得られた中間体１ｍｇ、ならびに３ｍＭアスコル
ビン酸、１０ｍＭ ＫＩ、０.２５ｍｇ／ｍＬカタラーゼ
（Sigma）および２００ｎＭ ＣｕＳＯ4を含む５０ｍＭ
Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ６.４）緩衝液中にＮ末端ア
ミド化酵素（資生堂：２.０ｕｎｉｔ）を加え、３７℃
で一晩反応させた。反応混合液を、Capcell Pak Ｃ８
（６×３５ｍｍ：資生堂）により、溶出液として０.１
Ｍ ＮａＣｌＯ4および０.１％Ｈ2ＰＯ4水溶液（ＮａＯ
ＨでｐＨ７.０に調整）、次いでアセトニトリル濃度を
１％から６０％まで直線的に変化させるグレージェント
を用いるＨＰＬＣ（流速：１.５ｍＬ／分、検出：２１
４ｎｍ）を行った。ＧＳＲＰＡＥ−ＣＧＲＰ画分を集
め、目的生成物７０ｍｇ（収率：中間体から４１％、Ｎ
−末端Ｇｌｙから７０％）を得た。
【００３４】なお、上記酵素反応はウマ血清から精製し
たＮ末端アミド化酵素（比活性１３.７ｕｎｉｔ／ｍｇ
タンパク質）を用いた（特公平７−４２３８号公報参
照）。
たＮ末端アミド化酵素（比活性１３.７ｕｎｉｔ／ｍｇ
タンパク質）を用いた（特公平７−４２３８号公報参
照）。
【００３５】Ｎ末端付加ＧＳＲＰＡＥアミノ酸残基の切
断 ＧＳＲＰＡＥ−ＣＧＲＰ→ＣＧＲＰ 上記で得られたＧＳＲＰＡＥ−ＣＧＲＰ７０ｍｇを、１
ｍＭ ＥＤＴＡを含有する１００ｍＭ炭酸アンモニウム
緩衝溶液中で、Ｖ８プロテアーゼ［Staphyrococcus aur
eus Ｖ８由来：比活性５８００ｕｎｉｔ／ｍｇ（Sigma
製）］を用い、２５℃で７時間、インキュベーションし
た。反応混合液を、Capcell Pak Ｃ８（６×３５ｍｍ：
資生堂）により、溶出液として０.１Ｍ ＮａＣｌＯ4お
よび０.１％Ｈ3ＰＯ4水溶液（ｐＨ２.０）、次いでアセ
トニトリル濃度を２０％から４０％まで直線的に変化さ
せるグレージェントを用いるＨＰＬＣ（流速：１.５ｍ
Ｌ／分、検出：２１４ｎｍ）を行った。ＣＧＲＰ画分を
集め、凍結乾して、ＣＧＲＰ（成熟型）５０ｍｇ（収
率：中間体から２９％、Ｎ末端−ＮＨ2から７１％）を
得た。
断 ＧＳＲＰＡＥ−ＣＧＲＰ→ＣＧＲＰ 上記で得られたＧＳＲＰＡＥ−ＣＧＲＰ７０ｍｇを、１
ｍＭ ＥＤＴＡを含有する１００ｍＭ炭酸アンモニウム
緩衝溶液中で、Ｖ８プロテアーゼ［Staphyrococcus aur
eus Ｖ８由来：比活性５８００ｕｎｉｔ／ｍｇ（Sigma
製）］を用い、２５℃で７時間、インキュベーションし
た。反応混合液を、Capcell Pak Ｃ８（６×３５ｍｍ：
資生堂）により、溶出液として０.１Ｍ ＮａＣｌＯ4お
よび０.１％Ｈ3ＰＯ4水溶液（ｐＨ２.０）、次いでアセ
トニトリル濃度を２０％から４０％まで直線的に変化さ
せるグレージェントを用いるＨＰＬＣ（流速：１.５ｍ
Ｌ／分、検出：２１４ｎｍ）を行った。ＣＧＲＰ画分を
集め、凍結乾して、ＣＧＲＰ（成熟型）５０ｍｇ（収
率：中間体から２９％、Ｎ末端−ＮＨ2から７１％）を
得た。
【００３６】このＣＧＲＰは、ペプチドシーケンサーお
よびＦＡＢ−Ｍａｓｓによる分析、ならびにウサギによ
る紅班形成性の測定によって、市販のＣＧＲＰ（バッケ
ム社）と同一であることが確認された。
よびＦＡＢ−Ｍａｓｓによる分析、ならびにウサギによ
る紅班形成性の測定によって、市販のＣＧＲＰ（バッケ
ム社）と同一であることが確認された。
【００３７】
【発明の効果】本発明によれば、ヒトカルシトニン関連
ペプチド（ＣＧＲＰ）を効果よく製造するための融合タ
ンパク質中間体ペプチドおよび前駆体ペプチド［ＣＧＲ
Ｐ(ＮＨ2 -）Ｇｌｙ］、ならびにそれらをコードするＤ
ＮＡ、かかるＤＮＡの発現による前記融合タンパク質、
ペプチド類の生産、得られたペプチド類からＣＧＲＰの
生成法が提供される。
ペプチド（ＣＧＲＰ）を効果よく製造するための融合タ
ンパク質中間体ペプチドおよび前駆体ペプチド［ＣＧＲ
Ｐ(ＮＨ2 -）Ｇｌｙ］、ならびにそれらをコードするＤ
ＮＡ、かかるＤＮＡの発現による前記融合タンパク質、
ペプチド類の生産、得られたペプチド類からＣＧＲＰの
生成法が提供される。
【００３８】特に、本発明では、ＣＧＲＰをコードする
遺伝子をそのＮ末端に少なくとも６個のアミノ酸残基を
