JP5352234B2

JP5352234B2 - 特定のエンドプロテアーゼによって塩基性アミノ酸のｃ末端を用いてポリペプチドをアミド化する方法

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Publication number: JP5352234B2
Application number: JP2008532625A
Authority: JP
Inventors: セバスティアン・リーソム; パウル・ハーバーマン; クリストフ・サラナド; フランク・ツォハー; ロール・ランドリク−ビュルタイン
Original assignee: サノフィ−アベンティス・ドイチュラント・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング
Priority date: 2005-09-27
Filing date: 2006-09-13
Publication date: 2013-11-27
Anticipated expiration: 2026-09-13
Also published as: MY148447A; BRPI0616712B1; US8765910B2; PT1931705E; EP1931705A2; US20100311112A1; CA2623547C; WO2007036299A2; IL190229A; SI1931705T1; CY1112182T1; ATE523522T1; AR055179A1; BRPI0616712A2; IL190229A0; BRPI0616712B8; CN101268097A; KR20080061367A; KR101363299B1; EP1931705B1

Description

本発明は、Ｃ末端がアミド化された二塩基性または多塩基性ペプチドの製造方法、具体的には、ＧＬＰ−１、または、それらの類似体もしくは誘導体の生物活性を有する上記ペプチドの製造方法に関する。

製薬的に関連するペプチドおよびタンパク質の安定性、生物医学的な利用可能性、および、作用の持続時間は、大体において、分子のＮまたはＣ末端の性質に依存する。生体分子の半減期は、塩基性アミノ酸を有するＣ末端の伸長部分によって著しく影響を受ける。１個より多くの塩基性アミノ酸を有するＣ末端の伸長部分において、Ｃ末端のアミノ酸がアミノアミドである場合、特に優れた薬剤活性が達成される。

このようなペプチドベースの活性物質は、ペプチドが十分に小さい場合、改変されたメリフィールドの合成プロトコールに従って完全な化学合成によって直接製造することができる。しかしながら、このようなペプチドが大量に必要な場合に限定が生じる。従って、このような合成で用いようとするアミノ酸をまず製造し、続いて化学修飾後にペプチド合成における反応物として適切になるように精製しなければならない。合成の最後に保護基を除去した後、標的ペプチドまたは生成物を精製して、製薬として製剤化してもよい。さらに、ペプチドの組成に応じて、合成中に、個々のカップリング工程において近隣の作用が起こり、カップリングが不完全になることによって、収量が制限されること、ラセミ化、または、副産物の形成が生じる可能性があるため、場合によっては、生成物の総体的な収量または純度に逆効果を与える可能性がある。すべて合成することは、必要な生成物を多量に製造するには複雑すぎる。それゆえに、その代わりの方法、特にバイオテクノロジーによる方法による製造が望ましい。

長い間、ペプチドのＣ末端をアミド化することができる酵素が知られてきた。これらの酵素は、ペプチジルグリシンα−アミド化酵素（ＰＡＭ）と名付けられている（Ｅｉｐｐｅｒ等．Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１９８７年１１月；１（１１）：７７７）。このようなＰＡＭ酵素の製造および精製は熟練者にはよく知られており、詳細に説明されている（Ｍ．Ｎｏｇｕｄｉ等．Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．２００３，２８：２９３）。しかしながら、このような製造は、例えばトリプシンまたはカルボキシペプチダーゼのようなその他の工業的に利用される酵素の製造に比べて多大な費用を要する。

「インビトロでの」アミド化のＰＡＭを用いた代替法、すなわちこのような酵素が同じ宿主細胞でアミド化される前駆タンパク質と共に発現されるような方法が開発されている。これは、宿主細胞に、ＰＡＭ活性に関してコードされた遺伝子配列を宿主特異的な調節配列の制御下に導入することによって達成される。この発現配列は、それぞれの染色体ＤＮＡ配列に安定して組み込まれるか、または、標的タンパク質に関する発現プラスミドと同時に存在する第二のプラスミドに存在するか、または、同じベクターにおける第二の発現カセットとして統合されるか、または、多シストロン性の発現アプローチにおいて、標的タンパク質をコードする遺伝子配列と同調して、同じプロモーター配列の制御下でクローニングされるかのいずれかが可能である。しかしながら、説明されている収量は低いため、大量製造はそれ相応な発酵の量によってのみ達成できる。このために、より多大な費用を要する複雑な精製が必要になる。加えて、アミド化が定量的に起こらないため、アミド化していない必要なタンパク質からアミド化したものを分離することが必要である。分泌による製造方法に基づく決定（例えば、Ｈｏｎｇ等．，ＡｐｐｌＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００３；１１０，１１３〜２３頁）は、多塩基性Ｃ末端を有するタンパク質が極めてわずかしか分泌されないか、または全く分泌されないことを考慮に入れなければならない。

さらなるアミド化法は、タンパク質特異的な自己切断メカニズムの使用に基づく（Ｃｏｔｔｉｎｇｈａｍ等．ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈ．第１９巻，９７４〜９７７，２００１）。しかしながら、この反応とトランスチオエステル化を制御することは簡単ではないため、不要な生成物の形成が生じる可能性がある。融合タンパク質が比較的大きく寄与していると、収量に逆効果を与える可能性がある。

上述のアミド化法は、少なくとも１個のアミノ酸のグリシンまたはその代わりのインテインペプチドによって伸長した標的ペプチドのＣ末端から開始する。しかしながら、Ｃ末端にリシンを有するペプチドがその後の配列に追加のリシンまたはアルギニンを含まない場合、それらは多量体構造として製造することができ、続いてそれらをトリプシン消化によって変換してもよいし、または、トリプシン様の酵素によってモノマー単位に変換してもよい。この方法で高い収量が達成できる。これは、上述の方法の場合不可能である。

従って、既知のバイオテクノロジーの製造方法は不利益を伴い、Ｃ末端に１個より多くの塩基性アミノ酸であるリシンまたはアルギニンを有し、末端がアミド化されているペプチドまたはタンパク質を、適度なコストで大量に製造する目的は、未だ満足に解決されたとはみなされていない。

代替の製造方法により、少なくとも１個の塩基性アミノ酸がトランケーションされた標的ペプチドの前駆体を大量に製造して、その後、リシンアミドまたはアルギニンアミドを用いた酵素触媒による半合成でこの前駆体伸長させることが可能であるかどうかが明らかになると予想される。

Ｌｅｖｉｎ等（ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＪｏｕｒｎａｌ６３：３０８〜１６；１９５６）は、リシンアミド、および、様々なポリリシンアミドペプチドに対するトリプシンの作用を説明している。著者の結果によれば、リシンアミド誘導体は、トリプシンの影響下では、高分子量のリシンアミド誘導体に変換することができないことが示され、これはなぜなら、中間で形成されたアミドの遊離酸への加水分解が、カップリング反応と比較すると急速に起こるためである。その結果から、Ｃ結合型のポリリシンアミドもしくはポリアルギニンアミド、または、ポリＬｙｓ／Ａｒｇ混合型の配列を有するペプチドの製造を提供するトリプシン触媒による半合成方法は成功しないか、または、成功したとしても収量が極めて低いと結論付ける必要がある。

驚くべきことに、ここで、アミド化した塩基性アミノ酸、それらの類似体または誘導体の、Ｃ末端に塩基性アミノ酸を有するペプチドへのトリプシン触媒によるライゲーションを高い収量で（すなわち３０％を超える）可能にするペプチドの化学的方法が見出された。

加えて、本発明の方法に関して、驚くべきことに、アミド化した塩基性アミノ酸（リシンアミド、アルギニンアミド）への保護基の導入（Ｐｉｔｒａｓｃｈｋｅ等，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ：Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ９，１５０５〜１５１８頁，１９９８を参照）、例えば−Ｂｏｃ（ｔ−ブチルオキシカルボニル）、−Ｚ（ベンジルオキシカルボニル）、または、−ＤＤＺ（ジメチルフェニルプロピルオキシカルボニル）のような保護基の導入によっても、ライゲーション反応の効率および選択性に関する改善がみられないことが観察することができた。従って、本発明の方法は、保護基でマスキングすることによって、保護基の除去、および、毒性の試薬の除去による収量の損失を防ぐことができるという利点を有する。これにより、全ての化学合成にわたり莫大なコスト面での利点を有する方法が得られる。

