CZ359396A3 - Složená bílkovina a rekombinantní molekula DNA - Google Patents

Description

Oblast techniky

Vynález se týká složené bílkoviny, obsahující část aminokyselinové sekvence epiderminu a druhou bílkovinu, která může usnadnit sekreci nebo čištění složené bílkoviny. Vynález se rovněž týká příslušné rekombinantní molekuly DNA.

Dosavadní stav techmkv

Některé polypeptidové protilátky, například nisin, subtiiin, duramycin, cinnamycin, ancovenin, Ro 09-0193 a epicermm obsahují dehydroaminokyseliny a lanthioninové můstky. Tyto polypeptidy jsou produkovány různými kmeny mikroorganismů. Například nisin je možno získat kultivací kmenů Streptococcus lactis a subtilin kultivací Sacillus subtilis.

Genetický dosud nebyl osv syntéze těchto mínckyselin v t nebo přes mul ti podklad pro biosyntézu těchto antibiotik až ětlen. Není tedy například známo, zza k bicar.tibiotik a zvláště ke tvorbě neobvyklých aěc.nto látkách dochází přes riboscmální syntézu enzymatické komplexy.

Mimoto až dosud není známo, zda prekursorové bílkoviny takových antibiotik jsou zakódovány ve strukturních genech nebo zda běží o degradační produkty bílkovin s větší molekulou ,

V průběhu studií, prováděných k průkazu strukturního

P*Vt M4A genu epidermv bylo neočekávaně prokázáno, že pro svrchu uvedená antibiotika, zvláště pak pro epidermin, existují zcela určité strukturální geny a že ke zpracování polypeptidového prekursoru dochází působením enzymatického komplexu, který vyvolá tvorbu zbytků dehydroaminckyseLín a/nebo thioéterovýc.n můstků.

Mimoto se uveder.v multienzvmati<

komoSlex muž;

uc;

nit také sekrece bílkoviny buněčnou membránou oo suoernatantu kultury a opracování preooiypepciciu. V této souvislosti může být taková účinnost spojena se signálním řetezcem prepo lypeptidu, tak jako tomu je například, v případe řetězce -3C až -1 crespiderminu, jak bude dále popsáno.

Podstata vynálezu /

Podstatu vynálezu tvoří složená bílkovina, tvořen#... první doménou, sestávající z polypeptidů se sekvencí aminokyselin alespoň jedné z bílkovin Epi B nebo Epi C nebo Epi D nebo Epi P nebo Epi Q z obr. 9 a druhou doménou, tvořenou pomocnou bílkovinou. Podstatu vynálezu tvoří rovněž rekombínantní molekula DNA, obsahující kodovou sekvenci pro složenou bílkovinu.

Ve výhodném provedení usnadňuje druhá doména sekreci složené bílkoviny z hostitele nebo její čištění. Výhodnou druhou doménou je bílkovina, schopná vázat maltozu z E. coli Mezi první a druhou doménou je s výhodou uloženo místo štěpe ní proteázou.

Pcois výkresů

Na obr. 1 je znázorněn nukleotidový řetězec strukturního genu epidermi.nu (aci A) a odvozený řetězec aminokyselin orsspiderminu. Shine-Oalgamův řetězec je uzavřen do obdélníku a místo proteolytického štěpení, v němž je prcceptid zpracováván je označeno šipkou. Opakování 3 obráceným řetězcem jsou podtržena a potenciální stop kočeny jsou označeny jako an (amber) a oc (ochre).

Na obr. 2A je znázorněna předpověz struktury preepiderminu při použití Hvronova programu, v jednotlivých úsecích je znázorněna: a) flexibilita:, b) hydropathie; o) hydrofiinost; d) sklon k obrácení; e) beta-struktura a t) tvorba alia helixu.

Na obr. 23 je znázorněna struktura helixu pro preepidermin, z níž je zřejmé, že N-terminální zakončení může vytvářet v příslušném orostředí amohofilní alfa-helikáí.ní útvar.

Na obr. 3 je znázorněna předpokládaná tvorba epíderminu. Polypeptid po translaci (preepiderrnin) je tvořen 52 zbytky aminokyselin. Předpověd struktury uvádí částečně alfa-heLikální N-terminální zakončení, v němž zbytky -30 až -10 mohou tvořit amphifilní alfa-helikální útvar. K odštěpení vody dochází

místě označených zbytků Sen a Thr (a). S výjimkou zbytku

Thr'^J' je odštěpení vody následováno tvorbou sulfidového kruhu (b) a na C-terminálním zakončení dekarboxylací (o) a tvorbou dvojné vazby (a) za vzniku μ ruep íde rminu. Za struktury Černínu pak vzniká proceclytickým štěpením epídermin.

Na obr. 4 je znázorněna struktura epiceminu. Kruhové struktury jsou označeny Λ, B, C, D a E. Jsou vyznačeny také struktury mesolanthionu a threo-methyllanthionu.