残こして切断されるように融合タンパク質発現プラスミ
ドを設計したことによって、タンパク質の発現量を高め
るとともに、該融合タンパク質からＣＧＲＰへの酵素処
理における収率の向上が達成される。
遺伝子をそのＮ末端に少なくとも６個のアミノ酸残基を
残こして切断されるように融合タンパク質発現プラスミ
ドを設計したことによって、タンパク質の発現量を高め
るとともに、該融合タンパク質からＣＧＲＰへの酵素処
理における収率の向上が達成される。
【００３９】
【表１】
【００４０】
【表２】
【００４１】
【表３】
【図１】本発明の融合タンパク質の発現プラスミドを構
築するための操作手順を示す流れ図である。
築するための操作手順を示す流れ図である。
【図２】本発明の発現プラスミドの構造を示す図であ
る。
る。
【手続補正書】
【提出日】平成８年４月１２日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００２
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００２】
【従来の技術】ヒトＣＧＲＰは、配列番号：１に示され
る３７個のアミノ酸残基からなり、かつＣ末端がアミド
化されている化合物であって、血管拡張作用等を有し、
高血圧の治療等の用途が検討されている興味深いペプチ
ドである。特表昭６０−５０１５６２号公報には、ヒト
ＣＧＲＰの組換えＤＮＡ技術の製造方法が記載されてい
る。記載された方法によれば、Ｃ末端に付加的アミノ酸
残基を有するヒトＣＧＲＰのＮ末端を選択的に化学また
は酵素分解しうる結合、例えばメチオニンもしくはグル
タミン酸残基、を介してクロラムフェコールアセチルト
ランスフェラーゼタンパク質もしくはβ−ガラクトシダ
ーゼタンパク質を結合させた融合タンパク質をコードす
るＤＮＡの発現に成功している。
る３７個のアミノ酸残基からなり、かつＣ末端がアミド
化されている化合物であって、血管拡張作用等を有し、
高血圧の治療等の用途が検討されている興味深いペプチ
ドである。特表昭６０−５０１５６２号公報には、ヒト
ＣＧＲＰの組換えＤＮＡ技術の製造方法が記載されてい
る。記載された方法によれば、Ｃ末端に付加的アミノ酸
残基を有するヒトＣＧＲＰのＮ末端を選択的に化学また
は酵素分解しうる結合、例えばメチオニンもしくはグル
タミン酸残基、を介してクロラムフェコールアセチルト
ランスフェラーゼタンパク質もしくはβ−ガラクトシダ
ーゼタンパク質を結合させた融合タンパク質をコードす
るＤＮＡの発現に成功している。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１１】このような発現ベクターのうち、宿主とし
て原核細胞、特に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を使用する場
合に適する市販されているものとしては、例えば、グル
タチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（以下、ＧＳＴとい
う）をコードするｐＧＥＸ系のｐＧＥＸ−２Ｔ、ｐＧＥ
Ｘ−３Ｘなど（ファルマシア社）、プロテインＡをコー
ドするｐＲＩＴ２Ｔ（ファルマシア社）、Ｔ７ファージ
のｇｅｎｅ １０遺伝子産物をコードするｐＧＥＭＥＸ
−２（プロメガ社）、β−ガラクトシダーゼをコードす
るｐＥＸ１、ｐＥＸ２など（クロンテック社）、および
その他マルトースバインデイグプロテインをコードする
ｐＭＡＬ系のベクターが挙げられる。また、本発明の融
合タンパク質をコードするＤＮＡは、宿主細胞としてそ
れ自体既知の真核細胞およびベクターを用いて発現する
こともできる。なお、この場合、融合タンパク質のＣ末
端がアミド化された形態で得られる場合もある。
て原核細胞、特に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を使用する場
合に適する市販されているものとしては、例えば、グル
タチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（以下、ＧＳＴとい
う）をコードするｐＧＥＸ系のｐＧＥＸ−２Ｔ、ｐＧＥ
