HU215548B - Rekombináns eljárás EpiB, EpiC, EpiD, EpiP vagy EpiQ enzimatikus aktivitással rendelkező fehérjék előállítására - Google Patents

Abstract

A találmány tárgya rekőmbináns eljárás EpiB, EpiC, EpiD, EpiP vagyEpiQ enzimaktivitással rendelkező fehérjék előállítására, különösen azepidermin biőszintézisében részt vevő EpiB, EpiC, Ep D, EpiP vagy EpiQenzimfehérjék előállítására. A találmány tárgyát képezi tővábbá afenti fehérjéket kódőló rekőmbináns DNS-mőlekűlák, ezeket tartalmazóplazmidők előállítása. A találmány tővábbá őlyan fúziós prőteinekelőállítására is vőnatkőzik melyek egy kisegítő fehérjén kívül a fentifehérjéket tartalmazzák. A találmány tárgyát képezi még egylantibiőtikűm strűktűrális tűlajdőnságú fehérje és ezt kódőló hibridplazmid előállítása is, am ly egy preepidermint és egy fenti fehérjétkódőló DNS-szekvenciát tartalmaz. ŕ

Description

A találmány tárgya rekombináns eljárás EpiB, EpiC, EpiD, EpiP vagy EpiQ enzimaktivitással rendelkező fehérjék előállítására. Közelebbről a találmány az epidermin bioszintézisében részt vevő EpiB, EpiC, EpiD, EpiP vagy EpiQ enzimfehérjék rekombináns géntechnológiával való előállítására vonatkozik.

A találmány tárgyát képezi továbbá a fenti fehérjéket kódoló rekombináns DNS-molekulák, ezeket tartalmazó plazmidok előállítása. A találmány továbbá olyan fúziós proteinek előállítására is vonatkozik, melyek egy kisegítő fehérjén kívül a fenti fehéijéket tartalmazzák. A találmány tárgyát képezi még egy lantibiotikum strukturális tulajdonságú fehérje és ezt kódoló hibrid plazmid előállítása is, amely egy preepidermint és egy fenti fehérjét kódoló DNS-szekvenciát tartalmaz.

Bizonyos polipeptid antibiotikumok, mint a nizin, szubtilin, duramicin, cinnamin, ankovenin, Ro 09-0198 és az epidermín dehidro-aminosavakat és lantioninhidakat tartalmaznak. Ezeket a polipeptideket a különböző mikroorganizmusok megfelelő törzsei termelik, így például a nizint a Streptococcus lactis, a szubtilint a Bacillus subtilis tenyésztése útján állíthatjuk elő.

Ezen antibiotikumok bioszintézisének genetikai alapja eddig nem volt tisztázva, például hogy az antibiotikumok bioszintézise, azaz a bennük lévő szokatlan aminosavak képződése riboszómális szintézis útján vagy multienzim komplex útján megy-e végbe.

Ezenkívül nem volt ismert, hogy az ilyen antibiotikumok prekurzor fehérjéit külön strukturális gének kódolják-e, vagy pedig nagyobb fehéijemolekulák degradációs termékei.

Az epidermín struktúrgénjének meghatározása céljából végzett munkánk során meg tudtuk állapítani, hogy a fenti antibiotikumokként az epidermint külön strukturális gén kódolja, és olyan enzimkomplex végzi a polipeptid előszekvencia feldolgozását, amely dehidro-amino-csoportok és/vagy tioéterhidak képződését indítja meg. Ennek a munkának egy részét már ismertettük a korábbi EP-A 0342 658 számon közzétett európai szabadalmi bejelentésünkben, amelyben leírtakat a jelen bejelentésben nem igényeljük.

Ezenfelül a multienzim komplex szerepet játszhat abban, hogy a protein a sejtmembránon keresztül a táptalaj felülúszóba szekretálódik, és részt vesz a prepeptid feldolgozásában. Ebben az összefüggésben az ilyen aktivitás kapcsolatban lehet egy, a prepolipeptidben lévő preszekvenciával, mint ahogy ez a preepidermin -30tól -1-ig teijedő szekvenciája esetén fennáll (lásd alább).

Az alábbiakban az ábrák leírása következik.

Az 1. ábrán az epidermín strukturális gén (epiA) nukleotidszekvenciáját és a preepidermin kikövetkeztetett aminosavszekvenciáját mutatjuk be. A Shine-Dalgamo (S/D) szekvenciát bekereteztük, és a proteolitikus hasítási helyet, ahol a propeptid feldolgozása történik, nyíllal jelöltük. A fordított ismétlődő szakaszokat aláhúztuk, és a potenciális stop kodonokat am (amber) és oc (ochre) jelzéssel láttuk el.

A 2.A. ábrán a preepiderminre egy Hyron program segítségével kiszámított grafikon látható, melyben a hasábdiagramok a következőket ábrázolják: (a) flexibilitás; (b) hidropátia; (c) hidrofilicitás; (d) hajlam a kanyarulatképződésre; (e) β-lemez; és (f) α-hélix konformáció.

A 2.B. ábrán a preepiderminre alkotott hélix kördiagram látható, mely azt mutatja, hogy az N-terminális vég - megfelelő környezetben - részleges a-helikális konformációt vehet fel.

A 3. ábra az epidermín keletkezésének feltételezett folyamatát ábrázolja. A transzlatált polipeptid (preepidermin) 52 aminosavmaradékból áll. A szerkezetre vonatkozó feltételezések részleges α-helikális N-terminális végre utalnak, melyből a -30-tól -1-ig teijedő csoportok amfifil α-hélix konformációt képezhetnek. A feltüntetett Ser- és Thr-csoportoknál (a) vízkilépés történik. A Thr⁺¹⁴ csoportot kivéve, a vízkilépést kéntartalmú gyűrű (b) képződése követi és a C-terminális végnél dekarboxileződés (c), majd kettőskötés-képződés (d) jön létre, s így keletkezik a proepidermin. A proepidermin szerkezetéből proteolitikus hasítás révén keletkezik az epidermín.

A 4. ábra az epidermín szerkezetét mutatja be. A gyűrűs szerkezeteket A, B, C, D és E betűkkel jelöltük, és bemutattuk a mezo-lantionin és treo-metillantíonin aminosavak szerkezetét.

Az 5. ábrán lantionin-antibiotikumokban talált olyan szokatlan aminosavak láthatók, amelyek a találmány szerinti eljárás alkalmazásával kapott peptidtermékekben képződhetnek.

A 6. ábra sematikusan ábrázolja a pCUl plazmidnak a pCLPlOO plazmidból és a pUC19 plazmidból való előállítási folyamatát.

A 7.A. ábrán a 2. példa szerint készített izolált táptalaj elúciós képe látható.

A 7.B. ábrán egy gallidermin tartalmú standard elúciós képe látható. A gallidermin 7,54 percnél oldódik le.

A 8. ábra az S. epidermis pTü32 plazmid pTü32 episzómája genetikai analízisét ábrázolja, ahol

8.A.: a pTü32 episzóma restrikciós térképe;

8.B.: a pTü32 13,5 kb méretű BglII fragmentumának restrikciós térképe. A betöltött nyíl az epiA strukturális génnek felel meg. Az üres nyilak az epiB, C, D, P és Q leolvasási kereteit jelentik;

8.C.: a különböző restrikciós enzimekkel (EcoRI, EcoRV, BglII, Sphl) emésztett pTü32 Southern hibridizálása egy epiA-ra specifikus 15-mer oligonukleotid (5 ’-CACATCCAGGAGTAC- 3 ’) használatával.

A 9. ábrán az epiA, B, C, D, P, Q, Y’ és Y” leolvasási kereteket tartalmazó pTü32 BglII/Hpall fragmentumának nukleotidszekvenciája és a megfelelő proteinekre levezetett aminosavszekvenciák láthatók. Az S/D szekvenciákat és a terminációs szerkezeteket felül vonallal jelöltük. Az IR fordított ismétlődő szakaszokat jelent. Az epiY, epiA, epiB, epiC, epiD, epiQ és epiP nyílt leolvasási keretek kezdetét vastag betűk jelzik. Az N-terminális aminosavcsoportokat (feltehető transzlációs starthelyek) bekereteztük.

HU 215 548 Β

A 10. ábra az epiA (10A) és epiB (10B) S. epidermisben való expressziójának Northern biot analízise eredményeit tartalmazza. Az ossz RNS-t (40 μg, 1-es, 3-as és 5-ös nyomsáv; 20 μg, 2-es, 4-es és 6-os nyomsáv) 1,2%-os agaróz gélben választottuk el, és a hibridizálást egy ellenkező értelmű (antiszensz) RNSszondával végeztük (SP6 átirat. A szűrőket növekvő szigorúsági körülmények mellett mostuk; 1-es, 2-es nyomsáv: lxSSC, 0,1% SDS, expozíciós idő 4 óra; 3-as, 4-es nyomsáv: 5 χ SSC, 0,1% SDS, expozíciós idő 16 óra; 5-ös, 6-os nyomsáv: 0,1 χ SSC, 0,1% SDS, expozíciós idő 3 nap). A 235. és 165. pozíciójú RNSeket méretstandardokként használtuk.

All. ábra az EpiP és a különböző szerinproteázok szekvenciái között az aktív helyeknél lévő homológiákat mutatja be [SUBSI, a B. subtilis szubtilizin 1168 prekurzora (Terzaghi et al., Appl. Microbiol., 29, 807-813 (1975); ISPI, B. subtilis eredetű fő intracelluláris szerinproteáz (Maniatis et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2. kiadás, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1990); SUMYTV, Thermoactinomyces vulgárisból származó termitáz (Stahl et al., J. Bacteriol., 158, 411-418 (1984)]. A nagymértékben állandó aszparaginsav- (Asp), hisztidin- (His) és szerin(Ser) csoportokat csillagokkal, a hasonló aminosavakat pontokkal, az azonos aminosavakat pedig kettősponttal jelöltük.

A 12. ábra az EpiQ- és PhoB-szekvenciák közti homológiákat mutatja be [Makino et al., J. Mól. Bioi., 190, 37-44 (1986)]. A hasonló aminosavcsoportokat pontokkal és az azonos aminosavcsoportokat kettősponttal jelöltük.

A 13. ábrán az S. camosus ΊΜ300 által termelt epidermin HPLC elúciós képe látható.

13.A.: az epidermin standard elúciós képe (6,75 perc, nyíllal jelezve):

13.B.: az S. camosus TM300 pTepil4 tenyészet szűrletéből izolált epidermin standard elúciós képe (6,75 perc, nyíllal jelezve); a tenyészet szűrletét XAD 1180-ra adszorbeáltuk, és végül bepárlással koncentráltuk;

13.C.: a transzformált S. camosus TM300 tenyészet 13.B szerint kezelt szűrletének elúciós képe; a vastag vonal az epidermin elúciós szakaszát jelzi.

A 14. ábra a pT181mcs szerkesztését ábrázolja. ApUC19 PvuII³⁰⁹-PvuII⁶³¹ fragmentumát, lacZ részét és a többszörös klónozó helyet (mcs) beépítettük a pT 181 pren belül lévő egyetlen Ndel helyre [Gennaro et al., J. Bacteriol., 169, 2601-2610 (1987); Kahn et al., Plasmid, 10, 251-259 (1983)] tompavég-ligálással. A lacZ egy prehez képest ellenkező irányítottságú. Fekete keret, megszakított pre; üres keret, beépített pUC19 fragmentum.