従って、本発明の一形態は、Ｃ末端がアミド化された二塩基性または多塩基性ペプチドの製造方法であって、該ペプチドは、一般式Ｉ：
（ＡＡ)_n−Ｘ_m−ＮＨ₂ （Ｉ）
［式中、
（ＡＡ)_nは、同一または異なるタイプのｎ個のアミノ酸からなるペプチドであり、ここで、
ＡＡは、アミノ酸、または、それらの類似体もしくは誘導体であり；
ｎは、３〜２０００の整数であり；および、
Ｘは、塩基性アミノ酸、または、それらの類似体もしくは誘導体であり；
ｍは、２〜１５の整数である］
で示され、本方法において、一般式ＩＩ：
（ＡＡ)_n−Ｘ_p （ＩＩ）
で示される化合物と、一般式ＩＩＩ：
（Ｘ)_q−ＮＨ₂ （ＩＩＩ）
［式中、
ＡＡ、ｎ、および、Ｘは、上記で定義された通りであり、
ｐ、および、ｑは、整数であり、そして
ｐ＋ｑ＝ｍである］
で示される化合物とを、トリプシンの生物活性を有する酵素の存在下で反応させ、必要に応じて、得られた式Ｉで示される化合物を、化学的なタンパク質精製で処理し；
具体的には、ｍは、２〜１０の整数であるか、または、ｍは、２〜６の整数である。

本発明のさらなる形態は、ｎが、１０〜１０００の整数であるか、または、１５〜５００もしくは２０〜４００の整数である上述の方法である。

本発明のさらなる形態は、
ａ）融合ペプチドの一部として１種またはそれ以上の式ＩＩで示される化合物を含む融合ペプチドを発現させ；
ｂ）前記融合ペプチドから、式ＩＩで示される化合物を化学的または酵素的な切断によって遊離させ；
ｃ）必要に応じて、化学的なタンパク質精製の後に、工程ｂ）からの中間体と式ＩＩＩで示される化合物とを、トリプシンの生物活性を有する酵素の存在下で反応させ；および、
ｄ）必要に応じて、得られた式Ｉで示される化合物を、化学的なタンパク質精製および単離処理する上述の方法であって、
ここで、具体的には、融合タンパク質からの式ＩＩで示される化合物の除去は、ハロゲン化シアン、エンテロキナーゼ、Ｘａ因子、ジェネナーゼ（Ｇｅｎｅｎａｓｅ）、トロンビン、または、トリプシンによって起こり；および、さらに好ましくは、融合タンパク質は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｓ．カルノーサス（Ｓ．ｃａｒｎｏｓｕｓ）、サルモネラ属、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、Ｋ．ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）、Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅ）、および、Ｓ．セレビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を含む群より選択される発現系で発現される。

本発明のさらなる形態は、前記一般式Ｉで示されるペプチドが、ＧＬＰ−１、または、それらの誘導体もしくは類似体の生物活性を有する、上述の方法である。

本発明のさらなる形態は、式Ｉで示される化合物は、式ＩＶ：
HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPS(X)m-NH₂ (ＩＶ)
で示されることを特徴とする上述の方法であり；

これらはさらに、具体的には、以下の配列：
HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPSKK KKKK-NH₂（配列番号１）；
HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPSKK-NH₂（配列番号２）；
HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPSKR-NH₂（配列番号３）；
HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPSKK KKKR-NH₂（配列番号４）、または、
HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPSRK-NH₂（配列番号５）
を特徴とする上述の方法であってもよい。

本発明はさらに、以下の配列：
HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPSKK-NH₂（配列番号２）；
HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPSKR-NH₂（配列番号３）；
HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPSKK KKKR-NH₂（配列番号４）、または、
HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPSRK-NH₂（配列番号５）；
を特徴とする式Ｉで示される化合物、それらの使用、特にデポー製剤での使用に関する。

本発明のさらなる形態は、以下の配列：
HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPSKK-NH₂（配列番号２）；
HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPSKR-NH₂（配列番号３）；
HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPSKK KKKR-NH₂（配列番号４）、または、
HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPSRK-NH₂（配列番号５）
を特徴とする式Ｉで示される化合物を１種またはそれ以上を含む医薬品である。

本発明の目的における意味は、以下の通りである：
アミノ酸の「類似体」という用語は、遺伝子コードではコードされないが、ペプチド鎖への取り込みに適している天然に存在するアミノ酸を意味する。アミノ酸の類似体の例は、オルニチン、および、シトルリンであり、加えて、側鎖において何らかの塩基性の官能性を有する、さらなる天然に存在しないアミノ酸、例えば２，４−ジアミノブタン酸；３−メチルオルニチン；４−メチルオルニチン、５−アミノロイシン；４−アミノロイシン；３−アミノロイシン；５−アミノノルロイシン；４−アミノ−ノルロイシン；３−アミノノルロイシン；４−アミノノルバリン；３−アミノノルバリン；６−メチルリシン；５−メチルリシン；４−メチルリシン；３−メチルリシンである。

アミノ酸の「誘導体」という用語は、１個またはそれ以上の化学基で置換されているアミノ酸、または、アミノ酸の類似体を意味する。このような化学基の例は、ペプチドの化学において一般的な保護基であり、例えば、−Ｂｏｃ（ｔ−ブチルオキシカルボニル）、−Ｚ（ベンジルオキシカルボニル）、−ＤＤＺ（ジメチルフェニルプロピルオキシ−カルボニル）、−Ｆｍｏｃ（Ｎ−アルファ−（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）、−２−ブロモ−Ｚ、−２−クロロ−Ｚ、−Ｔｆａ（トリフルオロアセチル）、−ニコチノイル、−４−ニトロ−Ｚ、−２−ピコリノイル、−Ｔｏｓ（４−トルエンスルホニル）、−Ｆｏｒ（ホルミル）、−ビオチニル、−ダンシル、−Ｄｎｐ（ジニトロフェニル）、−Ｍｃａ（モノクロロアセチル）、−Ｍｔｔ（Ｎ−メチルトリチル）、−Ｎｄｅ（Ｎ−１−（４−ニトロ−１，３−ジオキソインダン−２−イリデン）エチル）、−アセトイミドイル、−アセチル、−ミリストイル、−パルミトイル、Ｎ−リトコリル（ｌｉｔｈｏｃｈｏｌｙｌ）−γ−グルタミル、または、−ω−カルボキシヘプタデカノイルである。

このような基としては、さらに、基Ｃ（Ｏ）−（Ｃ₆〜Ｃ₂₄）アルキル、基Ｃ（Ｏ）−（Ｃ₆〜Ｃ₂₄）アルケニル、基Ｃ（Ｏ）−（Ｃ₆〜Ｃ₂₄）アルカンジエニル、または、基Ｃ（Ｏ）−（Ｃ₆〜Ｃ₂₄）アルカントリエニルが挙げられ、ここでアルキル、アルケニル、アルカンジエニルおよびアルカントリエニル基が示される場合、これらは分岐鎖である場合もあるし、または、直鎖である場合もある。（Ｃ₁〜Ｃ₆）アルキルは、１、２、３、４、５または６個のＣ原子を有する炭化水素ラジカルを意味する。（Ｃ₁〜Ｃ₆）アルキルラジカルの例は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、（１−メチルエチル）、ｎ−ブチル、イソブチル（２−メチルプロピル）、ｓｅｃ−ブチル（１−メチルプロピル）、ｔｅｒｔ−ブチル（１，１−ジメチルエチル）、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、ネオペンチル、ヘキシルである。同様に（Ｃ₆〜Ｃ₂₄）アルキルは、６〜２４個のＣ原子を有する炭化水素ラジカルを意味する。アルキルラジカルは、直鎖であってもよいし、または、分岐状であってもよい。好ましい（Ｃ₆〜Ｃ₂₄）アルキルラジカルは、脂肪酸残基であり、例えばヘキシル、オクチル、デカニル、ウンデカニル、ドデカニル、トリデカニル、テトラデカニル（ミリスチル）、ペンタデカニル、ヘキサデカニル、ヘプタデカニル、オクタデカニル（ステアリル）、ノナデカニル、エイコサニル、ジコサニル（ｄｉｃｏｓａｎｙｌ）、９，１１−ジメチルトリデカニル、１１−メチルトリデカニルである。

