JPH04293490A - ｐＳ２蛋白質の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 【０００１】 【産業上の利用分野】本発明は、ｐＳ２蛋白質製造のた
めの組換えＤＮＡ技術に関する。より具体的には、ｐＳ
２蛋白質遺伝子を含有するＤＮＡ、該ＤＮＡを保持せし
めてなるバチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｂｒ
ｅｖｉｓ）形質転換体およびそれらを用いるｐＳ２蛋白
質の製造法に関する。 【０００２】 【従来の技術】Ｐ．　Ｍａｓｉａｋｏｗｓｋｉ　らは［
ニュークレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ．　
ＡｃｉｄｓＲｅｓ．），　１０，　７８９５　（１９８
２）］、ヒト乳ガン細胞株（ＭＣＦ−７）にエストロゲ
ンを添加することによって増大するｐＳ２−ｍＲＮＡに
対応するｃＤＮＡをクローニングした。続いて、　Ｓ．
　Ｂ．　Ｊａｋｏｗｌｅｗ　らは［　Ｎｕｃｌ．　Ａｃ
ｉｄｓ　Ｒｅｓ．，　１２，　２８６１　（１９８４）
］、全長のｐＳ２−ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を決定
し、ｐＳ２−ｍＲＮＡが８４アミノ酸残基から成るポリ
ペプチドをコードしていることを明かにした。その後、
Ｋ．　Ｍｏｒｉ　らは［バイオケミカル・アンド・バイ
オフィジカル・リサーチ・コミュニケーション（Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍｕ
ｎ．），　１５５，　３６６　（１９８８）］、ＭＣＦ
−７細胞株によって分泌されたヒトＥＧＦ様因子（ＥＧ
Ｆ−ＬＩ）を単離してそのＮ末端３６アミノ酸配列を決
定し、その配列がｐＳ２遺伝子によってコードされた産
物のものと一致することを報告した。さらに、彼らはｐ
Ｓ２遺伝子産物（ｐＳ２蛋白質）の全アミノ酸配列を決
定し、ｐＳ２蛋白質は６０アミノ酸残基から構成されて
いることを証明した［　Ｋ．　Ｍｏｒｉら、ジャーナル
・オフ・バイオケミストリー（Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．
），　１０７，　７３　（１９９０）］。 【０００３】上述のようにｐＳ２遺伝子はある種の乳ガ
ン細胞で特異的に転写されることが分かったため、ｐＳ
２蛋白質はエストロゲン依存性の乳ガンの診断や予後の
推定に特異的マーカーとして使用できる可能性が大きい
。従って、該蛋白質を検出するための系の開発は有用で
あると考えられている。Ａ．−Ｍ．　Ｎｕｎｅｚ　らは
［エンドクリノロジー（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ）
，　１２１，　１７５９　（１９８７）］、ｐＳ２遺伝
子から推定されたｐＳ２ポリペプチド（カルボキシル末
端側３１アミノ酸残基）に対するウサギ抗血清がＭＣＦ
−７細胞株の抽出液や培養液からｐＳ２蛋白質を免疫沈
降することを証明している。抗血清の作製に用いる免疫
原としては、抗原の一部に相当する合成ペプチドよりも
天然型の抗原を用いる方がエピトープの数が多いために
有利であることは自明である。しかしながら、ＭＣＦ−
７細胞株によるｐＳ２蛋白質（ＥＧＦ−ＬＩ）の生産量
は、培養液２Ｌから３７μｇの該蛋白質が単離される程
度であり［　Ｋ．　Ｍｏｒｉ　ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．　
Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍｕｎ．，　１５
５，　３６６（１９８８）］、その生産量は多いとは言
えない。従って、遺伝子組換え技術によってｐＳ２蛋白
質を量産化することが望まれている。今日まで多くの組
換えＤＮＡの研究は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　
ｃｏｌｉ）を用いて行われ、すでに多くの異種遺伝子が
大腸菌内で発現されている。しかし、この方法では、発
現された遺伝子産物は菌体内に蓄積されるため、菌体か
らの産物の抽出およびその抽出液からの精製には多大な
時間と労力を要し、目的とする遺伝子産物を純粋な形で
取得することは容易ではない。 【０００４】一方、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細
菌は古くから種々の菌体外酵素の生産菌として工業的に
利用されており、これら菌体外酵素遺伝子のプロモータ
ーおよびシグナルペプチドをコードするＤＮＡ領域をク
ローニングし、その下流に目的とする蛋白質の構造遺伝
子を連結し、これをバチルス属菌に導入すれば、目的と
する蛋白質を菌体外へ分泌させることが可能になると考
えられる。バチルス属菌においては、分泌される蛋白質
はアミノ末端側におよそ２０〜３０アミノ酸残基から成
るシグナルペプチドを持つ前駆体として合成された後、
この部分がシグナルペプチダーゼによって切断されて成
熟した蛋白質になると考えられており、すでに、バチル
ス・アミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａ
ｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）のα−アミラーゼ
遺伝子［　Ｉ．　Ｐａｌｖａ　ら、ジーン（Ｇｅｎｅ）
，　２２，　２２９　（１９８３）］、バチルス・リケ
ニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏ
ｒｕｍｉｓ）のペニシリナーゼ遺伝子［Ｓ．Ｃｈａｎｇ
　ら、モレキュラー・クローニング・アンド・ジーン・
レギュレーション・イン・バシライ（Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ　Ｃｌｏｎｉｎｎｇ　ａｎｄ　ＧｅｎｅＲｅｇｕｌａ
ｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｂａｃｉｌｌｉ），ア　カデミック・
プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ），　６５９頁
，１９８２年］、バチルス・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の　α−アミラーゼ遺伝子［　
Ｈ．　Ｙａｍａｚａｋｉら、　ジャーナル・オブ・バク
テリオロジー（Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．），　１５
６，３２７　（１９８３）］がクローン化され、これら
のシグナルペプチドを利用した異種蛋白質の分泌が報告
