JP4857279B2 - カルボキシ末端をアミド化したペプチドの製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、Ｃ末端をアミド化したリシンを有し、特にＧＬＰ−１の生物活性を有する、カルボキシ末端（Ｃ末端）をアミド化したペプチドの製造、それらの化学的または生物工学的前駆体および中間体、それらの製造方法、ならびにそれらの医薬製品製造のための使用に関する。

世界中で、糖尿病または肥満症に罹っている人の数が高い上昇率で増加しつつある。それゆえに、このような病気の分野において高い治療的有用性を示す薬物が、ますます高い特性でかつ大量に利用できるようにする必要があると予想される。

米国特許出願第２００４／０１０６５４７号（Ａ１）は、エキセンディン（ｅｘｅｎｄｉｎ）から誘導されたペプチドを記載しており、これは血糖値を低下させる作用を有することから、糖尿病、またはその他の代謝性疾患、例えば肥満症を発症させる可能性がある代謝性疾患の治療において可能性のある薬物として重要性を有する。特に、それらの生理学的な作用機序のために、糖尿病の続発症を低く抑えるか、またはかなり遅延させることが現在期待されている。

米国特許出願第２００４／０１０６５４７号（Ａ１）で記載されているペプチドは、１個またはそれ以上のＣ末端リシン残基が導入されており、そのうちの末端の１つがＣ末端アミド化されているため、特に活性であることが見出されている。

米国特許出願第２００４／０１０６５４７号（Ａ１）には、このようなペプチドを製造するための様々な製造方法が述べられている。そのうち一つは、生物工学的方法に関し、この方法では、酵母において細胞内発現させた後、細胞の分解産物から標的タンパク質が単離される。しかしながら、Ｃ末端がアミド化されたペプチドは、微生物を用いた場合ほんのわずかしか生産されないため、米国特許出願第２００４／０１０６５４７号（Ａ１）で提案されているような生物工学的製造の実施は、非常に難儀であるか、またはコストがかかるものでしかない。

その代替法として、上記出願は、当該ペプチドの化学全合成を説明している。それに関して、改変されたメリーフィールド合成が提案されているが、この合成は、それでもなお非常に面倒であり、高いコストを伴う。その理由のなかでも、反応物としてペプチド合成で特に用いるために、上記合成に用いられるアミノ酸をまず、製造し、精製し、続いて化学修飾しなければならないことがある。合成の最後に、保護基を除去しなければならず、標的ペプチドまたは生成物は医薬品として製剤化可能とする前に精製しなければならない。従って、その化学全合成は、多大な費用をかければ実行可能だが、エコロジー面での利点はほとんどない。

ペプチドをＣ末端でアミド化することができる酵素は、かなり以前からすでに知られている。これらの酵素は、ペプチジルグリシンα−アミド化酵素（ＰＡＭ）と呼ばれる（Ｅｉｐｐｅｒ等，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１９８７年１１月；１（１１）：１９８７）。このようなＰＡＭ酵素の生産および精製は、当業者にはよく知られており、詳細に説明されている：その上、多くのこのような酵素調製物が市販されている（例えば、Ｋ Ｏｈｓｕｙｅ等，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３１，１９９９：８５〜９４、ＵＳ４７０８９３４、ＵＳ５７８９２３４、ＵＳ６２５５０６７、ＵＳ６３１９６８５、およびＪＰ０１７７１８４）。

Ｂｒａｄｂｕｒｙ等（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９８３）１１２（２）：３７２〜３７７は、ＰＡＭが、Ｃ末端がそのアミノ酸であるグリシンからなるペプチドを基質として、選択的に認識することを「インビトロ」で示している。また彼等は、グリシンのＮ末端の位置における塩基性アミノ酸が、ＰＡＭの反応速度を非常に遅延させることも述べている。

塩基性アミノ酸のＣ末端配列、特に、Ｃ末端にグリシン残基をさらに有するオリゴまたはポリリシン配列を有するエキセンディン誘導体が、驚くべきことに、ＰＡＭによって基質として良好に認識されることが今や見出された。

従って、驚くべきことに、本発明によれば、アミド化ペプチド、特に米国特許出願第２００４／０１０６５４７号（Ａ１）に開示されているようなアミド化ペプチドを、生物工学的にかなり低コストで製造することが可能になり、それによれば、そのＣ末端グリシン伸長ペプチド前駆体／タンパク質から、１回の酵素を用いた工程によって所望の生成物を製造することができる。

本発明に係る方法において、生物学的に活性なペプチドが製造されるが、このペプチドは、１個またはそれ以上の塩基性アミノ酸、好ましくはリシン、ヒスチジンおよび／またはアルギニン残基、特にリシン残基を含み、Ｃ末端がリシン残基であり、ここにおいて一番端にあるＣ末端のリシン残基は、Ｃ末端がアミド化されている。好ましくは、本発明に係る方法によって製造されたペプチドは、ＧＬＰ−１、エキセンディン−４、またはそれらの生物学的に活性な類似体もしくは誘導体の生物活性を示す。