さらにこのような基としては、基Ｃ（Ｏ）−フェニル−（Ｃ₅〜Ｃ₈）ヘテロアリール−フェニル、Ｃ（Ｏ）−ビフェニル、または、Ｃ（Ｏ）−ターフェニルが挙げられ、ここで、フェニル、ビフェニル、ターフェニルまたはヘテロアリール基は、非置換であるか、または、（Ｃ₁〜Ｃ₁₀）アルキル、または、Ｏ（Ｃ₁〜Ｃ₁₀）アルキルからなる群より選択される１または２個の基で置換されている。一置換されたフェニルラジカルにおいて、置換基は、２位、３位または４位に存在する可能性がある。二置換されたフェニルは、２，３位、２，４位、２，５位、２，６位、３，４位、または、３，５位で置換されていてもよい。三置換されたフェニルラジカルにおいて、置換基は、２，３，４位、２，３，５位、２，４，５位、２，４，６位、２，３，６位、または、３，４，５位に存在する可能性がある。ヘテロアリールは、例えばフラニル、チエニル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、ピリジル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、インドリル、インタゾリル、キノリル、イソキノリル、フタラジニル、キノキサリニル、キナゾリニル、および、シンノリニルを意味する。

用語「塩基性アミノ酸」は、リシン、アルギニン、または、それらの誘導体もしくは類似体を意味し、例えばオルニチン、または、シトルリンであり、好ましくはリシンまたはアルギニンであり、特にリシンである。この点について、リシンまたはアルギニンは、カルボキサミド基の代わりに、１種またはそれ以上のその他の反応性基、具体的には、アミノエステル、ペプチドエステル、無水物およびハロゲン化物からなる群より選択される反応性基で誘導体化されていてもよく、これらも本発明の方法において同様に使用可能である。

用語「トリプシンの生物活性を有する酵素」は、ラット、ウシ、ブタ、ヒト、イヌ、マウスのような一般的な源由来の既知のトリプシンや市販のトリプシンに加えて、それらのアイソザイム、誘導体または変異体、さらに高度に関連した生化学的特性を有する酵素を意味し、例えばカテプシン、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）およびストレプトマイセス属（Ｓ．グリセウス（Ｓ．ｇｒｉｓｅｕｓ）、Ｓ．エクスフォリアタス（Ｓ．ｅｘｆｏｌｉａｔｕｓ）、Ｓ．エリスラエウス（Ｓ．ｅｒｙｔｈｒａｅｕｓ）、Ｓ．フラジアエ（Ｓ．ｆｒａｄｉａｅ）、および、Ｓ．アルビドフラバス（Ｓ．ａｌｂｉｄｏｆｌａｖｕｓ））由来のトリプシン、トリプターゼ、マスチン（ｍａｓｔｉｎ）、アクロシン、カリクレイン、ヘプシン、プロスタシンｌ、リシルエンドペプチダーゼ（Ｌｙｓ−Ｃ）、および、エンドプロテイナーゼ−Ａｒｇ−Ｃ（クロストリパイン）である。

この点について当業者には当然ながら、この列挙は決定的なものではなく、Ｃ末端で特異的に切断して塩基性アミノ酸にすることができるさらなる酵素、アイソザイム、誘導体または変異体が、バイオテクノロジー研究中に継続的に見出されつつある。あるいは、酵素の特異性を、ペプチドの化学修飾、または、ＤＮＡレベルでの突然変異（突然変異タンパク質）によって変更することもできる。加えて、酵素の特異性および活性は、適切な反応条件の選択によって有意に改変することができる。

本発明の方法の好ましい実施態様において、微生物の異種ペプチドを生産する能力が利用される。この目的のために、望ましいペプチド配列がそれに対応するＤＮＡ配列に翻訳され、これらが宿主特異的なプロモーター配列にカップリングされる。このケースにおいて、発現方法に応じて、細胞の内部に残存する融合ペプチドとして直接的または間接的に細胞によって形成されるように標的ペプチドを発現させることが可能である。

適切な融合ペプチドを用いた融合方法が選択される場合、熟練者には当然ながら、融合パートナーはリンカーによって一緒に連結させ、プロセシング後に標的ペプチドの望ましいＮ末端が利用可能になるような方法でパートナーを特異的に分裂させなければならない。本発明の目的において、標的ペプチドは、式ＩＩで示される化合物である。適切なリンカーの設計に関して、熟練者に既知であり継続的に拡大している多数の可能性が利用可能である。例えばアミノ酸であるメチオニンが選択される場合、ハロゲン化シアンを用いた化学的な切断が可能である。例えば、リンカーとして配列ＤＤＤＤＫのペンタペプチドが選択される場合、エンテロキナーゼを用いた切断が可能である。例えばテトラペプチド配列ＩＥＧＲが選択される場合、切断は、Ｘａ因子を用いて行ってもよい。適切な設計を用いれば、Ｎ末端がヒスチジンで始まるペプチドのプロセシング酵素としてジェネナーゼ（Ｇｅｎｅｎａｓｅ^(R)）を用いることができる。Ｎ末端がジペプチドＧｌｙ−Ｓｅｒを特徴とする場合、トロンビンのための認識および切断部位が生じるようにリンカーとしてテトラペプチドＬＶＰＲを選択することが可能である。本発明によればペプチドのカップリングにおいてトリプシンの生物活性を有する酵素が用いられるが、このような酵素の使用は、原則的に本発明の方法のこの時点でも可能である。従って、リシンまたはアルギニンが、リンカーとして融合部分と標的ペプチドとの間に挿入されるのであれば、トリプシンは、最初に、融合ペプチドの融合部分を除去するために水性媒体中で用いることができる。

しかしながら、標的ペプチドに関して、標的ペプチドが移動に適している場合、その代わりに融合ペプチドの形態か、またはその野生型のいずれかで細胞培地に分泌されてもよい。この目的のために、組換え宿主細胞、特に微生物、好ましくは細菌または酵母の宿主細胞を用いることが可能である。発現系として細菌細胞が選択される場合、標的ペプチド、または、それに相当する標的ペプチドを包含する融合ペプチドという追加の選択肢があり、すなわち、本発明の目的に関する式ＩＩで示される化合物は、ペリプラスムまたは培地に直接分泌される。この点について当業者には当然ながら、Ｃ末端が１個より多くの塩基性アミノ酸からなる場合、移出がしばしば制限される。

この目的のために原則的に利用可能な宿主生物および方法は熟練者であればよく知っている（例えば、Ｇｅｌｌｉｓｓｅｎ，Ｇｅｒｄ（編集）ＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＰｒｏｔｅｉｎｓ，ＩＳＢＮ３−５２７−３１０３６−３を参照）。またこれらは、多数の供給元から市販されていることが多い。代表的な例としては、ニューイングランドバイオラボ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、および、ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）といった会社が挙げられる。このような会社のカタログの説明には、技術の大要を示す文献への参照が含まれる。また、この点についても熟練者には当然ながら、用いられる微生物の範囲は、バイオテクノロジーによる方法のレパートリーが広がるにつれて継続的に増えている。この点においてより特異的な実施態様も本発明の主題に含まれる。代表的な宿主／ベクター系の例としては、Ｅ．コリ、Ｓ．カルノーサス、サルモネラ属、バチルス・ズブチリス、または、シュードモナスタイプの細菌、特に、シュードモナス・フルオレッセンスタイプの細菌、および、Ｋ．ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）、Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅ）、および、Ｓ．セレビジエタイプの酵母が挙げられる。