されている。上記の異種蛋白質の分泌生産には、主にバ
チルス・サチルス（Ｂ．　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）が宿主と
して用いられているが、この微生物は菌体外プロテアー
ゼを多量に生産するため、組換えＤＮＡ技術を用いて分
泌された異種蛋白質は分解を受け、その蓄積量は著しく
減少する。 【０００５】これに対し、鵜高（　Ｓ．　Ｕｄａｋａ　
）らはバチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｂｒｅ
ｖｉｓ）にはプロテアーゼをほとんど生産しない菌株が
多いことを見いだし、その一菌株バチルス・ブレビス４
７［ＦＥＲＭ　　Ｐ−７２２４；特開昭６０ー５８０７
４号公報、特開昭６２−２０１５８３号公報参照］の主
要菌体外蛋白質［　Ｈ．　Ｙａｍａｇａｔａ　ら、Ｊ．
　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，　１６９，　１２３９　（１
９８７）；　　塚越規弘（　Ｎ．　Ｔｓｕｋａｇｏｓｈ
ｉ　）、　日本農芸化学会誌，　６１，　６８　（１９
８７）；および特開昭６２−２０１５８３号におい　て
、それぞれ”ｍｉｄｄｌｅ　ｗａｌｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ
　ａｎｄ　ｏｕｔｅｒ　ｗａｌｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ”、
”細胞壁構成主要蛋白質”および”細胞表層蛋白質”と
して記載されている。］遺伝子のプロモーターおよび該
主要菌体外蛋白質の一種であるＭＷ蛋白質（ｍｉｄｄｌ
ｅ　ｗａｌｌｐｒｏｔｅｉｎ）のシグナルペプチドをコ
ードする領域を用いて分泌ベクターを作製し、本　菌株
を宿主としてαーアミラーゼ［特開昭６２−２０１５８
３号公報；　Ｈ．Ｙａｍａｇａｔａ　ら、Ｊ．　Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｌ．，　１６９，　１２３９　（１９８７）
］やブタペプシノーゲン［鵜高重三（　Ｓ．　Ｕｄａｋ
ａ　）、日本農芸化学会昭和６２年度大会講演要旨集，
８３７頁；塚越規弘（　Ｎ．　Ｔｓｕｋａｇｏｓｈｉ　
）、日本農芸化学会誌，６１，　６８　（１９８７）］
の分泌生産に成功している。 【０００６】また、高木（　Ｈ．　Ｔａｋａｇｉ　）ら
はバチルス・ブレビスのプロテアーゼを生産しない菌株
バチルス・ブレビスＨＰＤ３１［なお、この菌株は本明
細書におけるバチルス・ブレビスＨ１０２（ＦＥＲＭ　
　ＲＭＢＰ−１０８７）と同一菌株である。］を分離し
、これを宿主として耐熱性α−アミラーゼの高分泌生産
に成功している［日本農芸化学昭和６２年度大会講演要
旨集，２７頁］。また、鵜高（　Ｓ．Ｕｄａｋａ　）ら
は同じくバチルス・ブレビスＨ１０２を用いてヒト上皮
細胞増殖因子（ｈｕｍａｎ　ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　ｇｒ
ｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ：ヒトＥＧＦ）の分泌生産［特
開平２−３１６８２号公報；　Ｈ．　Ｙａｍａｇａｔａ
　ら、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・ア
カデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ジ・ユナイテ
ッド・ステイッツ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃ．　Ｎａ
ｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ），　８６，　
８５８６　（１９８９）］およびヒト・プロテイン・ジ
スルフィド・イソメラーゼ（ｈｕｍａｎ　ｐｒｏｔｅｉ
ｎ　ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ　ｉｓｏｍｅｒａｓｅ：ヒトＰ
ＤＩ）の分泌生産（特願平１−２７４３１０号明細書参
照）を報告している。 【０００７】 【発明が解決しようとする課題】本発明はバチルス・ブ
レビスを宿主として用いるｐＳ２蛋白質の新規製造法を
提供することにある。 【０００８】 【課題を解決するための手段】本発明者らは、ｐＳ２蛋
白質を効率よく生産させる方法を提供すべく鋭意研究を
重ねたところ、バチルス・ブレビスを宿主として用いて
ｐＳ２遺伝子を発現させることにより、培養物中に著量
のｐＳ２蛋白質が生産されることを見いだし、本発明を
完成するに至った。すなわち、本発明は、（１）バチル
ス・ブレビス由来のプロモーター領域を含有するＤＮＡ
の３’末端にｐＳ２蛋白質をコードするＤＮＡを結合さ
せたＤＮＡ、（２）プロモーター領域を含有するＤＮＡ
の３’末端にｐＳ２蛋白質をコードするＤＮＡを結合さ
せたＤＮＡを保持するバチルス・ブレビス、および（３
）上記（２）に記載のバチルス・ブレビスを培地に培養
し、培養物中にｐＳ２蛋白質を生成、蓄積せしめ、これ
を採取することを特徴とするｐＳ２蛋白質の製造法であ
る。 【０００９】ｐＳ２蛋白質をコードするＤＮＡとしては
、ｐＳ２蛋白質をコードするものであればいずれでもよ
く、例えば、ヒト乳ガン細胞株ＭＣＦ−７のｃＤＮＡラ
イブラリーからクローン化されたものが挙げられ、その
具体例としては、Ｋ．　Ｍｏｒｉ　ら、Ｊ．　Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．，　１０７，７３　（１９９０）　　に記載の
方法に従ってクローン化されたＤＮＡ（〔図１〕，〔配
列番号３〕参照）が挙げられる。プロモーターとしては
、バチルス・ブレビスで機能するものであればいずれで
もよいが、バチルス・ブレビス由来のプロモーターが好
ましく、例えばバチルス・ブレビス４７あるいはバチル
ス・ブレビスＨ１０２の主要菌体外蛋白質遺伝子のプロ
モーターなどが挙げられる。該プロモーターは１種また
は２種以上含有されていてもよい。プロモーター領域を
含有するＤＮＡは、上記プロモーター以外に、ＳＤ配列
、翻訳開始コドンなどを有していることが必要であり、
さらに主要菌体外蛋白質遺伝子の一部を有していてもよ
い。本発明において、ｐＳ２蛋白質はバチルス・ブレビ
スの菌体内、菌体外のいずれに蓄積されてもよいが、ｐ
Ｓ２蛋白質の抽出、精製を容易にし、また生産量を増大
させるためには、菌体外にｐＳ２蛋白質を蓄積させるこ
とが望ましく、この場合、プロモーター領域を含有する
ＤＮＡには、該ＤＮＡの３’末端側にシグナルペプチド
をコードする領域が含まれる。シグナルペプチドとして
は、ｐＳ２蛋白質をバチルス・ブレビスの菌体外に分泌