Ｘ−３Ｘなど（ファルマシア社）、プロテインＡをコー
ドするｐＲＩＴ２Ｔ（ファルマシア社）、Ｔ７ファージ
のｇｅｎｅ １０遺伝子産物をコードするｐＧＥＭＥＸ
−２（プロメガ社）、β−ガラクトシダーゼをコードす
るｐＥＸ１、ｐＥＸ２など（クロンテック社）、および
その他マルトースバインデイグプロテインをコードする
ｐＭＡＬ系のベクターが挙げられる。また、本発明の融
合タンパク質をコードするＤＮＡは、宿主細胞としてそ
れ自体既知の真核細胞およびベクターを用いて発現する
こともできる。なお、この場合、融合タンパク質のＣ末
端がアミド化された形態で得られる場合もある。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１８】また、本発明に従えば、驚くべきことに、
Ｓ′−ＣＧＲＰ（ＮＨ２ −）Ｘは、そのＮ末端にＳ′と
して６個のアミノ酸残基からなるペプチド鎖が結合して
いることによって安定化され、続く酵素処理等による
Ｓ′−ＣＧＲＰ（ＮＨ２ −）Ｘからの成熟ＣＧＲＰ（Ｃ
末端がアミド化されている）への変換収率を有意に高め
うることが見い出された。Ｓ′−ＣＧＲＰ（ＮＨ２ −）
Ｘから成熟ＣＧＲＰを得るための酵素処理としては、例
えばＳ′が上記ＧＳＲＰＡＥからなり、ＸがＧ（Ｇｌ
ｙ）である場合には、ペプチドＣ末端アミド化酵素を用
いるＣ末端Ｇｌｙ残基からのアミド（ＮＨ２）化段階、
或いはＧＳＲＰＡＥのＶ８プロテアーゼによるＣＧＲＰ
部分からの開裂段階のいずれを先行させるかまたは同時
に行うこともできるが、ＣＧＲＰのＳ′残部による安定
化を考慮すると、Ｃ末端アミド化処理を先行させること
が好ましい。
Ｓ′−ＣＧＲＰ（ＮＨ２ −）Ｘは、そのＮ末端にＳ′と
して６個のアミノ酸残基からなるペプチド鎖が結合して
いることによって安定化され、続く酵素処理等による
Ｓ′−ＣＧＲＰ（ＮＨ２ −）Ｘからの成熟ＣＧＲＰ（Ｃ
末端がアミド化されている）への変換収率を有意に高め
うることが見い出された。Ｓ′−ＣＧＲＰ（ＮＨ２ −）
Ｘから成熟ＣＧＲＰを得るための酵素処理としては、例
えばＳ′が上記ＧＳＲＰＡＥからなり、ＸがＧ（Ｇｌ
ｙ）である場合には、ペプチドＣ末端アミド化酵素を用
いるＣ末端Ｇｌｙ残基からのアミド（ＮＨ２）化段階、
或いはＧＳＲＰＡＥのＶ８プロテアーゼによるＣＧＲＰ
部分からの開裂段階のいずれを先行させるかまたは同時
に行うこともできるが、ＣＧＲＰのＳ′残部による安定
化を考慮すると、Ｃ末端アミド化処理を先行させること
が好ましい。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３３】Ｃ末端アミド化 ＧＳＲＰＡＥ−ＣＧＲＰ（ＮＨ２ −）Ｇｌｙ→ＧＳＲＰ
ＡＥ−ＣＧＲＰ 上記で得られた中間体１ｍｇ、ならびに３ｍＭアスコル
ビン酸、１０ｍＭＫＩ、０．２５ｍｇ／ｍＬカタラーゼ
（Ｓｉｇｍａ）および２００ｎＭ ＣｕＳＯ４を含む５
０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ６．４）緩衝液中に
Ｎ末端アミド化酵素（資生堂：２．０ｕｎｉｔ）を加
え、３７℃で一晩反応させた。反応混合液を、Ｃａｐｃ
ｅ１１ Ｐａｋ Ｃ８（６×３５ｍｍ：資生堂）によ
り、溶出液として０．１Ｍ ＮａＣｌＯ４および０．１
％Ｈ２ＰＯ４水溶液（ＮａＯＨでｐＨ７．０に調整）、
次いでアセトニトリル濃度を１％から６０％まで直線的
に変化させるグレージェントを用いるＨＰＬＣ（流速：
１．５ｍＬ／分、検出：２１４ｎｍ）を行った。ＧＳＲ
ＰＡＥ−ＣＧＲＰ画分を集め、目的生成物７０ｍｇ（収
率：中間体から４１％、Ｎ−末端Ｇｌｙから７０％）を
得た。
ＡＥ−ＣＧＲＰ 上記で得られた中間体１ｍｇ、ならびに３ｍＭアスコル
ビン酸、１０ｍＭＫＩ、０．２５ｍｇ／ｍＬカタラーゼ
（Ｓｉｇｍａ）および２００ｎＭ ＣｕＳＯ４を含む５
０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ６．４）緩衝液中に
Ｎ末端アミド化酵素（資生堂：２．０ｕｎｉｔ）を加
え、３７℃で一晩反応させた。反応混合液を、Ｃａｐｃ
ｅ１１ Ｐａｋ Ｃ８（６×３５ｍｍ：資生堂）によ
り、溶出液として０．１Ｍ ＮａＣｌＯ４および０．１
