FI104498B - Biosynteettinen menetelmä kemiallisten yhdisteiden valmistamiseksi - Google Patents

Biosynteettinen menetelmä kemiallisten yhdisteiden valmistamiseksi Download PDF

Info

Publication number
FI104498B
FI104498B FI924909A FI924909A FI104498B FI 104498 B FI104498 B FI 104498B FI 924909 A FI924909 A FI 924909A FI 924909 A FI924909 A FI 924909A FI 104498 B FI104498 B FI 104498B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
protein
dna
host
sequence
epib
Prior art date
Application number
FI924909A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI924909A0 (fi
FI924909A (fi
Inventor
Guenther Jung
Roland Kellner
Friedrich Goetz
Karl-Dieter Entian
Norbert Schnell
Johannes Augustin
Germar Engelke
Cortina Kaletta
Cora Klein
Bernd Wieland
Thomas Kupke
Ralfy Rosenstein
Original Assignee
Thomae Gmbh Dr K
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Thomae Gmbh Dr K filed Critical Thomae Gmbh Dr K
Publication of FI924909A0 publication Critical patent/FI924909A0/fi
Publication of FI924909A publication Critical patent/FI924909A/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI104498B publication Critical patent/FI104498B/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
    • C07K1/113—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/305—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F)
    • C07K14/31—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F) from Staphylococcus (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/55—Fusion polypeptide containing a fusion with a toxin, e.g. diphteria toxin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/90—Fusion polypeptide containing a motif for post-translational modification
    • C07K2319/92—Fusion polypeptide containing a motif for post-translational modification containing an intein ("protein splicing")domain

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Cephalosporin Compounds (AREA)
  • Polymers With Sulfur, Phosphorus Or Metals In The Main Chain (AREA)
  • Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Epoxy Compounds (AREA)