発現させるものであればいずれでもよく、例えばバチル
ス・ブレビス４７あるいはバチルス・ブレビスＨ１０２
の主要菌体外蛋白質のシグナルペプチドなどが挙げられ
るが、なかでもバチルス・ブレビス４７のＭＷ蛋白質（
ｍｉｄｄｌｅ　ｗａｌｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ）のシグナル
ペプチドが好ましい。 【００１０】遺伝子の発現に用いる発現ベクターとして
は、バチルス・ブレビスで機能するものであればいずれ
でもよく、例えば後述の参考例１で得られるプラスミド
ｐＮＵ２００［鵜高重三（　Ｓ．　Ｕｄａｋａ　）、日
本農芸化学会誌，６１，　６６９　（１９８７）］など
が挙げられる。上記のＤＮＡを用いて作製したｐＳ２蛋
白質発現プラスミドとしては、バチルス・ブレビスで機
能するものであればいずれでもよく、具体的には後述の
実施例１で得られるプラスミドｐＮＵ２００−ｐＳ２な
どが挙げられる。これらのプラスミドを構築する方法と
しては、例えば　モレキュラー・クローニング（　Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｎｇ　），　ア・ラボラ
トリー・マニュアル（　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍ
ａｎｕａｌ），　コールド・スプリング・ハーバー・ラ
ボラトリー（　Ｃｏｌｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　），（１９８２）に記載の方法
などが挙げられ、一方、プラスミドの構築に用いる宿主
としては、大腸菌（　Ｅ．ｃｏｌｉ　）、バチルス・サ
チルス（　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　）、
バチルス・ブレビス（　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｂｒｅｖｉ
ｓ　）に属する微生物であればいずれでもよく、例えば
大腸菌ＨＢ１０１、大腸菌ＤＨ１、バチルス・サチルス
ＲＭ１４１［Ｎ．　Ｔｓｕｋａｇｏｓｈｉ　ら、Ｊ．　
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，　１５８，　１０５４　（１９
８４）］、バチルス・ブレビス４７（ＦＥＲＭ　　Ｐ−
７２２４）、バチルス・ブレビス４７−５（ＦＥＲＭ　
　ＢＰ−１６６４，　ＩＦＯ　　１４６９８）などが挙
げられる。 【００１１】遺伝子の発現に用いる宿主としては、バチ
ルス・ブレビスであればいずれでもよく、具体的にはバ
チルス・ブレビス４７（ＦＥＲＭ　　Ｐ−７２２４）、
バチルス・ブレビス４７−５（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１６
６４，ＩＦＯ　　１４６９８）バチルス・ブレビスＨ１
０２（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１０８７）、バチルス・ブレ
ビス４７Ｋ（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−２３０８）［　Ｈ．　
Ｋｏｎｉｓｈｉ　ら、アプライド・マイクロバイオロジ
ー・アンド・バイオテクノロジー（　Ａｐｐｌ．　Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．），３７，
　２９７　（１９９０）；特開平２−２５７８７６号公
報］などが挙げられ、なかでもバチルス・ブレビスＨ１
０２と４７Ｋが好ましい。なお、バチルス・ブレビスＨ
１０２はバチルス・ブレビスＨＰＤ３１［高木（　Ｈ．
　Ｔａｋａｇｉ　）ら、日本農芸化学会昭和６２年度大
会講演要旨集，２７頁；鵜高重三（　Ｓ．　Ｕｄａｋａ
　）、日本農芸化学会誌，６１，　６６９　（１９８７
）］と同一菌株である。バチルス・ブレビスを形質転換
する方法は公知の方法であればいずれでもよく、例えば
　Ｗ．　Ｔａｋａｈａｓｈｉ　ら［　Ｊ．　Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｌ．，　１５６，　１１３０　（１９８３）］あ
るいは　Ｓ．Ｃｈａｎｇ　ａｎｄ　Ｓ．　Ｎ．Ｃｏｈｅ
ｎ，　モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティ
クス（　Ｍｏｌ．　Ｇｅｎ．　Ｇｅｎｅｔ．），　１６
８，　１１１　（１９７９）］あるいは高木（　Ｈ．　
Ｔａｋａｇｉ　）らの方法（日本農芸化学会１９８９年
度大会講演要旨集，３７３頁）などが挙げられる。この
ようにして得られる形質転換体のｐＳ２蛋白質の発現が
不安定な場合には、紫外線、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ
ーＮ−ニトロソグアニジン、エチルメタンスルフォネー
トなどの自体公知の変異原を用いて形質転換体を処理し
た後、ｐＳ２蛋白質を安定に発現する変異体を取得する
ことができる。また、得られた安定化変異株をエリスロ
マイシンなどの抗生物質の非存在下に培養して、プラス
ミドを脱落させたバチルス・ブレビス変異株を取得し、
再度上述の形質転換法を用いてバチルス・ブレビス変異
体を形質転換させて安定な形質転換体を育種、取得する
ことが望ましい。得られる形質転換体の培養に用いる培
地は、形質転換体が生育して目的とする蛋白質を生産し
得るものであればいかなるものでもよい。 【００１２】該培地に含有される炭素源としては、例え
ばグルコース、シュークロース、グリセロール、でん粉
、デキストリン、糖密、尿素、有機酸などが用いられる
。該培地に含有される窒素源としては、例えばカゼイン
、ポリペプトン、肉エキス、酵母エキス、カザミノ酸、
グリシンなどのアミノ酸類、ＮＺ−アミンなどの有機窒
素源、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アン
モニウムなどの無機窒素源などが用いられる。その他、
塩化カリウム、リン酸一カリウム、リン酸二カリウム、
塩化ナトリウム、硫酸マグネシウムなどの無機塩が必要
に応じて培地に加えられる。具体的な天然培地としては
、例えばＴ２培地［　Ｓ．Ｕｄａｋａ，　Ａｇｒｉｃ．
Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　４０，　５２３　（１９７
６）］、Ｔ３培地［　Ｈ．　Ｙａｍａｇａｔａ　ら、Ｐ
ｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ
，　８６，　３５８６　（１９８９）］などが挙げられ
る。また、糖と無機窒素源を主とする合成培地を用いて
培養してもよい。栄養要求性を示す菌株を用いる場合に