従って、本発明は、特に、米国特許出願第２００４／０１０６５４７号に記載の化合物番号２の生物工学的な製造を可能にする。この化合物番号２は、以下の配列（配列番号１）：

を有する。

従って、本発明の目的は、式Ｉ：
（ＡＳ）_n−Ｘ_mＹ_p （式Ｉ）
［式中、
ＡＳは、１個またはそれ以上の遺伝学的にコード可能なアミノ酸であり；
ｎは、５〜２０００であり、好ましくは１０〜１０００であり、特に１５〜５００であり、非常に好ましくは２０〜４００であり；
Ｘは、１個もしくはそれ以上の塩基性アミノ酸、またはそれらの誘導体であり、好ましくはリシン、ヒスチジンおよび／またはアルギニンであり、特にリシンであり；
ｍは、１〜１５であり、好ましくは３〜１０であり、特に６〜８であり；
Ｙは、１またはそれ以上の中性の電荷を有するアミノ酸であり、好ましくはグリシンであり；ならびに、
ｐは、１〜１０であり、好ましくは１〜５であり、特に１であり；
ここにおいて、ｎ、ｍおよびｐは整数であり、（ＡＳ）_nおよび／または（ＡＳ）_nＸ_mは、好ましくは生物学的に活性なペプチドまたはタンパク質である］
で示されるペプチドである。

非常に好ましくは、配列番号２：

（配列番号２）
に記載の式Ｉで示される化合物、および少なくとも６０％、好ましくは８０％、特に９０％の相同性を有するそれらの生物学的に活性な誘導体である。

また、さらなる本発明の目的は：
ａ）本発明に係るペプチドをコードする核酸分子、好ましくはＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡ分子；
ｂ）本発明に係る核酸分子を含む発現カセット；
ｃ）本発明に係る核酸分子または発現カセットを含むベクター、好ましくは発現ベクター、特に酵母および／または細菌細胞で発現させるための発現ベクター；
ｄ）本発明に係る核酸分子、発現カセットまたはベクターを含む宿主細胞、好ましくは細菌細胞または酵母細胞（これらは場合により、酵素ＰＡＭも共発現する）；
ｅ）ＲＮＡ分子からタンパク質への翻訳を可能にするインビトロでの発現系、
である。

また、本発明のさらにその他の目的は、一般式II：
（ＡＳ）_n−Ｘ_m−ＮＨ₂ （式II）
［式中、
ＡＳは、１個またはそれ以上の遺伝学的にコード可能なアミノ酸であり；
ｎは、５〜２０００であり、好ましくは１０〜１０００、特に１５〜５００、非常に好ましくは２０〜４００であり；ならびに、
（ＡＳ）_nおよび／または（ＡＳ）_n−Ｘ_mは、生物学的に活性なペプチドまたはタンパク質であり；
Ｘは、１個もしくはそれ以上の塩基性アミノ酸、またはそれらの誘導体であり、好ましくはリシン、ヒスチジンおよび／またはアルギニンであり、特にリシンであり；
ｍは、１〜１５であり、好ましくは３〜１０であり、特に６〜８であり；ならびに、
ｎおよびｍは整数である］
で示されるＣ末端をアミド化したペプチドの製造方法であって、
ここにおいて、
ａ）本発明に係る宿主細胞を適切な栄養培地中で培養し、
ｂ）本発明に係るペプチドを発現させ、
ｃ）場合により、本発明に係るペプチドを、酵素的な切断によって、適切なペプチド前駆体から切り離し、
ｄ）工程ｂ）からの発現産物、または工程ｃ）からの中間生成物を、場合により精製した後に、α−アミド化酵素と反応させて、一般式IIで示される化合物を得、
ｅ）適切な方法で、好ましくは分取用クロマトグラフィーを用いた方法で、一般式IIで示される化合物を精製する。

しかしながら、当業者であれば、既知の生化学的または生物物理学的な分離方法を組み合わせることによっても所望の精製結果を得ることができることを承知している。

好ましくは、本発明に係る方法は、配列番号１に記載の化合物を製造するために、Ｃ末端をアミド化したペプチドを製造するのに用いられる。

まず第一に、本発明に係る方法に関して、微生物の異種ペプチド／タンパク質を生産する能力が利用される。このために、所望のペプチド／タンパク質配列をそれに対応するＤＮＡ配列に翻訳し、それを宿主特異的なプロモーター配列にカップリングさせる。ここにおいて、発現の方策に応じて、細胞内に留まりつつ融合タンパク質として直接的または間接的に形成されるような方法で、標的ペプチドを細胞によって発現させることができる。融合タンパク質は、ＰＡＭと直接反応させて、その後、化学的または酵素的に所望の標的タンパク質にプロセシングしてもよいし、またはそれとは逆の順番で、ＰＡＭとの反応によってアミド化を起こす前にまず融合フラグメントに切断してもよい。融合による方策が選択される場合、当業者には当然であるが、融合の相手方は、Ｌｙｓ−Ｘ_m−Ｇｌｙを伸長させた標的ペプチドのＮ末端がプロセシング後も正しく残るような方法で相手方の切断が可能な架橋要素を介して一緒に結合していなければならない。架橋要素の設計については、多数の選択肢がある。例えばアミノ酸であるメチオニンが選択される場合、ハロゲン化シアンを用いた化学的な切断が考えられる。架橋要素として例えば配列ＤＤＤＤＫのペンタペプチドが選択される場合、エンテロキナーゼを用いた切断が考えられる。例えばテトラペプチド配列ＩＥＧＲが選択される場合、Ｘａ因子による切断を行うことができる。適切な設計である場合、ジェネナーゼ（Ｇｅｎｅｎａｓｅ^(R)）を、Ｎ末端にヒスチジンを有するタンパク質のプロセシング酵素として用いることができる。以下の実施例の章で、エンテロキナーゼを用いた切断を説明する。