Description

104498
Biosynteettinen menetelmä kemiallisten yhdisteiden valmistamiseksi Tämä patenttihakemus on jatkohakemus US-patenttihakemukselle 07/353590, 5 jonka sisältö liitetään tähän kokonaisuudessaan viitteeksi.
Tämä keksintö koskee kemiallisten yhdisteiden biosynteesiä, ja erityisesti dehydroaminohappotähteitä ja/tai tioeetterisiltoja sisältävien kemiallisten yhdisteiden biosynteesiä. Keksintö koskee myös yhdistelmä-DNA-geeniteknologian 10 käyttöä valmistettaessa entsyymejä, jotka liittyvät tällaisten kemiallisten yhdisteiden biosynteesiin.
Jotkin polypeptidivasta-aineet kuten nisiini, subtiilini, duramysiini, kinnamysiini, ankoveriini, Ro 09-0198 ja epidermiini sisältävät dehydroaminohappoja ja 15 lantioniinisiltoja. Näitä polypeptidejä tuottavat erilaiset vastaavat mikro-orga- nismikannat. Nisiini esimerkiksi voidaan tuottaa viljelemällä Streptococcus lactin-kantoja, ja subtiilini Bacillus subtilis'ta viljelemällä.
Geneettistä taustaa näiden antibioottien biosynteesiä varten ei ole, tähän men-20 nessä, selvitetty. Siten ei ole esimerkiksi tiedetty, tapahtuuko tällaisten antibi-: oottien, ja erityisesti niissä esiintyvien epätavallisten aminohappojen muodos- : tuminen ribosomaalisen synteesin kautta vai monientsyymikompleksien kautta.
• * · • · · • · ·
Lisäksi ei tiedetty koodittivatko tällaisten antibioottien prekursoriproteiineja • ♦ 25 erilliset rakennegeenit tai olivatko ne suurempien proteiinien hajoamistuotteita.
»·* • · · ♦ · ·
Epidermin rakennegeenin selvittämiseksi suoritetun työn aikana olemme voi- • · · : neet selvittää, että edellä kuvattuja antibiootteja, erityisesti epidermiiniä, koo- • · · : dittaa kutakin erillinen rakennegeeni, ja että presekvenssipolypeptidin käsitte- 30 lyn suorittaa entsymaattinen kompleksi, joka aikaansaa dehydroaminotähtei- : ’ · i den ja/tai tioeetterisiltojen muodostumisen.
« « · • I 4 104498 2
Lisäksi monientsyymikompleksi voi olla osallisena proteiinin erityksessä solu-membraanin läpi kasvatussupernatanttiin, samoin kuin prepolypeptidin käsittelyssä. Tässä yhteydessä, tällainen aktiivisuus voi liittyä prepolypeptidin omaamaan presekvenssiin, esimerkiksi kuten alla kuvatun pre-epidermiinin -30 - -1-5 sekvenssin tapauksessa.
Kuviossa 1 kuvataan epidermiinin rakenne geenin (epi A) nukleotidisekvenssi ja pre-epiderimmin johdettu aminohapposekvenssi. Shine-Dalgamo-sekvenssi on laatikoitu, ja proteoklyyttinen katkaisukohta, jossa propeptidi käsitellään, 10 ilmaistaan nuolella. Invertoidut toistot on alleviivattu, ja mahdolliset lopetus-kodonit on merkitty "am" (amber) ja "oc" (ochre).
Kuviossa 2A kuvataan kaavio pre-epidermiinistä käyttämällä Hyron-ohjelmaa, jossa vastaavissa pylväsdiagrammeissa esitetään: (a) joustavuus; (b) hydropa-15 tia; (c) hydrofiilisyys; (d) taipumukset käännöksiin; (e) β-arkki-; ja (f) a-heliks-konformaatioon.
Kuviossa 2B kuvataan pre-epidermiinin heliks-pyöräkuvio (helix wheel plot), joka osoittaa, että N-terminaalinen pää voi sopivassa ympäristössä osittain 20 omaksua amfofiilisen α-helikaalisen konformaation.
Kuviossa 3 esitetään oletettu naturoitumisproseduuri epidermiinille. Transla- toitu polypeptidi (pre-epidermiini) koostuu 52 aminohappotähteestä. Rakenne- ··· ennusteet ilmaisevat osaksi α-helikaalisen N-terminaalisen pään, josta tähteet « »·· 25 -30 - -10 voivat muodostaa amfifiilisen a-heliks-konformaation. Veden poista- • · minen tapahtuu ilmaistujen Ser- ka Thr-tähteiden kohdalla (a). Lukuunottamatta Thr+14:ää seuraa veden poistamista sulfidirenkaan muodostus (b), ja C-’ terminaalisessa päässä dekarboksylointi ja kaksoissidoksen muodostus (d) • · · v : pro-epidermiinin tuottamiseksi. Sitten pro-epidermiinirakennetta käsitellään ·.; 30 proteolyyttisellä katkaisulla epidermiinin tuottamiseksi.
• ·« 104498 3
Kuviossa 4 esitetään epidermiinin rakenne. Rengasrakenteita merkitään A, B, C, D ja E. Esitetään aminohappojen mesolantioni ja threo-metyllantioni rakenteet.
5 Kuvio 5 esitetään esimerkkejä epätavallisista aminohapoista, jotka esiintyvät lantioniantibiooteissa ja jotka voidaan muodostaa peptidituotteissa keksinnön mukaista menetelmää käyttämällä.
Kuvio 6 on kaavamainen esitys menetelmästä pCUI-plasmidin muodostamisek-10 si pCLP100-plasmidista ja pUC18-plasmidista.
Kuvio 7 kuvaa esimerkissä 2 valmistetun eristetyn kasvatusväliaineen eluointi-mallia.
15 Kuvio 7B kuvaa gallidermiiniä sisältävän standardin eluointimallia. Gallidermii-ni eluoituu kohdalla 7,54 min.
Kuvio 8 on geneettinen analyysi S. epidemnis'in plasmidin ρΤϋ32 episomi pTu32:n geneettinen analyysi, jossa esitetään: 20 8A: episomin pTu32 restriktiokartta, ja 8B: ρΤϋ32:η 13,5-ke Bglll-fragmentin restriktiokartta.
.···; Umpinainen nuoli vastaa epiA-rakennegeeniä. Avoimet nuolet edustavat lukualueita epiB, C, D, P ja Q.
··· 8C: Eri restriktioentsyymeillä (EcoRI, EcoRV, Bgllll, Sphl) sulatetun pTu32:n ···· 25 "Southern'-hybridisointi käyttämällä 15-meerioligonukleotidiä • · :T: (5OACATCCAGGAGTAC-3'), joka on tunnusmerkillinen epiA:lle.
:T: Kuviossa 9 on pTu32:n Bglll/Hpall-fragmentin nukleotidisekvenssi sisältäen :1! ! lukualueet epiA, B, C, D, P, Q, Y' ja Y", ja vastaaville proteiineille johdetut « 30 aminohapposekvenssit. S/D-sekvenssit ja terminaatiorakenteet esitetään pääl-.;··· lä olevin viivoin. IR ilmaisee invertoidut toistot. epiA:n, epiB:n, epiC.n, epiD.n epiQ:n ja epiP:n avointen lukualueiden alku ilmaistaan lihavilla kirjaimilla. N- • · · » 104498 4 terminaaliset aminohappotähteet (mahdolliset translatooriset alkukohdat) on laatikoitu.
Kuviossa 10 esitetään tulokset S. epidermis'sä tapahtuvan epiA(10A)-ja epiB-5 (19B)-ekspression "Northern blot"-analyysistä, jossa kokonais-RNA (40 pg, linjat 1, 3 ja 5, tai 20 pg, linjat 2, 4 ja 6) erotettiin 1,2-% agaroosigeeleillä, ja hybridisoinnit suoritettiin "antisense"-RNA-koettimella (SP6 transkriptio. Suodattimet pestiin kasvavalla ankaruudella: linjat 1, 2: 1 x SSC, 0,1 % SDS, altis-tusaika (exposition time) 16 tuntia; linjat 5, 6: 1 x SSC, 0,1 % SDS, altistusaika 10 3 päivää) 235- ja 165-RNA'iden asemia käytettiin kokostandardeina.
Kuvassa 11 esitetään sekvenssihomologiat EpiP:n ja erilaisten seriiniproteaa-sien välillä aktiivisissa kohdissa (SUBSI, B. subtilis'in subtilisiini 1168-prekur-sori (Terzaghi et ai., Appi Microbiol. 29 (1975) 807-813; tärkeä solunsisäinen 15 seriiniproteaasi B. subtiileista (Maniatis et ai., Molecular Cloning. A Laboratory Manual; 2. painos Cold Spring Harbour Laboratory Press (1990); SUMYTV, termitaasi Thermoactinomyces vulgaris'ista (Stahl et ai., J. Bacteriol 158 (1984) 411-418). Voimakkaasti säilyneet asparagiini(asp)-, histidiini(his)-ja seriini(ser)tähteet merkitään tähdellä. Samanlaiset aminohappotähteet ilmais-20 taan pisteillä, ja identtiset aminohappotähteet kaksoispisteillä.
a · · .··. Kuviossa 12 esitetään epiQ:n ja PhoB:n (Makino et ai., J. Mol. Biol. 190 (1986) • < · 37-44) välinen sekvenssihomologia. Samanlaiset aminohappotähteet ilmais-taan pisteillä ja identtiset aminohappotähteet kaksoispisteillä.
···· 25 • ·· • ·
Kuvio 13 on S. carnosus TM300:ssa tuotetun epidermiinin HPLC-eluointiprofii- li.
··♦ • · · • · ♦ :T: 13A: Epidermiinistandardiaineen (6,75 min, ilmaistu nuolella) eluointiprofiili.
/. ·. 30 • · · ....: 13B: S. carnosus TM300 pTepi14:n viljelmäsuodoksista eristetyn epidermiinis tandardiaineen (6,75 min, ilmaistu nuolella) eluointiprofiili. Viljelmäsuodokset • · · 1 ♦ · • · 104498 5 adsorboitiin XAD 1180:een, eluoitiin metanolilla, ja konsentroitiin lopuksi haihduttamalla.
13C: Eluointiprofiili transformoimattoman S. camosus TM300:n viljelmäsuodok-5 sesta, joka oli käsitelty kuten kohdassa 13B. Kiinteä linja ilmaisee epidermiinin eluointialueen.
Kuviossa 14 esitetään pT181mcs:n konstruointi. pUC19:n Pvu ll^/Pvull631-fragmentti, osa lacZ:sta ja multippelikloonauskohta (mcs) insertoitiin ainoaan 10 Ndel-kohtaan pT181:n pre:n sisälle (Gennaro et ai., J. Bacteriol. 169 (1987) 2601-2610; Kahn et ai., Plasmid 10 (1983) 251-259) tylppäpäisellä liittämisellä. IacZ on vastakkaisessa orientaatiossa pre:hen verrattuna. Musta palkki, keskeytetty pre; avoin palkki, insertoitu pUC19-fragmentti.
15 Kuviossa 15 esitetään pCU1 :n konstruointi. pCLP100 on pC194:n johdannai nen (Horinouchi et ai., J. Bacteriol. 150 (1982) 815-825), joka sisältää yhden ainoan Pst1-kohdan, joka luotiin avaamalla pC194 Hindlll-kohdassa, poistamalla päät Ba131 :llä (noin 950 emäsparia) ja insertoimalla Pstl-linkkerin tylp-päpääliittämisellä. Sitten pCU1 muodostettiin tylppäpääliittämällä pCPL100:n 20 ja pUC19:n (vieira et ai., Gene 19 (1982) 259-268) ainoiden Pstl-ja Ndel-koh-tien kautta, vastaavasti. Multippelikloonauskohtaa (mcs) lacZ:n edessä käy-.· · ·. tettiin erilaisten epi-geenin sisältävien fragmenttien kloonaamiseen. Tämä sukkulavektori replikoituu sekä stafylokokeissa että E. colissa.
·· · IM» 25 Kuviossa 16 esitetään: • 1 M· • · · • · · A) pTepi14:n muodostaminen kloonaamalla pTu32:n 14-ke Bglll-fragmentin pT181 mcs:ään. Tämä fragmentti, joka sisältää koko geeni-informaation, joka :T: on välttämätön epidermiinintuotantoon S. carnosus'issa. Ilmaistut ORF't ja : 30 niiden transkriptiosuunnat (ilmaisu nuolilla) johdetaan DNA-sekvenssistä. epiA, • · · % · rakennegeeni, ilmaistaan mustalla nuolella.
«« 1 « « · • · « · • · · • I · * » 104498 6 B) erilaisia pTepi14-DNA-fragmentteja alikloonattuina pT181mcs:ään (pT...) tai pCU1:een (pCU...). Vastaavia plasmideja käytettiin S. epidermis Ερϊ-mutant-tien täydentämiseen. Ilmaistaan plasmidissa läsnä olevat täydelliset ORF't.
5 Kuviossa 17 esitetään pPS4epiA:n ja pPSepiB:n konstruointi. pPS4 on pLipPSV.n johdannainen (Liebl et ai., Mol. Gen. Genet. 204 (1986) 166-173). Yksi ainoa BamHI-kohta insertoitiin voimakkaan stafylokokkipromoottorin jälkeen. Geenien kloonaus BamHI-kohtaan ORF2-promoottorin kontrollin alle johtaa normaalisti hyvään ekspressioon stafylokokeissa. epiA PCR-monistet-10 tiin, ja se sisälsi reunustavat BamHI-kohdat. 3,2-ke BstNI-fragmentti, joka sisälsi epiB:n, insertoitiin BamHI-kohtaan tylppäpääliitoksella. Vastaavat EMS-mutantit täydennettiin vain kun epiA ja epiB olivat PRF2-promoottorin kontrollin alaisia, lip, likaasigeeni; cat, klooriamfenikoliasetyylitransferaasigeeni; ORF2, S. carnosus-spesifinen katkaistu ORF.
15
Kuviossa 18 esitetään epidermiinin tuotannon täydentäminen S. carnosus'issa (pTepiABCDQ) reunustavilla DNA-fragmenteilla. Fragmentit alikloonattiin yhteensopivaan plasmidiin pCA44.
20 Lyhyesti, tämä keksintö aikaansaa eräässä näkökannassa bakteeri-isännän, joka sisältää plasmidin, jolloin mainittu plasmidi koodittaa polypeptidiä, jota • t t mainittu isäntä ei normaalisti tuota, ja jolloin mainittu isäntä antaa kasvatuksen • · .lii. aikana käyttöön monientsyymikompleksin, jolloin muodostuu polypeptidiä, joka • · · sisältää ainakin yhden dehydroaminohapon ja/tai ainakin yhden lantioniinisil-25 lan, jolloin mainittu polypeptidi on mainitulle isännälle vieras.
• · · • · • # · • t « • · ·
Eräs sopiva monientsyymikompleksi on sellainen, joka voi aikaansaada aina-kin yhden operaatioista, ts. vedenpoistamisen ja rikkisillan muodostuksen; kompleksi voi myös aikaansaada dekarboksyloinnin ja kaksoissidoksen muo-30 dostuksen.
Sopivia isäntiä keksinnön mukaisen menetelmän suorittamiseksi ovat sellaiset, jotka voivat ilman niiden geenimateriaalin modifiointia tuottaa polypeptidejä,
I 1 I
7 104498 jotka sisältävät dehydroaminohappotähteen ja/tai lantioniinisillan ja/tai metyyli-lantioniinisillan. Esimerkkejä tällaisista isännistä ovat Streptococcus lactis, Bacillus subtilis, Streptomyces cinnamoneus, Streptomyces sp. Streptoverticul-lum griseoverticillum, Staphylococcus epidermis, Staphylococcus epidermin 5 kanta 5, Staphylococcus gallinarum ja näiden mutanttikannat, esimerkiksi S. epidermin DSM 3095:n mutanttikanta, joka ei kykene tuottamaan epidermiiniä.
Kantoja, jotka ovat erityisen kiinnostavia, ovat Staphylococcus gallinarum (F16/P57) Τϋ 3928, joka on talletettu 18. toukokuuta 1988 Budapestin sopimuk-10 sen mukaisesti kansainväliseen talletuslaitokseen Deutsche Sammlung von Microorganismen tulonumerolla Tu 3928 DSM 4616:ssa, ja Staphylococcus epidermis DSM 3095, jonka tämän keksinnön hakijat tallettivat 26. lokakuuta 1984 Budapestin sopimuksen mukaisesti kansainväliseen talletuslaitokseen Deutsche Sammlung von Microorganismen.
15
Sopivan isännän transformoimiseksi sopiva plasmidi voidaan modifioida tunnetuilla yhdistelmä-DNA-tekniikoilla.
Halutusti plasmidi isännästä, joka tuottaa polypeptidiä, joka sisältää ainakin 20 yhden dehydroaminohappotähteen ja/tai ainakin yhden sulfidisillan, käsitellään ..... modifioimalla tai korvaamalla pre-polypeptidiä koodittava geeni aikaansaa- maan plasmidin, joka koodittaa mainitulle isännälle vierasta polypeptidiä, ja • · .···. transformoimalla mainitun isännän sitten muutetulla plasmidilla.
• « · • · « « ♦ · · « .·. : 25 Pre-polypeptidiä koodittavan geenin korvaamiseen tai modifioimiseen voidaan • · · • · käyttää mitä hyvänsä joukosta erilaisia menetelmiä.
Toivotun yhdisteen pre-polypeptidisekvenssiä koodittava DNA voidaan valmis-taa kemiallisella synteesillä. Sopivia kemiallisia synteesejä on kuvattu julkai-./ . 30 sussa Anal. Biochem. 121 (1982) 365. Tunnetut tekniikat sallivat polynikleotidi- .'..: en valmistuksen, esimerkiksi jopa 60-100 emäksen valmistamisen.
8 104498
Sopivia suojattuja nukleotideja voidaan liittää fosfotriesterimenetelmällä, jonka on kuvannut Agarwal et ai., (Angew. Chem. 84 (1972) 489), fosfotriesterimenetelmällä (Reesem., Tetrahedron 39 (1983) 3) tai fosfiittitriesterimenetelmällä (Letsinger et ai., J. Am. Chem. Soc. 98 (1976) 3655) tai fosforiamidiittimenetel-5 mällä. Kiintofaasimenetelmä sallii polynukleotidien synteesin yksinkertaistamisen.
Kaksisäikeinen DNA voidaan muodostaa entsymaattisesti kemiallisesti valmistetuista lyhyistä mutta limittäisistä segmenteistä.
10
Voidaan esimerkiksi käyttää limittäisiä polynukleotidisekvenssejä molemmista DNA-säikeistä, joita pidetään yhdessä oikeassa konformaatiossa emäs-parinmuodostuksella, ja liitetään sitten kemiallisesti entsyymi DNA-ligaasilla (Khorana et ai., J. Biol. Chem. 251 (1976) 565).
15
Toinen mahdollisuus käsittää kussakin tapauksessa kahdesta DNA-säikeestä olevan yhden nukleotidisekvenssin inkuboinnin lyhyen limittäisen segmentin kanssa neljän vaaditun deoksinukleosiditrifosfaatin läsnä ollessa DNA-polyme- raasin, esimerkiksi DNA-polymeraasi l:n, polymeraasi l:n Klenow-fragmentin tai 20 T4 DNA-polymeraasin kanssa, tai käänteistranskriptaasin kanssa. Kahta poly- nukleotidisekvenssiä pidetään siten yhdessä oikeassa järjestyksessä emäspa- .\. rinmuodostuksella, ja entsyymi täydentää ne vaadituilla nukleotideilla anta- maan täydellisen kaksisäikeisen DNA.n (Narany et ai., Anal. Biochem. 121 V (1982)365).
• · · · • · 25 • 1 · • «·
Toinen sopiva menetelmä polypeptidiä koodittavan DNA:n saamiseksi käsittää • · » DNA:n eristämisen kudoksen tai soluviljelmän tai mikro-organismin genomi-DNA:sta, solujen liuottamisen esimerkiksi SDS:llä tai proteinaasi K:lla, tai haluttaessa mekaanisesti, DNA:n proteiininpoistokäsittelyllä uuttamalla toistu-.1 . 30 via kertoja fenolilla.
RNA voidaan edullisesti sulattaa RNAasilla. Saatu raaka DNA sulatetaan *·1 ' osaksi sopivilla restriktioentsyymeillä, esimerkiksi Haelllilla ja Alul:llä, ja frag- 104498 9 mentit eristetään ja monistetaan sopivassa faagissa tai kosmidissa, esimerkiksi karon 4A- tai EMBL-3-faagissa ja määritetään halutut sekvenssit esimerkiksi radioaktiivisesti leimatulla DNA-koettimella.
5 Haluttua polypeptidiä koodittava DNA voidaan saada myös eristetyn mRNA:n käänteistranskriptiolla cDNA:ksi. Tämä voi olla edullinen menetelmä jos DNA-rakenne ei ole tunnettu. Tässä menetelmässä DNA saadaan cDNA-kirjastossa olevasta genomi-DNA:sta mRNA:n kautta. cDNA-kirjasto käsittää geneettistä informaatiota, joka on komplementaarista soluista eristetylle mRNA:lle.
10 cDNA-kirjaston saamiseksi mRNA eristetään soluista, jotka ekspressoivat haluttua perus(-, mahdollisesti modifioimatonta )proteiinia. Tämä mRNA muutetaan kaksisäikeiseksi cDNA:ksi.