Na obr. 5 jsou znázorněny příklady neobvyklých aminokyselin, které je možno nalézt v lanthionových anticioticích a které se mohou vytvořit v peptidových produktech při použití způsobu podle vynálezu.

Na obr. 6 je schematicky znázorněn způsob výroby plastu du pCUI z plasmidu pCLPIOO a plasmidu pUC18.

Na obr. 7 je znázorněna eluce izolovaného živného pros' ředí, přioraveného zoůsocem podle příkladu 2.

Na obr. 73 je znázorněna eluce standartu, obsahujícího gallidermin. Gallidermin se vymývá v době 7,54 minut.

Obr. 3 uvádí genetickou analýzu episomu pTu32 plasmidu pTu32 3taphylococcus epidermis, včetně 8A: mapa restrikčních míst episomu pTu32 a

3B: mapa restrikčních míst fragmentu BglII o 13,5 kb z pTů32. Vyplněná šipka odpovídá strukturnímu genu epiA. Otevřená šipka představuje čtecí rámec epi3, C, D, P a 080: Southernova hybridizace pTú32 po rozštěpení různými restrikčními enzymy (EcoRI, EcoRV, BgLIII, Sphl) při použití oligonukleotidu (15-meru), specifického pro epiA s řetězcem 5'CACATCCAGGAGTAC 3'.

Ma obr. 9 je znázorněn nukleotidový řetězec BglII/MpaZ) plasmidu ρϊϋ32, obsahující čtecí rámce epiA, B, C, d, P, Q, Ύ' a Y a odvozené řetězce aminokyselin odpovídajících bílkovin. Řetězce S/D a tcrminačni struktury jsou označeny čarcu nad řetězcem. IR znamená obrácené opakování. Počátky otevřených čtecích rámců eoíY, epiA, epi3, epiC, epiD, epiQ a spi? jsou označeny velkými písmeny. N-cerminálni aminokyselina jich zbytky, které jsou pravděpodobnými počátky translace) jsou uvedeny v obdélnících.

Ma obr. LO jsou uvedeny výsledky analyzy Morhtern blot pro epiA (LDA) a epi3 (LOB) po expresi v 5. epidermidis, celková RMA byla dělena na 1,2% agarosovém gelu ( sq mikrogramů dráhy 1, 3 a 5 nebo 20 mikrogramů, dráhy 2, 4 a 6), hybriditě ce byla prováděna při použití antimediátorové sondy RMA (ΞΡ5 transkript, filtry byly promyty za zvyšujícího se omezení poo mínek: dráha L a 2:lx SSC, 0,1% SDS, doba exposice a n,dráhy 3 a 4 : 0,5 x SSC, 0,1% SDS, doba exposice L5 h, dráhy 5 a 6: 0,1 x SSC, 0,1% SDS, doba exposice 3 dny). Polohy 235 a L55 RMA byly užity jako standard pro délku řetězce.

Na obr. 11 je znázorněna homclogie řetězců mezi Spi? a různými proteázami šeřinu na účinných místech :SU3S_, preku sor subtilisinu ÍÍ63 z B. subtilis (Terzaghi a další, Appl. Miorobiol. 29:307-313, 1975), hlavni intracelulární proteáza šeřinu z 3. subtilis (Maniatis a další, Molecular cloning,

A Laboratory fjanual, 2. vyd. Cold Spring Harbour Laboratory Press, 1990, SUMYTV, thermitáza Z Thermoactinomyces vulgaris (Stáhl a další, J. Bacteriol. 158:411-413, 1984). Silně konservované zbytky asparaginu (aps), histidinu (his) a šeřinu (ser) jsou označeny hvězdičkami. Podobné zbytky aminokyseLin jsou označeny puntíkem a totožné zbytky aminokyselin dvěma puntíky nad sebou.

Na obr. 12 jsou znázorněny homologie řetězce mezi epiQ a PhoB (Makino a další, J. Mol. Biol. 190:37-44, 1986). Podob

né zbytky aminokyselin jsou označeny puntíkem a totožné zbvtk dvěma puntíky nad sebou.

Na obr. 13 je znázorněna sluce epiderminu, produkovaného

S. carnosus-TM 300 při HPLC.

13A: eluce standardu epiderminu, doba 6,75 minut, při níž epi· dermin je vymyt, je označena šipkou.

13B: eluce epiderminu, izolovaného z filtrátu kultury S. czrnosus TM300 p'Tepil4, doba 6,75 minut je opět označena Šipkou. Filtráty kultury byly adsorbovány na XAD 1130, k eluci byl užit methanol, frakce byly koncentrovány odpařováním.

L3C: eluce filtrátu kultury netransformovaného 3. carnosus TM300, zpracování bylo stejné jako na obr. 133. Plná čára označuje oblast eluce epiderminu.