しかしながら、熟練者であれば当然ながら、上記で例示されたこれらの系は、例えば、適切なプロモーターまたはその他の調節核酸配列の選択、宿主細胞と用いられるベクターの遺伝学的特性（例えば、ＤＮＡのコピー数、選択手段の選択などに関して）から生じる多数の可能性のある変異体を提供する。

同様に熟練者であれば当然ながら、特異的な精製方法は、標的ペプチドを単離された形態で提供することを目的とする場合、その物理化学的な特性のために標的ペプチドごとに適応させなければならない。これは、原則的に、既知の生化学および生物物理学的な分離方法の適切な組み合わせによって達成される。同様にこの点について当然ながら、（例えば、クロマトグラフィーのための）新規の材料に基づき望ましい成功する精製を達成したり、または、最適化したりするための新しい可能性が継続的に開けつつある。

前駆体ペプチドと、例えばアフィニティークロマトグラフィーによる精製を可能にするペプチド配列とをを融合させることが、本発明の目的に関して有利であり得る。

本発明のさらなる開発のために、一例として、ＵＳ２００４／０１０６５４７で開示されたようなエキセンディン誘導体が製造されている。このようなエキセンディンから誘導されたペプチドは、それらの血糖を低くする作用のために、糖尿病、または、例えば肥満症に至るその他の代謝性疾患を治療する医薬品開発において重要な役割を果たす可能性がある。それゆえに、このような利用可能なペプチドが適切な形態で含まれることは、製薬目的において価値が高い。

国際特許出願ＷＯ０２／０６６６２８は、Ｃ末端にアミノ酸Ｌｙｓ−Ａｒｇを有するヒルジン誘導体を説明している。抗血栓症作用のプロファイルは、Ｃ末端のアルギニンをアミド化することによって改変することができる。この目的のために、Ｃ末端にリシンを有する前駆体が製造され、その後、本発明に従ってアルギニンアミドとカップリング反応させ、アミド化したヒルジン誘導体を得る。このような前駆体は、酵母分泌による用途で説明されているようにして製造することができる。この目的のために、例えば、ＥＰ−Ａ０３２４７１２で説明されているＬｅｕ−ヒルジンの遺伝子配列をリシンに関するコドンで伸長させ、この特許において一例として説明されている手法を継続し、リシンで伸長させたヒルジンを製造する。その代わりに、細菌による前駆体分泌の経路に従うことも可能である。この目的のために、例えば特許出願ＥＰ−Ａ１２１６２５９で説明されている技術を用いることができる。

以下の実施例は本発明の説明に役立つが、決して本発明の主題を制限するように解釈されない。

実施例１：ＡＶＥ（１−４３）をコードするＥ．コリに特異的なＤＮＡ配列の合成
まずペプチドＡＶＥ（１−４３）（配列番号７）をコードする配列番号６の遺伝子配列を製造した：
配列番号６：
TTTTTTAAGCTTGCACGGTGAAGGTACCTTCACCTCCGACCTGTCCAAACAGATGGAAGAAGAAGCTGTTCGTCTGTTCATCGAATGGCTGAAAAACGGTGGTCCGTCCTCCGGTGCTCCGCCTTCGAAAAAGAAGAAAAAGTGATAATAGCATGCACGTGCGGCCGCACCTGGTCGACGAATTCAAA AAAA
配列番号７：
HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPSKK KKK

これらの遺伝子配列をＰＣＲ技術によって合成した。この目的のために、以下の５種のプライマーを、化学的なＤＮＡ合成によって製造した。この合成は、エクスペディット（Ｅｘｐｅｄｉｔｅ^TM）ＤＮＡ合成システム（アプライド・バイオシステムズ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）製）を用いてなされた。

ａ）プライマーｚｐ５ｕは、以下の配列を有する（配列番号８）：
５’-TTTTTTAAGCTTGCACGGTGAAG -３’
配列番号８は、センス鎖（「センス」）の１〜２３の領域を含む。ＣＡＣトリプレットは、標的ペプチドの第一のアミノ酸としてヒスチジンをコードする。

ｂ）プライマーｚｐ３ａは、以下の配列を有する（配列番号９）：
５’-CTTCCATCTGTTTGGACAGGTCGGAGGTGAAGGTACCTTCACCGTGCAAG CTTAAAAAA-３’
配列番号９は、相補的な系（「アンチセンス」）の１〜５９の領域を含む。

ｃ）プライマーｚｐ３ｂは、以下の配列を有する（配列番号１０）：
５’-GGACGGACCACCGTTTTTCAGCCATTCGATGAACAGACGAACAGCTTCTTCTTCCATCTGTTTGGACAG-３’
配列番号１０は、相補鎖（「アンチセンス」）の４０〜１０８の領域を含む。

ｄ）プライマーｚｐ３ｃは、以下の配列を有する（配列番号１１）：
５-CGTGCATGCTATTATCACTTTTTCTTCTTTTTCGAAGGCGGAGCACCGGAGGACGGACCACCGTTTTTC-３’
配列番号１１は、相補鎖（「アンチセンス」）の９１〜１５９の領域を含む。

アンチセンスのトリプレットＣＴＴは、標的ペプチドの最後のアミノ酸（ＡＡ₄₃）をコードする。

ｅ）プライマーｚｐ３ｄは、以下の配列を有する（配列番号１２）：
５’-TTTTTTGAATTCGTCGACCAGGTGCGGCCGCACGTGCATGCTATTATCACTT-３’
配列番号１２は、相補鎖（「アンチセンス」）の残存する領域を含む。

その後、上記プライマーを用いて４回のＰＣＲ反応を標準条件下で５４℃で行った。反応１において、プライマーｚｐ３ａおよびｚｐ５ｕそれぞれ１００ｎｇを用いた。ＰＣＲのサイクル数は５であった。第二の反応において、上記反応液の４０分の１を、プライマーｚｐ５ｕおよびｚｐ３ｂそれぞれ１００ｎｇと１０サイクルで反応させた。反応３において、反応２の生成物の４０分の１を、プライマーｚｐ５ｕおよびｚｐ３ｃそれぞれ１００ｎｇとさらに１０サイクルで反応させた。最後に、反応３からの収量の４０分の１、および、プライマーｚｐ５ｕおよびｚｐ３ｄを用いて、望ましいＤＮＡフラグメントを２５回のＰＣＲサイクルで合成し、その長さをゲル電気泳動でチェックした。望ましいＤＮＡフラグメントを精製し、制限酵素ＥｃｏＲ１、続いてＨｉｎｄ３と、製造元の（ニューイングランドバイオラボ）の情報に従って反応させた。

平行して、プラスミドｐＵＣ１９（ニューイングランドバイオラボ）のＤＮＡを、酵素ＥｃｏＲ１およびＨｉｎｄ３と反応させた。切断混合物のフラグメントを１.２％アガロースゲル上で分離し、次に、ｐＵＣ１９の残存するベクターフラグメントと、反応４の望ましい生成物を単離した。Ｔ４リガーゼ反応で、精製したフラグメントを１６℃で一晩一緒にライゲーションした。その後、コンピテントＥ．コリ細胞（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、Ｅ．コリ株ＸＬ１０ゴールド）を、上記のライゲーション混合物で形質転換し、２５ｍｇ／ｌアンピシリンを含む寒天プレート上で平板培養した。個々のクローンからプラスミドＤＮＡを単離し、ＤＮＡ配列解析によって特徴付けた。

望ましいフラグメントのプラスミドＤＮＡにｐＳＣＨＰＵＣＺＰ１−４３という記号を与え、Ｅ．コリＫ１２細胞中で式Ｉで示される化合物を合成する発現ベクターを製造するための出発原料として用いた。