は、その生育に必要な栄養物質を培地に添加すればよい
。該栄養物質としては、アミノ酸類、ビタミン類、核酸
塩基類などが挙げられる。本発明で用いられる培地の初
発ｐＨは５．０〜９．０であり、さらに好ましくは６．
５〜７．５である。培養温度は通常１０℃〜４２℃、好
ましくは１５℃〜３７℃、さらに好ましくは２０℃〜３
０℃であり、培養時間は通常１０から１６６時間、好ま
しくは１５〜９６時間、さらに好ましくは１５〜２０時
間である。また、培養に際しては必要があれば、培地に
抗生物質（例えば、ペニシリン、エリスロマイシン、ク
ロラムフェニコール、バシトラシン、Ｄ−サイクロセリ
ンなど）が加えられる。さらに必要により、消泡剤（例
えば、大豆油、ラード油など）を培地に加えてもよい。 なお、培養液中に生成・蓄積するｐＳ２蛋白質の濃度は
これらの培養条件によって左右されるので、最適の条件
を選択してｐＳ２蛋白質の生成、蓄積量を制御する必要
がある。培養終了後、それ自体公知の方法、例えば遠心
分離、ろ過などで菌体と上清とを分離する。 菌体内に産生されたｐＳ２蛋白質は、当該分野における
通常の方法、例えば超音波破砕法、フレンチプレスなど
を利用した破砕法、摩砕などの機械的破砕法、細胞壁溶
解酵素による破砕法などにより菌体を破砕し、さらに必
要ならば、トリトン−Ｘ１００、デオキシコーレートな
どの界面活性剤を加えることによって抽出される。この
ようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含ま
れるｐＳ２蛋白質を単離するには、自体公知の蛋白質精
製法を適切に組み合わせることにより行うことができる
。これらの公知の分離・精製法としては、例えば塩折や
溶媒沈澱などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ
過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方
法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利
用する方法、アフィニティクロマトグラフィーなどの特
異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラ
フィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳
動法などの等電点の差を利用する方法などが挙げられる
。 【００１３】 【作用】本発明で得られるｐＳ２蛋白質は、ヒト検体中
に存在するｐＳ２蛋白質を検出する抗体の作製のための
免疫原として用いることができる。すなわち、本発明の
ｐＳ２蛋白質を動物に接種することにより抗ｐＳ２蛋白
質抗体を作製し、これとｐＳ２蛋白質を含有するヒト検
体とを反応させ、次に該抗ｐＳ２蛋白質抗体を作製した
動物のＩｇＧおよびＩｇＭに対する抗体に酵素またはラ
ジオアイソトープで標識したものと反応させることによ
り、ヒト検体中に存在するｐＳ２蛋白質を測定すること
ができる。また、本発明で得られるｐＳ２蛋白質は、ｐ
Ｓ２蛋白質に対する抗体の検出のための抗原として用い
ることができる。すなわち、本発明のｐＳ２蛋白質を抗
原として固相に固定したものに抗ｐＳ２蛋白質抗体を含
有するヒト検体を添加、反応させ、次に酵素またはラジ
オアイソトープで標識した抗ヒトＩｇＧおよびＩｇＭ抗
体、あるいは酵素またはラジオアイソトープなどで標識
したｐＳ２蛋白質を反応させることにより、ヒト検体中
の抗ｐＳ２蛋白質抗体を検出することができる。 【００１４】なお、本願明細書や図面において、塩基や
アミノ酸などを略号で表示する場合、　ＩＵＰＡＣ−Ｉ
ＵＢ　Ｃｏｍｍｉｓｉｏｎ　ｏｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃ
ａｌ　Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ　による略号あるいは
当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例
を次に挙げる。またアミノ酸に関して光学異性体があり
得る場合は、特に明示しなければＬ−体を示すものとす
る。 ＤＮＡ　　　　　　　　　　：デオキシリボ核酸Ａ　　
　　　　　　　　　　：アデニンＴ　　　　　　　　　
　　　：チミン Ｇ　　　　　　　　　　　　：グアニンＣ　　　　　　
　　　　　　：シトシンＳＤＳ　　　　　　　　　　：
ドデシル硫酸ナトリウムＧｌｙまたはＧ　　：グリシン ＡｌａまたはＡ　　：アラニン ＶａｌまたはＶ　　：バリン ＬｅｕまたはＬ　　：ロイシン ＩｌｅまたはＩ　　：イソロイシン ＳｅｒまたはＳ　　：セリン ＴｈｒまたはＴ　　：スレオニン ＣｙｓまたはＣ　　：システイン １／２Ｃｙｓ　　　　：ハーフシスチンＭｅｔまたはＭ
　　：メチオニン ＧｌｕまたはＥ　　：グルタミン酸 ＡｓｐまたはＤ　　：アスパラギン酸 ＬｙｓまたはＫ　　：リジン ＡｒｇまたはＲ　　：アルギニン ＨｉｓまたはＨ　　：ヒスチジン ＰｈｅまたはＦ　　：フェニールアラニンＴｙｒまたは
Ｙ　　：チロシン ＴｒｐまたはＷ　　：トリプトファン ＰｒｏまたはＰ　　：プロリン ＡｓｎまたはＮ　　：アスパラギン ＧｌｎまたはＱ　　：グルタミン Ａｐｒ　　　　　　　　　　　：アンピシリン耐性遺伝
子Ｔｃｒ　　　　　　　　　　　：テトラサイクリン耐
性遺伝子なお、本発明のポリペプチドにおいて、そのア
ミノ酸配列の一部が修飾（付加、除去、その他のアミノ
酸への置換など）されてもよい。 【００１５】 【実施例】以下の参考例と実施例により本発明をより具
体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるもので
はない。後述の実施例１で得られた形質転換体バチルス
・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｂｒｅｖｉｓ）Ｂ．ｂ
ｒｅｖｉｓ４７Ｋ／ｐＮＵ２００−ｐＳ２は平成３年２
月１２日から財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）に受託番号
ＩＦＯ　　１５１３７として、また通商産業省工業技術
院微生物工業技術研究所（ＦＲＩ）に受託番号　　ＢＰ
−３３１１として寄託されている。 参考例１　　　　プラスミドｐＢＲ−ＡＮの構築プラス
ミドｐＢＲ３２２を制限酵素　ＢａｍＨＩ　と　Ｎｒｕ
Ｉ　で切断し、３．８ｋｂのＤＮＡ断片を単離した。こ
の断片に、５’−ＡＧＴＧＣＡＣＴＣＧＣＡＣＴＴＡＣ
ＴＧＴＴＧＣＴＣＣＣＡＴＧＧＣＴＴＴＣＧＣＴＧＣＡ
Ｇ−３’〔配列番号１〕及び５’−ＧＡＴＣＣＴＧＣＡ
ＧＣＧＡＡＡＧＣＣＡＴＧＧＧＡＧＣＡＡＣＡＧＴＡＡ
ＧＴＧＣＧＡＧＴＧＣＡＣＴ−３’〔配列番号２〕から
成る合成ＤＮＡをリン酸化した後に加え、Ｔ４ＤＮＡリ