A 15. ábra a pCUl szerkesztését ábrázolja. A pC194 [Horinouchi et al., J. Bacteriol., 750, 815-825 (1982)] egy származéka, a pCLPlOO egyetlen PstI helyet tartalmaz, és úgy állítjuk elő, hogy felnyitjuk a pC194-et a Hindlll helyen, deletáljuk a végeket Bal31gyel (körülbelül 950 bp), és tompavég-ligálással beépítünk egy PstI linkért. Ezután a pCUl-et a pCLPlOO és pUC19 [Vieira et al., Gene, 19, 259-268 (1982)] tompavég-ligálásával - egyetlen PstI, illetve Ndel helyénél - állítjuk elő. A lacZ-vel szemben lévő többszörös klónozó helyet (mcs) használtuk a különböző géneket tartalmazó fragmentumok klónozásához. Ez az ingázó vektor mind Staphylococcusokban, mind E. coliban replikálódik.

A 16. ábrán a következőket ábrázoljuk:

A) A pTepil4-et úgy állítjuk elő, hogy a pTü32 14 kb méretű Bglll fragmentumát beklónozzuk a pT181mcs-be. Ez a fragmentum tartalmazza az epidermin S. camosusban való termelődéséhez szükséges teljes genetikai információt. A feltüntetett nyílt leolvasási kereteket (ORF) és transzkripciójuk irányát (nyilakkal jelezve) a DNS-szekvenciából vezettük le. Az epiA strukturális gént fekete nyíl jelzi.

B) A különböző pTepil4 DNS-fragmentumokat a pT181mcs-be (pT...) vagy a pCUl-be (pCU...) szubklónoztuk. Az illető plazmidokat az S. epidermis Epi-mutánsok kiegészítésére használtuk. A plazmidban jelen lévő teljes leolvasási kereteket feltüntettük.

A 17. ábra a pPS4epiA és pPS4epiB szerkesztését mutatja be.

A pPS4 a pLipPSl egy származéka [Liebl et al., Mól. Gén. Génét., 204, 166-173 (1986)]. Egyetlen BamHI helyet építünk be egy hosszú, Staphylococcusból származó promoter után. Ha géneket klónozunk be a BamHI helyre, az ORF2 promoter szabályozása alá, ez általában jó expressziót eredményez Staphylococcusokban. Az epiA-t PCR-rel sokszoroztuk. Az epiA szomszédos BamHI helyeket tartalmazott. Az epiB-t tartalmazó 3,2 kb méretű BstNI fragmentumot tompavég-ligálással építettük be. Az illető EMS-mutánsokat csak akkor egészítettük ki, ha az epiA és epiB az ORF2 promoter szabályozása alatt áll.

lip: lipáz gén; cat: kloramfenikol-acetil-transzferáz gén; ORF2: S. camosus specifikus, csonka ORF:

A 18. ábra S. camosusban (pTepiABCDQ) az epidermintermeléshez való kiegészítést mutatja be szomszédos DNS-fragmentumok révén. A fragmentumokat a kompatíbilis pCA44 plazmidba szubklónoztuk.

A technika állása

Az EP-A 0342658 számú európai közrebocsátási irat olyan plazmidot tartalmazó bakteriális gazdasejtekre vonatkozik, amely plazmid által kódolt polipeptidet a szóban forgó gazdasejt normál körülmények között nem termeli. Ez a gazdasejt - tenyésztése folyamán - olyan polipeptid képződését előidéző multienzim komplexet termel, amely polipeptid legalább egy dehidro-aminosavat és/vagy legalább egy lantioninhidat tartalmaz, és az említett polipeptid idegen az említett gazdasejt szempontjából.

Alkalmas multienzim komplex az, amely a következő műveletek közül legalább egyet meg tud oldani: vízeltávolítás és szulfídhídképzés. A komplex dekarboxilezést és kettőskötés-képzést is végrehajthat:

A fenti iratban ismertetett eljárás kivitelezéséhez azok a gazdasejtek alkalmasak, amelyek genetikai anyaguk módosítása nélkül képesek dehidro-aminosav-csoportot és/vagy lantioninhidat és/vagy metil-lantioninhi3

HU 215 548 Β dat tartalmazó polipeptidek termelésére. Ilyen gazdasejtek például a következők: Streptococcus lactis, Bacillus subtilis, Streptomyces cinnamoneus, Streptomyces sp., Streptoverticullum griseoverticillum, Staphylococcus epidermis, Staphylococcus epidermis 5, Staphylococcus gallinarum és ezek mutánsai, mint például az S. epidermis DSM 3095 egy mutáns törzse, mely nem képes epidermin termelésére.

A különösen hasznos törzsek közé tartozik a Staphylococcus gallinarum (F16/P57) Tü 3928 törzs, melyet a bejelentők 1988. május 18-án helyeztek letétbe a Budapesti Egyezmény alapján a Deutsche Sammlung von Microorganismen (DSM) intézményben, Tü 3928 DSM 4616 letéti számon és a Staphylococcus epidermis DSM 3095, melyet a bejelentők a Budapesti Egyezmény alapján 1984. október 26-án helyeztek letétbe a Deutsche Sammlung von Microorganismen intézménynél.

Annak érdekében, hogy egy megfelelő gazdasejtet transzformáljunk, ismert génsebészeti technikákkal kell a megfelelő plazmidot módosítanunk.

Előnyös, ha egy olyan gazdasejtből - amely legalább egy dehidro-aminosav-csoportot és/vagy legalább egy szulfidhidat tartalmazó polipeptidet termel - származó plazmidot kezelünk úgy, hogy egy prepolipeptidet kódoló gént módosítunk vagy helyettesítünk, hogy olyan plazmid keletkezzék, amely egy, az említett gazdasejthez idegen polipeptidet kódol, majd az említett gazdasejtet a megváltoztatott plazmiddal transzformáljuk.

A prepolipeptidet kódoló gén helyettesítésére vagy módosítására a számos különböző módszer közül bármelyiket használhatjuk.

A kívánt vegyület prepolipeptid-szekvenciáját kódoló DNS-t kémiai szintézissel állíthatjuk elő. Megfelelő kémiai szintéziseket ír le a következő közlemény: Anal. Biochem., 121, 365 (1982). Az ismert technikákkal például 60-100 bázis tartalomig termelhetők polinukleotidok.

A megfelelően védett nukleotidokat vagy az Agarwal és munkatársai [Angew. Chem., 84, 489 (1972)] féle foszfotriészter módszerrel, vagy a Reesen-féle [Tetrahedron, 39, 3 (1983)] foszfotriészter-módszerrel vagy a Letsinger és munkatársai szerinti [J. Am. Chem. Soc., 98, 3655 (1976)] foszfit-triészter-módszerrel vagy foszforamidit-módszerrel kapcsolhatjuk össze. A szilárd fázisú módszer egyszerűsíti a polinukleotidok szintézisét.

A kettős szálú DNS-t (ds-DNS) enzimes módszerrel állíthatjuk elő kémiai úton előállított rövid, de átfedő szegmentumokból.

Felhasználhatunk például két DNS-szálból álló, egymást fedő polinukleotid-szekvenciákat, amelyeket a helyes konformációban bázispárosodás tart össze, és amelyeket ezután a DNS-ligáz enzim kémiai kötéssel kapcsol össze [Khorana et al., J. Bioi. Chem., 251, 565 (1976)].

Egy másik lehetőség szerint a két DNS-szálból egyegy polinukleotid-szekvenciát rövid átfedő szegmentummal a négy szükséges dezoxinukleozid-trifoszfát jelenlétében egy DNS-polimerázzal, például DNS-polimeráz I-gyel vagy a polimeráz I Klenow fragmentjével vagy T4 DNS-polimerázzal vagy reverz transzkriptázzal inkubálunk. A két polinukleotidszekvenciát ilyen módon a helyes elhelyezkedésben kapcsolja össze a bázispárosodás, majd az enzim révén kiegészül a szükséges nukleotidokkal, s így egy teljes kettős szálú DNSkeletkezik [Narany et al., Anal. Biochem., 121, 365 (1982)].

Polipeptidet kódoló DNS előállítására szolgál egy másik alkalmas módszer, mely szerint egy szövet vagy sejttenyészet vagy mikroorganizmus genomiális DNSéből származó DNS-t izolálunk úgy, hogy a sejteket például SDS-sel vagy proteináz K-val vagy kívánt esetben mechanikus módszerrel lizáljuk, és a DNS-t ismételt fenolos extrakcióval proteinmentesítjük.

Az RNS-előnyösen RNázzal emészthető. A kapott nyers DNS-t részlegesen emésztjük alkalmas restrikciós enzimekkel, például HaelII-mal és Alul-gyel, a fragmentumokat izoláljuk, majd megfelelő fágban vagy kozmidban - például Charon 4A vagy EMBL-3 fágban sokszorosítjuk, ezután a kívánt szekvenciákra vizsgáljuk, például radioaktív jelzett DNS-szondával.

A kívánt polipeptidet kódoló DNS-t úgy is megkaphatjuk, ha az izolált mRNS-t reverz transzkriptázzal cDNS-sé alakítjuk. Ez az előnyben részesített módszer, ha a DNS szerkezete ismeretlen. E módszer szerint a DNS-t genomiális DNS-ből kapjuk, cDNS gyűjteményben, mRNS-en keresztül. A cDNS gyűjtemény azt a genetikai információt tartalmazza, amely a sejtekből izolált mRNS-sel komplementer.

Egy cDNS gyűjteményt úgy állítunk elő, hogy mRNS-t izolálunk a kívánt alap (lehetőleg nem módosított) proteint kifejező sejtekből. A mRNS-t kétszálú cDNS-sé konvertáljuk.

A szakterületen jól ismert standard módszereket alkalmazzuk a mRNS előállítására. A sejtmembránt elroncsoljuk, ekkor a sejt tartalma kiszabadul, és innen izoláljuk a mRNS-t. A sejtmembránt előnyösen fizikai módszerekkel roncsoljuk vagy detergensekkel lizáljuk, például SDS-sel, guanidin-tiocianáttal, bizonyos sók által biztosított körülményekkel vagy homogenizálással, előnyösen keveréssel. A mRNS-t standard módszerekkel izoláljuk: fenolos extrahálást, etanolos kicsapást, centrifugálást és kromatografálást alkalmazunk, előnyösen több módszert kombinálunk. A centrifugálást előnyösen gradiensen keresztül végezzük, például cézium-kloridgrádiensben. Előnyös az oszlopkromatográfia alkalmazása, főként az oligo-dT oszlopoké.

Az ossz mRNS-t közvetlenül ds-cDNS-sé (kettős szálú cDNS-sé) konvertálhatjuk a szakterületen használatos módszerek alkalmazásával. A kívánt polipeptidet kódoló mRNS-t előnyösen tovább dúsíthatjuk számos technika felhasználásával, ilyenek az elektroforézis, kromatográfia és a centrifugálás, főként a szacharóz grádiens centrifugálás.

A kívánt polipeptidet kódoló mRNS-t tartalmazó frakciókat különböző módszerekkel azonosíthatjuk, ilyenek az in vivő vagy in vitro transzlációs módszerek. Ezután az aktuális aktivitást vizsgáljuk, vagy ha ismer4

HU 215 548 Β jük a nukleotidszekvenciát, egy oligonukleotid szondával hibridizálást végzünk.