Na obr. 14 je __r309 'U : í

Pvuíl' honásobné klonování bení Ndel v o re obl

159:2601-2610, 1937, Kahn a další, vazbou zarovnaných konců. Uložení vzhledem k pre. Plná část označuje ná část vložený fragment pUC19.

znázorněna konstrukce pT131mcs, Fragment plasmidu puCIP, část lacZ a místo pro mr.c (mcs) byly uloženy do jediného místa puso sti pT131 (Gennaro a další, J. Bacteriol.

Plasmid 10: 251-259, 1932 lacZ je v opačné orientaci přerušené konce pre, prázd

Na obr. 15 je znázorněna konstrukce plasmidu pCUl. Plasmís pOLPIOO je derivát plasmidu pC194 (Horinouchi a další,

J. Bacteriol. 150:315-825, 1982), který obsahuje jediné místo působení Pstl, které vzniklo otevřením pC194 v místě HindlII s následnou změnou zakončení působením 8al3l (přibližně 950 bp) a včleněním vazného řetězce Pstl s vazbou zarovnaných konců, plasmid pCUl byl pak vytvořen navázáním pCPLIOO a pUC19 Víeira a další, Gene 19:259-268, 1982) přes jediná místa působení enzymů Pstl a Ndel. Místo pro mnohonásobné klonováni

(mcs) v přední části lacZ bylo užito ke klonování různých fragmentů s obsahem epi genu. K replikaci tohoto vektoru dochází jak u čeledi Staphylococcus, tak u E. coli.

o·¹ o r .6 znázorňuje:

vznik plasmidu pTepiiu klonováním fragmentu BglII o 14 kb plasmidu pTu32 v pT181mcs. Tento fragment obsahuje úplnou genetickou informaci, nutnou k produkci spidermmu v s. camosus. Znázorněné úseky ORF a směry jejich transkripce, označené šipkami, jsou odvozeny od řetězce DNA. Strukturní gen eoiA ie znázorněn černou šiokou.

různé fragmenty pTepilu DMA, subklonov&né v pTLSlmcs (pT...) nebo pCUl pCU...). K doplnění epi mutar.t S. epice: midis byly užity odpovídající pLasmidy. Je znázorněna úplní ist Urtr , pr ítemná v Dlasmidu.

Plasmid oPS· je znázorněna konstrukce pPSdepiA a pPScecio ;e derivát pLipPSl (Liebl a další, Ml. Gen. Gene'

204:156-173, 1986). Jediné místo působení enzymu □ - —-i Lí ’ uloženo silný promotor z čeLedi Súaphylococcus. Klonování genů v místě 3amHI pod řízením promotoru GRF2 obvykle vede k dobré expresí u této čeledi. Úsek epi.A byl amlifikován pomocí PCR a obsahoval části řetězce v blízkosti místa BamHI. Do místa BamHI byl uložen fragment 8stNI o 3,2 kb, obsahující epi3 při použití vazby zarovnaných konců. Příslušné mutanty EMS byly kompLamentovány pouze v případě, že epiA a epíB byly pod řízením promotoru 0RF2.

Lip = gen pro lipázu, cat = gen pro chloramfenicolacetyltransferázu, 0RF2 = specificky zkrácený ORF S. carnosus.

Ma obr. 13 je znázorněna komplementace produkce epiderminu u Ξ. carnosus (pTepiABCDQ) při použití lemovacích řetězců DNA. K subkionování fragmentů byl použit kompatibilní plasmid.

£

Popis výhodných provedení

V obecnějším smyslu se vynález týká bakteriálního host tele, nesoucího ple.srid, s kódem pro polypeptid, který hosti Pelem obvykle, není produkován, přičemž v průběhu kultivace hostitel produkuje muitienzymatický komplex, jehož působením docnází k produkci pciypeptidu, obsahujícího alespoň jednu dehydrcaminokyse1inu a/nebo alespoň jeden lanthioninový můst přičemž běží o polypeptid pro hostitele cizorodý.

Vhodným mu 11iěnzymatickým komplexem je takový komplex, který je schopen uskutečnit alespoň jednu z následujících cperací: odštěpení vody a/nebo tvorbu sulfidových můstků, kůže rovněž provádět dekarboxylácí a tvorbu dvojných vazeb.

Vhodným hostitelem k provádění způsobu podle vynálezu je hostitel, který bez modifikace svého genetického materiál je schopen produkovat polypeptidy, obsahující zbytky dehydrc aminokyselin a/nebo lanthioninové můstky a/nebo methyllanchi ninové můstky. Příkladem takových hostitelů mohou být mikroc ganismy Streptococous lactis, Bacillus subtilis, Streptomyce cinnamoneus, Streptomyces sp., Streptoverticullum griseoverticullum, Stahylococous epidermidis, Staphylococcus epidermi kmen 5, Staphylococcus gallinarum a jeho mutantní kmeny, například mutantní kmen S. epidermin DSM 3095, který je schope produkovat epidermin.