実施例２：ＡＶＥ（１−４３）のための発現ベクターの構築
ＵＳ５４９６９２４（その内容は、明示的に参照により本願に含める）は、目的にあった融合タンパク質の製造が原則的に可能な発現系を提案している。このシステムの利点は、小さいバラスト部分を有する融合タンパク質を製造することができることである。この発現系は、一例としてこの用途で用いられる。エンテロキナーゼ認識配列ＤＤＤＤＫを介した配列セグメントＡ−Ｂと、ＡＶＥ（１−４３）との融合により、以下の遺伝子配列、および、アミノ酸配列（配列番号１３および番号１４）を有する融合タンパク質が得られた：
配列番号１３：
５’-GGAAACAGAATTCATGGCGCCGACCTCTTCTTCTACCAAAAAGCTCAACTG
CAACTGGAACACCTGCTGCTGGACCTGCAGATGATCCTGAACGGTATCAACAACTACAAAAACCCGAAACTGACGCGTATCGACGATGACGATAAACACGGTGAAGGTACCTTCACCTCCGACCTGTCCAAACAGATGGAAGAAGAAGCTGTTCGTCTGTTCATCGAATGGCTGAAAAACGGTGGTCCGTCCTCCGGTGCTCCGCCTTCGAAAAAGAAGAAAAAGTGATAATAGCATGCACGTGCGGCCGCAAGCTTAAAAAA-３’
ＡＴＧおよびＡＡＧコドンは、融合ペプチドの最初と最後のアミノ酸の特徴である。

配列番号１４：
MAPTSSSTKK TQLQLEHLLL DLQMILNGIN NYKNPKLTRI DDDDKHGEGT FTSDLSKQME EEAVRLFIEW LKNGGPSSGA PPSKKKKK

コードされた遺伝子配列をＰＣＲ技術によって製造した。この目的のために、以下のプライマーを合成した：
１）プライマーｐｓｗ３＿ｚｐｃｏｌｆ（配列番号１５）：
５’-CGTATCGACGATGACGATAAACACGGTGAAGGTACCTTC-３’
この場合のプライマーの配列は、エンテロキナーゼ認識部位、および、ＡＶＥ_1-43をコードする配列の始点を包含する。

２）プライマーｐｓｗ３＿ｚｐｃｏｌｒｅｖ（配列番号１６）：
５’-GTGTTTATCGTCATCGTCGATACGCGTCAGTTTCGG-３’
この場合の配列は、ＵＳ５４９６９２４の表Ｉで示されるようなインターロイキン２から誘導された合成配列に相当し、アミノ酸３４〜３８、および、アミノ酸メチオニンに関するコドンの３分の２を包含する。プライマー配列の残りは、プライマーｐｓｗ３＿ｚｐｃｏｌｆとオーバーラップする。

３）ｐＢｐｒｉｍｅｆ１（配列番号１７）：
５’-TGAGCGGATAACAATTTCACAC-３’
このプライマーは、上流でプラスミドｐＫ５０に存在するＥｃｏＲＩ切断部位とハイブリダイズする（ＵＳ５４９６９２４の図３３を参照）。

４）ｐｓｗ３＿ａｖｅ＿１−４３＿ｒｅｖとＨｉｎｄ３との切断部位（配列番号１８）：
５’-TTTTTTAAGCTTGCGGCCGCACGTGCATGCTATTATCACTT

２種のＰＣＲを平行して行った。その一方は、プラスミドｐＫ５０のＤＮＡで、プライマー対ｐＢｐｒｉｍｅｆ１およびｐｓｗ３＿ｚｐｃｏｌｒｅｖを用いて５０℃で行い、他方の反応は、プラスミドｐＳＣＨＰＵＣＺＰ１〜４３のＤＮＡで、プライマー対ｐｓｗ３＿ｚｐｃｏｌｆおよびｐｓｗ３＿ａｖｅ＿１−４３＿ｒｅｖを用いて５４℃で行った。ゲル電気泳動での分別後にＰＣＲ産物を精製し、各アリコートを１：１の比率で混合し、次に、第三のＰＣＲでプライマー対ｐＢｐｒｉｍｅｆ１およびｐｓｗ３＿ａｖｅ＿１−４３＿ｒｅｖと反応させた。ＰＣＲ産物を酵素ＥｃｏＲ１およびＨｉｎｄ３と反応させ、Ｔ４リガーゼ反応を用いて、平行してこれらの酵素を用いて開環したプラスミドｐＫ５０にライゲーションした。コンピテントＥ．コリＢＬ２１細胞をライゲーション混合物で形質転換させ、２５ｍｇ／ｌアンピシリンを含む選択的な寒天上で平板培養した。いくつかのクローンからプラスミドＤＮＡを再び単離し、ＰＣＲ、および、それに続くＤＮＡ配列解析で解析した。正しいプラスミドにｐＢＺＰ４３という名称をつけた。Ｅ．コリＢＬ２１：ｐＢＺＰ４３クローンを、融合タンパク質の発現に関してチェックした。これは、米国特許第５４９６９２４号の実施例１４に類似した方法で行った。発現生成物をマススペクトロメトリーおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析し、Ｎ末端をタンパク質配列解析によって決定した。より多量の材料の発酵に適したクローンを選択した。

実施例３：ＡＶＥ（１−３９）のための発現ベクターの構築
プラスミドｐＢＺＰ４３は、プライマーｐＢｐｒｉｍｅｆ１（実施例２）、および、ｐｓｗ３＿ａｖｅ＿３９ｒｅｖを用いて行われたＰＣＲ反応のためのテンプレートとして役立つ。そのＰＣＲ産物を、酵素の製造元からの情報に従って制限酵素ＥｃｏＲＩ、および、ＮｏｔＩと反応させ、Ｔ４リガーゼ反応でＥｃｏｒＩ／ＮｏｔＩで開環したプラスミドｐＢＺＰ４３に挿入した。その結果、プラスミドｐＢＺＰ３９が得られ、それを用いて実施例２で説明されている手法を継続した。
ｐｓｗ３＿ａｖｅ＿３９ｒｅｖ（配列番号１９）：
５’-TTTTTTGCGGCCGCACGTGCATGCTATTATCATTTCGAAGGCGGAGCACC-３’
ＴＴＴトリプレットは、３９位でリシンをコードする。

実施例４：ＡＶＥ（１−３８−Ａｒｇ）のための発現ベクターの構築
プラスミドｐＢＺＰ４３は、プライマーｐＢｐｒｉｍｅｆ１（実施例２）、および、ｐｓｗ３＿ａｖｅ３８＿ａｒｇｒｅｖを用いて行われたＰＣＲ反応のためのテンプレートとして役立つ。そのＰＣＲ産物を、酵素の製造元からの情報に従って制限酵素ＥｃｏＲＩ、および、ＮｏｔＩと反応させ、Ｔ４リガーゼ反応でＥｃｏｒＩ／ＮｏｔＩで開環したプラスミドｐＢＺＰ４３に挿入した。その結果、プラスミドｐＢＺＰ３８ａｒｇが得られ、それを用いて実施例２で説明されている手法を継続した。
プライマー：ｐｓｗ３＿ａｖｅ３８＿ａｒｇｒｅｖ（配列番号２０）：
５’-TTTTTTGCGGCCGCACGTGCATGCTATTATCATACGCGＡＡGGCGGAGCACCG-３’
ＡＧＧトリプレットは、３９位でアルギニンをコードする。