ガーゼを作用させたものを大腸菌ＨＢ１０１に導入し、
プラスミドｐＢＲ−ＡＮを得た。 【００１６】実施例１　　　　ｐＳ２蛋白質発現プラス
ミドの構築と形質転換体の調製 ｐＳ２蛋白質（〔図１〕，〔配列番号３〕）をコードす
るＤＮＡ断片を含むクローンｐＳ２Ｂ２［　Ｋ．　Ｍｏ
ｒｉ　ら、Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　１０７，　７３
　（１９９０）］を制限酵素　　ＲｓａＩ　と　Ｐｓｔ
Ｉ　で消化し、ｐＳ２蛋白質の７番目のＴｈｒからカル
ボキシル末端アミノ酸ＰｈｅまでをコードするＤＮＡを
含む、１７６ｂｐ　の　ＲｓａＩ−ＰｓｔＩ　断片を調
製した。一方、バチルス・ブレビスのＭＷ蛋白質シグナ
ル配列Ｃ末端付近の　ＮｃｏＩ　部分より下流と、ｐＳ
２蛋白質遺伝子中のＮ末端から６番目のアミノ酸Ｃｙｓ
をコードする箇所の　ＲｓａＩ　部位までの配列をコー
ドした３０ｂｐのＤＮＡを合成した〔図２〕。これと上
記で得られた　１７６ｂｐ　の　ＲｓａＩ−ＰｓｔＩ　
断片をＴ４リガーゼで連結し、２１０ｂｐ　の　Ｎｃｏ
Ｉ−ＰｓｔＩ　断片を得た。これはＭＷ蛋白質のシグナ
ル配列Ｃ末端部分とｐＳ２蛋白質のＮ末端部分をコード
するＤＮＡとを直接連結した形のものである。この断片
とｐＴＶ１１８Ｎ（宝酒造製）の　３．０ｋｂ　の　Ｎ
ｃｏＩ−ＰｓｔＩ　断片とをＴ４リガーゼで連結し、Ｅ
．　ｃｏｌｉ　　ＪＭ１０９　　を形質転換してプラス
ミドｐＴＶ−ｐＳ２を作製した。次に、このプラスミド
の　２２０ｂｐの　ＮｃｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ　断片と
ｐＢＲ−ＡＮ（参考例１参照）の　３．６ｋｂ　の　Ｎ
ｃｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ　断片をＴ４リガーゼで連結し
、Ｅ．　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９　を形質転換してプラス
ミドｐＢＲ−ＡＮ−ｐＳ２を作製した。さらに、このプ
ラスミドの　２３０ｂｐ　の　ＡｐａＬＩ−ＨｉｎｄＩ
ＩＩ　断片と、プラスミドｐＮＵ２００［鵜高重三（　
Ｓ．　Ｕｄａｋａ　）、日本農芸化学会誌，６１，　６
６９　（１９８７）］の　４．０ｋｂ　の　ＡｐａＬＩ
−ＨｉｎｄＩＩＩ　断片をＴ４リガーゼで連結して、プ
ラスミドｐＮＵ２００−ｐＳ２を得た〔図２〕。上記で
得られたｐＳ２蛋白質発現プラスミドｐＮＵ２００−ｐ
Ｓ２を用いて、高橋（　Ｗ．　Ｔａｋａｈａｓｈｉ　）
らの方法［　Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５６，　
１１３０　（１９８３）］によってバチルス・ブレビス
４７Ｋ（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−２３０８）およびバチルス
・ブレビスＨ１０２（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１０８７）の
形質転換を行い、形質転換体バチルス・ブレビス４７Ｋ
／ｐＮＵ２００−ｐＳ２およびバチルス・ブレビスＨ１
０２／ｐＮＵ２００−ｐＳ２を取得した。 【００１７】実施例２　　　　形質転換体の培養および
ｐＳ２蛋白質の生産 実施例１で得られた形質転換体バチルス・ブレビス４７
Ｋ／ｐＮＵ２００−ｐＳ２およびＨ１０２／ｐＮＵ２０
０−ｐＳ２をポリペプトン２％、酵母エキス０．４％、
肉エキス０．５％、グルコース１％、ウラシル０．０１
％（ｐＨ７）からなるＴ３培地中で３７℃で３日間振と
う培養した。上記の培養液を遠心分離し、その上清につ
いてＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、
ウサギ抗ｐＳ２蛋白質抗体を用いてウエスタンブロッテ
ィングにより抗原性のあるバンドを検出した。ｐＳ２蛋
白質の産生量は、上記両組換え体ともほぼ同程度で、培
養上清１リットル当り約２０ｍｇと算出された。 【００１８】実施例３　　　　ｐＳ２蛋白質産生株から
のｐＳ２蛋白質の精製 実施例１で得られたｐＳ２蛋白質生産株バチルス・ブレ
ビス４７Ｋ／ｐＮＵ２００−ｐＳ２を実施例２の条件で
得られた培養液をサーバル遠心機（デュポン社製）でＧ
ＳＡローターを用いて毎分１０，０００回転で１０分間
遠心分離し、上清液２リットルを得た。この液を４０％
飽和硫安−２０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ
８．０）で平衡化した　Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒ
ｌ　　６５０Ｍ（東ソー社製）カラム（　３．５　×　
２０　ｃｍ）に負荷した後、４０％から０％の飽和硫安
の濃度勾配でｐＳ２蛋白質を溶出した。ｐＳ２蛋白質の
溶出画分を２０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ
８．０）に対して透析した後、同緩衝液で平衡化した　
ＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ　６５０Ｍ　（東ソー社
製）カラム（　３．５　×　６０　ｃｍ　）に負荷し、
０から０．５Ｍ　　ＮａＣｌの濃度勾配でｐＳ２蛋白質
を溶出した。ｐＳ２蛋白質の溶出画分を限外ろ過（アミ
コン社製ＹＭ−２）によって濃縮した後、２０ｍＭＴｒ
ｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化した　Ｓｅ
ｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ−１００　（ファルマシア社製）カ
ラム（　２．０　×　１００　ｃｍ　）に負荷した。ｐ
Ｓ２蛋白質の溶出画分を０．１％ＴＦＡで平衡化したマ
イクロボンダパックＣ１８カラム（ウオーターズ社製）
に負荷し、最初の５分間は０−５９％アセトニトリルの
濃度勾配（流速：１ｍｌ／分）、続いて４０分間にわた
り５９−６１％のアセトニトリルの濃度勾配（流速：１
ｍｌ／分）でｐＳ２蛋白質を溶出した。得られたｐＳ２
蛋白質画分を上記と同じ条件下で再度高速液体クロマト
グラフィーを行い、ｐＳ２蛋白質画分を集め（２．０ｍ
ｌ、蛋白質１ｍｇ）、精製標品とした。 【００１９】実施例４　　　　ｐＳ２蛋白質の物性（１
）実施例３で得られたｐＳ２蛋白質標品は、実施例３の
マイクロボンダパックＣ１８カラム（ウオーターズ社製
）を用いる逆相高速液体クロマトグラフィーで左右対称
の単一ピークとして溶出された〔図３〕。（２）ｐＳ２
蛋白質標品の分子量は、還元条件下でのＳＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動法によって　７，０００〜１