Jako zvláště zajímavé kmeny v tomto smyslu je možno uvěst Staphylococcus gallinarum (F16/P57) Tů 3928, který byl uložen ve sbírce Deutsche Sammlung von Microorganismen podle budapešťské úmluvy 18. května 1988 a pod číslem uložení Tú 3928 v DSM 4615 a Staphylococcus epidermidis DSM 3095, který byl uložen rovněž ve sbírce Deutsche Sammlung von Mikroorganismen podle budapešťské úmluvy 26. října 1984.

Pro transformací vhodného hostitele je možno příslušný plasmid moči;'!kovat známými postupy genetického inženýrství.

Ξ výhodou se Dostupuje tak, že se plasmid z hostitele, produkujícíhc,polypeptid s obsahem alespoň jednoho zbytku dehydroaminokyselin a/nebo alespoň jednoho sulfidového můstku modifikuje tak, že dochází k náhradě genu, který je kódem cro prepolypeptzd za vzniku plasmidu, který je kódem pro polypeptid, cizorodý pro hostitele, načež se tento plasmid užije pro transformaci hostitele.

K náhradě nebo modifikaci genu, který je kódem pro prspolypeptiif. je možno užít jakéhokoliv postupu nebo kombinace pos tupů

Kočovou DNA pro cřepolypeptid požadované sloučeniny je možno připravit chemickou syntézou. Vhodné chemické postupy byly popsány v Anal Biochem. 121, 365, 1982. Známé postupy dovolují přípravu polynukleotidů například až do délky řetězce 60 až 100 baží.

Vhodné chráněné nukleotidy je možno vázat fosfodiesterc vou metodou podle publikace Agarwal a další, Angew. Chem. 3-, 489, 1972, fosfotriesterovou metodou (Reesem, Tetrahedron 29, 3, 1983) nebo rosíittriesterovou metodou (Letsmger a další, J. Am. Chem. Soc. 98, 2655, 1976) nebo také fosforamiditovou metodou. Metoda na pevné fázi umožOuje zjednodušení syntézy polynukleotidů,

DNA s dvojitým řetězcem je možno připravit enzymaticky z chemicky připravených krátkých, avšak překrývajících se segmentů řetězce.

Je například možno použít překrývající se polynukleotidové řetězce z obou části dvojitého řetězce DNA, tyto řetězce

1ú jsou současně udržovány ve správné vzájemné poloze párováním baží a pak chemicky vázány působením enzymu DNA-ligázy podle publikace Khorana a další, J. Biol. Chem. 251, 565, 1976.

Další'možností je postup, po lyr.ukl eo t í dový řetězec ze při němž se vždy zvou řetězců DNA ir.kubuje ροζ krátkým překrývajícím se segmentem v přítomnosti čtyř dscxyr.ukleosidcrifosfátů a DNA-polymerázy, například DNA-polymerázy I, Klenowova fragmentu polymerázy 1 nebo Tb DNA-polymerázy nebo v přítomnosti reversní transkriptázy. Oba polynukíeotidové řetěžce jsou udržovány ve správné vzájemné poloze párováním baží a jsou doplněny působením enzymu požadovanými nukleotidy za vzniku úplného dvojitého řetězce DNA (Narany a další, Anaí. Biochem. 121. 365, 1932).

Další vhodný postup pro získání kodové DMA pro polypeptid spočívá v tom, že se izoluje DNA z DMA genomu tkáně nebo tkáňové kultury nebo mikroorganismu, buňky se rozruší například působením SDS nebo proteinázy K, popřípadě mechanicky a DMA se podrobí deproze i nizaci opakovanou extrakcí fenolem.

RNA se 5 výhodou štěpí pomocí RNázy. Získaná surová DMA se částečně rozštěpí vhodným restrikčním enzymem, například HAefll a Alu a fragmenty se izolují a množí ve vhodném fágu nebo cosmídu, například Charon 4A nebo EMBL-3 a pak se sleduje obsah požadovaných řetězců například s použitím radioaktivně značené sondy DNA.

Kódovou DNA pro požadovaný polypeptid je možno rovněž získat reversní transkripcí izolované mRNA v cDNA. Může jít o výhodný postup v případě, že struktura DNA není známa. Při provádění tohoto postupu se DNA získává z DNA genomu v bance cDNA přes mRNA. Banka cDNA obsahuje genetickou informaci, která je komplementární k mRNA, izolované z buněk.

K získání banky cDNA se izoLuje mRNA z buněk, u nichž dochází k expresi požadovaného základního ( pokud možno nemodifikovaného) proteinu. Tato mRNA se pak převede na cDNA s dvo- |

Jtóyiiirětezcem. r.

X upy, které a buněčný obmRNA. Buněčná y nebo působe, změnou koníci m zařízení.