Az in vivő transzlációs módszerek prokarióta vagy eukarióta rendszerek lehetnek. Egy előnyös in vivő transzlációs rendszer a Xenopus laevis petesejtrendszer [lásd: Maniatis et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982)]. In vitro rendszer például a búzacsíra és a nyúl retikulocitalizátum rendszer. Mindkettő a kereskedelemben beszerezhető.

Minden mRNS-elegyből, akár nem frakcionált, akár frakcionált mRNS-ből származik, kaphatunk ds-cDNS-t a szakterületen ismert módszerek alkalmazásával [előnyös általános módszereket írnak le Maniatis és munkatársai (lásd fentebb), valamint Okayama és Berg a Molecular and Cell Biology, 2, 161-170 (1982) és Heidecker a Nucleic Acid Research, II, 4891-4906 (1983) közleményekben], A mRNS-t általában először ss-cDNS-sé konvertáljuk reverz transzkriptáz vagy DNS-polimeráz I (Klenow fragment) alkalmazásával. A ds-cDNS szintézisének a megindításához két különböző módszert használhatunk. Az egyik módszer szerint az ss-cDNS-ből természetes hurkot formálunk. A másik módszer szerint az ss-cDNS-t homopolimer farokkal - poli-dC vagy poli-dT - látjuk el.

Azt az mRNS-frakciót, amelyben a megfelelő polipeptid a legmagasabb aktivitást mutatja az észlelőrendszer szerint, komplementer cDNS-re írjuk át a szakterületen jól ismert módszerek segítségével. A mRNS-t és a primerként használt oligo-dT-t összekeverjük, ezután a dNTP-ket kiindulási anyag gyanánt hozzáadjuk, és a cDNS-mRNS hibrid molekula szintézisét a reverz transzkriptáz enzimmel valósítjuk meg. Az RNS-molekulákat nátrium-hidroxid hozzáadásával bontjuk meg. Hozzákeverünk DNS-polimerázt, előnyösen a DNS-polimeráz I Klenow fragmentjét, és az elegyet alkalmas hőmérsékleten, előnyösen 12-15 °C-on inkubáljuk. Az elegyet SÍ nukleázzal inkubáljuk, és így megkapjuk a kívánt polipeptidet kódoló mRNS-nek megfelelő ds-cDNS-t.

Sokszorozás céljából a kapott ds-cDNS-t megfelelő vektorba, például a pUC-KO plazmidba illeszthetjük be, és a hibrid vektort megfelelő gazdasejt, például E. coli HB101 alkalmazásával szaporíthatjuk. A hibrid vektorok újbóli izolálása és az izolált cDNS visszanyerése lehetővé teszi, hogy a kívánt polipeptidet kódoló DNS szerkezetét meghatározzuk.

Egy hibrid vektort úgy állíthatunk elő, hogy a kívánt szekvenciájú polipeptidet kódoló DNS-t megfelelő vektorba visszük be.

A megfelelő vektorok a hordozói az integrált passenger DNS-nek, amely a gazda-mikroorganizmus transzformálására használható fel.

Vektorokként olyan mikroorganizmusokból származó plazmidok alkalmazhatók, amelyek transzformálatlan állapotban dehidro-amino- és/vagy szulfidcsoportokat tartalmazó polipeptideket termelnek. A megfelelő vektorok meghatározott pozícióban tartalmazzák a beépült DNS-t.

Az ilyen vektorok általában olyan replikont és szabályozó szekvenciát, azaz promotert tartalmazhatnak, amelyek abból a gazdasejtből vagy abból a gazdasejttel kompatíbilis fajból származnak, amelyekben ezeket használjuk. A vektor rendszerint egy replikációs helyet hordoz, és tartalmazhat még olyan szekvenciákat (marker géneket), amelyek képesek a transzformált sejtekben a fenotípusos szelektálást biztosítani. Az alkalmas marker gének antibiotikum-rezisztenciát vagy nehézfémekkel szembeni rezisztenciát fejtenek ki, vagy kiegészítik a gazdasejt hiányos genetikai állományát. A vektorok további hasznos szekvenciái az erősítő (enhancer) és aktivátor szekvenciák.

Megfelel kezdő vektor a Staphylococcus epidermis (DSM 3095)-ből származó 54 kb méretű pEpi32 plazmid, mely azonos a pTü32 plazmiddal. Ez a plazmid jellemzését lásd alább - egy 52 aminosavból álló prepeptidet kódoló epiA gént tartalmaz, amely egy tetraciklusos, 21 aminosavból álló peptid amid-antibiotikummá dolgozódik fel. A passenger DNS-t hordozó vektort hibrid vektornak nevezzük.

A kívánt DNS-t hagyományos módszerekkel illeszthetjük be a kiindulási (start) vektorba.

A start vektort például először megfelelő restrikciós enzimekkel - például a pEpi32 plazmidot HindlII-mal, BamHI-gyel és EcoRI-gyel - linearizáljuk, azután dG farokkal látjuk el dGTP és terminális dezoxinukleotidil transzferáz jelenlétében. A kettős szálú cDNS inszertumot dC farkakkal látjuk el dCTP és terminális dezoxinukleotidil-transzferáz jelenlétében. A cDNS és a vektor kombinálása eredményezi a hibrid vektort. A bakteriofágok - ilyen a lambda fág - az előnyösek genomiális gyűjtemények létrehozásánál. A lambda klónozórendszert Maniatis (lásd fent) ismertette. A megfelelő vektor DNS-t teljesen megemésztjük az alkalmas restrikciós enzimmel, majd a jobb és a bal kart elválasztjuk a centrális fragmentumtól sebesség-gradiens centrifugálással vagy gélelektroforézissel. Egy másik módszer szerint restrikciós enzimekkel részlegesen emésztjük azokat a belső fragmentumokat, amelyeknek nincs felismerő helyük a bal és a jobb karban. Az izolált genomiális DNS részlegesen elemészthető 13-20 kb hosszúságú fragmentumokra. Ezután a karokat az idegen DNS azon fragmentumaival ligáljuk, amelyeknek a végződése e karokkal kompatíbilis.

A megfelelő DNS-inszertumot abból az eredeti vektorból, amelyet az eredeti klónozáshoz használtunk, megfelelő expressziós vektorba klónozzuk be. Ehhez a véghez megfelelő restrikciós enzimeket használunk lehetőleg oxonukleonokkal kombinálva - a kívánt DNS-fragmentumok előállítása céljából.

A DNS-inszertum egy alkalmasból ismert plazmid vektor többszörös klónozó helyére is szubklónozható, például a pC194, pT181 és a pUBllO származékainak HindlII/BamHI/EcoRI restrikciós helyére.

A fentiekben (EP-A 0342 658 számú közrebocsátási irat) ismertetett eljárás felhasználható ismert peptidek és hormonok származékainak az előállítására, amelyekben a módosítatlan peptid cisztein-csoportját szulfidhíd tartalmú aminosavakkal helyettesítjük, továbbá a szerint

HU 215 548 Β és a treonint a megfelelő dehidro-aminosav-csoportokkal helyettesítjük.

Ezeket a fragmentumokat megfelelő expressziós vektorba integráljuk, vagy úgy, hogy közvetlenül a kohezív végeket használjuk fel, vagy úgy, hogy hozzáadjuk a megfelelő, kémiailag szintetizált oligonukleotidhidakat. A végek módosítására például a HindlII és a BglII használható. A módszer nem korlátozódik semmilyen speciális restrikciós enzimre. Bármilyen kívánt kapcsolatot kialakíthatunk az expressziós vektor és a DNSinszertum között, megfelelő restrikciós enzimeknek kémiailag szintetizált oligonukleotidokkal való kombinációját alkalmazva.

Olyan megfelelő DNS-inszertumokat is előállíthatunk, amelyek helyre irányuló mutagenezist tartalmazó polipeptidet kódolnak.

Számos különböző módszert használhatunk az illető DNS mutációinak indukálására abból a célból, hogy a kívánt mutánsokhoz jussunk.

Az egyik módszer szerint a természetes vagy alapgén egy fragmentumát, amely a mutagenizálandó szakaszt kódoló szekvenciákat tartalmazza, először beépítjük egy fág replikatív formájába, például az M13mp8ba, és így kapjuk az M13mp8PA fágot. Ezután egy szintetikus oligonukleotidot - amely komplementer a beépített szekvenciákkal, de egy vagy több olyan nukleotidtripletet tartalmaz, melyek a szubsztituálandó aminosavat kódolják - hozzáigazítunk az M13mp8PA egyszálú formájához, hogy egy kettős szálú szakasz keletkezzék. Ez a szakasz printerként szolgál ahhoz, hogy a DNS-polimeráz I szintetizálja a hátralévő komplementer szálat. Replikáció és azonosítás után a mutáns szekvenciát tovább módosíthatjuk, vagy megfelelő vektor szerkesztéséhez használhatjuk, a mutált polipeptid kifejezése céljára.

Az epiderminnel végzett munka folyamán az epidermin preszekvenciára javasolt alkalmas pentapeptidszegmentumból (LysPhe IleCysThr) való levezetés alapján egy „lötyögő” DNS-szondát készítettünk: 5’-GTG(A)CAT(G/A)ATG(A)AAT(C)TT-3’. Ezt a DNS-szondát az S. epidermis (DSM 3095) plazmid DNS-ével hibridizáltuk.

Az izolált plazmid restrikciós analízise a következő eredményre vezetett: EcoRI-gyel hét DNS-fragmentumot (16,11, 10, 6,5, 5,5, 3,5 és 2,5 kb méretű fragmentum), HindlII-mal kilenc DNS-fragmentumot (17, 14, 10, 5,3, 2,8, 1,8, 0,8, 0,6 és 0,5 kb méretű fragmentum) és BamHI-gyel öt DNS-fragmentumot (20, 19, 10, 3 és 1 kb méretű fragmentum) kaptunk.

Az 5,4 kb méretű HindlII fragmentumot klónoztuk és rehibridizáltuk, s így az epiA strukturális gént egy 2,2 kb méretű EcoRI/BglII fragmentumon belül lokalizáltuk.

Hibridizációs szondaként 24 különböző 14-mer-ből álló keveréket használtunk. A szondát, mint szekvenáló prímért, 30-szoros feleslegben alkalmaztuk a Novick és munkatársai [Ann. N. Y. Acad. Sci., 182, 279-294 (1971)], J. Southern [J. Molec. Bioi., 98, 503-517 (1975)] és Heinrich és munkatársai [Molecul. gén. Génét., 209, 563-569 (1987)] által leírt technikáknak megfelelően. Az epidermin peptidszekvencia segítségével azonosítottuk a nyílt leolvasási keretet. Egyetlen metionin kódon van megfelelő távolságban a Shine-Dalgamo-szekvenciától. A preepidermin strukturális gén a TAA stop kodonnal végződik, a preepidermin 52 aminosavból áll (1. ábra), és ez dolgozódik fel epiderminné az Arg-¹ és Ile+¹ között. Tehát világosan látszik, hogy a preepidermin nem egy nagyobb protein degradációs terméke, hanem külön strukturális gén kódolja.

Tehát váratlanul nyilvánvalóvá vált, hogy az antibiotikumok prekurzor proteinjeit külön strukturális gének kódolják.