しかしながら、その代わりに、標的ペプチドが、輸送に耐え得るものであれば、それらを融合タンパク質の形態で、または天然の形態で直接的に培地に放出させてもよい。このため、遺伝子工学によって改変された細胞、特に微生物、好ましくは細菌または酵母の遺伝子工学的に改変された細胞を用いてもよい。発現系として細菌細胞が選択される場合、標的タンパク質を直接的に、または、それに相当する標的タンパク質を含む融合タンパク質を、ペリプラズムまたは培地中に放出させるという選択肢もある。

原理的にそれに利用できる宿主生物および方法は、当業者既知である。これらも、大体において多数の供給元から商業的に入手可能である。典型的な例として、以下のような会社、ニューイングランドバイオラボ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ），インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびロシュ（Ｒｏｃｈｅ）が挙げられる。このような会社が発行しているカタログの説明に、上記技術の大要を示す参考文献が記載されている。

しかしながら、当業者であれば当然であるが、使用できるようになる微生物の範囲は絶えず広がっており、生物工学的方法のレパートリーも同様である。
この点において特化された実施態様もまた、本発明の対象に含まれる。

典型的には、一例として、以下の宿主／ベクター系：Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｓ．カルノーサス（Ｓ．ｃａｒｎｏｓｕｓ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、またはシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）のような細菌、ならびに、Ｋ．ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）、Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、およびＳ．セレビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のような酵母が挙げられる。

以下、一例として、Ｅ．コリＫ１２、および、Ｅ．コリＢをベースとした系の使用を説明する。しかしながら、当業者であれば承知していることであるが、一例として述べられたこれらの系は、例えば適切なプロモーターまたはその他の調節核酸配列、宿主細胞の遺伝学的特性、および用いられるベクター（例えば、ＤＮＡのコピー数、選択培地など）の選択から生じる多数の改変の可能性を提供する。さらに当業者には明白であるが、本明細書に記載された実施例は、現実的に実施される可能性に関して、ほんの一部の選択を代表しているに過ぎない。

ＰＡＭを用いた「インビトロ」でのアミド化の１つの代替法は、１つの同じ宿主細胞内で、酵素をアミド化しようとする前駆タンパク質と共に共発現する場合に生じる。これは、宿主細胞内に、宿主特異的な調節配列の制御下でＰＡＭ活性をコードする遺伝子配列を導入することによって達成される。この発現配列は、対象の染色体ＤＮＡ配列に安定的に組み入れてもよいし、または標的タンパク質のための発現プラスミドと並べて、第二のプラスミドに存在させてもよいし、または１つの同じベクター内に第二の発現カセットとして組み込んでもよく、または同じプロモーター配列の制御下で標的タンパク質をコードする遺伝子配列と同調する多シストロン性の発現単位でクローニングしてもよい。

従って、本発明は、式Ｉで示されるペプチド、または式Ｉに少なくとも６０％、好ましくは少なくとも８０％、特に少なくとも９０％の相同性を示すそれらの誘導体の、生物工学的な製造方法を含む。

本発明に係る方法は、ペプチド前駆体を合成し、続いてこれを、酵素の存在下で直接的に、または１個もしくはそれ以上の塩基性アミノ酸、もしくはそれらの誘導体を順に連結させることによって、好ましくはリシン、ヒスチジンおよび／もしくはアルギニン残基を順に連結させることによって、特にリシンを連結させることによって（ここにおいて、この配列は、Ｃ末端がアミド化される）、式Ｉに相当するペプチドに変換する組換え生物を製造するという点で特徴付けられる。

また、本発明のさらなる目的は、医薬製品または医薬製剤を製造するための、好ましくは糖質代謝障害を治療するための、特に好ましくは糖尿病を治療するための、本発明に係る方法によって製造された本発明に係る式Ｉで示される化合物または式IIで示されるＣ末端をアミド化したペプチド、特に配列番号１または２に記載の化合物の使用である。

実施例１．ＡＶＥ ₁ 〜 ₄₄ −ＧｌｙをコードするＥ．コリに特異的なＤＮＡ配列の合成
まず第一に、ペプチドＡＶＥ₁〜₄₄−Ｇｌｙ（配列番号２）をコードする遺伝子配列（配列番号３）を調製した：
配列番号３：