15 mRNA:n valmistuksessa käytetään tekniikan alalla tunnettuja vakiomenetelmiä. Solumembraani rikotaan, ja vapautuu solun sisältö, joska mRNA eristetään. Solumembraani rikotaan edullisesti fysikaalisilla menetelmillä tai liuottamalla detergenteillä kuten SDS, guanidiinitiosyanaatti, määrätyillä suolaolosuhteilla tai homogenisoimalla, edullisesti sekoittamalla. mRNA eristetään fenoliuutto-20 etanolisaostus-, sentrifugointi- ja kromatografiavakiomenetelmillä, edullisesti ... usean menetelmän yhdistelmällä. Sentrifugointi suoritetaan edullisesti gradien- a « !.. teillä, esimerkiksi CsCI-gradientilla. Kromatografiaan käytetään edullisesti .IJI. kolonneja, erityisesti oligo-dT-kolonneja.
• · · • · · !·!*: 25 Kokonais-mRNA voidaan muuttaa suoraan Ds-cDNA:ksi tekniikan tason mene- « »o telmien mukaisesti. Edullisesti toivottua polypeptidiä koodittava mRNA rikastetaan edelleen käyttämällä erilaisia tekniikkoja kuten elektroforeesia, kromato-grafiaa ja sentrifugointia, edullisesti sakkaroosigradienttisentrifugointia.
• · · • · · • · · 30 Jakeet, jotka sisältävät mRNA:ta, joka koodittaa haluttua polypeptidiä, voidaan l havaita erilaisilla menetelmillä kuten in vivo- tai in vitro-translaatioilla, minkä »· · · * « « jälkeen seuraa asiaankuuluvan aktiivisuuden havaitseminen, tai kun nukleotidi- « « « Y ] sekvenssi on tunnettu, hybridisoimalla oligonukleotidikoettimella.
• · · • · · * · 10 104498
In vivo-translaatiojärjestelmät voivat olla prokarioottisaia tai eukarioottisia järjestelmiä. Edullinen in vivo-translaatiojärjestelmä on Xenopus laevis-varhais-munasolujärjestelmä (katso käsikirjaa Maniatis et ai., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982)). In vitro-järjestelmiä 5 ovat esimerkiksi vehnänalkio- ja kanin retikulosyyttilysaatit, jotka molemmat ovat kaupallisesti saatavia.
Mistä hyvänsä mRNA-poolista, joka on peräisin fraktioimattomasta tai fraktioidusta mRNA:sta, voidaan saada ds-cDNA:ta tekniikan tasolla hyvin tunnetuilla 10 tavoilla (edullisia yleisiä menetelmiä kuvataan julkaisuissa: Maniatis et ai.
(yllä); Okayamja Berg, Molecular and Cell Biology 2 (1982) 161-170; ja Heidecker, Nucleic Acid Research 11 (1983) 4891-4906). Yleensä mRNA muutetaan ensin ss-cDNA:ksi käyttämällä käänteistranskriptaasia tai DNA-polymeraasi l:tä (Klenow-fragmentti). ds-cDNA:n synteesin alustukseen 15 käytetään vaihtoehtoisesti kahta menetelmää. Ensimmäinen menetelmä on ss-cDNA;n luonnollinen silmukanmuodostus. Toinen menetelmä on hännän muodostaminen ss-cDNA:han homopolymeerisellä hännällä kuten poly-dC:llä tai polyDT.IIä.
20 mRNA-fraktio, jonka vastaavalla polypeptidillä on suurin aktiivisuus havaitse-misjärjestelmässä, käännetään tekniikan tasolla hyvin tunnetuilla menetelmillä komplementaariseksi cDNA.ksi. mRNA ja oligo-dT alukkeena sekoitetaan, * · sitten lisätään dNTP't lähtöainemateriaaliksi, ja cDNA-nRNA-hybridimolekyylin » · · *>;# synteesi toteutetaan käänteistranskriptaasi-entsyymillä. RNA-molekyylit hajote- *·": 25 taan lisäämällä NaOH:ta. DNA-polymeraasi lisätään sekaan, edullisesti DNA- • · · .·:*! polymeraasi l:n Klenow-fragmentti, ja seosta inkuboidaan sopivassa lämpöti- • · ♦ lassa, edullisesti 12 - 15°C:ssa. Seosta inkuboidaan nukleaasi S1:n kanssa ja saadaan ds-cDNA, joka vastaa mRNA:ta, joka koodittaa haluttua polypeptidiä.
• · · * m · · . 30 Saatu ds-cDNA voidaan liittää monistusta varten sopivaan vektoriin, esimerkik- ’ si plasmidiin pUC-KO, ja saatu hybridivektori monistetaan käyttämällä sopivaa isäntää, esimerkiksi E. coli HB101:tä. Hybridivektorien uudelleen eristäminen, • · « • * # • · · • · „ 104498 ja eristetyn cDNA:n ottaminen talteen niistä sallii haluttua polypeptidiä koodatavan DNA:n määrittämisen .
Hvbridivektorin valmistaminen 5
Keksinnön mukainen hybridivektori voidaan valmistaa liittämällä halutun sekvenssin omaavaa polypeptidiä koodittavaa DNA:ta sopivaan vektoriin.
Sopivia vektoreita ovat kantajat integroitua "matkustaja"-DNA:ta (passanger 10 DNA) varten, joita voidaan käyttää isäntämikro-organismin transformointiin.
Sopivia vektoreina ovat plasmidit, jotka on johdettu mikro-organismeista, jotka transformoimattomassa tilassa tuottavat polypeptidejä, jotka sisältävät dehyd-roamino- ja/tai sulfidiryhmiä. Sopivat vektorit sisältävät insertoidun DNA.n 15 määritellyssä asemassa.
Yleensä tällaiset vektorit voivat sisältää replikonin ja kontrollisekvenssin, ts.
promoottorin, jotka ovat peräisin isäntäsolusta tai lajista, joka on yhteensopiva isäntäsolun kanssa jossa niitä käytetään. Tavallisesti vektori sisältää replikoni- 20 kohdan ja voi sisältää sekvenssejä (merkkigeenejä), jotka voivat antamaan ... käyttöön fenotyyppivalinnan transformoiduissa soluissa. Sopivat merkkigeenit voivat aikaansaada antibioottiresistenssin tai resistenssin raskasmetalleja koh- .·». taan, tai ne voivat täydentää isännän geneettisen puutteen. Edelleen käyttö- • · · kelpoisia tällaisissa vektoreissa ovat edistäjä- ja aktivaattorisekvenssit.
• · · · .·. : 25 • ·«
Eräs sopiva lähtövektori on 54 kiloemäsparin plasmidi pEpi32 kannasta Staphylococcus epidermis DSM 3095, joka on identtinen plasmidin pTu32 kanssa. Tämä plasmidi, jota luonnehditaan alla, sisältää epiA-geenin, joka koodittaa 52-prepeptidiä, joka käsitellään nelirenkaiseksi 21 peptidin amidi-/ . 30 antibiootiksi. Vektoria, joka sisältää matkustaja-DNA:ta, merkitään hybridivek- toriksi.
‘ Haluttu DNA liitetään lähtövektoriin tavanomaisilla tavoilla.
104498 12 Lähtövektori voidaan esimerkiksi ensin linearisoida sopivilla restriktioentsyy-meillä, esimerkiksi plasmidi pEpi32 Hindlllilla, BamHI:llä ja EcoRUIä, sitten muodostaa d/G-häntä dGTP:n ja terminaalisen deoksinukleotidyylitransferaa-sin läsnä ollessa. Kaksisäikeiseen cDNA-insertioon muodostetaan dC-häntä 5 dCTP:n ja terminaalisen deoksinukleotidyylitransferaasin läsnä ollessa. Sekä cDNA.n että vektorin yhdistäminen antaa tulokseksi hybridivektorin. Bakteriofagit, kuten lamda, ovat edullisia geenikartastojen muodostamiseen. Maniatis (yllä) kuvaa lamda-kloonausjärjestelmät. Sopiva vektori-DNA sulatetaan sopivalla restriktioentsyymillä täysin, ja vasemmat ja oikeat päät (left and right 10 arms) erotetaan keskellä olevista fragmenteista nopeusgradienttisentrifugoin-nilla tai geelielektroforeesilla. Toinen menetelmä on sulattaa osia täytefrag-menteista restriktioentsyymeillä, joista puuttuvat tunnistuskohdat vasemmasta ja oikeasta päästä. Eristetty genomi-DNA voidaan sulattaa osittain fragmenteiksi, joiden pituus on 13 - 20 ke. Jälkeenpäin päät liitetään vieraan DNA:n 15 fragmenteilla, joissa on päädyt, jotka ovat yhteensopivat päiden fragmenttien kanssa.
Sopiva DNA-insertio kloonataan uudelleen alkuperäiseen kloonaukseen käytetystä alkuperäisestä vektorista sopivaan ekspressiovektoriin. Tähän tarkoituk-20 seen käytetään haluttujen DNA-fragmenttien tuottamiseksi sopivia restriktioent-syymejä, mahdollisesti yhdistelmänä oksonukleonien kanssa.
« « · • 1 · V/.' DNA-insertio voidaan alikloonata miltippelikohtaan sopivassa hyvin tunnetussa • · · plasmidivektorissa, esimerkiksi pC194:n, pTI81:n ja pUB110:n johdannaisissa [·]": 25 restriktiokohtiin Hindlll/BamHI/EcoRI.
• ♦ · • · ·«· • · « ♦ ♦ ·
Siten keksinnön mukaista menetelmää voidaan käyttää valmistettaessa tunnet-tujen peptidien ja hormonien johdannaisia, joissa modifioimattoman peptidin kysteiinitähde korvataan sulfidisilloitetuilla aminohapoilla, ja seriini ja tiamiini 30 korvataan vastaavilla dehydroaminohappotähteillä.
• · Nämä fragmentit integroidaan sopivaan ekspressiovektoriin käyttämällä koos- *;' ] sapysyviä päitä suoraan tai lisäämällä sopivia kemiallisesti syntetisoituja oligo- « · · 104498 13 mukleotidisiltoja. Päiden modifioimiseksi voidaan käyttää esimerkiksi Hindlll:a ja Bglll:ta. Tämä menetelmä ei ole rajoittunut mihinkään erityisiin restriktioent-syymeihin. Ekspressiovektorin ja DNA-insertion väliin voidaan tehdä mikä hyvänsä yhdysside käyttämällä sopivia restriktioentsyymejä yhdistelmänä 5 kemiallisesti syntetisoitujen oligonukleotidien kanssa.
Voidaan saada sopivia DNA-insertioita, jotka koodittavat polypeptidiä, jossa on paikkasuunnattua mutageneesiä.
10 Voidaan käyttää joukkoa erilaisia menetelmiä lisäämään perustana olevaan DNA:han mutaatioita haluttujen mutanttien valmistamiseksi.
Eräs menetelmä voi käsittää mutatoitavaa aluetta koodittavat sekvenssit sisältävän natiivin tai perusgeenin fragmentin insertoimisen faagin replikoituvaan 15 muotoon, esimerkiksi faagi MI3mp8:aan MI3mp8PA:n muodostamiseksi. Synteettinen oligonukleotidi, joka on komplementaarinen insertoiduille sekvensseille mutta sisältää yhden tai useita nukleotiditriplettejä, jotka koodittavat substituoitavaa aminohappoa, emäspariutetaan sitten MI3mp8A:n yksisäikei-seen muotoon kaksisäikeisen alueen muodostamiseksi. Tämä alue toimii 20 alukkeena lopun komplementaarisuussäikeen DNA-polymeraasi l-synteesille. Replikoinnin ja tunnistuksen jälkeen mutanttisekvenssi voidaan modifioida edelleen tai käyttää sopivan vektorin konstruoimiseen mutatoidun polypeptidin IV.' ekspressoimiseksi.
• · · ··· 25 Epidermiinillä suoritetussa työssä valmistettiin "wobbled"-DNA-koetin 5'- • · o GTG(A)CAT(G/A)ATG(A)AAT(C)TT-3\ joka johdettiin peidermiini LysPhelle- • ♦ ♦
CylTrh ehdotetun presekvenssin sopivasta pentapeptidisegmentistä. Tämä DNA-koetin hybridisoitiin S. epidermin DSM 3095:stä olevaa plasmidi-DNA.ta vastaan.
« · · / . 30 • · ·
Eristetyn plasmidin restriktioanalyysi paljastaa EcoRIMIä seitsemän DNA-frag- • · ; menttia(16, 11, 10, 6,5, 5,5, 3,5 ja 2,5 kiloemäsparia), Hindlll:lla yhdeksän • · · • · · 1 · · • · · • · 104498 14 DNA-fragmenttia (17, 14, 10, 5,3, 2,8, 1,8, 0,6 ja 0,5 kiloemäsparia) ja BamHl.llä viisi DNA-fragmenttia (20, 19, 10, 3 ja 1 kiloemäsparia).
Alikloonattiin 5,4 kiloemäsparin Hindlll-fragmentti ja alistettiin uudelleenhybri-5 disoinnille, jolloin rakennegeeli epiA paikannettiin 2,2 kiloemäsparin EcoRI/Bglll-fragmentin sisällä.
Hybridisointikoettimena käytettiin 24 eri 14-meerin seosta. Koetinta lisättiin 30-kertainen ylimäärä sekvensointialukkeena tekniikan mukaisesti, joka kuva-10 taan julkaisuissa: Novick et ai., Ann N.Y. Acad. Sei. 182(1971)279-294; Southern, J. Molec. Biol. 98 (1975) ja Heinrich et ai., Molec. gen. Genet. 209 (1987) 563-569. Epidermiinin peptidisekvenssi salli avoimen lukualueen tunnistuksen. Yksi ainoa metioniinikodoni on sopivalla etäisyydellä Shine-Dalgaro-sekvenssistä. Pre-epidermiinin rakennegeeni loppuu TAA-lopetuskodoniin, 15 siten pre-epidermiini koostuu 52 aminohaposta (kuvio 1) ja käsitellään epider-miiniksi välillä Arg'1 ja lle+1. Siten, kuten selvästi voidaan nähdä, ei pre-epidermiini ole suuremman proteiinin hajoamistuote, vaan sitä koodittaa erillinen rakennegeeni.
20 Siten on ilmeistä, että antibioottien prekursoriproteiinia koodittavat odottamattomasi! erilliset rakennegeenit.
• · ·
Sekundäärisen rakenteen (a, β-käänteet), joustavuus-, hydropatia-, hydrofiili- • · · syys- (kuvio 2A) ja heliksrengaskaavion ennustusprofiilien yhdistelmä tehtiin 25 käyttämällä Hycon-ohjelmaa (kuvio 2B). Suuri α-heliks-todennäköisyys ennus- • «« .·:·1 tetaan epidermiini -30 - -8:lle, kun taas C-terminaalisella osalla 1 - 22, joka • · · vastaa proepidermiiniä, on hyvin suuri käännetodennäköisyys. Lisäksi ennus-tekuva osoittaa selvästi, että N-terminaalinen -30 - -1 on hyvin hydrofiilinen, • · · kun taas C-terminaalinen osa on lipofiilisempi. N-terminaalinen osa -30 - -8 30 vaikuttaa laskostuvan osittain amfofiiliseen a-heliksiin.
• · · • · ·
Pre-epidermiinin N-terminaalinen segmentti -30 - -1 ei sisällä kysteiinintähteitä, ’ kun taas C-terminaalinen segmentti 1-22 sisältää neljä kysteiinitähdettä, jotka • « · 104498 15 ovat osallisina sulfidisillan muodostuksessa. Sekvenssi -30 - -1 sisälsi useita katkaisukohtia endoproteaaseja varten, kun taas sekvenssi 1 - 22 on myös pre-epidermiinitilassa hyvin resistentti proteolyyttistä hajotusta vastaan.
5 Kypsän antibiootin voi hajottaa vain trypsiini Lys asemassa 13. Käsittelykohta Agr'1-lle+1 on hydrofiilinen ja helppopääsyinen, johtuen käännöksen muodostavasta ProMähteestä.
Erilaisia entsymaattisia reaktioita, jotka tapahtuvat antibioottien kuten epider-10 miinin tuotannossa, ovat mm. propolypeptidiosan 1 - 22 modifikaatiot; N-termi-naalisen prepeptidifragmentin -30 - -1 katkaisu ja kypsyneen antibiootin eritys (katso kuvioita 3 ja 4).
Entsymaattisia modifikaatioita ovat mm. veden poistaminen Ser-ja Thr-tähteis-15 tä asemissa 5, 16, 19, ja 8, 14 vastaavasti dehydroalaniini-ja dehydrobutyriini-tähteiden muodostamiseksi. Tapahtuu myös Cys-tähteiden tioliryhmien lisääminen asemaan 2, 11, 21 ja 22 C=C-kaksoissidoksiin, jolloin tulokseksi saadaan mesolantioniini tai (2S 3S, 6R)-3-metyylilantioniinisiltoja. Lisäksi tähteen 22 dekarboksylointi ja kaksoissidoksen muodostus antaa tulokseksi C-termi-20 naalisen S-(2-aminovinyyli)-D-kysteiinin. C-terminaalisesti sijaitsevien kyste- ... iinitioliryhmien reaktio N-terminaalisesti sijaitsevien dehydroaminohappojen • · · • · « !.. kanssa tapahtuu epidermiinissä, nisiinissä ja subtiliinissa täydellisellä stereo- • · selektiivisyydellä. Niinpä nämä eliminointi/lisäys-reaktiot merkitsevät modifi- • · · kaation aikana Ca-hiiliatomien konfiguraation reversiota pre-epidermiinitäh-25 teissä L-Ser ja L-Thr, jolloin saadaan D-konfiguraation omaavat Ca-atomit.
• · · .·:·[ Toisaalta Säilyy kysteiinipuoliskoilla edelleen L-konfiguraatio.
• · ·
Myöhemmin muodostuu myös neljä sulfidirengasta samassa katalyyttisessä • « · kohdassa, mitä tukee vuorovaikutus N-terminaalisen amfofiilisen a-heliksin • · · .· . 30 kanssa. Vain Thr+14 dehydratoituu kysteiiniä löytämättä. Tämä asema (Lys+13- • · · ‘ Dhb+14) on entsymaattinen katkaisukohta, jossa trypsiini inaktivoi antibiootti « « epidermiinin. C-terminaalinen jäykkyys ja hydrofobisuus kasvaa sulfidirenkaan- 1 · « • · 104498 16 muodostuksen aikana ja voi edistää proepidermiinin vuorovaikutusta lipidikak-sikerroksen kanssa, ja voi indusoida kuljetusta.
Lopuksi hydrofiilinen α-helikaalinen N-terminaalinen pää -30 - -1 katkaistaan 5 spesifisellä proteaasilla edellä kuvatussa tunnusomaisessa katkaisukohdassa.
Edellä kuvattuja tekniikkoja käyttämällä antibiootteja koodittavia plasmideja voidaan modifioida joko mutatoimalla geeniä, joka koodittaa eri polypeptidiä ja käyttää transformoimaan alkuperäistä isäntää tai eri isäntää, sillä ehdolla, että 10 tällainen isäntä voi myös, natiivissa tilassaan, ekspressoida antibioottia.
Yleisesti käsitellen, kun alkuperäinen funktionaalinen geeni koodittaa pre-sekvenssiä, kuten edellä käsiteltiin epidermiinin tapauksessa, niin DNA-sek-venssi, joka koodittaa tällaista pre-sekvenssiä, voidaan säilyttää modifioidussa 15 plasmidissa; tässä tapauksessa uuden, mutatoidun pro-polypeptidin DNA-sek- venssi sijaitsee suoraan ylävirtaan pre-sekvenssi-DNA:sta, samalla lailla alkuperäisen pro-polypeptidisekvenssin kanssa.
Keksinnön mukaisen bakteeri-isännän kasvatus voidaan suorittaa tavanomai- 20 sesti käytetyissä kasvatusolosuhteissa, jotka kuvataan esimerkiksi yhdessä- haetussa GB-patenttihakemuksessamme 8811760.1, joka jätettiin 18.05.1988, ;!.1 ja EP-patenttihakemuksessa 01811578. Halutun proteiinin puhdistus ja eristys ”1 voidaan myös suorittaa käyttämällä tekniikkoja tai niiden sopivia modifikaatio!- • · • · · ' . ta, jotka kuvataan edellä olevissa patenttihakemuksissa epidermiinille ja galli- 25 dermiinille, mukaan lukien adsorbenttien, ioninvaihtohartsien ja haluttaessa * · · '·.·[ HPLC:n käytön.
• · ·