％Ｈ２ＰＯ４水溶液（ＮａＯＨでｐＨ７．０に調整）、
次いでアセトニトリル濃度を１％から６０％まで直線的
に変化させるグレージェントを用いるＨＰＬＣ（流速：
１．５ｍＬ／分、検出：２１４ｎｍ）を行った。ＧＳＲ
ＰＡＥ−ＣＧＲＰ画分を集め、目的生成物７０ｍｇ（収
率：中間体から４１％、Ｎ−末端Ｇｌｙから７０％）を
得た。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３４
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３４】なお、上記酵素反応はウマ血清から精製し
たＣ末端アミド化酵素（比活性１３．７ｕｎｉｔ／ｍｇ
タンパク質）を用いた（特公平７−４２３８号公報参
照）。
たＣ末端アミド化酵素（比活性１３．７ｕｎｉｔ／ｍｇ
タンパク質）を用いた（特公平７−４２３８号公報参
照）。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３８
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３８】特に、本発明では、ＣＧＲＰをコードする
遺伝子をそのＮ末端に少なくとも６個のアミノ酸残基を
残して切断されるように融合タンパク質発現プラスミド
を設計したことによって、タンパク質の発現量を高める
とともに、該融合タンパク質からＣＧＲＰへの酵素処理
における収率の向上が達成される。
遺伝子をそのＮ末端に少なくとも６個のアミノ酸残基を
残して切断されるように融合タンパク質発現プラスミド
を設計したことによって、タンパク質の発現量を高める
とともに、該融合タンパク質からＣＧＲＰへの酵素処理
における収率の向上が達成される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (11)
- 【請求項１】 式 Ｐ−Ｓ−ＣＧＲＰ(ＮＨ2 -)−Ｘ （Ｉ） 式中、Ｐは原核細胞または真核細胞で発現可能なタンパ
ク質部分を表し、 Ｓは、前記式で表される融合タンパク質をある種の酵素
で消化したとき、少なくとも６個のアミノ酸残基からな
る配列をＣＧＲＰ(ＮＨ2 -）のＮ末端に残存させてＨ−
Ｓ′−ＣＧＲＰ(ＮＨ2 -)−Ｘ（ここで、Ｓ′はＳ部分ま
たはＰ−Ｓ部分よりある種の酵素で消化された後のペプ
チド残部である）を形成し、次いで別の酵素で消化した
とき、Ｈ−ＣＧＲＰ(ＮＨ2 -)−Ｘを形成するスペーサー
ペプチド部分を表し、 ＣＧＲＰ(ＮＨ2 -）はヒトカルシトニン遺伝子関連ペプ
チドのＣ末端がアミド化されていない部分を表し、そし
てＸはＮＨ2、ＧｌｙまたはＧｌｙ−Ｙで表されるペプ
チド残基（ここで、ＹはＧｌｙをＣＧＲＰ(ＮＨ2 -）の
Ｃ末端に残存させたまま開裂することのできるペプチド
残基である）を表す、で示される融合タンパク質。 - 【請求項２】 Ｐのタンパク質が、β−ガラクトシダー
ゼ、Ｔ７ファージのgene １０遺伝子産物、グルタチオ
ン−Ｓ−トランスフェラーゼ、プロテインＡのＩｇＧ結
合ドメイン、γ−インターフェロンのＮ末端６０アミノ
酸、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ
およびマルトース結合タンパク質からなる群より選ばれ
るタンパク質である請求項１記載の融合タンパク質。 - 【請求項３】 Ｓ′がＧｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ
−Ａｌａ−Ｇｌｕのアミノ酸配列を含むスペーサーペプ
チド部分であり、Ｐがグルタチオン−Ｓ−トランスフェ
ラーゼである請求項１または２記載の融合タンパク質。 - 【請求項４】 ＸがＧｌｙである請求項１〜３項のいず
れかに記載の融合タンパク質。 - 【請求項５】 請求項１〜４のいずれかに記載の融合タ
ンパク質をコードするＤＮＡ。 - 【請求項６】 式 Ｓ´−ＣＧＲＰ(ＮＨ2 -)−Ｘ （ＩＩ） 式中、ＣＧＲＰ（ＮＨ2 -）およびＸは請求項１の定義に
同じであり、Ｓ′はＳ部分または式（Ｉ）のＰ−Ｓ部分
からある種の酵素で消化された後のペプチド残部であ
る、で示されるヒトカルシトニン遺伝子関連ペプチド中