ＰＣＲ技術を用いて遺伝子配列の合成を行った。このために、以下の５種のプライマーを化学的なＤＮＡ合成によって合成した。この合成を、エクスペディット（Ｅｘｐｅｄｉｔｅ^TM）ＤＮＡ合成システムを用いて行った。

ａ）プライマーｚｐ５ｕは、以下の配列（配列番号４）を有する：

配列番号４は、センス鎖の領域１〜２３を含む。

ｂ）プライマーｚｐ３ａは、以下の配列（配列番号５）を有する：

配列番号５は、アンチセンス鎖の領域１〜５９を含む。

ｃ）プライマーｚｐ３ｂは、以下の配列（配列番号６）を有する：

配列番号６は、アンチセンス鎖の領域４０〜１０８を含む。

ｄ）プライマーｚｐ３ｃは、以下の配列（配列番号７）を有する：

配列番号７は、アンチセンス鎖の領域９１〜１６４を含む。

ｅ）プライマーｚｐ３ｄは、以下の配列（配列番号８）を有する：

配列番号８は、アンチセンス鎖の領域１４４〜１９７を含む。

これらのプライマーを用いて、４回のＰＣＲ反応を、標準条件下で、５４℃で連続的に行った。反応１において、プライマーｚｐ３ａおよびｚｐ５ｕそれぞれ１００ｎｇを用いた。ＰＣＲのサイクル数は５とした。反応２において、反応物の４０分の１を、プライマーｚｐ５ｕおよびｚｐ３ｂそれぞれ１００ｎｇで１０サイクルで処理した。反応３において、反応２の産物の４０分の１を、プライマーｚｐ５ｕおよびｚｐ３ｃそれぞれ１００ｎｇでさらに１０サイクルで処理した。最後に、２５回のＰＣＲサイクルで、反応３からの産物の４０分の１と、プライマーｚｐ５ｕおよびｚｐ３ｄとを用いて、所望のＤＮＡフラグメントを合成し、その長さをゲル電気泳動でチェックした。所望のＤＮＡフラグメントを精製し、製造元（ニューイングランドバイオラボ）の説明書に従って制限酵素ＥｃｏＲ１、続いてＨｉｎｄ３と反応させた。

平行して、プラスミドｐＵＣ１９（ニューイングランドバイオラボ）のＤＮＡを、酵素ＥｃｏＲ１とＨｉｎｄ３で処理した。１.２％アガロースゲルを用いて切断処理した混合物からフラグメントを分離し、残りのｐＵＣ１９由来のベクターフラグメントと反応４からの所望の生成物を単離した。精製したフラグメントを、Ｔ４リガーゼ反応によって１６℃で一晩ライゲーションした。続いて、コンピテントＥ．コリ細胞（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、Ｅ．コリＸＬ１０ゴールド株（Ｅ．ｃｏｌｉ ＸＬ１０Ｇｏｌｄ））を、上記のライゲーション混合物で形質転換し、２５ｍｇ／ｌアンピシリンを含む寒
天プレート上で平板培養した。個々のクローンからプラスミドＤＮＡを単離し、ＤＮＡ配列解析によって特徴を調べた。

所望のフラグメントを有するプラスミドＤＮＡを、ｐＳＣＨＰＵＣＺＰ１０と命名した。これを、Ｅ．コリＫ１２細胞中で本発明に係るペプチド前駆体を合成する発現ベクターを製造するための出発原料として用いた。

実施例２：ペプチド前駆体ＡＶＥ ₁ 〜 ₄₄ −Ｇｌｙをコードする発現ベクターの構築
ペプチドＡＶＥ₁〜₄₄−Ｇｌｙを製造するために、そのコード配列を、インビトロジェン社製のベクターｐＴｈｉｏＨｉｓＡ（カタログ番号Ｋ３６０−０１）に導入した。エンテロキナーゼ認識配列ＤＤＤＤＫを介してペプチド前駆体ＡＶＥ₁〜₄₄−Ｇｌｙと連結したチオレドキシンを含む融合タンパク質を形成した。エンテロキナーゼ（インビトロジェン）での処理により、ＡＶＥ₁〜₄₄−Ｇｌｙを切り離した。これは、実施例７（以下）に従ってＰＡＭ（和光純薬工業株式会社（Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｉｎｄ．Ｌｔｄ．））の存在下で標的タンパク質ＡＶＥ₁〜₄₄−ＮＨ₂に変換できる。