A másodlagos szerkezetre vonatkozóan (α, β, kanyarok) flexibilitás, hidropátia, hidrofilicitás (2.A. ábra) számított profilja és a hélixszerkezet kombinációjával körgrafikont (2.B. ábra) készítettünk egy Hycon program segítségével. A preepiderminnél -30-tól -8-ig nagyszámú α-hélix előfordulás valószínűsíthető, míg a C-terminális 1-22 szakasznál, mely a proepiderminnek felel meg, igen nagy a kanyarulatok előfordulásának a valószínűsége. Ezenkívül a számított görbe lefutása világosan mutatja, hogy az N-terminális rész inkább lipofil. Úgy tűnik, hogy az N-terminális rész -30-tól -8-ig részben egy amfifil α-hélixbe csavarodik.

A preepidermin -30-tól -1-ig terjedő N-terminális szegmentuma egyetlen ciszteincsoportot sem tartalmaz, míg az 1 -22-ig terjedő C-terminális szegmentum tartalmazza azt a 4 ciszteincsoportot, amelyek részt vesznek a szulfidhídképzésben. A -30-tól -1-ig terjedő szekvencia több hasítási helyet tartalmaz endoproteázok számára, míg - még a preepidermin állapotban is - az 1-22 szekvencia erősen rezisztens a proteolitikus bontással szemben.

Az érett antibiotikumot csak a tripszin tudja megtámadni a 13. pozícióban lévő Lys-nél. A feldolgozás helye, az Arg-'-Ile⁺¹ hidrofil tulajdonságú és megtámadható, ami a kanyarulatképző Pro ² csoportnak tulajdonítható.

A különböző enzimreakciók, amelyek az antibiotikumok - mint például az epidermin - termelésében előfordulnak, az 1-22 polipeptid részben módosulásokat hoznak létre: ilyen az N-terminális -30-tól -1-ig terjedő prepeptid fragmentum hasítása és az érett antibiotikum szekréciója (lásd a 3. és 4. ábrát).

Az enzimes módosulások a peptid fragmentum hasadása előtt következnek be. Az enzimes módosulás abból áll, hogy víz lép ki a szerin- és treonin-csoportból az 5, 16, 19, illetve 8, 14 pozícióban, majd dehidro-alanin és dehidro-butirin keletkezik. Előfordul, hogy a 2,11,21 és 22 pozícióban lévő Cys-csoportok tiolcsoportjai addicionálnak a C=C kettős kötésekhez, s ez a reakció mezo-lantionint vagy (2S, 3S, 6R)-3-metil-lantionin hidakat eredményez. Ezenkívül a 22-es helyzetű csoportban a dekarboxileződés és a kettőskötés-képződés a Cterminális S-(2-amino-vinil)-D-ciszteint hozza létre. A C-terminálisban elhelyezkedő dehidro-aminosavaknak a reakciója teljes sztereospecificitással megy végbe az epiderminben, nizinben és szubtilinben. Ennek megfelelően, a módosulás folyamán a kilépéses-addícíós re6

HU 215 548 Β akciók a preepidermin L-Ser- és L-Thr-csoportjainál lévő C_a szénatomok konfigurációjának megváltozását vonják maguk után, s ezzel D-konfigurációjú C_a-atomok keletkeznek. Másrészt, a félciszteinek L-konfigurációja megmarad. Négy kéntartalmú gyűrű képződik egymás után ugyanannál a katalitikus helynél, amelyeket az Nterminálisnál amfifil α-hélixszel való kölcsönhatás tart fenn. Csak a Thr+¹⁴ dehidratálódik cisztein nélkül. Ez a pozíció (Lys⁺¹³-Dhb¹⁴) alkotja azt az enzimes hasítási helyet, amelynél a tripszin inaktiválja az antibiotikus hatású epidermint. A kéntartalmú gyűrű képződése folyamán nő a C-terminális merevség és a hidrofobicitás, ez elősegítheti a proepidermin kölcsönhatását a lipid kettősréteggel, továbbá transzlokációt is indukálhat.

Végül a hidrofil α-helikális N-terminális szakaszt (-3O-tól -1-ig) egy specifikus proteáz lehasítja a fent leírt jellemző hasítási helynél.

A fent leírt technikákkal a lantibiotikumokat kódoló plazmidokat vagy a saját polipeptidet kódoló gén mutációjával módosíthatjuk, vagy úgy, hogy ezt a gént egy más polipeptidet kódoló génnel helyettesítjük, majd a plazmidot vagy az eredeti gazdasejt vagy egy más gazdasejt transzformálására használjuk, feltéve, hogy ez a gazdasejt - natív állapotában - szintén képes egy lantibiotikum kifejezésére.

Általánosságban azt mondhatjuk, hogy ahol az eredetileg funkcionáló gén egy preszekvenciát kódol, mint az epidermin esetében is - ahogy ezt fentebb tárgyaltuk - az ilyen preszekvenciát kódoló DNSszekvenciát megtarthatjuk a módosított plazmidban; ebben az esetben az új vagy mutagenizált propolipeptidet meghatározó DNS-szekvenciát mindjárt a preszekvencia DNS-től 5’-felé helyezzük el, hasonlóan ahhoz, mint ahogy ez az eredeti propolipeptid szekvenciánál fennáll.

A bakteriális gazdasejt tenyésztését hagyományos tenyésztési feltételek mellett végezhetjük, mint ahogy ezt a 0342658 és a 0181 578 számú nyilvánosságra hozott európai szabadalmi bejelentésünkben leírtuk. A kívánt protein tisztítását és izolálását vagy ugyanezen technikák segítségével végezhetjük, vagy ezek megfelelő módosításával, ahogyan ezt az előbb említett szabadalmi bejelentéseinkben az epiderminre és galliderminre leírtuk, beleértve az adszorbensek, ioncserélő gyanták és kívánt esetben a HPLC használatát.

A fent ismertetett eljárás egyrészt kísérleti célt szolgáló új vegyületek előállítására alkalmazható, másrészt ismert vegyületeknek vagy ismert vegyületek származékainak új gazdasejtekben való előállítására. Például az epidermint kódoló gént tartalmazó plazmid felhasználható a Streptococcus lactis species transzformálására abból a célból, hogy ez a gazdasejt epidermint termeljen. Felhasználható továbbá a gallidermint kódoló gén (lásd az EP-A 0 342 658 számú európai közrebocsátási iratot) az epidermin propolipeptidet kódoló gén helyettesítésére, például a pEpi32 plazmidban, és alkalmazható a Staphylococcus epidermis (DSM 3095) transzformálására abból a célból, hogy ez a gazdasejt gallidermint termeljen. Hasonló módon termeltethetünk dehidro-aminosav-csoportokat és/vagy lantioninhidakat és/vagy metil-lantionin-hidakat tartalmazó aktív peptidszármazékokat, így hormonszármazékokat, mint az inzulin, oxitocin, vazopresszin, peptid antibiotikumokat, hormon inhibitorokat, mint az elasztáz inhibitor és fibrinolízist előidéző szereket, mint a humán szöveti plazminogén aktivátor. Az ilyen származékoknak, melyek ugyanakkor megtartják az eredeti vegyület biológiai aktivitását, nagyobb lehet a stabilitása, és javulhat a felezési ideje.

Ideális esetben a kívánt propolipeptidet kódoló DNS-nek tartalmaznia kell cisztein és szerin kodonokat és/vagy cisztein és treonin kodonokat a tioéterhidak kialakulásához.

A viszonylag rövid láncú polipeptidek esetében ezeknek az említett kodonoknak normál körülmények között nyolc kodonnál nem nagyobb, de előnyösen hat kodonnál nem nagyobb távolságra kell lenniük egymástól, jóllehet ezzel együtt azzal is számolnunk kell, hogy a végső polipeptidmolekula térbeli konformációjától függően ez a távolság nagyobb is lehet.

Ami a dehidro-aminosavak képződését illeti, ezek rendszerint szerűiből és treoninből keletkeznek, és ennek megfelelően a kívánt propolipeptidet kódoló DNSezen aminosavak kodonjait fogja tartalmazni.

Az így termelt polipeptidekben található szokatlan aminosavak a következők: dehidro-alanin, 2,3-dehidro2-amino-vajsav, mezo-lantionin, (2S,3S,6R)-3-metillantionin, S-(2-(Z)-aminovinil)-D-cisztein, lizinoalanin és β-hidroxi-aszparaginsav; e csoportok szerkezeti képletét az 5. ábra mutatja be.

A találmány ismertetése

Meglepő módon azt találtuk, hogy az epidermin poszttranszlációs módosításáért felelős multienzim komplex a Staphylococcus epidermis Tü 3298 (DSM 3095) 54 kb méretű pTü32 plazmidján helyezkedik el.

Az epidermintermelésért felelős hat gént (ORF-ok; ORF=open reading ffame=nyílt leolvasási keret) itt epiA, B, C, D, Q és P jellel jelöltük. Ezek a gének 8 kb méretű szakaszon belül csoportosulnak. Az általuk kódolt proteinek jelzése EpiA, B, C, D, Q, illetve P; az epiA kódolja az 52 aminosav hosszúságú preepidermint. Mint alább leíijuk, az epiB, C és D négy enzimes módosítási reakcióban vesz részt: 1) vízelvonás szerin/treonin dehidratázzal; 2) kénaddíció lantionin szintázzal; 3) C-terminális dekarboxilezés cisztein dekarboxilázzal; és 4) kettőskötés-képzés. Úgy gondoljuk, hogy az EpiP protein felelős az érett epiderminnek az N-terminális vezérpeptidről való lehasadásáért. Ennek az az alapja, hogy meglepő homológiát mutat a szerinproteázok esszenciális doménjével [Kőidé et al., J. Bacteriol., 167, 110-116 (1986); Meloun et al., FEBS Lett., 183, 195-200 (1985); Stahl et al., J. Bacteriol., 158, 411-418 (1984)]. Továbbá azt gondoljuk, hogy az EpiQ egy szabályozó protein, mely az epidermin bioszintézisét szabályozza. Feltevésünk alapja az E. coli PhoB génjével való határozott homológiája [Makino et al., J. Mól. Bioi., 190, 37-44 (1986)]. Tény, hogy a két protein hasonló méretű, azaz 205 (epiQ) és 229 (PhoB) aminosavcsoportból állnak, és a megfigyelt 24,2%-os

HU 215 548 Β homológia a két protein 153 C-terminális aminosavcsoportjára és hidrofobicitási térképére teljed ki.

Az epidermin bioszintézise teljes genetikai információs rendszerének váratlan felfedezése és az EpiB, C, D, Q és P proteineket meghatározó gének felderítése eredményeképpen ma már lehetségessé vált az ezen proteineket kódoló DNS-ek izolálása és olyan plazmidok szerkesztése, amelyek egy vagy több ilyen gént tartalmaznak. Az ilyen plazmidokat tartalmazó gazdasejtek tenyésztése révén vagy egy ilyen proteint, vagy e proteinek előre meghatározott kombinációját ki tudjuk fejezni, melyek ezután izolálhatok.