Při přípravě mRNA se užijí standardní peso jsou v oooru známy. 3ur.ěčná membrána se rozruší sah se úvodní, z tohoto materálu se pak izoluje membrána se s výhodou rozruší fysikálními postup ním smáčedel, například SDS , guanídinthiokyanázu centrace solí nebo homogenizací, s výhodou v mís pak se mRNA izoluje standardními postupy, a to extrakcí fenolem, vysrážením pomocí ethanolu, odstředěním a chromatografií, 3 výhodou kombinací několika metod. Odstředění se obvykle provádí při použití gradientu, například CsCl. Chromatografie se s výhodou provádí na sloupci, zejména oligc-dT.

Celková mRNA muže být přímo převedena na Ds-cDNA známými postupy. S výhodou se mRNA, která je kódem pro požadovaný polypeptid dále obohatí při použití několika různých postupů, například elektroforézy, chromatografie a odstřsdcvání, s výhodou odstředěním při použití sacharozového gradientu.

Frakce s obsahem mRNA, která je kódem pro požadovaný polypeptid může být zjištěna různými postupy, například translací in vivo i in vitro s následnou detekcí relevantní aktivity nebo v případě, že nukleotidový řetězec je znám, hybridizací při použití oligonukleotidové sondy.

Použitý in vivo translační systém může být prokaryotický nebo eukaryotický systém. Výhodným systémem pro translací in vivo je systém oocytů Xenopus laevis (Maniatis a další, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982). Vhodnými systémy in vitro jsou například pšeničný klícek a lysát retikulocytů králíka, běžně dodávané.

/2

K

Z jakékoliv směsi mRNA, odvozené od nefrakcionované nebo frakcionované mRNA je možno získat ds-cDNA známými postupy (s výhodou obecnými postupy, které byly popsány v|é svrchu

ích.	dále Okayam a 3e	>-1 <7 ' o r
170,	1^8^ s d θ p t1*1	, Nuc-
13 3 3	. Obecně je možno	UVés t
DNA	oři ooužití rever	sní

uvrceno ροοχίνοοι naniatise a n;

Noleular and .Cell BioLosy, 2, 151-i lei; Ac: f Research li, 4891-4906, 193 že mRNA se nejprve převádí na ss-cDNA transkriptázy nebo DNA-polymerázy I (Klenowův fragment). Rro zahájení syntézy ds-cDNA je možno použít dvou postupů. První postup spočívá ve tvorbě přirozené smyčky ss-oDHA, druhý v prodlužování ss-cDNÁ homopolymerním zakončením, například poly-dC něco poly-dT.

Frakce mRNA, z níž odpovídající polypeptid má nejvyšší účinnost je transkribcvána do komplementární cDNA známým způsobem. Rak se smísí mRNA a oligo-dT jako primer, přidá se dMT? jako výchozí materiál a syntéza hybridní molekuly cDNAmRNA se provádí působením enzymu reversní transkriptázy. Molekuly RNA jsou degradovány přidáním NaOH. Přidá se DMA-polymeráza, s výhodou Klenowův fragment DNA polymerázy I a směs se inkubuje při vhodné teplotě, s výhodou 12-15 Ό . Rak se směs inkubuje s nukieázou Sl a tak se získá ds-cDNA, odpovídající mRNA, která je kódem pro požadovaný polypeptid.

K dosazení amplifikace je možno získanou ds-cDNA po úpravě sestřihem uložit do vhodného vektoru, například do plasmidu pUC-KO a získaný hybridní vektor pak pomnožit při použití vhodného hostitele, například E. coli HB10L. ReizoLace hybridních vektorů a opětná izolace cDNA z těchto vektorů pak umožní stanovení struktury kódové DNA pro požadovaný polypeptid.

X

Příprava hybridního vektoru

Hybridní vektor podle vynálezu je možno připravit tak, že se po úpravě sestřihem uloží kódová DNA pro polypeptid s Dožadovaným 'řetězcem do vhodného vektoru.

váné

Vhodné vektory jsou vektory, které jsou nosiči izorocé DMA a je možno je použít k transformac

Integra hostit ského mikroorganismu.

Vhodnými vektory jsou plasmidy, odvozené od mikroorgar, mů, které v netransformovaném stavu produkují polypeptidy s obsahem dehydroamincsxupin a/nebo sulfidových skupin. Vhodné vektory obsahují vloženou DNA v definované poloze.

X^-

Obecně mohou takové vektory obsahovat replikon a říci:

řetězec, tj. promotor, odvezený cd hostitelské buňky nebo od jiné buňky, která je kompatibilní s hostitelskou buňkou, v níž jsou tyto části pcužity. Vektor obvykle obsahuje repliko r·, a m.ůže obsahovat signální řetězce (značící geny), které umo ňují fenotypovou selekci v transformované buňce. Vhodnými ge ny pro toto použití jsou geny pro odolnost proti působení ar. tibiotik nebo pro odolnost proti těšným kovům nebo geny, kte doplňují genetický defekt hostitele. Dalšími vhodnými řetěz ci, které mohou být ve vektrou obsaženy jsou zesilovací četě ce a aktivační řetězce.