以下の配列を有する２種のプライマーを合成した：
ＢａｍＨ１切断部位を有するプライマーＺｐ＿ｔｈｉｏｈｉｓｆ（配列番号９）：

ＥｃｏＲ１切断部位を有するプライマーＺＰ＿ｔｈｉｏｈｉｓｒｅｖ（配列番号１０）：

ＰＣＲ反応で、標準条件下で、プライマーＺｐ＿ｔｈｉｏｈｉｓｆとＺＰ＿ｔｈｉｏｈｉｓｒｅｖを、テンプレートとしてのｐＳＣＨＰＵＣＺＰ１０のＤＮＡと共に用いた。ＰＣＲフラグメントを製造し、酵素ＢａｍＨ１およびＥｃｏＲ１で切断した後、これを、ＢａｍＨ１およびＥｃｏＲ１でそれに対応して開環させたｐＴＨＩＯＨｉｓＡベクターに、Ｔ４リガーゼ反応で直接挿入した。コンピテントＥ．コリＢＬ２１細胞をライゲーション混合物で形質転換し、２５ｍｇ／ｌアンピシリンを含む選択用寒天上で平板培養した。いくつかのクローンからプラスミドＤＮＡを再び単離し、ＰＣＲ、続いてＤＮＡ配列解析で解析した。所望の陽性クローンをｐＴＨＩＯＨｉｓＡＺＰ１０−Ｇｌｙと命名し、これを、米国特許第５４９６９２４号の実施例１４と同様にして融合タンパク質の発現に関してチェックした。陽性発現解析に基づいて、１つのクローンを選択し、より大量の試料を製造するために発酵させた。形成された融合タンパク質は、エンテロキナーゼ認識配列を介してＡＶＥ₁〜₄₄−Ｇｌｙと連結したチオレドキシンを含む（配列番号１２）。

米国特許第５４９６９２４号（その内容は、参照により本願に組み入れる）は、原則的に特別に設計された融合タンパク質の生産が可能な発現系を提案している。この系の利点は、小さいバラスト含量を有する（ｗｉｔｈ ａ ｓｍａｌｌ ｂａｌｌａｓｔ ｃｏｎｔｅｎｔ）融合タンパク質を生産することができることにある。配列セグメントＡ−Ｂが、エンテロキナーゼ認識配列ＤＤＤＤＫを介してＡＶＥ₁〜₄₄−Ｇｌｙと融合している場合、以下の遺伝子およびアミノ酸配列（配列番号１１および１２）を有する融合タンパク質が得られる：
配列番号１１：

配列番号１２:

コード遺伝子配列の調製をＰＣＲ技術によって行った。このために、以下のプライマーを合成した：
１）プライマーｐｓｗ３＿ｚｐｃｏｌｆ（配列番号１３）：

従って、このプライマー配列は、エンテロキナーゼ認識部位、およびＡＶＥ₁〜₄₄−Ｇｌｙコード配列の開始部位をカバーしている。

２）プライマーｐｓｗ３＿ｚｐｃｏｌｒｅｖ（配列番号１４）：

従って、この配列は、米国特許第５４９６９２４号の表１に従って、アミノ酸３４〜３８、およびアミノ酸であるメチオニンに関するコドンの３分の２をカバーしている合成インターロイキン−２の配列に相当する。プライマー配列の残りは、プライマーｐｓｗ３＿ｚｐｃｏｌｆとオーバーラップする。

３）ｐＢｐｒｉｍｅｆ１（配列番号１５）：

このプライマーは、プラスミドｐＫ５０（米国特許第５４９６９２４号の図３３）に含まれるＥｃｏＲ１切断部位と上流側でハイブリダイゼーションする。

４）Ｈｉｎｄ３切断部位を有するｐｓｗ３＿ｚｐ１０ｃｏｌｒｅｖ（配列番号１６）：

平行して２種のＰＣＲを行った。一方は、プラスミドｐＫ５０のＤＮＡで、プライマー対ｐＢｐｒｉｍｅｆ１およびｐｓｗ３＿ｚｐｃｏｌｒｅｖを用いて５０℃で行い、他方の反応は、プラスミドｐＴＨＩＯＨｉｓＡＺＰ１０−ＧｌｙのＤＮＡで、プライマー対ｐｓｗ３＿ｚｐｃｏｌｆおよびｐｓｗ３＿ｚｐ１０ｃｏｌｒｅｖを用いて５４℃で行った。そのＰＣＲ産物をゲル電気泳動によって分離した後、精製し、それぞれのアリコートの１つを１：１の比率で混合し、続いてプライマー対ｐＢｐｒｉｍｅｆ１およびｐｓｗ３＿ｚｐ１０ｃｏｌｒｅｖを用いた第三のＰＣＲで反応させた。そのＰＣＲ産物を酵素ＥｃｏＲ１およびＨｉｎｄ３で処理し、これらの酵素で平行して、開環したプラスミドｐＫ５０に、Ｔ４リガーゼ反応で挿入した。コンピテントＥ．コリＢＬ２１細胞を、ライゲーション混合物で形質転換し、２５ｍｇ／ｌアンピシリンを含む選択的な寒天上で平板培養した。いくつかのクローンからプラスミドＤＮＡを再び単離し、ＰＣＲ、続いてＤＮＡ配列解析で解析した。陽性クローンをｐＢＺＰ１００と命名し、融合タンパク質の発現に関してチェックした。

その発現産物をマススペクトロメトリーとＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、Ｎ末端をタンパク質配列解析によって決定した。より大量の試料を発酵するのに適したクローンを選択した。