実施例５：実施例２〜４で構築された株の発酵
発酵を、ドイツ特許出願ＤＥ１０２００４０５８３０６．４の実施例３で説明されている方法をわずかに変更して行った。標的ペプチド誘導体（融合タンパク質）をコードする様々なプラスミドベクターで形質転換したＥ．コリＢＬ２１細胞を、発酵槽中で、無機塩培地または複合培地（実施例１を参照）中で、３０℃または３７℃で、および、ｐＨ７.０で培養した。ｐＨをＮＨ₄ ⁺溶液（２６％水溶液）で調節した。培養液体培地中の溶存酸素を３０％で一定に維持する制御方法によって確実に培養液に通気されるようにした。無機塩培地での供給型のバッチプロセスのために、グルコース溶液（６０％ｗ／ｖ）を供給した（８ｇ／Ｌ／時間〜２６ｇ／Ｌ／時間）。タンパク質発現を、ＩＰＴＧ（最終濃度（ｆ．ｃ．）は１〜４ｍＭ）を添加することによって誘導した。誘導の持続時間は６〜８時間であった。標的タンパク質の発現をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で検出した。

Ｅ．コリＢＬ２１／ｐＢＺＰ４３中でのＡＶＥ前駆体融合タンパク質の発現を、以下で説明するようにして行った：
−８０℃で保存してあったＥ．コリＢＬ２１細胞の連続培養から細胞懸濁液１００μＬを取り出し、予備培地０.５Ｌ中で３７℃で１０〜１６時間振盪しながらインキュベートした。発酵槽での本培養の培地に、適切な量の予備培養液を植菌密度０.０１〜０.０５ＯＤ₆₀₀で植え付けた。

予備培地：
５ｇ／Ｌのバクトトリプトン
１０ｇ／Ｌの酵母エキス
５ｇ／ＬのＮａＣｌ。

本培養の培地：
炭素源としてグルコースをベースとした既定の無機塩培地（最小培地）（ＪｅｆｆｒｅｙＨ．Ｍｉｌｌｅｒ：ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃｓ，コールドスプリングハーバーラボラトリー（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）（１９７２））。

本培養の培地中に最初に存在するグルコースが消費された後、グルコース溶液を供給した。タンパク質発現を、ＩＰＴＧ（最終濃度１ｍＭ）を添加することによって誘導し、誘導後に融合タンパク質の最大発現が観察された。ノヴェックス（Ｎｏｖｅｘ）製のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析システム（ＮｕＰａｇｅ^(R)ノヴェックス１２％ゲルシステム，インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ^TM））を例えば製造元の情報に従って用いて、それぞれの場合の発酵において、様々な培養時間で発酵槽から分取された細胞懸濁液の０.０２ＯＤ_600nmを解析した。

実施例６：実施例５で製造された融合タンパク質の精製
組換えＥ．コリ株のバイオマス１０００ｇを、トリス緩衝液（５０ｍＭトリス／ＨＣｌ，ｐＨ７.４）１０００ｍｌに再懸濁した。高圧で２回均一化することによって（ラニー（Ｒａｎｎｉｅ）の高圧ホモジナイザー，１０００ｂａｒ）細胞を破壊した。ゲノムＤＮＡにベンゾナーゼ（Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ）（１０００Ｕ／Ｌ）、および、塩化マグネシウム（１０ｍＭ）を添加して１.５時間消化した。融合タンパク質を、膨張層のクロマトグラフィーで精製した。この目的のために、細胞のホモジネートを緩衝液（５０ｍＭトリス／ＨＣｌ，ｐＨ７.４）で１０リットルに希釈し、緩衝液（５０ｍＭトリス／ＨＣｌ，ｐＨ７.４）で予め平衡化させたクロマトグラフィーカラム（ストリームライン（Ｓｔｒｅａｍｌｉｎｅ）ＳＰＸＬ，ＧＥヘルスケア（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ））に直接ローディングした。サンプルをローディングし、続いて平衡緩衝液（カラム体積の６倍量）での洗浄工程を行い、続いて７％高塩濃度の緩衝液（５０ｍＭトリス／ＨＣｌ，ｐＨ７.４；１ＭのＮａＣｌ）でのさらなる洗浄工程を行った。カラム体積の１０倍量の２０％高塩濃度の緩衝液で洗浄することによって溶出を起こした。溶出液のプールを、ＳＤＳゲル電気泳動（ＮｕＰａｇｅ^(R)ノヴェックス１２％ゲルシステム，インビトロジェン）、および、ＨＰＬＣでチェックした。融合タンパク質のプールを、エンテロキナーゼ緩衝液（５０ｍＭトリス／ＨＣｌ，ｐＨ７.４；５０ｍＭのＮａＣｌ，２ｍＭのＣａＣｌ₂）で透析ろ過した後、それらをプロテアーゼによる切断反応に用いた。融合タンパク質を、エンテロキナーゼ緩衝液（２０ｍＭトリス／ＨＣｌ，５０ｍＭのＮａＣｌ，２ｍＭのＣａＣｌ₂，ｐＨ７.４）中でエンテロキナーゼ（インビトロジェン）で製造元の情報に従って切断した。

実施例７：エンテロキナーゼ切断反応物からの切断産物の分離
切断産物の分離は、ドイツ特許出願ＤＥ１０２００４０５８３０６．４の実施例６に従って行った。エンテロキナーゼによる融合タンパク質の切断を行い、続いて、イオン交換クロマトグラフィー（ソース（Ｓｏｕｒｃｅ）３０Ｓ、アマシャム・バイオサイエンス（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））によって切断産物それぞれを分離した。溶液のイオン濃度をＨ₂Ｏで希釈することによって約７ｍＳ／ｃｍにした。タンパク質溶液を予め平衡化させたカラム（２０ｍＭトリス／ＨＣｌ，ｐＨ７.４；ＮａＣｌで伝導率を約７ｍＳ／ｃｍに調節）にローディングした後、１５％緩衝液Ｂ（２０ｍＭトリス／ＨＣｌ，ｐＨ７.４；５００ｍＭのＮａＣｌ）で未結合の材料を洗浄した。カラム体積の１０倍量にわたって１００％緩衝液Ｂに至る濃度勾配を適用することにより、ＡＶＥペプチド前駆体を溶出させた。ＡＶＥ前駆体を含む画分を、ＳＤＳゲル電気泳動、ＨＰＬＣ、および、マススペクトロメトリーによって同定した。それに対応する画分を合わせて、脱塩し、有機溶媒を除去した後、凍結乾燥した。

実施例８：ＡＶＥ（１−３９）とＨ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＮＨ ₂ とのペプチドカップリング
ＡＶＥ（１−３９）（ＭＷ４２１８；０.０４７μｍｏｌ；最終濃度１ｇ／Ｌ）０.２ｍｇを量って１.５ｍＬのポリプロピレン製反応容器に入れた。０.１Ｍのピリジン−酢酸塩緩衝液（ｐＨ５.６）１１μＬ、０.１Ｍのピリジン−酢酸塩緩衝液（ｐＨ５.６）中の１２９ｇ／ＬのＨ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＮＨ₂・ＨＣｌ溶液（７.７５ｍｇのＨ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＮＨ₂・ＨＣｌ＝２７.５μｍｏｌ＝ＡＶＥ（１−３９）１モルあたり５８５ｍｏｌのＨ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＮＨ₂・ＨＣｌを含む）６０μＬ、および、ＤＭＦ１１９μＬを添加した。この透明な溶液を１２℃で平衡化させた。この反応を、２ｇ／Ｌトリプシン水溶液（０.０２ｍｇのトリプシン＝ＡＶＥ（１−３９）１ｇあたり０.００２ｇのトリプシンを含む）１０μＬを添加することによって開始させた。反応溶液を１２℃で１０００／分で振盪しながらインキュベートした。プロセス制御のためのサンプルを定期的に分取し、９倍量の１７％水、１７％アセトニトリル、および、６４％トリフルオロ酢酸の溶液で希釈することによって停止した。反応が進行した後、ＬＣ−ＭＳを行った。最大収量が達成された後、トリフルオロ酢酸を添加することによって反応液を２.５未満のｐＨに酸性化し、クロマトグラフィーによって精製した。