間体。 - 【請求項７】 Ｓ′がＧｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ
−Ａｌａ−Ｇｌｕである請求項６記載の中間体。 - 【請求項８】 ＸがＧｌｙである請求項６または７記載
の中間体。 - 【請求項９】 請求項５記載の融合タンパク質をコード
するＤＮＡを担持する発現プラスミドで形質転換した宿
主細胞を、栄養培地で培養して、前記融合タンパク質を
生産し、次いで培養物から前記融合タンパク質を回収す
ることを特徴とするタンパク質の生産方法。 - 【請求項１０】 請求項１〜４のいずれかに記載の融合
タンパク質を含有する水性媒体をＰのタンパク質に対し
て親和性を有するアフィニティークロマトグラフィーの
担体に供してＰ部分を介して固定し、次いで式（Ｉ）の
Ｐ−Ｓの配列の少なくとも１箇所を開列させて式（Ｉ
Ｉ）のＳ′−ＣＧＲＰ（ＮＨ2 -)−Ｘで示されるヒトカ
ルシトニン遺伝子関連ペプチド中間体を生成せしめ、同
時かまたは引続いて前記中間体を溶出させることを特徴
とする請求項６または７記載の式（ＩＩ）で示されるヒ
トカルシトニン遺伝子関連ペプチド中間体の製造方法。 - 【請求項１１】 請求項６または７記載のヒトカルシト
ニン遺伝子関連ペプチド中間体をＣ末端アミド化酵素で
処理し、次いで式（ＩＩ）で示されるＳ′部分をそのＣ
末端で開裂させること、を特徴とするヒトカルシトニン
遺伝子関連ペプチドの製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8068990A JPH09234076A (ja) | 1996-03-01 | 1996-03-01 | ヒトｃｇｒｐ前駆体およびその調製方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8068990A JPH09234076A (ja) | 1996-03-01 | 1996-03-01 | ヒトｃｇｒｐ前駆体およびその調製方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09234076A true JPH09234076A (ja) | 1997-09-09 |
Family
ID=13389620
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8068990A Withdrawn JPH09234076A (ja) | 1996-03-01 | 1996-03-01 | ヒトｃｇｒｐ前駆体およびその調製方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH09234076A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0838224A3 (en) * | 1996-10-02 | 1999-12-01 | Kuraray Co., Ltd. | Polymer-drug conjugates with an enzyme cleavable linker |
-
1996
- 1996-03-01 JP JP8068990A patent/JPH09234076A/ja not_active Withdrawn
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0838224A3 (en) * | 1996-10-02 | 1999-12-01 | Kuraray Co., Ltd. | Polymer-drug conjugates with an enzyme cleavable linker |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR0150565B1 (ko) | 유전자 조환에 의한 사람 인슐린 전구체의 제조 및 이를 이용한 인슐린의 제조방법 | |
| US5506120A (en) | Method of producing peptides or proteins as fusion proteins | |
| JP4857279B2 (ja) | カルボキシ末端をアミド化したペプチドの製造方法 | |