Jedním z vhodných vektorů pro toto použití je plasmid pEpi32 o 54 ,Řbp z kmene Staphylococcus epidermis DSM 3095. Tento plasmid, který bude dále podrobněji charakterizován, obsahuje gen epiA, který je kódem pro 52-prepeptid, který je dále zpracováván na 21- peptičamid s antibiotickým účinkem. Vektor, obsahující cizorodou DNA je označován jako hybridní vektor.

Požadovaná DNA se po sestřihu uloží do vektoru obvyklými postupy.

Výchoz?! plasmid je například možno nejprve linearizovat působením vhodných restrikcních enzymů, například v případe plasmidu pEpi32 je možno použít enzymy HindlII, EamHl a EcoRI, pak se naváží zakončení d/G v přítomnosti dGT? a terminální deoxynukleotidyltransíerázy. Uložená oDNA s dvojitým řetězcem se opatří zakončením dC v přítomnosti dCTP a terminální deoxynukleotidyItransferázy. Po vazbě cDNA a vektoru se získá hycridní vektor. Bakteriofágy, například lambda jsou velmi vhodr ne pro konstrukci gencmovych bank. Klonovaci systém na bázi lambda byl popsán ve svrchu uvedené publikaci Maniatise a dalších. Vhodná DMA vektoru se úplně rozštěpí příslušným restrikčním enzymem a levá a pravá zakončení se oddělí cd středních fragmentů odstředěním pří použití gradientu nebo elektroforézcu na gelu. Další postup spočívá v tom, že se středové Částí řetězce odštěpí působením restrikcních enzymů, pro něž již pravý a levý fragment neobsahuje místo štěpeni. Izolovanou DNA genomu je možno částečně rozštěpit na fragmenty o délce 13 až 20 ko . Pak se zakončení spojí s fragmenty cizorodé DNA, jejíž zakončení jsou kompatibilní s odštěpenými postranními řetězci.

Uložená DNA se pak reklonuje z původního vektoru, použitého pro počáteční klonování, do vhodného vektoru pro expresi. i< tomuto účelu se použití vhodné restrikční enzymy, popřípadě v kombinaci s oxonukieony, čímž je možno získt požadované fragmenty DNA.

Uloženou DNA je pak možno subklonovať v místě pro vícenásobné klonování vhodného plasmidového vektoru, například je možno použít deriváty pC194, pTISl· a pUBHO v restrikČním místě HindlII/Bamf-íI/EcoRI.

Způsob podle vynálezu je tedy možno použít k získání derivátů známých peptidů a hormonů, v nichž je cysteinový zbycek v nemodifikovaném peptidu nahrazen aminokyselinami 3g ůLi. i GU V V iii úluč vKciii 5. 36 Γ1Λ 3 uΓΊ1 um dajícími zbytky dehydroaminokyselin.

Tyto fragmenty jsou integrovány do příslušného vektoru pro expresi při použití kohesivních zakončení přímo nebo po navázání příslušně chemicky synthetízovaných oligonukleotidcvých můstků. Pro modifikaci zakončení je možno užít napříklac enzymy Hinclll a BglII. Postup však není omezen na žádné specifické restrikční enzymy, Mezi vektorem pro expresi a uloženou DNA je možno vytvořit jakoukoliv požadovanou vazbu při použití vhodných restrikčních enzymů v kombinaci s chemicky synthetizovanými o 11gonukieotidy.

Je možno připravit také příslušné uložené DNA, které jsou kódem pro polypeptid s cílenou mutagenezí.

K indukci mutací uvedené DNA je možno použít celou řadu metod a tak získat požadované mutanty.

Jeden z možných postupů spočívá v tom, že se nejprve uloží fragment nativního nebo bazického genu s obsahem kódového řetězce pro oblast, která má být podrobena mutaci, do repli Nativní formy fágu, například fágu M13mp8 za vzniku M13mp8PA. Pak se synthetický oligonukleotid, komplementární k uloženému řetězci, avšak obsahující jeden nebo větší počet tripletů nukleotidů, které jsou kódem pro aminokyselinu, která má být nahrazena, naváže na formu M13mp8A s jednoduchým řetězcem za vzni ku oblasti s dvojitým řetězcem. Tato oblast slouží jako primer pro syntézu zbývající Části kom plementárního řetězce působením DNA polymerázy I. Po replikaci a identifikaci je možno mutovaný řetězec dále modifikovat nebo použít ke konstrukci vhodného vekzpru pro expresí mutovaného polypeptidu.