実施例９：ＡＶＥ（１−４３）とＨ−Ｌｙｓ−ＮＨ ₂ とのペプチドカップリング
ＡＶＥ（１−４３）（ＭＷ４７３１；０.８１４μｍｏｌ；最終濃度２０ｇ／Ｌ）３.８５ｍｇを量って１.５ｍｌのポリプロピレン製反応容器に入れた。０.１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５.８）中の６２０ｇ／ＬのＨ−Ｌｙｓ−ＮＨ₂・２ＨＣｌ溶液（２５.６ｍｇのＨ−Ｌｙｓ−ＮＨ₂・２ＨＣｌ＝１１７.５μｍｏｌ＝ＡＶＥ（１−４３）１モルあたり１４４ｍｏｌのＨ−Ｌｙｓ−ＮＨ₂・２ＨＣｌを含む）４１μＬ、ＤＭＦ１１６μＬ、および、０.１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５.８）３２μＬを添加した。この透明な溶液を１２℃で平衡化した。反応を、２０ｇ／Ｌのトリプシン水溶液（０.０６ｍｇのトリプシン＝トリプシンＡＶＥ（１−４３）１ｇあたり０.０１５ｇを含む）２.９μＬを添加することによって開始させた。この反応溶液を、９００／分で振盪しながら１２℃でインキュベートした。プロセス制御のためのサンプルを定期的に分取し、９倍量の１７％水、１７％アセトニトリル、および、６４％トリフルオロ酢酸の溶液で希釈することによって停止した。反応が進行した後、ＬＣ−ＭＳを行った。最大収量が達成された後、トリフルオロ酢酸を添加することによって反応液を２.５未満のｐＨに酸性化し、クロマトグラフィーによって精製した。

実施例１０：ＡＶＥ（１−３９）とＨ−Ｌｙｓ−ＮＨ ₂ とのペプチドカップリング
ＡＶＥ（１−３９）（ＭＷ４２１８；０.０４７μｍｏｌ；最終濃度１ｇ／Ｌ）０.２ｍｇを量って、１.５ｍＬのポリプロピレン製の反応容器に入れた。０.１Ｍのピリジン−酢酸塩緩衝液（ｐＨ５.６）１１μＬ、０.１Ｍのピリジン−酢酸塩緩衝液（ｐＨ５.６）中の１００ｇ／ＬのＨ−Ｌｙｓ−ＮＨ₂・２ＨＣｌ溶液（６.０ｍｇのＨ−Ｌｙｓ−ＮＨ₂・２ＨＣｌ＝２７.５μｍｏｌ＝ＡＶＥ（１−３９）１モルあたり５８５ｍｏｌのＨ−Ｌｙｓ−ＮＨ₂・２ＨＣｌを含む）６０μＬ、および、ＤＭＦ１１９μＬを添加した。この透明な溶液を１２℃で平衡化した。反応を、２ｇ／Ｌのトリプシン水溶液（０.０２ｍｇのトリプシン＝ＡＶＥ（１−３９）１ｇあたり０.００２ｇのトリプシンを含む）１０μＬを添加することによって開始させた。この反応溶液を、１０００／分で振盪しながら１２℃でインキュベートした。プロセス制御のためのサンプルを定期的に分取し、９倍量の１７％水、１７％アセトニトリル、および、６４％トリフルオロ酢酸の溶液で希釈することによって停止した。反応が進行した後、ＬＣ−ＭＳを行った。最大収量が達成された後、トリフルオロ酢酸を添加することによって反応液を２.５未満のｐＨに酸性化し、クロマトグラフィーによって精製した。

実施例１１：ＡＶＥ（１−３９）とＨ−Ａｒｇ−ＮＨ ₂ とのペプチドカップリング
ＡＶＥ（１−３９）（ＭＷ４２１８；０.０４７μｍｏｌ；最終濃度１ｇ／Ｌ）０.２ｍｇを量って、１.５ｍＬのポリプロピレン製の反応容器に入れた。０.１Ｍのピリジン−酢酸塩緩衝液（ｐＨ５.６）１１μＬ、０.１Ｍのピリジン−酢酸塩緩衝液（ｐＨ５.６）中の１１３ｇ／ＬのＨ−Ａｒｇ−ＮＨ₂・２ＨＣｌ溶液（６.７７ｍｇのＨ−Ａｒｇ−ＮＨ₂・２ＨＣｌ＝２７.５μｍｏｌ＝ＡＶＥ（１−３９）１モルあたり５８５ｍｏｌのＨ−Ａｒｇ−ＮＨ₂・２ＨＣｌを含む）６０μＬ、および、ＤＭＦ１１９μＬを添加した。この透明な溶液を１２℃で平衡化した。反応を、２ｇ／Ｌのトリプシン水溶液（０.０２ｍｇのトリプシン＝ＡＶＥ（１−３９）１ｇあたり０.００２ｇのトリプシンを含む）１０μＬを添加することによって開始させた。この反応溶液を、１０００／分で振盪しながら１２℃でインキュベートした。プロセス制御のためのサンプルを定期的に分取し、９倍量の１７％水、１７％アセトニトリル、および、６４％トリフルオロ酢酸の溶液で希釈することによって停止した。反応が進行した後、ＬＣ−ＭＳを行った。最大収量が達成された後、トリフルオロ酢酸を添加することによって反応液を２.５未満のｐＨに酸性化し、クロマトグラフィーによって精製した。

実施例１２：ＡＶＥ（１−４３）とＨ−Ａｒｇ−ＮＨ ₂ とのペプチドカップリング
ＡＶＥ（１−４３）（ＭＷ４７３１；０.０４７μｍｏｌ；最終濃度１.１ｇ／Ｌ）０.２５ｍｇを量って、１.５ｍＬのポリプロピレン製の反応容器に入れた。０.１Ｍのピリジン−酢酸塩緩衝液（ｐＨ５.６）１１μＬ、０.１Ｍのピリジン−酢酸塩緩衝液（ｐＨ５.６）中の１１３ｇ／ＬのＨ−Ａｒｇ−ＮＨ₂・２ＨＣｌ溶液（６.７７ｍｇのＨ−Ａｒｇ−ＮＨ₂・２ＨＣｌ＝２７.５μｍｏｌ＝ＡＶＥ（１−４３）１モルあたり５８５ｍｏｌのＨ−Ａｒｇ−ＮＨ₂・２ＨＣｌを含む）６０μＬ、および、ＤＭＦ１１９μＬを添加した。この透明な溶液を１２℃で平衡化した。反応を、２ｇ／Ｌのトリプシン水溶液（０.０２ｍｇのトリプシン＝トリプシンＡＶＥ（１−４３）１ｇあたり０.００２ｇを含む）１０μＬを添加することによって開始させた。この反応溶液を、１０００／分で振盪しながら１２℃でインキュベートした。プロセス制御のためのサンプルを定期的に分取し、９倍量の１７％水、１７％アセトニトリル、および、６４％トリフルオロ酢酸の溶液で希釈することによって停止した。反応が進行した後、ＬＣ−ＭＳを行った。最大収量が達成された後、トリフルオロ酢酸を添加することによって反応液を２.５未満のｐＨに酸性化し、クロマトグラフィーによって精製した。