Keksinnön mukaista menetelmää voidaan käyttää uusien yhdisteiden muodos- • · · tamiseen koetarkoituksiin, tai tunnettujen yhdisteiden tai tunnettujen yhdistei- • · · ,· 30 den johdannaisten muodostamiseen uusissa isännissä. Esimerkiksi plasmidi, « · « • i joka sisältää geenin, joka koodittaa epidermiiniä, voidaan käyttää lajin Strepto coccus lactis transformoimiseen epidermiinin tuottamiseksi tuosta isännästä, v : tai geeniä, joka koodittaa gallidermiinia (katso yhdessähaettua GB-patenttiha- • · 1 • · · 17 104498 kemustamme, johon viitattiin edellä), voidaan käyttää korvaamaan geenin, joka koodittaa epidermiinin propolypeptidiä esimerkiksi plasmidissa pEpi32 ja käyttää transformoimaan Staphylococcus epidermis DSM 3095:tä gallidermiinin tuottamiseksi tästä isännästä. Samalla lailla voidaan tuottaa muita biologisesti 5 aktiivisia peptidijohdannaisia, jotka sisältävät dehydroaminohappotähteitä ja/tai lantioniinisiltoja ja/tai metyylilantioniinisiltoja, kuten johdannaisia hormoneista kuten ihmisen insuliini, oksitosiini, vasopressiini, peptidiantibiootit, hormoni-inhibiittoreita kuten elastaasi-inhibiittori, ja fibrinolyyttisesti aktiivisia aineita kuten ihmisen kudosplasminogeeniaktivaattori. Paitsi että tällaiset johdannai-10 set voivat säilyttää emäyhdisteen biologisen aktiivisuuden, niillä myös olla lisääntynyt stabiilisuus ja parantuneet puoliintumisajat.
Ihanteellisesti haluttua propolypeptidiä koodittavan DNA:n pitäisi sisältää kodoneita seriiniä ja/tai kysteiiniä ja treoniinia varten tioeetterisiltojen muodos-15 tamiseksi.
Suhteellisen lyhytketjuisia polypeptidejä varten näiden vastaavien kodonien ei normaalisti pitäisi olla toisistaan useamman kuin kahdeksan eikä edullisesti useamman kuin kuuden kodonin päässä toisistaan, mukaan luettuna, vaikka 20 otetaan huomioon, että paljon suurempi etäisyys on mahdollinen lopullisen polypeptidimolekyylin steerisestä konformaatiosta riippuen.
< « · • · · • ·
Dehydroaminohapot muodostuvat tavallisesti seriinin ja treoniinin derivatisoin- • · · nilla, niinpä DNA, joka koodittaa haluttua propolypeptidiä, sisältää kodoneita 25 tällaisia aminohappoja varten.
• · · 4 · « · · • · · • · ·
Epätavallisia aminohappoja, joita voi olla läsnä keksinnön mukaisesti tuotetus- ,···, sa polypeptidissä, ovat dehydroalaniini, 2,3-dehydro-2-aminovoihappo, meso- • · « lantioniini, (2S, 3S, 6R)-3-metyylilantioniini, S-(2(Z)-aminovinyyli)-D-kysteiini, .· , 30 lysinoalaniini ja β-hydroksiasparagiinihappo; näiden tähteiden rakenne esite- • t · * I tään kuviossa 5.
« « · • · · 1 · • « · « c · • · 104498 18
Olemme odottamattomasti keksineet, että monientsyymikompleksi, joka on vastuussa pre-epidermiinin translaation jälkeisestä modifioinnista, sijaitsee Staphylococcus epidermis Τϋ 3298/DSM 3095:n 54-ke plasmidissa pTu32.
5 Kuutta geeniä (ORF't), jotka ovat vastuussa epidermiinin muodostumisesta, merkitään tässä nimillä epi A, B, C, D, Q ja P, ja ne ryhmittyneet 8 ke:n sisälle, ja proteiineja, joita ne koodittavat, merkitään nimillä Epi A, B, C, D, Q ja P, vastaavasti; epi A koodittaa 52 aminohapon pituista pre-epidermiiniä. Kuten alla kuvataan, epi B, C ja D ocat osallisina neljässä entsymaattisessa modifiointi-10 reaktiossa (i) veden poistaminen seriini/treoniini-dehydrataasilla, (ii) rikin lisääminen lantinoniinisyntaasilla, (iii) C-terminaalinen dekarboksylointi kysteiinide-karboksylaasilla ja (iv) kaksoissidoksen muodostaminen. Epi P-proteiinin uskotaan olevan vastuussa kypsän epidermiinin katkaisusta N-terminaalisesta joh-topeptidistä, perustuen sen silmiinpistäviin homologioihin seriiniproteaasien 15 välttämättömän alueen kanssa (Koide et ai., J. Bacteriol. 167 (1986) 110-116; Meloun et ai., FEBS Lett. 183 (1985) 195-200; ja Stahl et ai., J. Bacteriol. 158 (1984) 411-418, kun taas Epi Q:n uskotaan olevan säätelyproteiini, joka säätelee epidermiinin biosynteesiä, perustuen sen selvään homologiaan E. colin pho B-geenin kanssa (Makino et ai., J. Mol. Biol. 190 (1986) 37-44), siihen 20 tosiseikkaan, että molemmilla proteiineilla on samanlainen koko, 205 (epi Q) ja .··. 229 (pho B) aminohappotähteellä, havaitun homologian 24,2 % ulottuessa 153 C-terminaalisen aminohappotähteen ja molempien proteiinien hydrofiilisyys- ·:· kaavioiden yli.
·· · · • · • « · • · · • · 25 Tuloksena koko epidermiinibiosynteesin geneettisen informaation odottamattomasta keksimisestä ja proteiinien epi B, C, D, Q ja P geenien selvittämisestä :T: on nyt mahdollista saada eristetty DNA, joka koodittaa proteiineja, ja muodos- :T: taa plasmideja, jotka sisältävät yhden tai useita näistä geeneistä niin, että : viheltäessä isäntää, joka sisältää tällaisia plasmideja, voi ekspressöityä yhtä 30 näistä proteiineista yksinään tai proteiinien ennalta määrättyjä yhdistelmiä, ja nämä voidaan eristää seuraavaksi.
• · « 1 • · · · 19 104498
Sen vuoksi keksintöön kuuluvat DNA-sekvenssit, jotka koodittavat vastaavasti proteiinia Epi B tai Epi C, tai Epi D, tai Epi P tai Epi Q. Nämä sekvenssit voivat olla eristettyä DNA:ta, joko 1- tai 2-säikeistä, ne voivat olla saatuja pTu32:sta katkaisemalla ja eristämällä tunnetulla tavalla, tai ne voivat olla saatuja kemial-5 lisella synteesillä tai millä hyvänsä muulla tavanomaisella menettelytavalla. DNA voi myös olla integroitu plasmidiin, sopivasti ekspressioplasmidiin ja pro-moottorisäätelijän kontrollin alle; kun tällaisia konstruktioita transformoidaan sopivaan isäntään, jota sitten kasvatetaan, ne ekspressoivat proteiinia Epi B, Epi C, Epi D, Epi P tai Epi Q tai näiden proteiinien yhdistelmää sen mukaan 10 mitä DNA'ita plasmidiin liitettiin. Vaihtoehtoisesti plasmidi pTu32 voidaan käsitellä sopivilla restriktionukleaaseilla yhden tai toisen DNA-sekvensseistä leikkaamiseksi, minkä jälkeen seuraa uudelleen liittäminen sulatetun plasmidin vapaiden päiden minkä hyvänsä välttämättömän modifioinnin jälkeen, luomaan modifioidun plasmidin, joka sisältää DNA-sekvenssit, jotka koodittavat ennalta 15 määrättyjä joukosta epi B, C, D, P ja Q.
Edelleen eräs muunnos käsittää pTu32:ssa epidermiiniä koodittavan geenin substituoinnin DNA-sekvenssillä, joka koodittaa ennalta määrättyä aminohapposekvenssiä, jolloin modifioidun plasmidin sisältävän sopivan isännän viljely . 1: ·. 20 antaa tulokseksi epidermiinistä poikkeavan proteiinin ekspression.
• · ·
Siten on mahdollista korvata pTCi32:ssa epidermiiniä koodittava sekvenssi ··· gallidermiinia tai mutanttiepidermiiniä tai muuta antibioottia tai muuta proteiinia • · · · :1·.· koodatavalla DNA-sekvenssillä, jolloin tulokseksi saatu plasmidi voidaan trans- • · 25 formoida sopivaan isäntään, joka voi olla isäntä, joka ei normaalisti pysty tuottamaan antibioottia tai mitään proteiineista Epi B, C, D, P tai Q, ja kasvattaa :T: isäntää olosuhteissa, joissa substituoitu DNA-sekvenssi ja geenit epi B, C, D, :T: P ja Q ekspressoituvat, jotta saataisiin proteiinia, joka on gallidermiiniä, mu- .·. : tanttiepidermiiniä tai muuta proteiinia, joka sisältää lantibiootin ainakin yhden « « 30 ominaispiirteen.
• · # • « ·
Vaihtoehtoisesti geenit, jotka koodittavat proteiineja Epi B, C, D, P tai Q, voidaan insertoida sopivaan vektoriin, yhdessä DNA-sekvenssin kanssa, joka 20 104498 koodittaa ennalta määrättyä aminohapposekvenssiä, jolloin geenit koodittavat Epi-proteiineja ja ennalta määrättyä aminohapposekvenssiä, joka on toiminta-kykyisesti liittynyt sopivien promoottorisäätelytoimintojen kanssa, jolloin tulokseksi saatu plasmidi transformoidaan sopivaan isäntään, joka voi olla isäntä, 5 joka on normaalisti kykenemätön tuottamaan lantibioottia tai muuta proteiineista Epi B, C, D, P tai Q, ja isäntää kasvatetaan niin, että insertoidut geenit aiheuttavat proteiinin ekspressoitumisen, joka proteiini on johdettu mainitusta ennalta määrätystä aminohapposekvenssistä mutta sisältää lantibioottirakenne-ominaispiirteen, joka proteiini voi olla gallidermiini, epidermiini, mutanttiepider-10 miini tai muu proteiini.
Siten keksinnön suoja-alaan kuuluvat myös DNA-sekvenssit, jotka voivat hybri-disoitua, edullisesti ankarissa olosuhteissa, tässä kuvattujen DNA-sekvenssien kanssa, ja voivat koodittaa proteiineja, joilla on oleellisesti proteiinien Epi B, C, 15 D, P tai Q aktiivisuus. Ankarat hybridisointiolosuhteet valitsevat DNA-sekvens-sejä, joilla on yli 85-%, tai edullisemmin yli noin 90-% homologia. cDNA-kirjas-ton seulonta voidaan suorittaa hyvin ankarissa olosuhteissa menetelmällä, joka kuvataan EP-patenttihakemuksessa 88119602.9 ja julkaisussa Kashima et ai.. Nature 313 (1985) 402-404). DNA-sekvenssit, jotka voivat hybridisoitua anka-20 rissa olosuhteissa tässä patenttihakemuksessa kuvattujen DNA-sekvenssien kanssa, voivat olla esimerkiksi alleelisia muunnelmia kuvatuista DNA-sekvens- • · · :":’i seistä, voivat olla luonnollisesti läsnä erityisessä mikro-organismissa mutta olla ··♦ sukua kuvatuille DNA-sekvensseille, tai ne voivat olla peräisin muista lähteistä.
·»··
Nukleiinihappohybridisoinnin yleiset tekniikat kuvaa Maniatis, T. et ai., käsikir- :T: 25 iässä: Molecular Cloning, a Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, NY (1982), ja Haymes, B.D. et ai., teoksessa: Nucleic Acid Hybridization, a Practical :T: Approach, IRL Press, Washington, DC (1985), jotka viitteet liitetään tähän v : viitteeksi.
• · ; 30 Proteiinit Epi B, C, D, P ja Q ovat arvokkaita ja kiinnostavia uusia reagensseja, _.!. t jotka ovat käyttökelpoisia valmistettaessa uusia proteiineja tai muita aineita, . jotka sisältävät rakenneominaispiirteitä kuten dehydroalaniini, dehydrobuty- niini, meso-lantioniini, 3-metyylilantioni ja S-(2-aminovinyyli)-D-kysteiini.
104498 21
Sellaisinaan niitä voidaan käyttää eristettyinä proteiineina, tai kemiallisina katalyyttisinä reagensseina kemiallisissa synteesiproseduureissa proteiinien solunulkoisen käsittelyn tutkimiseksi tällaisilla entsyymeillä.
5 Keksintö kosakee myös proteiineja Epi B, C, D, P ja Q oleellisen puhtaassa muodossa. Käsitteellä "oleellisen puhdas" tarkoitetaan, että proteiini on vapaata siihen luonnollisesti liittyvistä epäpuhtauksista. Oleellinen puhtaus voidaan todistaa yhdellä vyöhykkeellä elektroforeesilla.
10 Keksinnön mukaiset polypeptidit voidaan eristää ja puhdistaa edellä kuvatuista rekombinanttimolekyyleistä tavanomaisilla menetelmillä kuten uuttamalla, saostuksella, kromatografialla, affiniteettikromatografialla, elektroforeesilla ja vastaavilla. Edullisesti polypeptidit tuotetaan osana fuusioproteiinia, joka käsittää edelleen apuproteiinia. Sellaista apuproteiinia, joka helpottaa kiinnostuk-15 sen kohteena olevan polypeptidin eristystä ja puhdistusta. Tällaisiin apuprote-iineihin luetaan mukaan esimerkiksi tyypilliset erityssignaalit, maltoosia sitova proteiini E. colista, eli proteiini A. Menetelmät proteiini A:ta sisältävien fuusio-proteiinien valmistamiseksi, sen puhdistamiseksi immunoaffiniteettikromato-grafialla, ja sen katkaisu kiinnostuksen kohteena olevan proteiinin vapauttami-20 seksi esitetään esimerkiksi PCT-patenttihakemuksessa W084/03103 (1984).
Välttämätön tila fuusioproteiinin katkaisun sallimiseksi on sellainen, että se ··· sisältää ainutlaatuisen katkaisukohdan, joka voidaan tunnistaa ja katkaista • · · · sopivalla tavalla. Tällainen katkaisukohta voi olla ainutlaatuinen aminohappo- • · 25 sekvenssi, joka voidaan tunnistaa kemiallisesti tai entsymaattisesti, ja se voi sijaita halutun proteiinin ja apuproteiinin välissä. Tällainen erityinen aminohap- :T: posekvenssi ei saa sijaita halutun proteiinin tai apuproteiinin sisällä. Esimerk- :T: kejä entsymaattisista reagensseista ovat mm. proteaasit kuten kollagenaasi,
: joka voi tunnistaa aminohapposekvenssin NH2-Pro-X-Gly-Pro-COOH, jossa X
30 on mielivaltainen aminohappotähde, esimerkiksi leusiini; kymosiini (renniini), ,;. joka katkaisee Met-Phe-sodiksen; kallikreiini B, joka katkaisee Arg:n karbok- • · « syylipuolelta X-Phe-Arg-Y:ssä; enterokinaasi, joka tunnistaa sekvenssin X- « « (Asp)n-Lys-Y, jossa n on 2 - 4, ja katkaisee sen Lys:n karboksyylipuolelta; 104498 22 trombiini, joka katkaisee spesifisissä arginyylisidoksissa. Esimerkkejä kemiallisista aineista, joita voidaan käyttää fuusioproteiinieun katkaisuun, ovat mm. syanogeenibromidi, joka katkaisee Met:n jälkeen; hydroksyyliamiini, joka katkaisee Asn-Z-sidoksen, jossa Z voi olla Gly, Leu tai Ala; muurahaishappo 5 suuressa konsentraatiossa (~70 %) katkaisee spesifisesti Asp-Pro:n.
Ilman enempää yksityiskohtaista valmistelua, uskotaan että ammattimies voi edellä olevaa kuvausta käyttäen hyödyntää tätä keksintöä koko laajuudessaan. Seuraavat edulliset erityiset suoritusmuodot ovat sen vuoksi vain kuvaavia, 10 eivätkä ne rajoita kuvauksen muuta osaa millään lailla.
Esimerkit
Esimerkki 1 15 1. Gallidermiinin ylituotanto DNA-fragmentti, joka sisältää gallidermiinin avoimen lukualueen, voidaan kloonata Staphylococcus epidermis DSM 3095:een, epidermiiniä tuottavaan 20 kantaan käyttämällä keskinkertaisen kopioluvun omaavaa plasmidia kuten pC194, pE194, pUB110, pT181 tai pMH148 gallidermiini. Geeniannoksen • » » lisäys korreloi tavallisesti tuotteen tuotannon lisäyksen kanssa; korrelaatio ei ··· välttämättä ole lineaarinen. Kloonausvehikkeleinä voidaan käyttää myös • · · · pC194:n tai pT181:n suurikopiolukuisia johdannaisia.
:T: 25 2. Johtosekvenssin vaihto • M • · · • · · :T: Epidermiinin johtosekvenssi vastaten aminohappoja -1 - -30 on osallisena : epidermiinin erityksessä. Sekvenssiä voidaan käyttää erittämään S. epider- ....: 30 mis'issä muita peptidejä kuten gallidermiiniä.
I « · ! . Johtosekvenssi-DNA voi olla siirrettävissä insertoimalla sen sekvenssin alkuun ja loppuun vastaavat linkkerit. Siten johtosekvenssi-DNA:ta voidaan eristää 23 104498 plasmidista suuria määriä ja insertoida muiden peptidien ja proteiinien vastaaviin asemiin. Johtosekvenssi-DNA voidaan tuottaa myös kemiallisella synteesillä.
5 Esimerkki 2
Gallidermiinin tuotanto käyttämällä isäntänä S. eDidermis'tä 1. Plasmidin valmistus (katso kuviota 6) 10 a) Valmistettiin plasmidi pCUI liittämällä Pst1 -sulatettu pCLPIOO ja Ndel-sula-tettu pUC18 käyttämällä Klenow'ta tavalla, joka kuvataan väitöskirjassa "Molekular genetische Untersuchungen zur plasmidkodierten Arsenit und Arsenatresistent bei Staphylococcen", tohtori Ralf Rosenstein (saatavissa yli- 15 opistosta Technische Universität, Miinchen, Länsi-Saksa). Sitten tulokseksi saatu plasmidi sulatettiin EcoR1:llä.
b) Kromosomaalista DNA:ta eristettiin S. gallinarum'ista (DMS 4616) ja sulatettiin EcoR1:llä. 4,7-ke fragmentti, joka sisälsi gallidermiinirakennegeenin 2,4-ke 20 pituisessa sekvenssissä Hindlll-ja EcoR1-restriktiokohtien välissä, eristettiin .· ·. käyttämällä alukkeena sekvenssiä . *:'* · 5’ CAC ATC CAG GAG TAC 3' • · · ··· • « · · c) Sitten 4,7-ke fragmentti liitettiin vaiheesta a) olevan sulatetun pCUI-plasmi- • · :T: 25 din EcoR1-kohtaan, jolloin saatiin plasmidi, jolle annerttiin nimi pCUgdml.
:T: 2. S. epidermis-isännän valmistus • · · • · · • · · : Tässä esimerkissä eristettiin mutanttikanta S. epidermis DSM 3095, joka oli ....: 30 kykenemätön tuottamaan epidermiiniä.
Mutageneesi suoritettiin kannalla, jolle oli tunnusomaista kromosomaalisesti koodattu rifampisiiniresistenssi (20 pg/ml).
104498 24 S. epidermis DSM 3095:tä, jota oli kasvatettu agarlevyillä, käytettiin siirrosta-maan 30 ml peruskasvatusväliainetta, jota viljeltiin yön yli. 0,5 ml yön yli kasvatettua viljelmää käytettiin sitten siirrostamaan 50 ml tuotantoväliainetta, jota ravistelukasvatettiin 37°C:ssa kolmen tunnin ajan.
5
Solut poistettiin viljelyväliaineesta ja suspendoitiin 4,5 ml:aan esi lämmitettyä TM-puskuria (30 ml Tris-maleaattia, pH 6,5 (tulokseksi saatua liuosta lutsuttiin liuokseksi A)).
10 Liuoksesta A tarkastettiin spontaanit mutaatiot ja solujen lukumäärä (1,25 x 1010 solua/ml).
4 ml liuosta A ravisteltiin läpikotaisin 1 ml:n kanssa etyylimetyylisulfonaattia (lopullinen konsentraatio 47 pg/ml), ja pidettiin sitten ravistellen 37°C:ssa 1 15 tunnin ajan.
Sitten slut uutettiin kasvatusliemestä, pestiin kahdesti TM-puskurissa, ja suspendoitiin uudelleen 5 ml:aan TM-puskuria (tulokseksi saatua liuosta kutsuttiin nimellä liuos B, ja sisälsi mutatoituja soluja).
20 • · · : ‘ Liuoksen B havaittiin sisältävän 2 x 108 solua/ml, vastaten eloonjäämismäärää 1,6%.
• · · • · · · 50 ml liuosta B lisättiin 5 ml:aan tuotantoväliainetta ja kasvatettiin yön yli • · 25 37°C.ssa (fenotyyppiekspressio). Tulokseksi saatua liuosta kutsuttiin nimellä liuos C. Solujen lasku osoitti 7,3 x 108 solua/ml.
* · t • · · v**: Liuos levitettiin BM-agarlevyille, ja poimittiin yksittäiset koloniat. Niitä käytettiin . ·. : siirrostamaan testilevyjä (koostuen BM-agarista, jonka pinnalle oli lisätty Micro- 30 coccus luteus'ta). Ne koloniat, joilla ei ollut inhibitiovaikutusta M. luteus'iin, _. j. valittiin epidermiiniä tuottamattomina.