A találmány tehát olyan DNS-szekvenciák előállítására vonatkozik, amelyek az EpiB vagy EpiC vagy EpiD vagy EpiP vagy EpiQ proteint kódolják. Ezek a szekvenciák vagy egyszálú vagy kétszálú izolált DNSek lehetnek, melyeket ismert módon a pTü32 hasításával és a pTü32-ből való izolálással kaphatunk meg. Előállíthatjuk ezeket kémiai szintézissel is, vagy más hagyományos eljárásokkal. A DNS-plazmidba is lehet integrálva, előnyösen egy expressziós plazmidba, és egy regulátor promoter szabályozása alatt is állhat; ha ezekkel a szerkezetekkel megfelelő gazdasejtet transzformálunk, amelyet ezután tenyésztünk, a sejt kifejezi az EpiB, EpiC, EpiD, EpiP vagy EpiQ proteint vagy ezen proteinek kombinációit aszerint, hogy mely DNS-eket ligáltunk a plazmidba. Más módszer szerint, a pTü32 plazmidot megfelelő restrikciós nukleázokkal kezeljük egy vagy több DNS-szekvencia kimetszése céljából, majd az emésztett plazmid szabad végeinek szükséges módosításai után religálás következik, s így olyan módosított plazmid keletkezik, amely az epiB, C, D, P és Q közül csak az előre kiválasztottakat kódoló DNS-szekvenciákat tartalmazza.

Egy további eljárásváltozat abból áll, hogy a pTü32ben az epidermint kódoló gént egy olyan DNS-szekvenciával szubsztituáljuk, amely gallidermint vagy mutáns epidermint vagy más lantibiotikumot vagy más proteint kódol. A kapott plazmiddal ezután megfelelő gazdasejtet transzformálunk. Ez olyan gazdasejt lehet, mely normál körülmények között nem képes a lantibiotikumok vagy az EpiB, C, D, P vagy Q közül bármelyiket is termelni. A gazdasejtet olyan körülmények között tenyésztjük, hogy a szubsztituált DNS-szekvencia és az epiB, C, D, P és Q gének kifejeződjenek, és hogy megkapjunk olyan proteineket, mint a gallidermin, mutáns epidermin vagy valamely lantibiotikum legalább egy strukturális formáját tartalmazó más protein.

Más módszer szerint az EpiB, C, D, P vagy Q proteineket kódoló géneket megfelelő vektorba építhetjük be egy előre meghatározott aminosavszekvenciát kódoló DNS-szekvenciával együtt. Az Epi proteineket és az előre meghatározott aminosavszekvenciát kódoló géneket mesterségesen kapcsoljuk össze alkalmas promoter regulátor funkciókkal. A kapott plazmiddal megfelelő gazdasejtet transzformálunk. A gazdasejt olyan sejt is lehet, amely normál körülmények között nem képes lantibiotikumot vagy az EpiB, C, D, P és Q proteinek valamelyikét termelni. A gazdasejtet olyan módon tenyésztjük, hogy a beépített gének az említett előre meghatározott, de egy lantibiotikum strukturális szerkezetét tartalmazó aminosavszekvenciából származó protein expresszióját eredményezzék, amely protein gallidermin, epidermin, mutáns epidermin vagy más protein lehet.

A találmány oltalmi körébe tartozik még olyan DNS-szekvenciák előállítása is, amelyek az itt leírt DNS-szekvenciákkal képesek hibridizálni szigorú körülmények mellett, és olyan proteineket kódolnak, amelyeknek az aktivitása lényegében az EpiB, C, D, P vagy Q proteinével azonos. A szigorú hibridizálási feltételek a nagyobb mint 85%-os, előnyösen a nagyobb mint 90%-os homológiával rendelkező DNS-szekvenciákat szelektálják. A cDNS gyűjtemény szűrését igen szigorú feltételek mellett, az EP-A 0355 202 számú közrebocsátási iratban leírt módszer szerint és Kashima és munkatársai szerint [Natúré, 313, 402-404 (1985)] végezhetjük. A jelen bejelentésben leírt DNS-szekvenciákkal szigorú körülmények mellett hibridizálni képes DNSszekvenciák például a leírt DNS-szekvenciák eredetiben is jelen lehetnek az adott mikroorganizmusban - de rokonságban vannak a leírt szekvenciákkal - vagy más forrásokból származhatnak. A nukleinsav hibridizációk általános technikai leírását T. Maniatis és munkatársai: Molecular Cloning. A Laboratory Manual [Cold Spring Harbor, N. Y. (1982)] és B. D. Haymes és munkatársai: Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach [IRL Press, Washington, DC., (1985)] című munkái tartalmazzák. A hivatkozott munkákat itt referenciaként használjuk. Az EpiB, C, D, P és Q proteinek vagy más anyagok előállítására használhatók, amelyek szerkezetükben dehidro-alanint, dehidro-butirint, mezo-lantionint, 3-metil-lantionint és S-(2-amino-vinil)-D-ciszteint tartalmaznak.

Az említett anyagok mint izolált proteinek használhatók fel, vagy mint kémiai katalitikus reagensek olyan kémiai szintetikus eljárásokban, amelyekben a proteinek ezen enzimekkel történő extracelluláris feldolgozását kutatjuk.

A találmány tárgyát képezik az EpiB, C, D, P és Q proteinek lényegében tiszta formáinak előállítása is. A „lényegében tiszta” meghatározás azt jelenti, hogy a protein a természetben vele társult szennyeződésektől mentes. A tisztaság bizonyítéka az elektroforézissel kapott egyetlen sáv.

A találmány szerint előállított polipeptideket hagyományos módszerekkel izolálhatjuk és tisztíthatjuk a fent leirt rekombináns molekulákból, például extrakcióval, precipitációval, kromatográfíával, elektroforézissel vagy hasonló módszerekkel. Előnyös, ha a polipeptideket egy olyan fúziós protein részeként állítjuk elő, mely egy kisegítő proteint tartalmaz. A kisegítő protein megkönnyíti a szóban forgó polipeptid izolálását és tisztítását. Ilyen kisegítő proteinek például a következők: a tipikus szekréciós szignálok, az E. coli eredetű maltózkötő protein vagy a protein A. A protein A-t tartalmazó fúziós proteinek termelésére szolgáló módszereket, immunaffinitás-kromatográfiával való tisztításukat és az illető lényeges protein elválasztása céljából történő hasításukat a WO 89/03 103 (1984)

HU 215 548 Β számú nyilvánosságra hozott PCT nemzetközi szabadalmi bejelentés ismerteti.

A fúziós protein hasadásához az a feltétel szükséges, hogy tartalmazzon egy olyan hasítási helyet, mely felismerhető és alkalmas módon hasítható. Ez a hasítási hely egyetlen aminosavszekvencia lehet, mely vagy kémiai vagy enzimes módszerekkel felismerhető, és alkalmas módon hasítható. Ez a hasítási hely egyetlen aminosavszekvencia lehet, mely vagy kémiai vagy enzimes módszerekkel felismerhető, és a kívánt protein és a kisegítő protein között helyezkedik el. Az ilyen specifikus aminosavszekvencia nem helyezkedhet el a kívánt proteinen belül vagy a kisegítő proteinen belül. Az enzim reagensek közé tartoznak a proteázok, például a kollagenáz, amely az H₂N-Pro-X-Gly-Pro-COOH aminosav-szekvenciát képes felismerni, melyben X egy tetszőleges aminosavcsoport, például leucin; ilyen például a chimozin (remiin), amely a Met-Phe kötést hasítja; a kallikrein B, amely az Χ-Phe-Arg-Y szekvenciában az Arg karboxil oldalát biztosítja; az enterokináz, mely az X-(Asp)_n-Lys-Y szekvenciát ismeri fel, melyben n=2-4, és a Lys karboxiloldalát hasítja, továbbá a trombin, mely specifikus arginilkötéseknél hasít. A fúziós proteinek hasítására használatos kémiai reagens például a bróm-cián, amely a Met után hasít; a hidroxil-amin, amely az Asn-Z kötést hasítja, ahol Z Gly, Leu vagy Alá lehet; a hangyasav magas koncentrációban (körülbelül 70%) specifikusan hasítja az Asp-Pro kötést.

Úgy véljük, hogy a szakterületen járatosak a fenti leírás alapján további részletezés nélkül teljes mértékben fel tudják használni a találmányt. Az alábbi előnyös kiviteli alakokat tehát csupán a szemléltetés végett adjuk közre, és ezek semmiképpen sem korlátozzák a találmány oltalmi körét.

1. példa:

Plazmidizolálás

Az S. epidermis TÜ3298 sejtekből plazmid DNS-t izoláltunk Norick és munkatársai [Ann. N. Y. Acad. Sci., 182, 182-294 (1971)] szerinti eljárásának módosítása szerint. Az S. epidermist BM-táptalajon [1% pepton 140 (Gibco, Neu-Isenburg, NSZK), 0,5% élesztőkivonat (Difco, Detroit, USA), 0,1% glükóz, 0,5% nátrium-klorid és 0,1% dikálium-hidrogén-foszfát-víz (1/2)] tenyésztjük stacionárius fázisig. A sejteket lecentrifugáljuk, és kétszer mossuk 0,5 M EDTA-val. Az üledéket 80 ml nátrium-klorid-pufferben (50 mM trisz/HCl, pH = 7,50 mM EDTA, 2,5 M nátrium-klorid) reszuszpendáljuk, hozzáadunk 1,5 ml lizosztafin oldatot (0,5 mg/ml; Sigma, Heidelberg, NSZK), majd a szuszpenziót 37 °C-on 20 percig inkubáljuk. A sejteket 80 ml lizáló puffer [50 mM trisz/HCl, pH=8, 300 mM EDTA, 500 mM Brij., (polioxi-etilén-éter), 40 mM nátriumdezoxikolát] hozzáadásával lizáljuk, és 1 órán át jégen tartjuk. A lizátumot lecentrifugáljuk (30 perc; 13 000 ford/perc; 4 °C), és a felülúszót negyed térfogatnyi 50%-os PRG 6000 oldattal keveijük. A plazmid DNS-kicsapását 4 °C-on egy éjszakán át végezzük. A DNS-szuszpenziót centrifugáljuk (20 perc; 13 000 ford/perc; 4 °C), 8 ml TE-pufferben reszuszpendáljuk, és hozzáadunk 50 μΐ proteináz K oldatot (20 mg/ml). Inkubálás (37 °C; 15 perc) után a DNS-t etanollal kicsapjuk, majd tovább tisztítjuk cézium-kloridos centrifugálással (1 g CsCl/ml; 40 000 ford/perc; 40 óra; 20 °C).

RNS-izolálás és elektroforézis

Az S. epidermist SMS minimál táptalajon [Terzaghi et al., Appl. Microbiol., 29, 807-813 (1975)] tenyésztjük. A tenyészetből egy módosított eljárással, mely hasonló ahhoz, amelyet a Bacillus subtilis RNSre írtak le Ulmanen és munkatársai [J. Bacteriol., 162, 176-182 (1985)] RNS-t izolálunk. A sejteket lizosztafinnal (0,1 mg/ml lizáljuk protoplasztképző pufferben, és 37 °C-on inkubáljuk. Az ossz RNS-t glioxilezzük [McMaster et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 74, 4835-4839 (1977)] és 1,2% agaróz gélben választjuk el; az elektroforézishez 10 mM dinátrium-hidrogénfoszfát (pH=7) puffért használunk. Az RNS-t etídiumbromiddal festjük, és nitrocellulóz membránra (Schleicher és Schüll; Dassel, NSZK) cseppentjük 20xSSC-pufferrel (0,15 M nátrium-klorid, 0,015 M trinátrium-citrát, pH=9) kapilláris transzferrel. Méretstandardként 23SrRNS-t és 16SrRNS-t használtunk.