０，０００　と算出された〔図４〕。　　（３）ｐＳ２
蛋白質の等電点は、等電点ゲル電気泳動法によって４．
３と算出された。（４）ｐＳ２蛋白質標品、２５０　ｐ
ｍｏｌ　を用いて、気相プロテインシークエンサー（ア
プライドバイオシステムズ社製モデル４７０Ａ）により
そのアミノ末端アミノ酸配列を分析した。その結果、ｐ
Ｓ２蛋白質のＮ末端アミノ酸配列はｃＤＮＡから予想さ
れる配列と一致し、ＭＷＰシグナル配列は正しい位置で
切断、除去されていることが明かとなった〔表１〕。さ
らに、ｐＳ２蛋白質をカルボキシペプチダーゼＰによっ
て分解した後、ＰＩＣＯ−ＴＡＧＲ　アミノ酸分析機（
ウオーターズ社製）によりカルボキシル末端アミノ酸を
分析した結果、ｃＤＮＡ配列から予想されるフェニール
アラニンが検出された。（５）ＰＩＣＯ−ＴＡＧＲ　ア
ミノ酸分析機によりｐＳ２蛋白質のアミノ酸組成を分析
した。 その結果、得られた組成値はｃＤＮＡ配列より予想され
る値とほぼ一致した〔表２〕。 【００２０】 【表１】 　　　　　　　　　　　　　　　　精製ｐＳ２蛋白質の
アミノ末端アミノ酸配列分析────────────
───────────────────────　　
　　サイクル　　　　　　　検出されたＰＴＨアミノ酸
　　　　　　　ｃＤＮＡから予想され　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　残基　　　　　
　　　　　ｐｍｏｌ　　　　　　　　　　　　　　るア
ミノ酸──────────────────────
──────────────　　　　　　　　１　　
　　　　　　　　　　Ｇｌｕ　　　　　　　　　　２０
　　　　　　　　　　　　　　　　Ｇｌｕ　　　　　　
　　２　　　　　　　　　　　　Ａｌａ　　　　　　　
　　　２８　　　　　　　　　　　　　　　　Ａｌａ　
　　　　　　　３　　　　　　　　　　　　Ｇｌｎ　　
　　　　　　　　２１　　　　　　　　　　　　　　　
　Ｇｌｎ　　　　　　　　４　　　　　　　　　　　　
Ｔｈｒ　　　　　　　　　　１１　　　　　　　　　　
　　　　　　Ｔｈｒ　　　　　　　　５　　　　　　　
　　　　　Ｇｌｕ　　　　　　　　　　１６　　　　　
　　　　　　　　　　　Ｇｌｕ　　　　　　　　６　　
　　　　　　　　　　Ｔｈｒ　　　　　　　　　　　　
９　　　　　　　　　　　　　　　　Ｔｈｒ　　　　　
　　　７　　　　　　　　　　　　　　−　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　Ｃｙｓ　　　　　　　　８　　　　　　　　　　　　
Ｔｈｒ　　　　　　　　　　　　７　　　　　　　　　
　　　　　　　Ｔｈｒ　　　　　　　　９　　　　　　
　　　　　　Ｖａｌ　　　　　　　　　　１５　　　　
　　　　　　　　　　　　Ｖａｌ　　　　　　１０　　
　　　　　　　　　　Ａｌａ　　　　　　　　　　１３
　　　　　　　　　　　　　　　　Ａｌａ　　　　　　
１１　　　　　　　　　　　　Ｐｒｏ　　　　　　　　
　　１３　　　　　　　　　　　　　　　　Ｐｒｏ　　
　　　　１２　　　　　　　　　　　　Ａｒｇ　　　　
　　　　　　　　７　　　　　　　　　　　　　　　　
Ａｒｇ　　　　　　１３　　　　　　　　　　　　Ｇｌ
ｕ　　　　　　　　　　　　６　　　　　　　　　　　
　　　　　Ｇｌｕ　　　　　　１４　　　　　　　　　
　　　Ａｒｇ　　　　　　　　　　　　９　　　　　　
　　　　　　　　　　Ａｒｇ　　　　　　１５　　　　
　　　　　　　　Ｇｌｎ　　　　　　　　　　　　４　
　　　　　　　　　　　　　　　Ｇｌｎ　　　　　　１
６　　　　　　　　　　　　Ａｓｎ　　　　　　　　　
　　　５　　　　　　　　　　　　　　　　Ａｓｎ　　
　　　　１７　　　　　　　　　　　　　　−　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　Ｃｙｓ　　　　　　１８　　　　　　　　　　　
　Ｇｌｙ　　　　　　　　　　　　５　　　　　　　　
　　　　　　　　Ｇｌｙ　　　　　　１９　　　　　　
　　　　　　Ｐｈｅ　　　　　　　　　　　　８　　　
　　　　　　　　　　　　　Ｐｈｅ　　　　　　２０　
　　　　　　　　　　　Ｐｒｏ　　　　　　　　　　　
　８　　　　　　　　　　　　　　　　Ｐｒｏ────
─────────────────────────
──────　　【００２１】 【表２】 　　　　　　　　　　　　　　　　精製ｐＳ２蛋白質の
アミノ酸組成分析─────────────────
──────────────────　　　　　　ア
ミノ酸　　　　　　　　　　　　　　　　　　１分子当
たりのアミノ酸残基数　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　測定値　　　　　　　　ｃＤＮＡから予想され
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
る期待値─────────────────────
──────────────　　　　　　Ａｓｐ／Ａ
ｓｎ　　　　　　　　　　　　５．９　　　　　　　　
　　　　　　　　　　６　　　　Ｇｌｕ／Ｇｌｎ　　　
　　　　　　　１０　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　１０　　　　Ｓｅｒ　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　１．６　　　　　　　　　　　　　　
　　　　１　　　　Ｇｌｙ　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　４．３　　　　　　　　　　　　　　　
　　　４　　　　Ｈｉｓ　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　０．１　　　　　　　　　　　　　　　　
　　０　　　　Ａｒｇ　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　２．５　　　　　　　　　　　　　　　　　
　３　　　　Ｔｈｒ　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　５．８　　　　　　　　　　　　　　　　　　
６　　　　Ａｌａ　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　３．４　　　　　　　　　　　　　　　　　　３
　　　　Ｐｒｏ　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　７．７　　　　　　　　　　　　　　　　　　７　
　　　Ｔｙｒ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　１．０　　　　　　　　　　　　　　　　　　１　　