///

V průběhu prací, prováděných na epiderminu byla přípra/ véna DNA sonda s kolísavým párováním baží, se vzorcem 5 '-GTG( A) CAT (G/'A) ATG(A) AAT(C ) T7-3 ' , odvozená od vhodného pentaco oti dového segmentu oředookilhaného nředběžného řetězce epiderminu LysPhelleCylThr. Tato sonda DNA byla hybridizována srotí DNA olsamidu ze S. epidermis DSM 3095.

Restrikční analýza izolovaného plasmidu prokazuje sedm fragmentů DNA při použiti EcoRI (16, LI, 10, 6,5, 5,3, 3,5 a 2,5 kbp) 9 fragmentů DNA při použití Hindill (17, 14, 10, 5,3, 2,8, 1,3. 0,8, 0,5 a 0,5 kbp) a 5 fragmentů DNA při použití BamHI (20, 19, 10, 3 a 1 kbp).

i

Fragment o 5,4 kbp po štěpení enzymem Hindill byl subklonován a podroben rehybridizaci, přičemž struktura genu epiA byla uložena do fragmentu o 2,2 kbp po štěpení enzymy EcoRl/BglIi .

Jako hybridizační sonda byla užita směs 24 různých 14merů. Tato sonda byla užita ve 30násobném přebytku jako příměr při analýze řetězce způsobem podle publikace Novick a další, Ann, N.Y. Acad. Sci 132, 279-294 (1971), Southern, J. Moleo. Biol. 98, 503-517, 1975 a Heinrich a další, Molecui. gen Genet. 209, 563-569, 1987. Peptidový řetězec epiderminu dovolil identifikaci otevřeného Čtecího rámce. Jediný kodon pro methicnin se nachází v příslušné vzdálenosti od Shine-Dalgarnova řetězce. Strukturní gen pro epidermin končí na stop kodonu

TAA, preepidermín je tedy tvořen 52 aminokyselinami (obr. 1) _ i a je zpracován na epidermin mezi zbytky aminokyselin Arg a Ile⁺^. Je tedy zcela zřejmé, že preepidermín není degradačním produktem větší bílkoviny, nýbrž je zakódován v určitém strukturálním genu.

Kombinace předpovědí pro sekundární struktury (alfa, beta, apod.) flexibilita, hydropathie, hydrofilnost (obr.

/7

2A) a šroubovicový závit byly provedeny pří použití programu Hycon (obr. 23). Vysoká pravděpodobnost alía-helixu je předpovídána pro preepidermin -30 až -8, kdežto v případě C-termíná: ní částí 1 až 22, kte-á odpovídá preepiderminu je vyseká pravděpodobnost otočení. Mimoto je z předpovědi zřejmé, že M-tsrminální zakončeni -3C až -1 je vysoce hydrofilní, kdežto Cterminální čáet je lipofilnější- M-terminální část -30 až -8 je patrně stočena do amphofilního alfa-helixu.

M-terminální segment prespiderminu -30 až -1 neobsanuje žádné cysteínové zbytky, kdežto C-terminálnní segment 1-22 obsahuje čt^yři cysteínové zbytky, které tvoří sulfidové můstky. V řetězci -30 sž -L se nachází řada míst štěpení pro o endoproteázy, /kdežto/ i ve formě prespiderminu je řetězec 1 až 22 vysoce odolný proti proteolytické degradaci.

Úplné antibiotikum může být rozrušeno pouze tryp_ i _ j sinem v místě Lys v poloze 13. Místo zpracovaní Arg *Ile je hydrofilní a snadno přístupné vzhledem k ohybu, který je o

vytvořen zbytkem Pro

Různé enzymatické reakce, k nímž dochází při tvorbě antibiotik, například epíderminu zahrnují modifikace propolypeptidové části 1 až 22, štěpení N-terminálního prepeptidového fragmentu -30 až -1 a sekreci výsledného antibiotika (obr.

a d) .

K enzymatickým modifikacím dochází před odštěpením prepeptidového fragmentu. Enzymatická modifikace zahrnuje odštěpení vody ze zbytků 5er a Thr v polohách 5, 16, 19 a 8,14 za vzniku dehydroalaninových a dehydrobutyrinových zbytků. Dochází rovněž k adici thiolových skupin zbytků Cys v polohách 2, 11, 21 a 22 na dvojné vazby C=C, čímž vzniká meso-lanthionin nebo (2S, 3S, 6R)-3-methyllanthioninový můstek. Mimoto dochází při dekarboxylaci zbytku 22 a tvorbě dvojné vazby

X tomnosti cysteinoveho zbytku. Tato poloha voří místo enzymatického štěpení, v němž dccháantibiocika epiderminu působením trypsinu, vých kruhů dochází k C-terminální rigiditě a ke vzniku C-terminálního S-{2-aminovínyl)-D-cysteinu. K reakci C-terminálně uložených thiolových skupin cysteinu s N-terminálně uloženými dehydroaminokyselinami dochází s vysokou stereosoecifičností u epiderminu, nisinu a subtilinu. Tomu odpovídá, že v průběhu modifikace těchto eliminačních a edičních reakcí dochází k obrácení konfigurace na uhlíkovém atomu v poloze alfa na preepiderminových zbytcích L-3er a b-Thr za vzniku D-konfigurace uhlíkových atomů v poloze alfa. Na druhé straně je konfigurace L na cysteinové části zachována.