In vitro transzkripció

Egyszálú RNS-szondákat állítunk elő úgy, hogy a megfelelő fragmentumot egy pSPT18/19 vektorrendszerbe (Boehringer Mannheim, Mannheim, NSZK) klónozzuk. A plazmidot EcoRI-gyel és HindlII-mal linearizáljuk, és így lineáris DNS-templátot kapunk. Transzkripció céljára a Méltón és munkatársai [Nucl. Acid. Rés., 12, 7035-7056 (1984)] szerinti eljárást a kereskedelmi vállalat előírásai szerint módosítottuk. T7-RNS polimerázt vagy SP6-RNS polimerázt használunk a³²-P-CTP (800 Ci/mM) jelenlétében. A be nem épült ribonukleotidokat Sephadex G50-en való kromatografálással választjuk el a jelzett RNS-től.

Northern hibridizálás

Elektroforézis után az RNS-t P. S. Thomas [Proc. Natl. Acad. Sci., 77, 5201-5205 (1980)] szerint visszük át szűrőmembránra, majd 2 óra 80 °C-on való inkubálás után a szűrőket rövid ideig 20 mM trisz/HCl (pH=8) pufferben 100 °C-on inkubáljuk deglioxilezés céljából. Ezután a szűrőket 42 °C-on 2 órán át a következő összetételű elegyben prehibridizáljuk: 50% formamidban 5xSSC (0,15 M nátrium-klorid, 0,015 M trinátriumcitrát; pH=9) 50 mM nátrium-foszfát (pH=6,5), 0,1% Ficoll 400 (Pharmacia, Freiburg, NSZK), 0,1% poli(vinil-pirrolidon), 0,1% marhaszérum-albumin és 0,25 mg/ml denaturált lazacsperma-DNS. A szűrőket egyszer lxSSC, 0,1% SDS-oldattal mossuk 42 °C-on 15 percig, majd -70 °C-on 4 órán át Kodak-XOmat filmre exponáljuk. Ezután a szűrőket kétszer mossuk 0,5xSSC, 0,1% SDS-oldattal 70 °C-on 15 percig és -70 °C-on 16 órán át exponálva radiografáljuk. A következő nap folytatjuk a mosást 0,1 xSSC, 0,1% SDSoldattal 70 °C-on 30-60 percig, ezután -70 °C-on 3 napon át exponáljuk Kodak-XOmat filmre.

Southern hibridizálás

Southern hibridizáláshoz [Ε. M. Southern, J. Mól. Bioi., 98, 503-517 (1975)] 23 °C-on 5’-jelzett oligo9

HU 215 548 Β nukleotidokat használunk szondák gyanánt. Az oligonukleotidokat gamma ³²P-ATP-vel jelöljük, T4 polinukleotid kinázt (Boehringer Mannheim, Mannheim, NSZK) használva. Az oligonukleotidokat és a primereket egy 391-es DNS-szintetizátoron (Applied Biosystems, Weiterstadt, NSZK) szintetizáljuk és további tisztítás nélkül használjuk.

DNS-szekvenálás

A DNS-t - akár radioaktív, akár nem radioaktív láncterminációs módszerrel szekvenáljuk [Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 74, 5463-5467 (1977)] T7 DNSpolimerázt (Pharmacia, Freiburg, NSZK) használva. A radioaktív plazmid szekvenálását Hattori és munkatársai [Anal. Biochem., 152, 232-238 (1984)] leírása szerint végezzük megfelelő primerekkel. A 3,6 kb méretű BamHI/PstI - nem radioaktív - fragmentumot egy 373A típusú DNS-szekvenátorral (Applied Biosystems, Weiterstadt, NSZK) szekvenáljuk. A szerkezetet BamHI-gyel és Sacl-gyel emésztjük, és a linearizált DNS-t 5’-végétől exonukleáz III-mal emésztjük (Boehringer Mannheim, Mannheim, NSZK), így egy sor belső deléciót kaptunk, amelyeket szójabab (mung bean) ₇nukleázzal (Boehringer Mannheim, Mannheim, NSZK) kezelünk, hogy tompa végekhez jussunk. Elektroforézis (1%-os agaróz gél) után a gélből a megfelelő nagyságú fragmentumokat izoláljuk, religáljuk és ezekkel transzformálunk E. coli XL-1 Blue törzset. Egyszálú DNS-t izoláltunk a CSM13 helper fág alkalmazásával, melyet Taq polimerázzal (Promega, Freiburg, NSZK) szekvenálunk a kereskedelmi cég technológiája szerint.

Plazmidszerkesztés

A Staphylococcus tetraciklin rezisztenciát biztosító pT181 plazmidot szekvenáltuk [Kahn et al., Plasmid, 10, 251-259 (1983)] és úgy találtuk, hogy egyetlen Ndel helyet tartalmaz a pregénen belül, amely nem szükséges a plazmid replikációjához [Gennaro et al., J. Bacteriol., 169, 2601-2610 (1987)]. A pUC19 E. coli vektor sokszoros klónozó helyét (mcs=multiple cloning site) [Yanisch-Perron et al., Gene, 33, 103-119 (1985)] beépítettük az Ndel helyre, s így képeztük a pT181mcs plazmidot (lásd a 14. ábrát).

A Staphylococcus - E. coli ingázó vektort, a pCUlet (10. ábra) a pCLP 100-ból szerkesztettük, ez utóbbi a Staphylococcusnak kloramfenikol rezisztenciát kölcsönző pC194 plazmid [Horinouchi et al., J. Bacteriol., 150, 815-825 (1982)] és az E. coli pUC19 vektor származéka. A pCUl stabilan fennmarad mindkét gazdasejtben, körülbelül 6 kb inszertum méretig. A pT181mcs és a pCUl Staphylococcusokban kompatíbilisek, és a pTü3 2-ből származó DNS-fragmentumok szubklónozására szolgálnak.

A pTü32 HindlII fragmentumát beklónozzuk a pUC 19-be, és Southern hibridizálás esetén szondaként használjuk a HindlII fragmentumhoz közeli további restrikciós helyek azonosítására (8.C. ábra).

Az S. epidermis eredetű pTü32 - 54 kb episzómális elem - 13,5 kb méretű BglII fragmentumát a pT181mcsbe szubklónozzuk, így kapjuk a pTepil4 plazmidot (8.A. ábra). DNS-szekvenálásához a pUC19 E. coli vektorban [Yanisch-Perron et al., Gene, 33, 103-119 (1985) és a pBluescript II^R-ben (Stratagene, Heidelberg, NSZK)] készítettünk szubklónokat. Egyszálú DNS-szondákat kapunk a pSPT18/19 vektorba (Boehringer Mannheim, Mannheim, NSZK) klónozott DNS-től.

Génanalízis

Az epiA epidermin strukturális génnel szomszédos DNS-szakasz szekvenálása öt további teljes nyílt leolvasási keretet mutatott ki a pTü32 13,5 kb méretű BglII fragmentumán belül: epiB, C, D, P és Q.

A 9. ábrán látható, hogy közvetlenül az EpiA-t kódoló szekvencia mellett, az epiA ochre kodontól mindössze 50 nukleotid távolságban van egy 2970 bp hosszúságú nagy nyílt leolvasási keret, melyet megelőz egy S/D szekvencia. Egy TTG leucin kodon, amely transzlá15 ciós start ködönként is tud működni Staphylococcusokban, megfelelő távolságra (8 bp) van az S/D szekvenciától. Ezt a nyílt leolvasási keretet epiB-nek neveztük, és mint leírjuk, eredményesen használhatjuk az epidermin bioszintetikus mutánsai kiegészítésére. Lényeges szere20 pe van az epidermin bioszintézisében is.

Az epiB által kódolt protein - a TTG (Leu)-tól kezdődik - molekulatömege körülbelül 115 kD, pH=7-nél töltése -3, enyhén hidrofób (41% hidrofób csoport), amely a Kyte és munkatársai [J. Mól. Bioi.,

157, 105-132 (1982)] szerinti hidrofilicitási grafikonból is leolvasható.

Az epiB 3’-végén nem látható a transzkripció befejezésére jellemző palindróm szerkezet. Itt azonban egy 122 bp hosszú átfedést figyelhetünk meg egy másik le30 olvasási kerettel - az epiC leolvasási keretével - amely -1 bázispárral van eltolva, és ez is látható a 9. ábrán.

Hogy ez nem műtermék, azt úgy állapítottuk meg, hogy a szóban forgó 47 kb méretű Hindin fragmentumot két egymástól független plazmidizolálásból kétszer egy35 mástól függetlenül klónoztuk és szekvenáltuk. Ugyanezt mutáns kiegészítéssel is bizonyítottuk egy epiC tartalmú fragmentum segítségével az itt leírtak szerint.

Az epiB és epiC leolvasási keretek egymást átfedő szakaszán belül az első TTG kodon (Leu), mely csak

36 bp-ra van 3’-felé egy AGGA-elemtől, transzlációs start kodon gyanánt szolgál, és ez mutatja, hogy a két leolvasási keret egymást mintegy 40 kodonnal fedi át. Az EpiC protein tényleges amino-terminális végét Nterminális szekvenálással határoztuk meg. Az epiC leol45 vasási keret, amely a TTG (Leu) start kodonnal kezdődik, egy 445 aminosavmaradékból álló proteint kódol. Az epiD leolvasási kerete közvetlenül az epiC-t követi 3’-felé egy ATG start kodonnal, az AGGAGG S/D szekvenciától 8 bp-nyira 3’-irányban. Az epiD 3’-része egy klasszikus rho-függő transzkripciós terminátor szerkezet; az epiD 181 aminosavból álló proteint kódol, ahol ATG a start kodon.

Az epiB, C, D, P és Q proteinek közül egy sem mutat semmilyen hasonlóságot a Swiss Prot and Gene

Bank protein adatbázisában lévő proteinszekvenciákkal, ennélfogva ezek tehát enzimek és proteinek ismeretlen típusait képviselik.

A bioszintetikus gének transzkripciója Egyszálú RNS-szondákat készítettünk úgy, hogy a kívánt fragmentumot egy pSPT 18/19 vektorrendszerbe

HU 215 548 Β (Boehringer Mannheim, Mannheim, NSZK) klónoztuk be a fent leírtak szerint.

Két átiratot kaptunk, melyek mérete jelentősen különbözött egymástól, mint ezt a 10. ábra mutatja. Az epiA-ra specifikus hibridizációs szondával egy körülbelül 300 bp méretű átiratot azonosítottunk. Hasonló méretű átiratokat találtunk a nizin [Buchmann et al., J. Bioi. Chem., 263, 16260-16266 (1988)] és a szubtilin [Banerjee et al., J. Bioi. Chem., 263, 9508-9514 (1988)] antibiotikumnál is. Ezenkívül egy körülbelül 5 kb méretű átirat is azonosítható egy epiBre specifikus hibridizációs szondával. Tekintve, hogy nem voltak az epiB-vel szemben E. coli-szerű promoter szekvenciák, míg a helyes szekvenciák az epiA-tól 5’-felé helyezkedtek el, látható, hogy az epiA promoter úgy működik, mint egy promoter egy policisztronikus mRNS számára.