　　Ｖａｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
５．３　　　　　　　　　　　　　　　　　　５　　　
　Ｍｅｔ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０
．０　　　　　　　　　　　　　　　　　　０　　　　
Ｈ−Ｃｙｓ　　　　　　　　　　　　　　　　　　−　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　７　　　　Ｉ
ｌｅ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１．３
　　　　　　　　　　　　　　　　　　１　　　　Ｌｅ
ｕ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．４　
　　　　　　　　　　　　　　　　　０　　　　Ｐｈｅ
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　４．２　　
　　　　　　　　　　　　　　　　４　　　　Ｔｒｐ　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　−　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　１　　　　Ｌｙｓ
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１．１　　
　　　　　　　　　　　　　　　　１────────
─────────────────────────
──【配列表】 【００２２】 配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ）：１ 配列の長さ（ＳＥＱＵＥＮＣＥ　ＬＥＮＧＴＨ）：４３
配列の型（ＳＥＱＵＥＮＣＥ　ＴＹＰＥ）：ｎｕｃｌｅ
ｉｃ　ａｃｉｄ鎖の数（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：
ｓｉｎｇｌｅトポロジ−（ＴＯＰＯＬＯＧＹ）：ｌｉｎ
ｅａｒ配列の種類（ＭＯＬＥＣＵＬＥ　ＴＹＰＥ）：ｏ
ｔｈｅｒ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ（ｓｙｎｔｈｅｔ
ｉｃ　ＤＮＡ） 配列： ＡＧＴＧＣＡＣＴＣＧ　ＣＡＣＴＴＡＣＴＧＴ　ＴＧＣ
ＴＣＣＣＡＴＧ　ＧＣＴＴＴＣＧＣＴＧ　ＣＡＧ　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　４３ 【００２３】 配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ）：２ 配列の長さ（ＳＥＱＵＥＮＣＥ　ＬＥＮＧＴＨ）：４７
配列の型（ＳＥＱＵＥＮＣＥ　ＴＹＰＥ）：ｎｕｃｌｅ
ｉｃ　ａｃｉｄ鎖の数（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：
ｓｉｎｇｌｅトポロジ−（ＴＯＰＯＬＯＧＹ）：ｌｉｎ
ｅａｒ配列の種類（ＭＯＬＥＣＵＬＥ　ＴＹＰＥ）：ｏ
ｔｈｅｒ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ（ｓｙｎｔｈｔｉ
ｃ　ＤＮＡ） 配列： ＧＡＴＣＣＴＧＣＡＧ　ＣＧＡＡＡＧＣＣＡＴ　ＧＧＧ
ＡＧＣＡＡＣＡ　ＧＴＡＡＧＴＧＣＧＡ　ＧＴＧＣＡＣ
Ｔ　　　　　　　　　　　　　　　　４７ 【００２４】 配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ）：３ 配列の長さ（ＳＥＱＵＥＮＣＥ　ＬＥＮＧＴＨ）：８４
配列の型（ＳＥＱＵＥＮＣＥ　ＴＹＰＥ）：ａｍｉｎｏ
　ａｃｉｄ鎖の数（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：ｓｉ
ｎｇｌｅトポロジ−（ＴＯＰＯＬＯＧＹ）：ｌｉｎｅａ
ｒ配列の種類（ＭＯＬＥＣＵＬＥ　ＴＹＰＥ）：ｐｅｐ
ｔｉｄｅ起源（ＯＲＩＧＩＮＡＬ　　ＳＯＵＲＣＥ）生
物名（ＯＲＧＡＮＩＳＭ）：ｈｕｍａｎ細胞の種類（Ｃ
ＥＬＬ　ＴＹＰＥ）：ｂｒｅａｓｔ　ｃａｎｃｅｒ　ｃ
ｅｌｌセルライン（ＣＥＬＬ　ＬＩＮＥ）：ＭＣＦ−７
配列： Ｍｅｔ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｍｅｔ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｌ
ｙｓ　Ｖａｌ　Ｉｌｅ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｖａ
ｌ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　　　　　　　　　　　　
　　　　　−２０　　　　　　　　　　　　　　　　　
−１５　　　　　　　　　　　　　　　　　−１０Ｍｅ
ｔ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ
　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｇｌｎ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　
Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　　　　　　　　　　　　−５
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１　　　　　
　　　　　　　　　　５Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ａｒ
ｇ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｇｌｎ　Ａｓｎ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ
　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　
　　　１０　　　　　　　　　　　　　　　　　　１５
　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０Ｓｅｒ　Ｇ
ｌｎ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｃｙ
ｓ　Ｃｙｓ　Ｐｈｅ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ
　Ａｒｇ　Ｇｌｙ２５　　　　　　　　　　　　　　　
　　　３０　　　　　　　　　　　　　　　　　　３５