実施例３：実施例２で構築された系の発酵
標的ペプチド誘導体（融合タンパク質）をコードする様々なプラスミドベクターで形質転換されたＥ．コリＢＬ２１細胞を、無機塩培地または複合培地（実施例１を参照）を含む発酵槽中で、３０℃または３７℃、ｐＨ７.０で培養した。ＮＨ₄ ⁺溶液（２６％水溶液）を用いてｐＨ調整を行った。培養ブロス中の溶存酸素を３０％で一定に維持する制御法によって培養物への通気を確保した。無機塩培地の流加プロセスにおいて、バッチ段階の完了後、グルコース溶液（６０％ｗ／ｖ）を供給した（８ｇ／Ｌ／時間〜２６ｇ／Ｌ／時間で）。タンパク質発現の誘導を、ＩＰＴＧの添加によって（最終濃度（ｆ．ｃ．）１〜４ｍＭ）行った。誘導時間は６〜８時間とした。ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で標的タンパク質の発現を検出した。

Ｅ．コリＢＬ２１／ｐＢＺＰ１００中でのＡＶＥ₁〜₄₄−Ｇｌｙ（−融合タンパク質）の発現を、以下に記載しているように行った：
−８０℃で保存したＥ．コリＢＬ２１細胞の恒久培養物から細胞懸濁液１００μＬを回収し、前培養培地０.５Ｌ中で３７℃で振盪しながら１０〜１６時間インキュベートした。発酵槽中のメインの培養物に、適切な量の前培養物を用いてＯＤ₆₀₀が０.０１〜０.０５の植菌密度で植え付けた。

前培養培地：
５ｇ／Ｌのバクトトリプトン、
１０ｇ／Ｌの酵母抽出物、
５ｇ／ＬのＮａＣｌ。

メインの培養：
炭素源としてグルコースをベースとした規定の無機塩培地（最少培地）（Ｊｅｆｆｒｅｙ Ｈ Ｍｉｌｌｅｒ：Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，コールドスプリングハーバーラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（１９７２））。

最初にメインの培地中に存在するグルコースが消費された後、そこにグルコース溶液を供給した。ＩＰＴＧ（ｆ．ｃ．は１ｍＭ）添加によって誘導されたタンパク質発現と、誘導後の融合タンパク質の最大発現を観察した。

例えばノヴェックス社（Ｎｏｖｅｘ）製のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析システム（ＮｕＰａｇｅ^(R)ノヴェックス１２％ゲルシステム，インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ^TM））を用いて、製造元の説明書に従って、異なる培養時点で発酵槽から回収した細胞懸濁液のＯＤ_600nmが０.０２の部分を解析した。

実施例４：融合タンパク質の精製
ＢＺＰ−ＡＶＥ ₁ 〜 ₄₄ −Ｇｌｙ融合タンパク質の単離：
組換えＥ．コリ株（バイオマス２００ｇ）を、トリス緩衝液（５０ｍＭトリス／ＨＣｌ，ｐＨ７.４；１ｍＭのＥＤＴＡ）３００ｍｌに再懸濁した。２倍高圧で均質化することによって（ラニー（Ｒａｎｎｉｅ）製の高圧ホモジナイザー，１０００ｂａｒ）細胞を崩壊させた。ホモジネート中の不溶性成分を遠心分離によって除去した。加圧下で上清をろ過し（ザルトリウス（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）製の０.２２μｍフィルター，タイプ１１１）、緩衝液（５０ｍＭトリス／ＨＣｌ，ｐＨ７.３；１ｍＭのＥＤＴＡ）で予め平衡化させたクロマトグラフィーカラム（ソースＳ（Ｓｏｕｒｃｅ Ｓ），アマシャム・バイオサイエンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））上にアプライした。サンプルをアプライした後に、平衡緩衝液（カラム体積の２倍）で洗浄工程を行い、続いて、１０％高塩濃度緩衝液（５０ｍＭトリス／ＨＣｌ，ｐＨ７.３；１ＭのＮａＣｌ，１ｍＭのＥＤＴＡ）でさらなる洗浄工程を行った。高塩濃度緩衝液をカラム体積の５倍以上で用いて塩濃度勾配を適用することによって分画化を行った。個々の分画の融合タンパク質含量を、ＳＤＳゲル電気泳動（ＮｕＰａｇｅ^(R)ノヴェックス１２％ゲルシステム，インビトロジェン）によって試験した。融合タンパク質を含む分画を合わせ、５〜１０倍に濃縮した（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）製の限外ろ過セル，１０ｋＤａで分離する膜）。緩衝液をエンテロキナーゼ緩衝液（５０ｍＭトリス／ＨＣｌ，ｐＨ７.４；５０ｍＭのＮａＣｌ，２ｍＭのＣａＣｌ₂）に交換することによるプロテアーゼ切断反応に、この濃縮物を直接用いるか、または切断反応の前に、ゲルろ過（スーパーデックス７５（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５），アマシャム・バイオサイエンス）によってさらに精製した。