| JP5352234B2 (ja) | 特定のエンドプロテアーゼによって塩基性アミノ酸のｃ末端を用いてポリペプチドをアミド化する方法 | |
| JPH02500876A (ja) | 組換えポリペプチドの製品およびその製造、単離および精製方法 | |
| CN109486800B (zh) | 一种新型赖氨酰肽链内切酶及其制备方法 | |
| JP4749548B2 (ja) | インテイン媒介ペプチド連結 | |
| WO1986007380A1 (en) | Process for preparing polypeptide | |
| Polyak et al. | Introduction of spacer peptides N-terminal to a cleavage recognition motif in recombinant fusion proteins can improve site-specific cleavage. | |
| US7001745B1 (en) | Intein mediated peptide ligation | |
| Forsberg et al. | Thrombin and H64A subtilisin cleavage of fusion proteins for preparation of human recombinant parathyroid hormone | |
| RU2144957C1 (ru) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pPINS07, КОДИРУЮЩАЯ ГИБРИДНЫЙ ПОЛИПЕПТИД, СОДЕРЖАЩИЙ ПРОИНСУЛИН ЧЕЛОВЕКА, И ШТАММ БАКТЕРИЙ Escherichia coli - ПРОДУЦЕНТ ГИБРИДНОГО ПОЛИПЕПТИДА, СОДЕРЖАЩЕГО ПРОИНСУЛИН ЧЕЛОВЕКА | |
| US8530217B2 (en) | Processing of peptides and proteins | |
| JP2021511785A (ja) | 組換えポリペプチド生産用ｎ末端融合パートナーおよびこれを用いた組換えポリペプチドの生産方法 | |
| CN101172996A (zh) | 用于多肽融合表达的连接肽及多肽融合表达方法 | |
| JPH09234076A (ja) | ヒトｃｇｒｐ前駆体およびその調製方法 | |
| JP2845558B2 (ja) | メチオニンアミノペプチダーゼのｄｎａ配列 | |
| WO2012048856A1 (en) | Proinsulin with helper sequence | |
| KR102643064B1 (ko) | 발현 수준 및 가용성이 증대된 인간 엔테로키나제 융합 단백질 및 그 제조방법 | |
| US5641646A (en) | Process for preparation of human glicentin | |
| JP2887060B2 (ja) | グリセンチンの生産方法 | |
| KR0149955B1 (ko) | 융합단백질을 이용한 인간 글루카곤의 제조방법 | |
| KR101949009B1 (ko) | 융합단백질-다당 복합체의 제조방법 및 이의 용도 | |
| NZ229748A (en) | Process of producing a protein from a precursor having an n-terminal pro by enzymatic cleavage | |
| KR100562873B1 (ko) | 인간 인슐린 발현 플라스미드 및 이를 이용한 인간인슐린의 제조 방법 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A300 | Withdrawal of application because of no request for examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 20030506 |