c 104498 25 BM-agar sisältää litraa kohden:
10 g peptonia no. 140 5 g hiivauutetta 1 mg glukoosia 5 5 mg NaCI
1 mg K2HP04 pH 7,5
Havaittiin mutaatioaste noin 3 %.
10 45 löydettyä ei-tuottajaa alikloonattiin 20 kertaa, jolloin saatiin 16 stabiilia ei-tuottajaa.
Kaikkien stabiilien ei-tuottajien havaittiin sisältävän villityyppiplasmidin pEpi32.
15 Restriktiomallista tämä tunnistetaan identtiseksi villityyppikannan plasmidin kanssa.
Tuottamattoman S. epidermis'in transformointi 20 750 ml BM-väliainetta siirrostettiin 5 ml:lla väliainetta, joka saatiin kasvattamal- • · · .···. la yön yli stabiilia tuottamatonta kantaa, ja siirrostettua väliainetta ravistelukas- vaiettiin 2-I astiassa 37°C:ssa ravistelijan nopeudella 120 r/min.
··· «·»·
Siirrostetun BM-väliaineen optinen alkutiheys oli 0,03 - 0,04. Kun optinen tiheys • · 25 oli saavuttanut 0,45 - 0,55, poistettiin solut sentrifugoimalla GS.-3-roottorissa nopeudella 8 500 r/min 15 min ajan 4°C:ssa. Sitten eristetyt solut pestiin peräk-käin 750, 350, 40 ja 10 ml:ssa 10-% glyseriiniä, suspendoitiin 2-3 ml:aan 10-% :T: glyseriiniä, ja pakastettiin 110-ml erissä ERG:issä -70°C:ssa. Solulukumäärä oli .·* ; 1-5x1010/ml.
a · · ····: 30
Pakastettuja soluja sulatettiin huoneenlämpötilassa 5 min ajan, sitten 50 pl «aa a « t ; . solususpensiota inkuboitiin ERG:ssä 2 μΙ:η kanssa plasmidia pCUgdml TE- puskurissa 30 min ajan huoneenlämpötilassa.
104498 26
Sitten seos lisättiin elektroporaatiokyvettiin, jossa oli 0,2-cm elektrodiako, ja käsiteltiin välittömästi elektroporaatiolla. Tämän jälkeen solut suspendoitiin nopeasti uudelleen 950 ml:aan SMMP50-väliainetta, siirrettiin 2,5 ml:an ERG:tä ja ravisteltiin 90 min ajan 37°C:ssa. ERG:itä kallistettiin 45° väliaineen 5 hyvän ilmastoinnin aikaansaamiseksi.
SMM050-väliaine sisältää 100 ml:aa kohden 55 ml 2SMM:ää, 40 ml 4 PAB:tä ja 5 ml 5-% BSA:ta. 2SMM sisältää 1 mol sakkaroosia, 0,04 mol maleiinihap-poa, 0,04 mol MgCI2:ta ja NaOH:ta pH-arvoon 6,5. 4 PAB on liuos, jossa on 10 7 g/100 ml Gibco-antibioottiväliainetta 3.
Solususpensio laimennetaan ja levitetään BM-agarille, joka sisältää gallider-miiniä, jota inkuboidaan 20 tuntia 37°C:ssa.
15 Gallidermiiniä tuottavien kasvavien kantojen testaus suoritettiin valitsemalla kolonioita M. luteus-testilevyltä ja viljelemällä vastaavia valittuja kolonioita ja määrittämällä gallidermiinin läsnäolon HPLC:llä.
Paikannettiin kolme transformoitua pCUgdml-mutanttia, jotka pystyivät tuotta-20 maan gallidermiiniä.
pCUadml:llä transformoidun S. eoidermin'in tuottaman gallidermiinin läsnäolon • · · määrittäminen • · · · • · • · · • «· • · 25 a) Biomääritys :*·*: FP-agaria siirrostettiin M. luteus ATCC 9341 :llä ja inkuboitiin 37°C:ssa 18 :*·*: tunnin ajan. Puolet tuotetusta viljelmästä poistettiin silmukalla ja suspendoitiin ; 100 ml.aan FP-väliainetta ja kasvatettiin 8 tunnin ajan 36°C:ssa. Kasvatus • « · .!..: 30 lopetettiin kun optinen tiheys saavutti arvon 1,0. FP-agar siirrostettiin 0,5 %:lla ,;, tätä suspensiota, kulloinkin 10 ml kaadettiin petrimaljaan ja varastoitiin 3 viikon ajan 4°C:ssa.
104498 27
Levydiffuusiotesti suoritettiin tavalla, joka kuvataan teoksessa Zähner ja Maas, "Biology of Antibiotics", Springer Verlag, Berliini 1972. 10 μΙ viljelmäsuodosta transformoidun S. epidermin'in kasvatuksesta siepattiin suodatinpaperille ja kuivattiin. Paperi asetettiin testilevylle, jota sitten inkuboitiin 24 tunnin ajan 5 37°C:ssa.
b) HPLC
Valittua transformoitua kantaa kasvatettiin 26 tunnin ajan tuotantoväliaineessa. 10 Kasvatuslientä sentrifugoitiin 10 min ajan nopeudella 13 000 r/min.
Sitten eristetty kasvatusneste alistettiin HPLC:Ile SP8.700 nestekromatografia-laitteella (Spectra Physics, Darmstadt, SLT) käyttäen liikkuvana faasina A) H20:ta, jossa oli 0,5 % 70-% perkloorihappoa ja B) asetonitriiliä. Kolonnin 15 pakkausaine oli Nucleosil -100, jonka raekoko oli 7 pm, ja kolonnikoot 125 mm x 4,6 mm ja 20 mm x 4,6 mm sisähalkaisija esikolonnilla.
Gradientit olivat seuraavanlaiset: 20 aika (min) A[%] B [%] • « · . 0 77,5 22,5 8 63,0 37,0 • · · 8,5 0 100 : 9,5 0 100 25 10 77,5 22,5 14 77,5 22,5 • · · • · · • · ·
Tulokseksi saatu kromatogrammi esitetään kuviossa 7A. Kuvassa 7B esitetään .·* ; standardikäyrä, joka osoittaa, että gallidermiini eluoituu kohdalla 7,54 min.
30
Seuraavia käytettiin kasvatusväliaineena.
t « I
104498 28 1. FP-agar lihauute 4 g peptoni 10 g
NaCI 3 g 5 Na2HP04 5 g glukoosi 10 g
kompleksiagar 15 g vesi 1 I
pH 7,2 10 2. FP-väliaine lihauute 4 g peptoni 10 g
NaCI 3 g 15 Na2HP04 5 g glukoosi 10 g
vesi 1 I
pH 7,2 20 3. Tuotantoväliaine .··>. lihauute 33 g mallasuute 30 g
NaCI 40 g »··* kalsiumhydroksidi 3,8 g * ·
25 vesi 1 I
• t · pH 6,5 • · · • · « • · ·
Esimerkki 3 30 Plasmidin eristäminen
Plasmidi-DNA S. epidermis Tu3298:sta eristettiin modifioiden menetelmää, joka kuvataan julkaisussa: Norick et ai., Ann. NY-Acad. Sei. 182 (1971) 104498 29 279-294. S. epidermis'tä kasvatettiin BM-väliaineella (1 % peptoni 140, Gibco, Neu-lsenburg, SLT, 0,5 % hiivauutetta, Dicfo, Detroit, USA, 0,1 % glukoosia, 0,5 % NaCI:ää ja 0,1 % K2HP04 x 2H20) stationääritilaan asti. Solut sentrifu-goitiin ja pestiin kahdesti 0,5 M EDTA:lla. Pelletti suspendoitiin uudelleen 5 80 ml:aan NaCI-puskuria (50 mM Tris/HCI, pH 7, 50 mM EDTA, 2,5 M NaCI), lisättiin 1,5 ml lysostafiiniliuosta (0,5 mg/ml, Sigma, Heidelberg, SLT), ja suspensiota inkuboitiin 37°C:ssa 20 min ajan. Solut liuotettiin lisäämällä 80 ml lyysipuskuria (50 mM Tris/HCI, pH 8, 300 mM EDTA, 500 mM Brij., 40 mM nat-riumdeoksikolaattia) ja pidettiin jäässä 1 tunti. Lysaatti sentrifugoitiin (30 min, 10 13 000 r/min, 4°C), ja supernatantti sekoitettiin neljäsosan kanssa tilavuudes taan 50-% PEG-6000-liuosta. Plasmidi-DNA saostettiin 4°C:ssa yön yli. SNA-suspensio sentrifugoitiin (20 min, 13 000 r/min, 4°C), suspendoitiin uudelleen 8 ml:aan TE-puskuria, ja lisättiin 50 pl proteinaasi K-liuosta (20 mg/ml). Kun oli inkuboitu 15 min 37°C:ssa, DNA saostettiin etanolilla ja puhdistettiin edelleen 15 CsCI-sentrifugoinnilla (1 g CsCI/ml, 40 000 r/min, 40 h, 20°C).
RNA:n eristys ia elektroforeesi S. epiderimin'iä kasvatettiin SMS-minimaalisella väliaineella (Terzaghi et ai., 20 Appi. Microbiol. 29 (1975) 807-813), ja RNA eristettiin siitä, käyttämällä modifi- t’..# oitua menettelytapaa, joka oli samanlainen kuin kuvattiin Bacillus subtilis- ,'j·. RNA:lle (Ulmanen et ai., J. Bacteriol. 162 (1985) 176-182). Solut liuotettiin • · « lysostafiinilla (0,1 mg/ml) protoplastiinipuskurissa, ja inkubointi suoritettiin .%1: 37°C:ssa. Kokonais-RNA glyoksyloitiin (McMaster et ai., Proc. Natl. Acad. Sei.
• · · 25 USA 74 (1977) 4835-4839) ja erotettiin 1,2-% agaroosigeelillä käyttämällä eletroforeesipuskurina 10 mM Na2P04:ää, pH 7. RNA värjättiin etidiumbromi- dilla ja siirrettiin nitroselluloosamembraanille (Scheider ja Schuell, Dasser, SLT) kapillaarisiirrolla 20 x SSC-puskurilla (0,15 M NaCI, 0,015 M trinatrium- / . sitraatti, pH 9). 23SrRNA:ta ja 16SrRNA:ta käytettiin kokostandardina.
';/j 30 • · • · · • · · » « » · · • · · • · 30 104498
In vitro-transkriptio
Yksisäikeiset RNA-koettimet saatiin kloonaamalla vastaava fragmentti pSPT18/19-vektorijärjestelmässä (Boehringer Mannheim, Mannheim, SLT).
5 Plasmidit linearisoitiin EcoRLIlä tai Hindlll:lla lineaarisen DNA-templaatin saamiseksi. Transkriptiota varten modifioitiin protokollaa julkaisussa Melton et ai., Nucl. Acid Res. 12 (1984) 7035-7056) kaupallisen toimittajan ohjeiden mukaisesti. T7-RNA-polymeraasia tai SP6-RNA-polymeraasia käytettiin 032P-CTP:n (800 Ci/mMol) läsnä ollessa. Liittymättömät ribonukleotidit erotet-10 tiin leimatusta RNA:sta Sephadex G50-kromatografialla.
"Northern"-hvbridisointi RNA siirrettiin elektroforeesin jälkeen tavalla, joka kuvataan kulkaisussa: 15 Thomas, P.S.; Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77 (1980) 5201-5205. Kahden tunnin inkuboinnin jälkeen 80°C:ssa suodatinta inkuboitiin lyhyesti 20 Tris/HCI:ssä, pH 8, 100°C:ssa käänteisglyoksylointia varten. Jälkeen päin suodattimia esi-hybridisoitiin 2 tunnin ajan 42°C:ssa seoksessa, jossa oli 50 % formamidia, 5 x SSC (0,15 M NaCI, 0,015 M trinatriumsitraatti, pH 9), 50 NaP04:ää, pH 6,5, 20 0,1 % ficoll 400:aa (Pharmazia, Freiburg, SLT), 0,1 % polyvinyylipyrrolidonia, λ. 0,1 % naudan seerumialbumiinia ja 0,25 mg/ml denaturoitua lohenmaiti- DNA:ta. Koettimen lisäyksen jälkeen hybridisointi suoritettiin samassa pusku- • « «
rissa 42°C:ssa 12 tunnin ajan. Suodattimia pestiin kerran 15 min ajan 42°C:ssa seoksessa, jossa oli 1 x SSC, 0,1 % SDS, ja niillä valotettiin Kodak-X
• · · 25 Omat-filmejä -70°C:ssa 4 tunnin ajan. Tämän jälkeen suodattimet pestiin kah- • · · desti 15 min ajan 70°C:ssa seoksella, jossa oli 0,5 SSC, 0,1 % SDS, ja autora- diogrammit valotettiin -70°C:ssa 16 tunnin ajan. Seuraavana päivänä pesua jatkettiin 30 - 60 min ajan 70°C:ssa seoksella, jossa oli 0,1 x SSC, 0,1 % SDS, / . ja valotettiin sitten jälleen Kodak-X Omat-filmejä 3 päivän ajan -70°C:ssa.
• · ·
« « I
30 31 104498 "Southern"-hvbridisointi "Southern'-hybridisointia (Southern, E.M., J. Mol. Biol. 98 (1975) 503-517) 5'-leimattuja oligonukleotideja käytettiin koettimina 23°C:ssa. Oligonukleotidit 5 leimattiin gamma32P-ATP:llä käyttäen 4T-polynukleotidikinaasia (Boehringer Mannheim, Mannheim, SLT). Oligonukleotidit ja alukkeet syntetisoitiin 391 DNA-syntetisoijalla (Applied Biosystems, Weiterstadt, SLT) ja käytettiin enempää puhdistamatta.
10 DNA-sekvensointi DNA sekvensoitiin radioaktiivisesti ja ei-radioaktiivisesti ketjunterminaatiome-netelmällä (Sanger et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74 (1977) 4363-5467) käyttämällä T7-DNA-polymeraasia (Pharmazia, Freiburg, SLT). Radioaktiivinen 15 plasmidisekvensointi suoritettiin tavalla, joka kuvataan julkaisussa: Hattori et ai.; Anal. Biochem. 152 (1984) 232-238 sopivilla alukkeilla. 3,6-ke BamHI/Pstl-fragmentti sekvensoitiin ei-radioaktiivisesti Applied 373A DNA-sekvenaattorilla (Applied Biosystems, Weiterstadt, SLT). Vastaava fragmentti kloonattiin fage-midi pBSH-/+:aan. Muodostelma sulatettiin BamHLIlä ja Sacl:llä, ja linearisoi-20 tu DNA sulatettiin unibidirektionaalisesti 5'-päästä eksonukleaasi Ulilla • · · • · · (Boehringer Mannheim, Mannheim, SLT) tylppien päiden saamiseksi. Elektro-foreesin (1-% agaroosigeeli) jälkeen sopivankokoiset fragmentit eristettiin • · · geelistä, liitettiin uudelleen ja transformoitiin E. coli-kantaan XL-1 Blue. Yksi- ]·[*: säikeinen DNA eristettiin käyttämällä avustajafaagia CSM13 ja sekvensoitiin • · · • * 25 Taq-polymeraasilla (Promega, Freiburg, SLT) kaupallisen toimittajan työohjeen • · · mukaisesti.
• · · i · · • « ·
Plasmidin konstruointi • · · ^~~~““^ « * « « « ] ! 30 Stafylokokkaalinen terrasykliiniresistentti plasmidi pT181 on sekvensoitu (Kahn ; et ai., Plasmid 10 (1983) 251-259), ja sen keksittiin sisältävän yhden ainoan I · <
Ndel-kohdan pre-geenin sisällä, joka ei ole välttämätön plasmidin replikaatiolle (Gennaro et ai., J. Bacteriol. 169 (1987) 2601-2610). E. coli-vektorin pUC19 32 104498 (Yanisch-Perron et al., Gene 33 (1985) 103-119) multippelikloonauskohta (mcs) insertoitiin Ndel-kohtaan pT181mcs:n muodostamiseksi (katso kuviota 14).
5 Staphylococcys/E.coli-sukkulavektori, pCUI (kuvio 10) konstruoitiin pCLP100:sta, joka on stafylokokkaalisen klooriamfenikoliresistentin plasmidin pC194 johdannainen (Horinouchi et al., J. Bacteriol. 150 (1982) 815-825), ja E. coli-vektorista pUC19. pCUI pysyy stabiilisti molemmissa isännissä insertion koolla jopa noin 6 ke. pT181 ja pCUI ovat yhteensopivia stafylokokeissa, ja 10 niitä käytettiin alikloonaamaan pTCi32:sta olevia DNA-fragmentteja.
pTu32:n Hindlll-fragmentti kloonattiin pUC19:ään ja käytettiin koettimena "Southem'-hybridisoinnissa tunnistamaan lisää restriktiokohtia lähellä Hindlll-fragmenttia (kuvio 8C).
15 13,5 kiloemäsparin Bglll-fragmentti S. epidermis'istä olevan 54 kiloemäsparin episomaalisesta elementistä pTu32 alikloonattiin pT181mcs:ään, jolloin saatiin pTepi14 (kuvio 8A). DNA-sekvensointia varten valmistettiin alikloonit E. coli-vektorissa pUC19 (Yanisch-Perron et al., Gene 33 (1985) 103-119) ja ... 20 pBluescript llR:ssä (Stratagene, Heidelberg, SLT). Yksisäikeiset RNA-koettimet t I < saatiin DNA:sta, joka oli kloonattu vektoriin pSPT18/19 (Boehringer Mannheim, • ·
Mannheim, SLT).
( I · ··· *·”· Geenianalyysi
• M
.*:·! 25 • · ·
Epidermiinirakennegeenin, epi A, viereisen DNA-alueen sekvensointi paljasti 5 muuta täydellistä avointa lukualuetta epi B, C, D, P ja Q pTu32:n 13,5 kilo-emäsparin Bglll-fragmentin sisällä.
4 · « « · • « · ' 30 Kuten kuviosta 9 voidaan nähdä, suoraan EpiA.ta koodittavan sekvenssin • » vieressä vain 50 nukleotidin etäisyydellä epi A-okrakodonista sijaitsee laaja ';' ' avoin lukualue, jota edeltää S/D-sekvenssi, jonka pituus on 2 970 emäsparia.
TTG-kodoni leusiinia varten, ja joka voi myös toimia translaation aloituskodoni- 104498 33 na stafylokokeissa, on sopivalla etäisyydellä (86 emäsparia) S/D-sekvenssistä. Tätä avointa lukualuetta merkitään epiB, ja kuten tässä on kuvattu, sitä voidaan käyttää menestyksekkäästi epidermiinibiosynteesimutanttien täydentämiseen, ja sillä on oleellinen merkitys epidermiinin biosynteesissä.
5 epiB:n koodittamalla proteiinilla, alkaen TTG:stä (Leu), on molekyylipaino noin 115 kDa, nettovaraus -3 pH-arvossa 7, ja se on keskinkertaisen hydrofobinen (41 % hydrofobisia tähteitä), kuten voidaan ennustaa myös hydrofiilisyyskaa-viosta tavalla, joka kuvataan julkaisussa: Kyle et ai.; J. Mol. Biol. 157 (1982) 10 105-132.
epiB.n 3'-päässä ei voida palindromiinirakennetta, joka on tyypillinen transkription lopetukselle. Siellä on kuitenkin 122 emäsparin päällekkäisalue toisen avoimen lukualueen epiC kanssa, siirtyneenä -1 emäsparilla, kuten myös on 15 nähtävissä kuviossa 9.
Olemme osoittaneet ettei tämä ole tekotuote kloonaamalla ja sekvensoimalla vastaavan 47 kiloemäsparin fragmentin kahdesti kahdesta toisistaan riippumattomasta plasmidieristyksestä. Tämä varmistettiin myös mutanttikomplementoin- * · · *·* * 20 niHa tässä kuvatulla epiC:n sisältävällä fragmentilla.
'·* * epiB:n ja epiC:n lukualueiden limittäisen alueen sisällä ensimmäinen TTG- kodoni (Leu), joka on vain 36 emäsparin etäisyydellä 3’-suuntaan AGGA-ele- • · · mentistä, toimii translaation aloituskodonina, mikä ilmaisee, että molemmat • · · ' 25 lukualueet ovat limittäin noin 40 kodonin osalta. EpiC-proteiinin tosiasiallinen ... aminoterminaalinen pää määritettiin N-terminaalisella sekvensoinnilla. Luku- • · · • · · alue epiC koodittaa 445 aminohappotähteen proteiinia, alkaen aloituskodonilla • · · TT G (Leu). Avoin lukualue epiD seuraa suoraan 3'-päässä epiC:stä, alkaen • · ’·**·: ATG:llä 86 emäsparia 3-suuntaan AGGAGG S/D-sekvenssistä. 3'-suuntaan
* * 30 epiD:stä on klassinen rho.sta riippuvainen transkription lopetusrakenne; epiD
: koodittaa 181 aminohappotähteen proteiinia, jossa on ATG (Met) aloituskodo- ♦.’•j nissa.
34 104498
Yhdelläkään proteiineista EpiB, C, D, P ja Q ei ole samankaltaisuutta proteiini-sekvenssien kanssa, jotka on kortistoitu priteiinitietopankkeihin Swiss Prot ja Gene Bank, ja edustavat täten entsyymien ja säätelyproteiinien tuntemattomia tyyppejä.
5
Biosvnteettisten geenien transkriptio
Yksisäikeiset RNA-koettimet saatiin kloonaamalla haluttu fragmentti edellä kuvattuun pSPT 18/19-vektorijärjestelmään (Boehringer Mannheim, Mannheim, 10 S LT).
Saatiin kaksi kooltaan merkittävästi poikkeavaa transkriptia, kuten kuviossa 10 kuvataan. epiA-spesifinen hybridisointikoetin tunnisti pienen, noin 300 emäs-parin transkriptin. Samankokoiset transkriptit keksittiin myös lantibiooteille ni-15 siini (Buchmann et ai., J. Biol. Chem. 263 (1988) 16260-16266) ja subtiilini (Banerjee et ai., J. Biol. Chem. 263 (1988) 9508-9514). Lisäksi voidaan tunnistaa suuri noin 5 kiloemäksen transkripti epiB-spesifisellä hybridisointikoettimel-la. Koska epiB:n edellä ei ollut E. coli-tyyppisiä promoottorisekvenssejä, sopivien sekvenssien sijaitessa 5’-suuntaan epiA:sta, voidaan nähdä, että epiA- « « | 20 promoottori toimii polykistronisen mRNA.n promoottorina.