実施例１３：ＡＶＥ（１−３８）−ＡｒｇとＨ−Ｌｙｓ−ＮＨ ₂ とのペプチドカップリング
ＡＶＥ（１−３８）−Ａｒｇ（ＭＷ４２４６；０.０４７μｍｏｌ；最終濃度１ｇ／Ｌ）０.２ｍｇを量って、１.５ｍＬのポリプロピレン製の反応容器に入れた。０.１Ｍのピリジン−酢酸塩緩衝液（ｐＨ５.６）１１μＬ、０.１Ｍのピリジン−酢酸塩緩衝液（ｐＨ５.６）中の１００ｇ／ＬのＨ−Ｌｙｓ−ＮＨ₂・２ＨＣｌ溶液（６.０ｍｇのＨ−Ｌｙｓ−ＮＨ₂・２ＨＣｌ＝２７.５μｍｏｌ＝ＡＶＥ（１−３８）−Ａｒｇ１モルあたり５８５ｍｏｌのＨ−Ｌｙｓ−ＮＨ₂・２ＨＣｌを含む）６０μＬ、および、ＤＭＦ１１９μＬを添加した。この透明な溶液を１２℃で平衡化した。反応を、２ｇ／Ｌのトリプシン水溶液（０.０２ｍｇのトリプシン＝ＡＶＥ（１−３８）−Ａｒｇ１ｇあたり０.００２ｇのトリプシンを含む）１０μＬを添加することによって開始させた。この反応溶液を、１０００／分で振盪しながら１２℃でインキュベートした。プロセス制御のためのサンプルを定期的に分取し、９倍量の１７％水、１７％アセトニトリル、および、６４％トリフルオロ酢酸の溶液で希釈することによって停止した。反応が進行した後、ＬＣ−ＭＳを行った。最大収量が達成された後、トリフルオロ酢酸を添加することによって反応液を２.５未満のｐＨに酸性化し、クロマトグラフィーによって精製した。

実施例１４：ＡＶＥ（１−４３）とＨ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＮＨ ₂ とのペプチドカップリング
ＡＶＥ（１−４３）（ＭＷ４７３１；１.０５８μｍｏｌ；最終濃度２０ｇ／Ｌ）２０ｍｇを量って、２ｍＬのポリプロピレン製の反応容器に入れた。０.１Ｍのクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５.５）中の４８２ｇ／ＬのＨ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＮＨ₂・ＨＣｌ溶液（１５５ｍｇのＨ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＮＨ₂・ＨＣｌ＝５５０μｍｏｌ＝ＡＶＥ（１−４３）１モルあたり１３０ｍｏｌのＨ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＮＨ₂・ＨＣｌを含む）３７０μＬ、および、ＤＭＦ６００μＬを添加した。この透明な溶液を１２℃で平衡化した。反応を、３.３ｇ／Ｌのトリプシン水溶液（０.１ｍｇのトリプシン＝ＡＶＥ（１−４３）１ｇあたりトリプシン５ｍｇを含む）３０μＬを添加することによって開始させた。この反応溶液を、１０００／分で振盪しながら１２℃でインキュベートした。プロセス制御のためのサンプルを定期的に分取し、９倍量の１７％水、１７％アセトニトリル、および、６４％トリフルオロ酢酸の溶液で希釈することによって停止した。反応が進行した後、ＬＣ−ＭＳを行った。最大収量が達成された後、この反応液にトリフルオロ酢酸を最終濃度５０％（ｖ／ｖ）まで添加することによって酸性化した。これにより反応を止め、同時にＢｏｃ保護基を定量的に除去した。反応生成物をクロマトグラフィーによって精製した。

実施例１５：アミド化したＡＶＥ誘導体の精製
続いて、カップリング反応からの反応混合物を、支持体材料としてアンバークロム（Ａｍｂｅｒｃｈｒｏｍ）ＣＧ３００ＸＴ２０を用いたＲＰクロマトグラフィーによって分離し、続いて適切な溶出液画分から、支持体としてソース３０Ｓを用いたイオン交換工程によってアミド化した標的ペプチドを単離した。アンバークロムカラムでの脱塩後、生成物は医薬品のための調合物として利用可能である。生成物の構造の同一性をＭＡＬＤＩ−ＭＳおよびＮＭＲ解析によって実証した。

実施例１６：Ｌｅｕ−ヒルジン _1-65 Ｌｙｓ−Ａｒｇ−ＮＨ ₂ の製造
特許出願ＥＰ−Ａ１２１６２５９の実施例１は、細菌の上清へＬｅｕ−ヒルジンを分泌させる発現プラスミドの製造を説明している。標準的なＰＣＲで、テンプレートとしてプラスミドのＤＮＡが用いられる。この反応で用いられるフォワードプライマーは、この実施例で説明されている配列ｓｍｏｍｐａｆ２である。用いられるリバースプライマーは、以下の配列を有するオリゴヌクレオチドｈｉｒ＿ｌｙｓ６６＿ｒｅｖ（配列番号２１）である：
５’-TTTTTTAAGC TTCTATTATT TCTGAAGGTA TTCCTCAGGG-３’
Hind３

上記で下線で示したコドンはリシンをコードする。２２位〜４０位（末端）の配列は、出願ＥＰ−Ａ１２１６２５９の表１に示された配列の配列セグメント１７８〜１９５に相補的である。この実施例で説明されているように、ＰＣＲを行い、その産物を制限酵素ＥｃｏＲ１およびＨｉｎｄ３で消化し、同様にして開環したベクターｐＪＦ１１８に挿入した。特徴付けた後、特許出願ＥＰ−Ａ１２１６２５９の実施例１１と同様にＤＮＡをＥ．コリＫ１２に形質転換し、中間生成物が発現され、精製した。次に、本願の実施例１３に対応して、相応するモル濃度にして、アルギニンアミドを用いて反応を行い、Ｌｅｕ−ヒルジン_1-65Ｌｙｓ−Ａｒｇ−ＮＨ₂を得た。中間体の宿主株として用いられたＭＣ１０６１株で発現が直接行われる場合、生成物は、ペリプラスム間隙でも見出された。そのため、中間生成物を単離するための追加のワークアップ工程として、既知の方法による細胞の破壊が必要になる。

実施例１７：ＡＶＥ誘導体に関するペプチドカップリング反応の解析
実施例８〜１４によるカップリング反応の後、シンメトリー（Ｓｙｍｍｅｔｒｙ）３００１５０×４.６ｍｍ、５μｍ、ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）製）カラムでのＲＰ−ＨＰＬＣによって分析した。溶出液として、０.１％（ｖ／ｖ）ギ酸（溶出液Ａ）、および、０.１％ギ酸を含むアセトニトリル（溶出液Ｂ）が用いられた。溶出には、カラム温度６０℃、および、流速１ｍＬ／分での、１５分間にわたる２０〜５０％Ｂの直線的な濃度勾配が用いられた。検出は２１５ｎｍで行った。一般的には、１：２５に希釈した反応サンプル５μＬを注入した。７〜１０分間の保持時間で脱保護されたＡＶＥ誘導体が検出された。

Claims

Ｃ末端がアミド化された二塩基性または多塩基性ペプチドの製造方法であって、該ペプチドは、以下の配列：
HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPSKK KKKK-NH ₂ (配列番号１)、またはHGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPSKK KKKR-NH ₂ (配列番号４)
で示され、該方法において、以下の配列：
HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPSKK KKK（配列番号７）
で示されるペプチドと、
一般式III：
(Ｘ)_q−ＮＨ₂ (III)
［式中、
Ｘは、リシンまたはアルギニンであり、そして
ｑは、１である］
で示される化合物とを、トリプシンの生物活性を有する酵素の存在下で反応させ、必要に応じて、得られた配列番号１または配列番号４で示される前記ペプチドを、化学的なタンパク質精製で処理する、上記方法。
ａ）融合ペプチドの一部として配列番号７で示されるペプチドを含む融合ペプチドを発現させ；
ｂ）上記融合ペプチドから、前記配列番号７で示されるペプチドを化学的または酵素的な切断によって遊離させ；
ｃ）必要に応じて、化学的なタンパク質精製の後に、工程ｂ）からの中間体と請求項１に記載の式IIIで示される化合物とを、トリプシンの生物活性を有する酵素の存在下で反応させ；そして、
ｄ）必要に応じて、得られた請求項１に記載の配列番号１または配列番号４で示されるペプチドを、化学的なタンパク質精製および単離処理する、
請求項１に記載の方法。
融合ペプチドからの配列番号７で示されるペプチドの除去は、ハロゲン化シアン、エンテロキナーゼ、Ｘａ因子、ジェネナーゼ、トロンビン、または、トリプシンによって行う、請求項２に記載の方法。
融合ペプチドは、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓ．ｃａｒｎｏｓｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅ、および、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからなる群より選択される発現系で発現される、請求項２に記載の方法。