エンテロキナーゼ（インビトロジェン）を製造元の説明書に従って用いて、エンテロキナーゼ緩衝液（２０ｍＭトリス／ＨＣｌ，５０ｍＭのＮａＣｌ，２ｍＭのＣａＣｌ₂，ｐＨ７.４）中で融合タンパク質の切断を行った。

実施例５：配列番号３を含むチオレドキシン融合タンパク質の精製
組換えＥ．コリ株（バイオマス２００ｇ）を、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７.４；１ｍＭのＥＤＴＡ）に再懸濁した。２倍高圧で均質化することによって（ラニー製の高圧ホモジナイザー，１０００ｂａｒ）細胞を崩壊させた。ホモジネート中の不溶性成分を遠心分離によって除去した。加圧下で上清をろ過し（ザルトリウス製の０.２２μｍフィルター，タイプ１１１）、緩衝液（５０ｍＭトリス／ＨＣｌ，ｐＨ７.４；１ｍＭのＥＤＴＡ）で予め平衡化させたクロマトグラフィーカラム（ソースＱ，アマシャム・バイオサイエンス）上にアプライした。サンプルをアプライした後に、平衡緩衝液（カラム体積の２倍）で洗浄工程を行い、高塩濃度緩衝液をカラム体積の６倍以上で用いて（５０ｍＭトリス／ＨＣｌ，ｐＨ７.４；０.３ＭのＮａＣｌ，１ｍＭのＥＤＴＡ）塩濃度勾配を適用することによって、分画化を行った。個々の分画の融合タンパク質含量を、ＳＤＳゲル電気泳動（ＮｕＰａｇｅ^(R)ノヴェックス１２％ゲルシステム，インビトロジェン^TM）によって試験した。融合タンパク質を含む分画を合わせ、５〜１０倍に濃縮した（ミリポア製の限外ろ過セル，１０ｋＤａで分離する膜）。この濃縮液を、ゲルろ過クロマトグラフィー（スーパーデックス７５，アマシャム・バイオサイエンス）によってさらに分画した。予め平衡化したカラム（５０ｍＭトリス／ＨＣｌ，ｐＨ７.４；２００ｍＭのＮａＣｌ）に、濃縮した融合タンパク質溶液をカラム体積の５％までローディングした。平衡緩衝液でリンスすることによって溶離を行った。ＳＤＳゲル電気泳動（ＮｕＰａｇｅ^(R)ノヴェックス１２％ゲルシステム，インビトロジェン^TM）によって、個々の分画の融合タンパク質含量を再度試験した。適切な分画を合わせ、約５ｍｇ／ｍｌに濃縮し（ビバスピン（Ｖｉｖａｓｐｉｎ）濃縮装置，１０ｋＤで分離，ビバサイエンス（Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ））、緩衝液のエンテロキナーゼ緩衝液（２０ｍＭトリス／ＨＣｌ，ｐＨ７.４；５０ｍＭのＮａＣｌ）への交換を、透析ろ過（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）ユニット（ビバサイエンス）によって行った。

次に、実施例４と同様にエンテロキナーゼを用いて、前駆体段階のＡＶＥ₁〜₄₄−Ｇｌ
ｙをプロセシングした。

実施例６：エンテロキナーゼによる切断反応液からの切断産物の分離
エンテロキナーゼを用いて融合タンパク質を切断した後、イオン交換クロマトグラフィー（ソース３０Ｓ，アマシャム・バイオサイエンス）で切断産物をそれぞれ分離した。この溶液のイオン強度を、塩化ナトリウムの添加によって約１０ｍＳ／ｃｍに調製した。予め平衡化したカラム（２０ｍＭトリス／ＨＣｌ，ｐＨ７.４；ＮａＣｌで伝導率を約１０ｍＳ／ｃｍに調製した）にタンパク質溶液をアプライした後、未結合物質を、緩衝液（２０ｍＭトリス／ＨＣｌ，ｐＨ７.４；ＮａＣｌで伝導率を約１０ｍＳ／ｃｍ調製した）で洗浄して除いた。ＡＶＥ₁〜₄₄−Ｇｌｙペプチドの溶離を、５００ｍＭのＮａＣｌまでの濃度勾配をカラム体積の１０倍以上でアプライすることによって行った。

ＡＶＥ₁〜₄₄を含む分画またはＡＶＥ₁〜₄₄への前駆体段階の同定を、ＳＤＳゲル電気泳動、ＨＰＬＣおよびマススペクトロメトリーによって行った。適切な分画を合わせ、有機溶媒を除去した後、凍結乾燥した。

最終的に、アミノ酸配列を確認するために、エドマン（Ｅｄｍａｎ）によって単離されたＡＶＥ₁〜₄₄−Ｇｌｙを完全に配列解析した。

実施例７：ＡＶＥ ₁ 〜 ₄₄ −ＧｌｙのＡＶＥ ₁ 〜 ₄₄ −ＮＨ ₂ への変換
この反応を、酵素ＰＡＭ（ペプチジル−グリシン−アミド化酵素，和光純薬工業株式会社（注文番号１６１−１６９７１））を製造元の反応条件に関する説明書に従って用いて行った。