• · ’ . Alavirran avoimet lukualueet l»«l • · • · · • · ·
Avoimet lukualueet epiP ja epiQ sijaitsevat vastakkaisella DNA:Ha suhteessa
• I I
25 epiB:hen, C:hen ja D:hen, jolloin epiQ:lla on yhteinen lopetusrakenne epiD:n kanssa, täydellinen hiuspinni, jossa on 6 emäsparin silmukka.
• · e i ti • · · • · · / # Täsmälleen tämän silmukkarakenteen sisällä TAA-lopetuskodoneilla sekä • · · ** *; lukualuetta epiD että epiQ varten on kaksi yhteistä nukleotidia kolmesta.
'! : 30 * epiP-lukualue alkaa ATG-kodonilla, joka on sopivalla etäisyydellä (6 emäspa- ria) S/D-sekvenssistä. Jos oletetaan, että ATG-kodoni on epiP.n translaation alku, saadaan 461 aminohappotähdettä sisältävä proteiini, jonka molekyylipai- ,, 104498 ot) no on 51,8 kD. epiP:llä on yhteiset tunnusomaiset homologiat seriiniproteaasi-en konservoitujen aminohappoaiheiden kanssa (katso kuviota 11) osoittaen, että epiP osallistuu kypsän lantibiootin katkaisuun modifioidusta prepeptidistä.
5 epiQ-lukualue alkaa myös ATG-kodonilla ja koodittaa 205 aminohappotähdettä (kuvio 9). S/D-sekvenssi, joka sijaitsee 6 emäsparin etäisyydellä ATG-kodonis-ta, ja DNA-sekvenssistä voidaan johtaa molekyylipaino 243 kD. epiQ-proteiinil-la on yhteiset tunnusomaiset homologiat PhoB:n kanssa (katso kuviota 12), joka on E. colin fosfaattisäätelyn positiivinen säätelytekijä, joten epiQ osallistuu 10 lantibioottisynteesiin säätelytekijänä.
epiP:tä edeltää E.coli-mainen -10 alue (5'-TATAAA), joka sijaitsee 12 emäspa-ria ennen S/D-sekvenssiä, joka voi toimia promoottorina stafylokokeissa. Etäisyys epiP:n lopetuskodonin ja epiQ:n ATG-aloituskodonin välillä on vain 10 15 nukleotidia, ja epiQ S/D-sekvenssi on päällekkäin epiP-lopetuskodonin kanssa, kuten kuviossa 9 esitetään.
5'-suuntaan epiA:sta, B:stä, C:stä ja D:stä voidaan nähdä vielä yksi vastakkaisen orientaation omaava lukualue, joka koodittaa mahdollisesti enintään 148 I | 1 * 20 aminohappoa. Läsnä on tunnusomainen S/D-sekvenssi, muttei mitään aikai- 4 · semmin kuvatuista stafylokokkien aloituskodoneista (ATG, TTG, GTG).
• · « -1-alueensiirrolla seuraa edelleen lukualue, joka ulottuu kuviossa 9 kuvattua • · · eristettyä Bglll-fragmenttia pitemmälle.
• · · • · · 25 Nämä kaksi lukualuetta ovat homologisia avoimelle lukualueelle, gdm Y, joka • · «· l..m on tunnistettu gallidermiinin rakennegeenin vieressä (Schnell, N., Biosynthese ]· der Peptid-Antibiotika Epidermin und Gallidermin; tohtorinväitöskirja, University • · « *· *j of Tubingen, SLT (1989)). S. epidermis-plasmidissa olevia homologisia luku- 30 alueita merkitään epiV ja epiY".
• · « · · • · 36 104498
Esimerkki 4 S. carnosus TM300 transformoitiin plasmidilla pTepi14, joka valmistettiin edellä kuvatulla tavalla vakiotekniikkoja käyttäen. Sitten transformoitua kantaa kasva-5 tettiin BM-väliaineella (katso edellä).
Tulokseksi saatujen transformanttien keksittiin pystyvän inhiboimaan epider-miiniherkkää testikantaa Micrococcus luteus ATCC9341. Tässä määrityksessä lisättiin 1 ml M. luteusin yön yli kasvatettua kantaa (säädettynä OD578-arvoon 10 1,0) 500 ml:aan sulatettua BM-agaria. Petrimaljat sisälsivät tavallisesti 10 ml tätä agaria. S. epidermis-kasvustojen laimennoksia levitettiin agarpinnalle. Epidermiinipositiiviset koloniat havaittiin M. luteus'in kasvunestorenkaana kolonioiden ympärillä.
15 Soluja kasvatettiin seoksessa, jossa oli 3 % lihauutetta, 3,8 % mallasuutetta, 0,6 % CaCI2x2H20 ja 4,6 % NaCI, pH 6,5. Käytetyn transformoinen mukaan lisättiin tetrasykliiniä tai klooriamfenikolia. Kun oli inkuboitu 24 tuntia (37°C, 160 r/min) 500-ml erlenmeyer-pulloissa, joissa oli yksi laajennus sisältäen 100 ml väliainetta, kasvatuslientä sentrifugoitiin 10 min ajan Servall-sentrifugis-’; ‘ ' 20 sa nopeudella 10 000 r/min.
• · · ’· Y Nestemäisten transformanttiviljelmien supernatantit puhdistettiin adsorptiokro- matografialla (XAD1180, epäpuhtaudet eluoitiin vesi/metanolilla (1:1), ja epi- • · · λ!: dermiini eluoitiin metanoli/0,1 N HCI.IIä (9:1); eluaatti säädettiin haihduttami- • · · * · · * 25 sen jälkeen 3 N NaOH:lla pH-arvoon 3,5, ja täytettiin vedellä 10 ml:aan) ja ... havaittiin HPLC-kromatografialla. Inhiboiva aktiivisuus kulki yhdessä kypsän • · · '...m epidermiinin kanssa kohdalla 6,75/6,76 min (katso kuvioita 13Aja 13B).
• · ·
Transformoimattomilla S. carnosus-kasvatusväliaineilla, jotka käsiteltiin samal-• · * • · · *· la lailla, ei ollut huippua tällä eluointialueella (6,72 - 6,79 min), kuvio 13C).
30 Nämä tulokset osoittivat selvästi heterologisen epidermiinibiosynteesin S.
:.: : carnosus'issa ja osoittivat, että pTepi14 sisältää kaiken epidermiinibiosyntee- siin tarvittavan informaation.
104498 37
Koska pTepi14 sisältää 13,5 kiloemäsparin bglll-fragmentin, tämä osoittaa, etteivät epiY’- ja epiY"-lukualueet ole välttämättömiä eoidermiinin tuotannolle tässä järjestelmässä, koska epiY^sta puuttuu translaation aloituskodoni, ja epiY":Ha tämä fragmentti on epätäydellinen.
5
Esimerkki 5
Valmistettiin joukko S. epidermin TCi3298:n epi'-mutantteja etyylimetaanisulfo-naatti(EMS)-mutageneesillä. Tämä menettelytapa suotitettiin tavalla, joka 10 kuvataan teoksessa Miller, J.H., Experiments in molecular genetics, Cold
Spring Harbor Laboratory; Cold Spring Harbor, N.Y. (1972). Mutantit seulottiin epidermiinituotannon tai epidermiinituotannon puuttumisen suhteen käyttämällä edellä kuvattua M. luteus-määritystä. Epi-mutantit siirrettiin useita kertoja niiden stabiilisuuden testaamiseksi. 40 eristetystä epi-mutantista vain 10 oli 15 stabiileja; ei-stabiilit mutantit tuottivat epidermiiniä jälleen usean siirron jälkeen. Kaikki stabiilit epi -mutantit sisälsivät yhä plasmidin pTu32, jossa ei ollut tapahtunut deleetioita tai uudelleenjärjestäytymisiä restriktioendonukleaasianalyysil-lä testattuna. 10 epi‘-mutanttia käytettiin komplementointitutkimuksiin.
‘;* ‘ 20 Plasmidin pTu32 erilaisia restriktiofragmentteja kloonattiin S. carnosus'iin ';; heterologisen epidermiinituotannon testaamiseksi. Fragmentit insertoitiin edel- '·*.* lä kuvattuihin plasmidivektoreihin T181mcs ja pCU1, ja erilaisiin ORF’iin, jotka alikloonattiin kuviossa 16B esitetyllä tavalla.
• · · • · · • · • · · • · · • · · 25 Kloonaus suoritettiin ensin S. carnosus'issa (protoplastitransformaatiolla (Gotz ... et ai., FEMS Microbiol. Lett. 40 (1987) 285-288) tai E. coli'ssa (käyttäen
CaCI2:ta; Cohen et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 69 (1972) 2110-2114), ja sit- • · · ten eristettiin yhdistelmä-DNA-plasmidit ja siirrettiin erilaisiin S. epidermis-epi- • > · *· *; mutantteihin elektroporaatiolla (Augustin et ai., FEMS Microbiol. Lett. 66 30 (1990) 203-208). Molekyylikloonauksessa käytetyt entsyymit saatiin yhtiöistä
Boehringer Mannheim (Mannheim, SLT), BRL (Eggenstein, S LT) tai Pharmacia (Ruotsi). Tämä epäsuora transformointimenetelmä oli välttämätön, koska S. epidermis-kantojen transformointi oli menestyksellinen ainoastaan rengasmai- 38 104498 silla, kovalenttisesti sulkeutuneilla(ccc) plasmideilla; kun käytettiin liittämistuot-teita, voitiin transformantteja eristää vain silloin tällöin.
Komplementointitutkimusten tulokset esitetään yhteenvetona taulukossa 1.
5 • · » · · • 1 ♦ ♦ · • ♦ · » · 1 « · · ·« « • · ♦ • « 1 «»» • · · • 1 1 « * · • ♦ ♦ • · · 39 ^ 104498
li 1 I 1 1 1 ! 1 1 ! I
5 S
X CU
C I
• • a M 3 H Q,
• © I I I I I I I I I I
J 1 e c - - - - -----
H
o e 2
0 CU
u « I I I I I I I I I I
1 & 5-----------a 3 -p • a ö ♦j © ii + tiiiiii£«
I 18 I
S — — -— — _ — _ —— —
V M
g Ή
0 CU
4 P<?' 1 + + + 1 + ' + 1 4-> ~ ΐ ^ S .3
1 rt -P
«3 CC
5 5 & o 'o 3 * la..........3 Ϊ
Ά £ V
s-----------S I
© 51 :td rH
3 ·* -H ·· CU
| 3 f„ + .........yo s ts s e m ** -5 t—i
B S___________00 -H
g rH © ϊ 4 a a .
;'·'· 3 §" tL + + 1 ·· + · + ' + .. .^ S· * S & o .··. a a -p ·. .· «____ c e ·*. «e
a +J -P
t -ho
. S g« +J P
... £ 5 c> + + 1 + + + + + + + c3-P
saa g -h : ·.: J. & -h • · as .j
° m B
·.· · £ *w H
Λ -HO. 0) % &8 + + + + + + + + + + -p,d saa s ·η ... -g -p a
• · · «H Id (U
. -g-----------β v_ .·:·, · o ·. ; ; 3 o -h
* o. S -H 4J
m H Ji C
.·. : . 8* + + + + + + + + + + -3 ·, ·: ~ %. ö o £ © +» ; : ί © c 2 ___________ ·· ©
2 h B
' · H O ©
V : UH
h aa . 1 . ! 1Λ1Α^«η·*η»ιη g 1 1 S 1 S i ! 3 S S I 8 * I _ a + 104498 40
Konstruoitiin sarja plasmideja, jotka sisältävät erilaisia epi-geenejä (A, B, C, D, P ja Q) (kuvio 16B). Kaksi plasmidia pTepi14 ja pTepiABCDQ pystyivät komp-lementoimaan kaikki epi-mutantit. Muut konstruoidut plasmidit pCUepiABC, pTepiAB, pCUepiCDQ, pCUepiB, pCUepiA,, pCUepiA2l pCUepiDQ ja pCUe-5 piQ sisälsivät ilmoitetut geenit.
Erilaiset plasmidit pystyivät komplementoimaan vain määrättyjä mutanttien luokkia, jotka luokitellaan tässä seuraavasti: EMS 5 ja 6 - epiA-mutantit, 10 EMS 18, 33 ja 45 - epiB-mutantit, EMS 12, 13, 19 ja 39 - epiC-mutantit, EMS 11 - epiD-mutantti.
Alla esitetyt tulokset osoittavat, että ainakin neljää ORF:ää epiA, B, C ja D 15 vaaditaan epidermiinin biosynteesiin.
Plasmidi pCUeoiAi sisältää rakennegeenin epiA ainoana täydellisenä ORF:nä, ja lisäksi 1 400 emäsparia ylävirtaan ja 602 emäsparia alavirtaan, viimeisten koodittaessa epiB:n N-terminaalisen pään 190 aminohappoa. Transformointi ;'/ 20 pCUepiA^tä käyttäen antoi tulokseksi epidermiinimutanttien EMS 5 ja 6 komp- lementoinnin, tunnistaen ne epiA-mutanteiksi. Pienempi epiA.n sisältävä Scal- ‘ . fragmentti kloonattuna molempiin orientaatioihin pCUepiA2:een ei komplemen- « jl". toinut epi'-mutantteja kun epiA-promoottori katkaistiin tällä entsyymillä.
• · · • · • · · • · · • · · 25 pCUepiB sisältää BstN1-fragmentin, joka sisältää täydellisen epiB:n ja 100 emäsparin ylävirta-alueen, joka sisältää 75 emäsparia epiA.n 3'-terminaalises- • · · ta päästä; epiA-promoottori puuttuu. Transformointi pCUepiB:llä ei komple- * « · mentoinut mitään S. epidermis-mutanttia epidermiinintuotannolle, mikä ilmaisi, • · · * että epiB.stä puuttuu oma promoottori, ja se käännetään hyvin todennäköisesti 30 yhdessä epiA-promoottorista.
• · a ♦ · · 104498 41 Tämä on johdonmukaista tulosten kanssa, jotka saatiin pTepiAB:llä (kuvio 16B, taulukko 1), joka sisältää epiA-promoottorin ja täydelliset epiA- ja epiB-geenit, ja jonka käyttö komplementoi sekä epiA- että epiB-mutantit.
5 Plasmidi pCUepiCDQ pystyi komplementoimaan sekä epiC- että epiD-mutantit, ja plasmidi pCUepiDQ pystyi komplementoimaan vain epiD-mutantin (taulukko 1). Komplementointi oli kloonatun DNA-fragmentin orientaatiosta riippumatonta. Nämä tulokset osoittavat, että sekä epiCillä että epiD.llä on omat promoottorinsa.
10
Esimerkki 6 epiA-mutatoidut pTu32-johdannaiset eristettiin EMS 5:stä ja 6:sta, ja sekven-söitiin vastaavat epiA-ORF't. Molemmilla plasmideilla oli pistemutaatiot epiA.n 15 sisällä; EMS 5-plasmidissa kodoni AGT (Ser3) oli muuttunut AATiksi (Asn3), ja EMS 6-plasmidissa kodoni GGA (Gly10) muuttui GAA:ksi (Gin10); molemmat näistä mutaatioista sijaitsivat ratkaisevilla paikoilla modifioimattoman epider-miinin sisällä.
14« ‘' 20 Esimerkki 7 4 4« epiB (BstN1-fragmentissa) sijoitettiin plasmidissa pPS4 (kuvio 17) olevan promoottorin kontrollin alle. Tulokseksi saatu plasmidi pPSepiB pystyi komple- • · · • · · mentoimaan epiB-mutantit EMS 18, 33 ja 45. Plasmidi, joka sisälsi epiB:n • · · 25 vastakkkaisessa orientaatiossa, ei komplementoinut mutaatioita. Tämä varmisti myös, ettei pCUepiB pystynyt komplementoimaan mitään EMS-mutanteista, • · · .*:.t koska epiA-promoottori puuttuu.
• · · • · » i · ** *j Esimerkki 8 ” 30 : Kuten edellä kuvattiin, antoi pTepi4:n (kuvio 16A) läsnäolo tulokseksi epider- \*·: miinin biosynteesin S. carnosus'issa, mutta pTepiABCDQ:n läsnäolo ei. DNA:n minimikoko, joka vaaditaan heterologiseen epidermiiniekspressioon 104498 42 S. carnosus'issa, määritettiin komplementoimalla S. carnosus'ia (pTepiABCDQ) distaalisesti sijaitsevilla DNA-fragmenteilla (kuvio 18). S. camosus'in (pTepiABCDQ) transformointi plasmideilla pCA44-90, pCA44-91 ja pCA44-92 johti epidermiinituotantoon, pCA44-92:n sisältäessä täydelliset epiQ-ja 5 epiP-ORF't, jotka koostuivat pienimmästä DNA-fragmentista, joka pystyi komplementoimaan epidermiinituotannon. Nämä tulokset osoittavat, että epi-dermiinibiosynteesigeenit ovat ryhmittyneet 8-ke DNA-fragmentin sisälle, joka sisältää 6 ORF:ää, epiA, B, C, D, Q ja P, ja ettei epidermiinin biosynteesiin osallistu muita geenejä.
10 Näissä esimerkeissä valmistettiin stafylokokkaalista plasmidi-DNA:ta "cleaved lysate"-menetelmällä (Makino et ai., J. Mol. Biol. 190 (1986) 37-44). Solut liuotettiin lisäämällä lysostafiinia (8 pg/ml), ja DNA eristettiin CsCI-sentrifugoinnilla. E. colin supervyyhtiytynyttä (supercoiled) plasmidi-DNA:ta valmistettiin modifi-15 oidulla alkalisella liuotusmenetelmällä (Birnboim et ai., Nucl. Acid Res. 7 (1979) 1513-1518).
PCR-monistetun, epiA:n sisältävän fragmentin DNA-sekvenssi ja S. epidermis-mutanttien kaksi mutatoitua epiA-aluetta, EMS 5 ja 6, määritettiin kaksisäikei- • * · 20 sellä DNA-sekvensöinnillä käyttäen dedeoksiproseduuria (McMaster et ai., « «
Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74 (1977) 4835-4839), yhtiön Pharmacia "sek- " . venssi"-luetteloa ja (0-35S)-dATP:tä yhtiöstä Amersham. DNA-sekvensointiin ja • · · T‘. PCR-monistukseen käytetyt alukkeet syntetisoitiin yhtiön Applied Biosystems • · * DNA-syntetisoijaa käyttämällä. epiA.n PCR-monistukseen käytetyn kahden • · · 25 alukkeen sekvenssit olivat seuraavat: ··· ♦ ♦ · a) 5'-GGGTTTTAGG(TA)ATCCTTTTT AAT ΑΑΑΤΤΠΤAGGAG-3' • » · / . b) 5’-CCTCAAAATTAAGACG(A)GAT(G)CCTCTATTGAAGCCC-3’ • · · • · · • · • t 4 · · * · 30 Aluke a) sitoutuu epiA:n RBS:n eteen, ja aluke b) epiA-lopetuskodonin perään.
*·’ ' Nämä emäkset, jotka ilmaistaan lihavoiduilla kirjaimilla, edustavat poikkeamia • · * « · '· sekvenssistä (esitetty suluissa) käytettiin BamHI-kohtien muodostamiseen 104498 43 epiA:n eteen ja taakse; epiA-promoottori puuttuu monistetusta DNA-fragmentis-ta.
Mutatoidun epiA:n DNA-sekvenssin määrittämiseksi mutanteissa EMS 5 ja 6 5 plasmidi pTu32 eristettiin ja DNA-alue monistettiin PCR:llä käyttäen toista DNA-alukkeiden ryhmää, jotka sitoutuvat ylävirtaan oletetusta epiA-promootto-rialueesta (5'-GGTTTGGTTAI l l TCC-3') ja ylävirtaan lopetuskodonista (51-CCTCAAAATTAAGACAGAGCCTC-3'); epiA:n DNA-sekvenssi esitetään myös julkaisussa: Schnell et ai.; Nature (Lontoo) 333 (1988) 276-278.
10
Esimerkki 9 epiD-geeni eristettiin piasmidista pTepi14, monistettiin PCR-amplifioinnilla ja kloonattiin vektorin plH902 (New England, Biolabs) Stul-restriktiokohtaan 15 "tylppäpää"-liitoksella, sillä tuloksella, että epiD-geeni fuusioidaan ilman keskeyttäviä emäspareja välittömästi tekijä Xa-katkaisukohtaan vektorissa plH902, joka transformoitiin sitten E. coliin.
E. Colin kasvatuksesta saatiin tulokseksi E. colin maltoosia sitovaan proteiiniin 20 fuusioituneen entsyymin EpiD ekspressio. Tulokseksi saatu fuusioproteiini .'J! puhdistettiin affiniteettikromatografialla amyloosikolonnimateriaalilla.
i · ·
Keksittiin, että entsyymi epiD voitiin katkaista fuusioproteiinista alhaisella • · · ,·:·! saannolla tekijällä Xa. Aminohapposekvenssin modifiointi katkaisukohdassa • · · 25 mahdollistaa katkaisunopeuden kasvun.
M» • I « • · ·
Fuusioproteiini sekvensöitiin DNA-tasolla fuusioasemasta epiD:n 3'-päähän. epiD-sekvenssi vastasi S. epidermis', villityyppisekvenssiä. Plasmidi pCA44 on • 1 · · ) ! talletettu Staphylococcus carnosus TM 300:ssa kansainväliseen talletuslaitok- 30 seen DSM Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, j Mascheroder Weg 1b, D-3000 Braunschweig, SLT, numerolla 6863, 23.12.1991.
104498 44
Plasmidi pPS4 on talletettu Staphylococcus carnosus TM 300:ssa numerolla 6864 samaan talletuslaitokseen, 23.12.1991.
Edellä olevasta kuvauksesta ammattimies voi helposti todeta keksinnön oleelli-5 set ominaispiirteet, ja tehdä keksinnön hengestä ja suoja-alasta poikkeamatta erilaisia muutoksia ja modifikaatioita sen sopeuttamiseksi erilaisiin käyttöihin ja tiloihin.
• « · • · I · · < • •Il 9 · • · · • M « · • · · • · · • · • · · • · · • Il • · « • · · • · · • · • · · • M • · 1
I I
4 · 4 I · · · 4 ·