A replikációval megegyező irányú (3’; downstream) nyílt leolvasási keretek.

Az epiP és epiQ nyílt leolvasási keretek az epiB, C és D DNS-sel szemben helyezkednek el úgy, hogy az epiQ terminációs szerkezetét megosztja az epiD-vel egy 6 bp láncszemből álló teljes hajtűkanyar révén.

Pontosabban, e hurokszerkezeten belül az epiD és az epiQ két leolvasási keretéhez tartozó TAA stop kodonban a három nukleotid közül kettő közös.

Az epiP leolvasási keret egy ATG kodonnal kezdődik, megfelelő távolságra (6 bp) egy S/D szekvenciától. Ha az ATG kodont tartjuk az epiP transzlációs startjának, úgy egy 461 aminosavmaradékból álló, 51,8 kD molekulatömegű proteinről van szó. Az epiP jellemző homológiát mutat a szerinproteázok állandó aminosavmotívumaival (lásd all. ábrát), és ez jelzi, hogy az epiP szerepet játszik az érett lantibiotikumnak a módosított prepeptidről való lehasításában.

Az epiQ leolvasási keret, mely szintén ATG kodonnal kezdődik, 205 aminosavmaradékot kódol (9. ábra). Az S/D szekvencia 6 bp távolságban van az ATG kodontól. A DNS-szekvenciából levezethető molekulatömeg 243 kD. Az epiQ protein jellemző homológiát mutat a PhoB-vel (lásd a 12. ábrát), mely az E. coli foszfátszabályozásának pozitív szabályozó faktora, tehát az epiQ mint szabályozó faktor vesz részt a lantibiotikum-szintézisben.

Az epiP-t megelőzi egy E. coli-szerű 10 szakasz (5’-TATAAA), az S/D szekvenciával szemben 12 bp, amely promoterként szolgálhat Staphylococcusokban. Az epiP stop kodonja és az epiQ ATG start kodonja között csak 10 nukleotid a távolság, és az epiQ S/D szekvencia átlapolja az epiP terminációs kodont, mint ahogy ezt a 9. ábra mutatja.

Az epiA, B, C, D-től 5’-felé egy további leolvasási keret látható, amely feltehetően maximum 148 aminosavat kódol. Jelen van egy jellegzetes S/D szekvencia, de nincsenek jelen a Staphylococcusoknál szokásos előzőekben leírt start kodonok (ATG, TTG, GTG). Egy -1 kereteltolódással további leolvasási keret következik, amely túlmegy a 9. ábrán látható izolált BglII fragmentumon.

Ez a két leolvasási keret egyetlen nyílt leolvasási kerettel - gdmY - homológ, amelyről megállapítottuk, hogy a gallidermin strukturális gén szomszédságában van [N. Schnell, Biosynthese dér Peptid-Antibiotika Epidermin und Gallidermin; doktori tézis, Tübingeni Egyetem, NSZK (1989)]. Az S. epidermis plazmidon lévő homológ leolvasási kereteket epiY’ és epiY” jelzéssel láttuk el.

2. példa:

S. camosus TM300 sejteket transzformálunk a fentiek szerint szerkesztett pTepil4 plazmiddal, standard technikák segítségével. A transzformált törzset BMtáptalajon (lásd fentebb) tenyésztjük.

Azt találtuk, hogy a kapott transzformált sejtek képesek gátolni az epidermin-érzékeny Micrococcus luteus (ATCC 9341) teszttörzset. Ebben a vizsgálatban az M. luteus egyéjszakás tenyészetének (OD_57g= 1,0-re beállítva) 1 ml-ét hozzáadjuk 500 ml megolvasztott BMagarhoz. A Petri-csészék ebből az agárból rendszerint 10 ml-t tartalmaznak. Az S. epidermis tenyészet hígításait az agar felületére szélesztjük. Az epidermin-pozitív telepeknél a telepek körül az M. luteus növekedésének gátlása nulla növekedésben nyilvánult meg.

A sejteket a következő összetételű táptalajon tenyésztjük: 3% húskivonat, 3,8% malátakivonat, 0,6% kalcium-klorid-víz (1/2) és 4,6% nátrium-klorid; pH=6,5. Az alkalmazott transzformációnak megfelelően tetraciklint vagy kloramfenikolt adunk a táptalajhoz. A 100 ml táptalajt tartalmazó 500 ml-es Erlenmeyer lombikokat 24 órán át 37 °C-on (160 ford/perc mellett) inkubáljuk. A táplevest 10 000 ford/perc mellett 10 percig centrifugáljuk Sorvall centrifugán.

A transzformált sejttenyészetek folyékony felülúszóját adszorpciós kromatográfiával tisztítjuk [XAD1180; a szennyezéseket víz/metanol (1:1) elegyével oldjuk le; bepárlás után az eluátumot 3 M nátrium-hidroxid-oldattal pH=3,5-re állítjuk be, és 10 ml-re töltjük fel vízzel], A kapott anyagot HPLC-vel vizsgáljuk. A gátló aktivitás együtt vándorolt az érett epiderminnel 6,75/6,75 percnél (lásd a 13.A. és 13.B. ábrát). A hasonló módon kezelt, nem transzformált S. camous táptalaja nem adott csúcsot ebben a tartományban (6,72-6,79 perc; 13.C. ábra). Ezek az eredmények világosan bizonyítják a heterológ epidermin bioszintézisét S. camosusban, és bemutatják, hogy a pTepil4 minden szükséges információt tartalmaz az epidermin bioszintéziséhez.

Minthogy a pTepil4 tartalmazza a 13,5 kb méretű BglII fragmentumot, ez azt jelenti, hogy ebben a rendszerben az epiY’ és az epiY” leolvasási keretek nem szükségesek az epidermin termeléséhez, ugyanis az epiY’-nak nincs transzlációs start kodonja és az epiY” nem komplett ezen a fragmentumon.

3. példa:

Az S. epidermis TÜ3298 törzs számos mutánsát készítettük el etil-metán-szulfonát (EMS) segítségével végzett mutagenezissel. Ezt az eljárást J. H. Miller [Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor, Ν. Y. (1972)] szerint végeztük. A mutánsokat

HU 215 548 Β epidermintermelésre, illetve epidermintermelés hiányára szűrtük a fent leírt M. luteus assay használatával. Az epi mutánsokat sokszor passzáljuk stabilitásuk tesztelése céljából. Az izolált 40 epi mutáns közül csak 10 volt stabil; a nem stabil mutánsok számos passzázs után újra termeltek epidermint. Minden olyan stabil epi mutáns tartalmazott pTü32 plazmidot, amelynél nem történt deléció vagy átrendeződés restrikciós endonukleáz-analízissel való vizsgálat szerint. A 10 epi mutáns törzset komplementációs kísérletekhez használtuk.

A pTü32 plazmid különböző restrikciós fragmentumait S. camosusba klónoztuk heterológ epidermintermelés vizsgálata céljából. A fragmentumokat a T181mcs és a pCUl plazmid vektorba vittük be - mint azt fent leírtuk - és a különböző ORF-okat a 16.B. ábrán bemutatott módon szubklónoztuk.

A klónozást először S. camosusban [protoplaszt transzformációval; Gotz et al., FEMS Microbiol. Lett.,

40, 285-288 (1987)] vagy E. coliban [kalcium-klorid használatával; Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 69, 2110-2114, (1972)] végeztük, ezután a rekombináns plazmidokat izoláltuk, és átvittük különböző S.

epidermis epi mutáns sejtekbe elektroporáció segítségével [Augustin et al., FEMS Microbiol. Lett., 66, 203-208 (1990)]. A molekuláris klónozáshoz szükséges enzimeket a Boehringer Mannheim (Mannheim, NSZK), a BRL (Bethesda Research Laboratory,

Eggenstein, NSZK) vagy a Pharmacia (Svédország) cégektől szereztük be. Az indirekt transzformációs módszerre azért volt szükség, mivel az S. epidermis törzsek transzformációja csak cirkuláris, kovalens kötéssel zárt (circular covalently closed=ccc) plazmidokkal jár ered15 ménnyel. Ha ligációs termékeket használtunk, transzformáit sejteket csak ritkán tudtunk izolálni.

Az 1. táblázat összegezi a komplementációs vizsgálat eredményeit.

HU 215 548 B

1. táblázat

HU 215 548 Β

Egy sorozat plazmidot szerkesztettünk, melyek különböző epi géneket tartalmaztak (A, B, C, D, P és Q) (16.B. ábra). Két plazmid, a pTepil4 és a pTepiABCDQ, volt képes minden epi mutáns kiegészítésére. A többi szerkesztett plazmid, a pCUepiABC, pTepiAB, pCUepiCDQ, pCUepiB, pCUepiA,, pCUepiA₂, pCUepiDQ és pCUepiQ a feltüntetett géneket tartalmazta.

A különböző plazmidok csak a mutánsok bizonyos osztályait voltak képesek kiegészíteni. Ezeket a következőkben ismertetjük:

EMS 5 és 6 - epiA mutánsok,

EMS 18, 33 és 45 - epiB mutánsok,

EMS 12, 13,19 és 39 - epiC mutánsok,

EMS 11 - epiD mutáns.

Az alább bemutatott eredmények azt jelentik, hogy négy leolvasási keret, az epiA, B, C és D (ORF=open reading frame) szükséges az epidermin bioszintéziséhez.

A pCUepiA[ plazmid hordozza az epiA strukturális gént, mint az egyetlen teljes ORF-ot. Ettől 5’-felé további 1400 bp és 3’-felé 602 foglal helyet, s ez utóbbi az epiB N-terminális 190 aminosavát kódolja. A pCUepiA,-gyel végzett transzformáció az EMS 5 és 6 epidermin mutáns kiegészítését eredményezte, és ezeket mint epiA mutánsokat azonosítottuk. A kisebb epiA-tartalmú Seal fragmentum, amelyet a pCUepiA₂be klónoztuk mindkét irányban, nem tudta kiegészíteni az epi mutánsokat, tekintve, hogy ez az enzim levágta az epiA promotert.

A pCUepiB a teljes epiB-t tartalmazó BstNI fragmentumot hordozza, valamint 5’-felé egy 100 bp méretű szakaszt, amely az epiA 3’-terminális végéből 75 bp-t tartalmaz; az epiA promoter hiányzik. A pCUepiB-vel való transzformálással nem sikerült egyetlen S. epidermis mutánst sem kiegészíteni epidermin termelése céljára, ami azt mutatja, hogy az epiB-nek nincs saját promotere, és nagyon valószínű, hogy az epiA promoter vesz részt a transzkripciójában.

Ez egybevág a pTepiAB-vel kapott eredményekkel (6.B. ábra; 1. táblázat), ugyanis a pTepiAB tartalmazza az apiA promotert és a teljes epiA és epiB géneket, tehát használatával mind az epiA, mind az epiB mutánsokat ki lehet egészíteni.

A pCUepiCDQ plazmid ki tudta egészíteni mind az epiC, mind az epiD mutánsokat, a pCUepiDQ csak az epiD mutánst volt képes kiegészíteni (1. táblázat). A komplementáció független volt a klónozott DNSfragmentum irányától. Az eredmények azt mutatják, hogy mind az epiC-nek, mind az epiD-nek saját promotere van.