以下の溶液を作製した：
１μＭのＣｕＳＯ₄、
５ｍＭのＫＩ、
３ｍＭのアスコルビン酸ナトリウム、
２３０Ｕ／ｍｌのカタラーゼ（ウシ，フルカ（Ｆｌｕｋａ））、
６００Ｕ／ｍｌのＰＡＭ（和光純薬）、
０.００１％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００を含む０.１Ｍのトリス／ＨＣｌ（ｐＨ７.０）。

この溶液を３７℃で１時間プレインキュベートし、ＡＶＥ₁〜₄₄Ｇｌｙタンパク質溶液（トリス／ＨＣｌ，ｐＨ７.０，最終濃度８０μｇ／ｍｌ）を添加した。次に、この反応混合物を３７℃でさらにインキュベートした。異なる時間でサンプリングすることによって反応経過を追った。最大の変換がなされた時点で、５０ｍＭのＥＤＴＡ溶液を添加することによって反応を止めた。

次に、この反応混合物を、イオン交換クロマトグラフィー（ショウデックス社（Ｓｈｏｄｅｘ Ｃｏ.），カラムタイプＩＥＣ ＣＭ−８２５（８×７５ｍｍ））で分離した。
このカラムに、以下の濃度勾配を適用した：
溶離液Ａ−４０ｍＭｏｌのリン酸緩衝液（ｐＨ７）＋２０％アセトニトリル、
溶離液Ｂ−５０ｍＭｏｌのリン酸緩衝液（ｐＨ７）＋１ＭのＮａＣｌ。

このカラムを、室温で、２ｍｌ／分または１ｍｌ／分の通過流速（ｔｈｒｏｕｇｈｆｌｏｒｏ ｒａｔｅ）で稼働させた。

溶離した分画（２８０ｎｍで検出）を回収し、関連するペプチドの質量をＭＡＬＤＩ−ＭＳによって測定した。ブルカー（ＢＲＵＫＥＲ）製のリフレックスIV（Ｒｅｆｌｅｘ）タイプの装置を用いてマススペクトロメトリー分析を行った。このサンプルをＭＡＬＤＩ−ＭＳ解析に直接用いるか、または５０％ＴＡａｑ（１：１の０.１％ＴＦＡ＋５０％アセトニトリル）で約５０ｐｍｏｌ／μｌの濃度に希釈した。

ＡＶＥ₁〜₄₄−ＮＨ₂の期待された質量が確認された。得られた産物はさらなる製薬用途に供給することができる。

従って、当業者既知の方法で、生物学的に活性なペプチドまたはペプチド誘導体に適切な医薬製剤用の添加剤を添加することによって医薬製剤を製造することができる。

Claims (6)

1. 一般式II：
   （ＡＳ）_n−Ｘ_m−ＮＨ₂ （式II）
   ［式中、
   ＡＳは、遺伝学的にコード可能なアミノ酸であり；
   ｎは、５〜２０００であり；そして
   （ＡＳ）_nおよび／または（ＡＳ）_n−Ｘ_mは、生物学的に活性なペプチドまたはタンパク質であり、
   Ｘは、塩基性アミノ酸、またはそれらの誘導体であり；
   ｍは、１〜１５であり；ならびに、
   ｎおよびｍは整数である］
   で示されるＣ末端をアミド化したペプチドの製造方法であって、
   ａ）一般式Ｉ：
   （ＡＳ） _n −Ｘ _m Ｙ _p （式Ｉ）
   ［式中、Ｙは、中性の電荷を有するアミノ酸であり；
   ｐは、１〜１０の整数である］
   で示される化合物をコードする核酸分子を含む宿主細胞を、適切な栄養培地中で培養し、
   ｂ）該一般式Ｉで示される化合物を発現させ、
   ｃ）工程ｂ）からの発現産物を、α−アミド化酵素と反応させ、
   ｄ）適切な方法で、一般式IIで示されるＣ末端をアミド化したペプチドを精製する、
   ことからなる、上記方法。
2. 前記宿主細胞は、前記一般式Ｉで示される化合物を含む融合タンパク質をコードする核酸分子を含むものであり、
   該宿主細胞を、適切な栄養培地中で培養し、
   該融合タンパク質を発現させ、
   該融合タンパク質から、酵素による切断または化学的な切断によって、前記一般式Ｉで示される化合物を切り離し、
   得られた中間生成物を、α−アミド化酵素と反応させ、
   適切な方法で、一般式IIで示されるＣ末端をアミド化したペプチドを精製する、
   ことからなる、請求項１に記載の方法。
3. 式Ｉの化合物は、配列番号２で定義される化合物である、請求項１または２に記載の方法。
4. 式Ｉの化合物は、酵素による切断によって、融合タンパク質から切り離される、請求項２に記載の方法。
5. 式Ｉの化合物は、酵素エンテロキナーゼによって、融合タンパク質から切り離される、請求項４に記載の方法。
6. 配列番号１で定義される式IIの化合物を製造するための、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。