Claims (15)

4s 104498
1. Yhdistelmä-DNA-molekyyli, tunnettu siitä, että se kykenee hybridisoitumaan stringenteissä olosuhteissa EpiB-, EpiC-, EpiD-, EpiP-tai EpiQ-proteiinia koo- 5 dittavaan nukleotidimolekyyliin, jonka sekvenssi on esitetty kuviossa 9 ja sisältyy S. epidermistä olevan 54 kiloemäsparin episomaalisen elementin pTCi32:n Bglll-fragmenttiin, joka mainittu mikro-organismi on talletettu numerolla DSM (Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen) 3095 ja joka koodittaa proteiinia, jolla on EpiB-, EpiC-, EpiD-, EpiP- tai EpiQ-entsyymiaktiivisuutta. 10
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen yhdistelmä-DNA-molekyyli, tunnettu siitä, että se koodittaa ainakin yhtä proteiineista EpiB, EpiC, EpiD, EpiP tai EpiQ, joilla on kuviossa 9 esitetty aminohapposekvenssi.
3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen yhdistelmä-DNA-molekyyli, tunnettu siitä, että se sisältää ainakin yhden EpiB-, EpiC-, EpiD-, EpiP- tai EpiQ-proteiinia koodittavan kuviossa 9 esitetyistä nukleiinihapposekvensseistä.
... 4. Plasmidi, tunnettu siitä, että se sisältää patenttivaatimuksen 1-3 mukaisen , ·.. t 20 DNA-molekyylin promoottorisäätelijäsekvenssin kontrollin alla, joka sekvenssi » « .··. koodittaa proteiinia, jolla on EpiB-, EpiC-, EpiD-, EpiP-ja/tai EpiQ-aktiivisuutta, • · · ',:. mutta josta puuttuu yksi tai useampi muita mainittuja proteiineja tai EpiA:ta • · ·« .·. : koodittavista DNA-sekvensseistä. • · · • · • · · • · · • · ·
5. Proteiini, tunnettu siitä, että se on jonkin patenttivaatimuksen 1 - 4 mukai- sen DNA-molekyylin koodittama.
• · · • · · • · * * ,·,* ; 6. Menetelmä patenttivaatimuksen 5 mukaisen proteiinin valmistamiseksi, • ·· tunnettu siitä, että jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukaan määritelty DNA-30 molekyyli insertoidaan plasmidivektoriin siten, että DNA-molekyyli on promoot- * » « I . torisäätelijän kontrollin alla, tulokseksi saatu plasmidivektori insertoidaan sopi- * · · * ’ vaan isäntään, kasvatetaan mainittua isäntää niin, että proteiini ekspressoituu, ja eristetään proteiini. 4β 104498
7. Menetelmä proteiinin tuottamiseksi, jolla proteiinilla on ainakin yksi lantibioo-tin ominaispiirteistä isännässä, joka on transformoitu jonkin patenttivaatimuksen 1-4 määrittelemällä DNA-sekvenssillä tai -sekvensseillä, jotka ekspres-soituvat mainitun isännän kasvatuksen aikana, tunnettu siitä, että 5 a) aminohapposekvenssiä, joka ei ole epidermiini tai vieras isännälle, koodatava DNA-sekvenssi insertoidaan vektoriplasmidiin siten, että se on säätelijäpro-moottorin kontrollin alla, b) transformoidaan tulokseksi saatu plasmidivektori mainittuun isäntään ja c) kasvatetaan isäntää ekspressoimaan mainittua DNA:ta, ja eristetään proteii-10 ni.
8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että aminohapposekvenssiä, joka ei ole epidermiini tai vieras isännälle, koodittava DNA-sekvenssi ja jonkin patenttivaatimuksen 1-3 määrittelemä DNA-sekvenssi 15 insertoidaan samaan plasmidivektoriin, jota käytetään isännän transformoimiseen.
9. Patenttivaatimuksen 7 tai 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainit- .,. tu DNA-sekvenssi sisältää pre-epidermin pre-peptidisekvenssiä -30 ... -1 koo- « i I !.. t 20 dittaman DNA-sekvenssin tai on insertoitu välittömästi sen jälkeen. i < i
« · * \10. Fuusioproteiini, tunnettu siitä, että se sisältää patenttivaatimuksen 5 mu- tili .·. : kaisen proteiinin ja apuproteiinia. • · · • · • · · • · · • · ·
11. Fuusioproteiini, tunnettu siitä, että se sisältää patenttivaatimuksen 5 mu- kaisen proteiinin fuusioituneena apuproteiiniin niin, että patenttivaatimuksen 5 mukaisen proteiinin ja apuproteiinin välinen liitoskohta voidaan katkaista ent- ; syymillä. • · · • ·
12. Patenttivaatimuksen 10 mukainen fuusioproteiini, tunnettu siitä, että mai- [ nittu apuproteiini helpottaa fuusioproteiinin erittymistä valitusta isännästä. • « · • · · « · 104498 47
13. Patenttivaatimuksen 10 mukainen fuusioproteiini, tunnettu siitä, että apu-proteiini helpottaa puhdistusta affiniteettikromatografialla.
14. Patenttivaatimuksen 10 mukainen fuusioproteiini, tunnettu siitä, että apu-5 proteiini on maltoosia sitova proteiini E. colista.
15. Yhdistelmä-DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että se koodittaa patenttivaatimuksen 10 mukaista fuusioproteiinia. 10 «» · I · * · · 4 · · 4 4 4 4 4 4 4 4 • * • · · • · · • · • · · • · · • · · • · · • t » • · · ··· • · · • · · • » • · · • · · • · • · 4 4 4 4 4 t • 4 · f « „„ 104498 48
FI924909A 1991-10-31 1992-10-29 Biosynteettinen menetelmä kemiallisten yhdisteiden valmistamiseksi FI104498B (fi)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US78423491A 1991-10-31 1991-10-31
US78423491 1991-10-31