4. példa:

A mutagenizált epiA pTü32 származékokat az

EMS 5 és 6 plazmidból izoláltuk, és az illető epiA nyílt leolvasási kereteket szekventáltuk. Mindkét plazmid pontmutációkat tartalmazott az epiA-η belül;

az EMS 5 plazmidban az AGT kodon (Ser³) AAT-re (Asn^{4 * * * 3}) változott és az EMS 6 plazmidban a GGA kodon (Gly¹⁰) GAA-ra (Gly¹⁰) változott; mindkét mutáció a kritikus helyeken található a nem módosított epiderminen belül.

5. példa:

Az epiB-t (egy BstNI fragmentumon) a pPS4 plazmid promotere szabályozása alá helyeztük (17. ábra). A kapott pPS4epiB plazmid ki tudta egészíteni az EMS 18, 33 és 45 epiB mutánsokat. Egy plazmid, mely az epiB-t ellenkező irányítottsággal tartalmazta, nem tudta kiegészítem a mutációkat. Ez szintén arra utal, hogy a pCUepiB azért nem volt képes egyetlen EMS mutáns kiegészítésére sem, mivel az epiA promoter hiányzott.

6. példa:

Mint fent leírtuk, a pTepil4 (16.A. ábra) az epidermin bioszintézisét eredményezte S. camosusban, ugyanakkor a pTepiABCDQ nem. A DNS-nek azt a minimálisan szükséges méretét, amely S. camosusban a heterológ epidermin expressziójához vezet, úgy határoztuk meg, hogy az S. camosust (pTepiABCDQ) disztálisan elhelyezkedő DNS-fragmentumokkal egészítettük ki (18. ábra). Az S. camosus (pTepiABCDQ) transzformálása a pCA44-90, pCA44-91 és pCA44-92 plazmidokkal epidermintermelést eredményezett. A pCA44-92 amely a teljes epiQ és epiP nyílt leolvasási kereteket tartalmazta - volt a legkisebb DNS-fragmentum, amely képes volt epidermintermelést teljesíteni. Ezek az eredmények arra mutatnak, hogy az epidermin bioszintetikus gének egy 8 kb méretű olyan DNS-fragmentumon csoportosulnak, mely a hat (ORF-ot) nyílt leolvasási keretet tartalmazza, azaz az epiA-t, B-t, C-t, D-t, Q-t és P-t, és hogy más gének nem vesznek részt az epidermin bioszintézisében.

Ezekben a példákban Staphylococcus plazmid DNS-t állítottunk elő hasításos lizáló módszerrel [Makino et al., J. Mól. Bioi., 190, 37-44 (1986)]. A sejteket lizosztafín (8 μg/ml) hozzáadásával lizáltuk, és a DNS-t céziumklorid-grádiensben centrifugálással izoláltuk. Az E. coli szuperspiralizált plazmid DNS-t a módosított alkalikus lizáló módszerrel [Bimbóim et al., Nucl. Acid. Rés., 7, 1513-1518 (1979)] állítottuk elő.

A PCR-rel sokszorozott epiA-tartalmú fragmentum és az EMS 5 és 6. S. epidermis mutánsok két mutált epiA szakaszának a DNS-szekvenciáját kettős szálú DNS-szekvenálással határoztuk meg didezoxi eljárással [McMaster et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 74, 4835-4839 (1977)]. A „szekvencia” lista a Pharmacia cégtől, az (a³⁵S)-dATP az Amersham cégtől származik. A DNS-szekvenáláshoz és a PCR-sokszorozáshoz szolgáló primereket az Applied Biosystems DNSszekvenátorával szintetizáltuk. Az epiA PCR sokszorozásához használt két primer szekvenciája a következő :

a) 5’-GGGTTTTAGG(TA)ATCCTTTTTAATAAATTTTTAGGAG-3’

b) 5’-CCTCAAAATTAAGACG(A)GAT(G)CCTCTATTGAAGCCC-3’

HU 215 548 Β

Az a) primer az epiA RBS-sel szemben kötődik, a b) primer pedig a stop kodon után. A vastagított betűkkel jelölt bázisokat (lásd zárójelben) használtuk BamHI helyek képzésére az epiA-val szemben és az epiA végén; a sokszorozott DNS-fragmentumból hiányzik az epiA promoter.

Az EMS 5 és 6 mutánsokban lévő mutált epiA DNS-szekvenciájának meghatározása céljából pTü32 plazmidot izoláltunk, és a DNS-szakaszt PCRrel sokszoroztuk más DNS-primer készleteket használva, amelyek a lehetséges epiA promoter szakasztól 5’irányban (5 ’ -GGTTTGGTTATTTTCC-3 ’) és a stop kodontól 3’-irányban (5’ -CCTCAAAATTAAGACAGAGCCTC-3 ’) kötődtek; az epiA DNS-szekvenciáját Schnell és munkatársai [Natúré, 333, 276-278 (1988)] is közölték.

7. példa:

Az epiD gént, melyet a pTepil4 plazmidból izoláltunk, PCR-eljárással sokszorozzuk, és beklónozzuk a pIH902 vektor (New England Biolabs) Stul restrikciós helyére „tompavég” -ligálással. Ennek eredményeképpen az epiD gén, közbeeső bázispárok nélkül, közvetlenül fuzionál a pIH902 vektor Xa-faktor hasítási helyénél, majd a kapott plazmiddal E. coli sejteket transzformálunk.

Az E. coli tenyésztése folyamán kifejeződik az E. coli maltózkötő proteinjéhez fuzionált EpiD enzim. A kapott fúziós proteint afifinitás-kromatográfiával tisztítjuk (Amylose oszloptöltet).

Azt találtuk, hogy az EpiD enzimet Xa faktor segítségével alacsony kihozatallal lehet hasítani a fúziós proteinről. A hasítási szakasz aminosavszekvenciájának a módosításával a hasadási arány javítható.

A fúziós proteint DNS-szinten szekvenáltuk a fúzió helyétől az epiD 3’ végéig. Az epiD szekvencia megfelelt a vad típusú S. epidermis szekvenciájának.

A pCA44 plazmidot - S. camosus TM300-ban 1991. december 23-án helyeztük letétbe a Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH-nál (Mascheroder Weg lb, D-3000 Braunschweig, NSZK) DSM 6863 letéti számon.

A fenti leírás alapján a szakemberek könnyen felbecsülhetik a találmány lényeges jellemzőit, és anélkül, hogy a találmány szellemétől és tárgyától eltérnének, a találmányt különböző változtatásokkal és módosításokkal alkalmazhatják a gyakorlatban a különböző feltételeknek megfelelően.

Claims (14)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Eljárás egy EpiB, EpiC, EpiD, EpiP vagy EpiQ enzimatikus aktivitással rendelkező fehérjét kódoló rekombináns DNS-molekula előállítására, azzal jellemezve, hogy önmagában ismert módon a DSM 3095 számon letétbe helyezett Staphylococcus epidermisből származó pTü32 54 kb méretű episzomális elemének Bglll fragmentumán belül elhelyezkedő, a 9. ábrán megadott szekvenciával rendelkező EpiB, EpiC, EpiD, EpiP vagy EpiQ fehérjét kódoló nukleotidszekvenciához szigorú körülmények között hibridizáló DNS-molekulát állítjuk elő.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 9. ábrán megadott aminosavszekvenciával rendelkező EpiB, EpiC, EpiD, EpiP vagy EpiQ fehéijék legalább egyikét kódoló DNS-molekulát állítjuk elő.
3. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy legalább egy 9. ábra szerinti, az EpiB, EpiC, EpiD, EpiP vagy EpiQ fehérjét kódoló nukleinsavszekvenciát tartalmazó DNS-molekulát állítunk elő.
4. 4. Eljárás egy EpiB, EpiC, EpiD, EpiP vagy EpiQ aktivitású fehérjét kódoló DNS-molekulát tartalmazó plazmid előállítására, azzal jellemezve, hogy egy, az 1-3. igénypontok bármelyike szerint előállított DNSmolekulát behelyezünk egy alkalmas plazmidba egy promoter szabályozó szekvencia kontrollja alá, amely plazmidban a többi, említett fehérjét vagy az EpiA fehérjét kódoló DNS-szekvenciák közül egy vagy több hiányzik.
5. 5. Eljárás EpiB, EpiC, EpiD, EpiP vagy EpiQ enzimatikus aktivitással rendelkező fehérje előállítására, azzal jellemezve, hogy egy 4. igénypont szerint előállított plazmidot egy alkalmas gazdasejtbe bevezetünk, az így kapott gazdasejtet a fehérje kifejeződését biztosító körülmények között tenyésztjük, és az expresszált fehérjét izoláljuk.
6. 6. Eljárás legalább egy lantibiotikumra jellemző strukturális tulajdonsággal rendelkező fehérje előállítására, azzal jellemezve, hogy egy előre meghatározott aminosavszekvenciát kódoló DNS-szekvenciát beépítünk egy vektor plazmidba egy szabályozó promoter kontrollja alá, majd az így kapott plazmid vektorral egy olyan gazdasejtet transzformálunk, amelyet az 1-3. igénypontok bármelyike szerint előállított rekombináns DNS-szekvenciával vagy szekvenciákkal is transzformálunk, a transzformált gazdasejtet a DNS-szekvenciák kifejeződését biztosító körülmények között tenyésztjük, és az expresszált fehérjét izoláljuk.
7. 7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az előre meghatározott aminosavszekvenciát kódoló DNS-szekvenciát és az 1-3. igénypontok bármelyike szerint előállított DNS-szekvenciát ugyanabba - a gazdasejt transzformálásához alkalmazott - plazmid vektorba építjük be.
8. 8. A 6. vagy 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az előre meghatározott DNS-szekvencia tartalmazza a preepidermin -30-tól -1-ig terjedő prepeptid szekvenciáját kódoló DNS-szekvenciát, vagy az említett DNS-szekvenciát a preepidermin -30-tól -1-ig terjedő prepeptid szekvenciáját kódoló DNS-szekvenciához közvetlenül downstream (3’) irányba építjük be.
9. 9. Eljárás fúziós fehérje előállítására, azzal jellemezve, hogy egy 5. igénypont szerinti eljárással előállított fehérjét és egy kisegítő fehérjét tartalmazó fúziós fehér15

   HU 215 548 Β jét rekombináns úton kifejezünk vagy egy 5. igénypont szerinti eljárással előállított fehérjét egy kisegítő fehérjéhez kovalensen kapcsolunk.
10. 10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett fehérjéket egy enzimatikusan hasítható aminosavszekvencián keresztül kapcsoljuk össze.
11. 11. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kisegítő fehérjéket egy, a fúziós proteinnek a kiválasztott gazdasejtből való szekrécióját elősegítő fehérjét alkalmazunk.
12. 12. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kisegítő fehérjeként egy, az affinitás-kromatográftával való tisztítást elősegítő fehérjét alkalmazunk.
13. 13. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, 5 hogy kisegítő fehérjeként E. coli eredetű maltózkötő fehérjét alkalmazunk.
14. 14. Eljárás egy 9. igénypont szerint előállított fúziós fehérjét kódoló rekombináns DNS-molekula előállítására, azzal jellemezve, hogy a fúziós fehérje tagjait kó10 doló DNS-szekvenciákat működőképesen összekapcsoljuk.