　　　　　　　　　　　　　　　　　　４０Ｖａｌ　Ｐ
ｒｏ　Ｔｒｐ　Ｃｙｓ　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　Ａｓ
ｎ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ
　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　　　　　　　　　　　　　　　　４
５　　　　　　　　　　　　　　　　　　５０　　　　
　　　　　　　　　　　　　　５５Ｇｌｕ　Ｃｙｓ　Ｇ
ｌｕ　Ｐｈｅ 　　　　　　　　６０ 【００２５】 配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ）：４ 配列の長さ（ＳＥＱＵＥＮＣＥ　ＬＥＮＧＴＨ）：２５
５配列の型（ＳＥＱＵＥＮＣＥ　ＴＹＰＥ）：ｎｕｃｌ
ｅｉｃ　ａｃｉｄ鎖の数（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）
：ｄｏｕｂｌｅトポロジ−（ＴＯＰＯＬＯＧＹ）：ｌｉ
ｎｅａｒ配列の種類（ＭＯＬＥＣＵＬＥ　ＴＹＰＥ）：
ｃＤＮＡ　ｔｏ　ｍＲＮＡ起源（ＯＲＩＧＩＮＡＬ　Ｓ
ＯＵＲＣＥ）生物名（ＯＲＧＡＮＩＳＭ）：ｈｕｍａｎ
細胞の種類（ＣＥＬＬ　ＴＹＰＥ）：ｂｒｅａｓｔ　ｃ
ａｎｃｅｒ　ｃｅｌｌセルライン（ＣＥＬＬ　ＬＩＮＥ
）：ＭＣＦ−７配列の特徴（ＦＥＡＴＵＲＥ） １．．７２　　　　　　Ｓ　ｓｉｇ　ｐｅｐｔｉｄｅ７
３．．２５２　　　　Ｓ　ｍａｔ　ｐｅｐｔｉｄｅ特徴
を決定した方法：　　Ｅ 配列： ＡＴＧ　ＧＣＣ　ＡＣＣ　ＡＴＧ　ＧＡＣ　ＡＡＣ　Ａ
ＡＧ　ＧＴＧ　ＡＴＣ　ＴＧＣ　ＧＣＣ　ＣＴＧ　ＧＴ
Ｃ　ＣＴＧ　ＧＴＧ　ＴＣＣ　　４８Ｍｅｔ　Ａｌａ　
Ｔｈｒ　Ｍｅｔ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｉ
ｌｅ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｖａ
ｌ　Ｓｅｒ　　　　　　　　　　　　　　　　−２０　
　　　　　　　　　　　　　　　　−１５　　　　　　
　　　　　　　　　　　−１０ＡＴＧ　ＣＴＧ　ＧＣＣ
　ＣＴＣ　ＧＧＣ　ＡＣＣ　ＣＴＧ　ＧＣＣ　ＧＡＧ　
ＧＣＣ　ＣＡＧ　ＡＣＡ　ＧＡＧ　ＡＣＧ　ＴＧＴ　Ａ
ＣＡ　　９６Ｍｅｔ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ
　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｇｌｎ　
Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　　　　　　
　　　　　　−５　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　１　　　　　　　　　　　　　　　５ＧＴＧ　ＧＣ
Ｃ　ＣＣＣ　ＣＴＧ　ＧＡＡ　ＡＧＡ　ＣＡＧ　ＡＡＴ
　ＴＧＴ　ＧＧＴ　ＴＴＴ　ＣＣＴ　ＧＧＴ　ＧＴＣ　
ＡＣＧ　ＣＣＣ　１４４Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ａｒ
ｇ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｇｌｎ　Ａｓｎ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ
　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　
　　　１０　　　　　　　　　　　　　　　　　　１５
　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０ＴＣＣ　Ｃ
ＡＧ　ＴＧＴ　ＧＣＡ　ＡＡＴ　ＡＡＧ　ＧＧＣ　ＴＧ
Ｃ　ＴＧＴ　ＴＴＣ　ＧＡＣ　ＧＡＣ　ＡＣＣ　ＧＴＴ
　ＣＧＴ　ＧＧＧ　１９２Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　Ｃｙｓ　Ａ
ｌａ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　Ｃｙｓ　Ｐｈ
ｅ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ
２５　　　　　　　　　　　　　　　　　　３０　　　
　　　　　　　　　　　　　　　３５　　　　　　　　
　　　　　　　　　　４０ＧＴＣ　ＣＣＣ　ＴＧＧ　Ｔ
ＧＣ　ＴＴＣ　ＴＡＴ　ＣＣＴ　ＡＡＴ　ＡＣＣ　ＡＴ
Ｃ　ＧＡＣ　ＧＴＣ　ＣＣＴ　ＣＣＡ　ＧＡＡ　ＧＡＧ
　２４０Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｔｒｐ　Ｃｙｓ　Ｐｈｅ　Ｔ
ｙｒ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ａｓｐ　Ｖａ
ｌ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　　　　　　　　
　　　　　　　　４５　　　　　　　　　　　　　　　
　　　５０　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５
５ＧＡＧ　ＴＧＴ　ＧＡＡ　ＴＴＴ　ＴＡＧ　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　２５５Ｇｌｕ　Ｃｙｓ
　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ 　　　　　　　　　　　　６０

【図面の簡単な説明】

【図１】ｐＳ２蛋白質遺伝子およびアミノ酸配列

【図２
】ｐＳ２蛋白質遺伝子の発現プラスミドの構築

【図３】
ｐＳ２蛋白質遺伝子の発現プラスミドの構築

【図４】ｐ
Ｓ２蛋白質の高速液体クロマトグラフィーにおける溶出
図

【図５】ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動図（
ＣＢＢ染色）

【符号の説明】

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】バチルス・ブレビス由来のプロモーター領
   域を含有するＤＮＡの３’末端にｐＳ２蛋白質をコード
   するＤＮＡを結合させたＤＮＡ。
2. 【請求項２】プロモーター領域を含有するＤＮＡの３’
   末端にｐＳ２蛋白質をコードするＤＮＡを結合させたＤ
   ＮＡを保持するバチルス・ブレビス。
3. 【請求項３】請求項２記載のバチルス・ブレビスを培地
   に培養し、培養物中にｐＳ２蛋白質を生成、蓄積せしめ
   、これを採取することを特徴とするｐＳ２蛋白質の製造
   法。