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI924909A0 FI924909A0 (fi) 1992-10-29
FI924909A FI924909A (fi) 1993-05-01
FI104498B true FI104498B (fi) 2000-02-15

Family

ID=25131778

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI924909A FI104498B (fi) 1991-10-31 1992-10-29 Biosynteettinen menetelmä kemiallisten yhdisteiden valmistamiseksi

Country Status (18)

Country Link
EP (1) EP0543195B1 (fi)
JP (1) JP4117033B2 (fi)
KR (1) KR100242268B1 (fi)
AT (1) ATE162852T1 (fi)
AU (1) AU661054B2 (fi)
CA (1) CA2081704C (fi)
CZ (2) CZ359396A3 (fi)
DE (1) DE69224269T2 (fi)
DK (1) DK0543195T3 (fi)
ES (1) ES2112289T3 (fi)
FI (1) FI104498B (fi)
GR (1) GR3026465T3 (fi)
HU (1) HU215548B (fi)
IL (1) IL103603A (fi)
MX (1) MX9206265A (fi)
NO (1) NO307474B1 (fi)
NZ (1) NZ244976A (fi)
ZA (1) ZA928397B (fi)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5662898A (en) * 1990-08-20 1997-09-02 Ciba-Geigy Corporation Genes for the synthesis of antipathogenic substances
US5639949A (en) * 1990-08-20 1997-06-17 Ciba-Geigy Corporation Genes for the synthesis of antipathogenic substances
US6117670A (en) * 1994-06-08 2000-09-12 Novartis Finance Corporation Pyrrolnitrin biosynthesis genes and uses thereof
US6964760B2 (en) 1997-06-10 2005-11-15 University Of Florida Research Foundation Antimicrobial polypeptide, nucleic acid, and methods of use
US6475771B1 (en) 1997-06-10 2002-11-05 University Of Florida Research Foundation Antimicrobial polypeptides and methods of use
US5932469A (en) 1997-06-10 1999-08-03 University Of Florida Antimicrobial polypeptide, nucleic acid, and methods of use
US6861236B2 (en) 2002-05-24 2005-03-01 Applied Nanosystems B.V. Export and modification of (poly)peptides in the lantibiotic way
DE10261782A1 (de) * 2002-12-19 2004-07-01 Dr. Petry Genmedics Gmbh Neue Gene und Genprodukte
DK1819816T3 (da) 2004-12-07 2009-01-26 Applied Nanosystems Bv Fremgangsmåder til fremstilling og udskillelse af modificerede peptider
CN117511763A (zh) * 2022-08-05 2024-02-06 天康制药股份有限公司 一种表皮葡萄球菌高密度发酵培养基及其发酵方法和应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8811761D0 (en) * 1988-05-18 1988-06-22 Thomae Gmbh Dr K Biosynthetic process for preparation of chemical compounds

Also Published As

Publication number Publication date
JPH05292952A (ja) 1993-11-09
EP0543195A2 (en) 1993-05-26
CZ284861B6 (cs) 1999-03-17
MX9206265A (es) 1994-05-31
CA2081704C (en) 2007-05-01
DE69224269D1 (de) 1998-03-05
NO924192L (no) 1993-05-03
CA2081704A1 (en) 1993-05-01
CZ326992A3 (en) 1993-09-15
KR100242268B1 (ko) 2000-02-01
DK0543195T3 (da) 1998-09-23
HU215548B (hu) 1999-01-28
NO307474B1 (no) 2000-04-10
IL103603A0 (en) 1993-03-15
EP0543195A3 (en) 1994-06-08
ATE162852T1 (de) 1998-02-15
FI924909A0 (fi) 1992-10-29
KR930008147A (ko) 1993-05-21
FI924909A (fi) 1993-05-01
NO924192D0 (no) 1992-10-30
NZ244976A (en) 1995-07-26
CZ359396A3 (cs) 1999-03-17
ZA928397B (en) 1994-05-02
GR3026465T3 (en) 1998-06-30
CZ286727B6 (cs) 2000-06-14
HU9203434D0 (en) 1993-01-28
HUT65492A (en) 1994-06-28
IL103603A (en) 1999-12-31
ES2112289T3 (es) 1998-04-01
AU661054B2 (en) 1995-07-13
JP4117033B2 (ja) 2008-07-09
EP0543195B1 (en) 1998-01-28
AU2745992A (en) 1993-05-27
DE69224269T2 (de) 1998-06-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1507798B2 (en) Export and modification of (poly)peptides in the lantibiotic way
CA2623547C (en) Method for amidating polypeptides with basic aminoacid c-terminals by means of specific endoproteases
GEIßLER et al. Serine protease EpiP from Staphylococcus epidermidis catalyzes the processing of the epidermin precursor peptide
Ottenwälder et al. Isolation and characterization of genetically engineered gallidermin and epidermin analogs
CA2185343A1 (en) Enhanced secretion of polypeptides
FI104498B (fi) Biosynteettinen menetelmä kemiallisten yhdisteiden valmistamiseksi
US5837485A (en) DNA encoding and biosynthetic process for the preparation of chemical compounds, lantibiotics
EP0342658B1 (en) Biosynthetic process for the preparation of chemical compounds
US5962253A (en) Oxidative decarboxylation of peptides catalyzed by flavoprotein EpiD
IE912035A1 (en) Chemical compound
US5759852A (en) Expression vector containing PL6M promoter and TAT32 ribosome binding site and host cells transformed therewith
JPS60188070A (ja) シグナルペプチドをコードするｄｎａ
Gasson Lantibiotics

Legal Events

Date Code Title Description
MA Patent expired