VYtváří se také čt^ři sulfidové kruhy, postupně na tomtéž katalytickém misce, které vzniká interakcí s N-cer· + L mmalnim ampncfilnim alfa.heiixem. Pouze k dehycraci Thr dochází óez pří

-i ^Ί -i a (Lys ^Dho ) t z i k inaktivaci Tvorbou sulfido ke zvýšení hydrofoonosti, což může příznivě ovlivnit interakci proepiderminu s lipídovcu dvojvrstvou a indukovat translokací.

Nakonec dochází k odštěpení hydrofilniho alfa-helikálního N-terminálního zakončení -30 až -1 působením specifické proceázy na charakteristickém místě štěpení, jak jíž bylo uvededno svrchu.

Při použití svrchu uvedeného postupu je možno,/ modifikovat plasmidy, které obsahují kód pro lantibiotika bud mutací genového kódu pro odpovídající polypeptid nebo nahrádou tohoto genu genem, který je kódem pro doli&ný polypeptid s následnou transformací původního hostitele na odlišného hostitele za předpokladu, že tento hostitel je v netransformované formě rovněž schopen exprese lantibiotika.

Obecně řečeno: v případe, že původní funkční gen je kódem pro předběžný řetězec, jak bylo svrchu uvedeno v případě epiderminu, je možno zachovat řetězec DMA, který je kódem pro tento předběžný řetězec i v modifikovaném plasmidu. V tomto případě bude řetězec DNA pro nový, mutovaný propolypeptid uložen těsně za předběžným řetězcem DNAj cak jak tomu je v případě původního propoLypeptidového řetězce.

Kultivaci bakteriálního hostit;

podle vyňal :u je možno uskutečnit za oovyklo užívaných jak byly popsány naoříklad v britské patentové přihlášce Č. 3811760.1, podané 18. května 1988 a ve zveřejněné evropské patentové přihlášce č. 181 578. Čištění a izolace požadované bílkoviny se rovněž provádí způsobem podle svrchu uvedených patentových přihlášek pro epidermin a gallidermin s případným: modifikacemi pokud jde o použití adsorpčních činidel, iontoměničových rpyskyřic a popřípadě HPLC.

Způsob podle vynálezu je možno využít pro získání nových sloučenin pro experimentální účely nebo ke tvorbě známých sloučenin nebo derivátů známých sloučenin v nových hostitelích. Js například možno použít plasmid, obsahující gen, který je kódem pro epidermin k transformaci Střeptococcus lactis k získání epiderminu pomocí tohoto hostitele, nebo je možno gen pro gallidermin užít k náhradě genu pro propolypeptid epiderminu například v plasmidu p£pi32 a pak plasmid použít d

k transformaci Íítaphylococcus epidermis DSM 3095 k získání gal1iderminu z tohoto hostitele. Obdobným způsobem je také možno připravit další biologicky účinné peptidové deriváty, obsahující zbytky dehydroaminokyselin a/nebo lanthioninové můstky a/nebo methyllanthioninové můstky, například deriváty hormonů jako jsou lidský insulin, oxytocin, vasopressin, peptidová antibiotika, inhibitory hormonů, jako inhibitor elastázy a fibrinolyticky účinné kátky jako lidský tkáňový aktivátor plasminogenu. Takové deriváty si mohou podržet biologickou účinnost původní látky při vyšší stálosti a delším biologickém poločasu.

χ

V ideálním případě by mel kód DNA pro požadovaný propolypeptid obsahovat kodony pro cystein a serin a/nebo pro cystein a threonin pro tvorbu thioéterových můstků.

V* případě poměrně krátkých řetězců poiypeptídů bv uvedené kodony měly být cd sebe uloženy ve vzdálenosti ne více než šest kodcnů včetně,ačkoLiv v závislosti na scénickém uspořádání molekuly výsledného polypeptidu by zásadně mohly být zbytky uloženy dále od sebe.

Pokud jde' o tvorbu dehydroýmínokyseLin, jsou tyto aminokyseliny obvykle odvozeny od šeřinu a threoninu,a proto kódové DNA pro požadované cropolypepúidy budou zanrnovat koceny pro tyto aminokyseliny.

Z neobvyklých aminokyselin, které mohou být přítomny v polypeptidu, získaném způsobem podle vynálezu je možno uvést dehydroalanin, 2,3-dehydro-2-aminomáselnou kyselinu, mesoianthionin, (25,33 ,-5R)-3-methyLlanthionín , S-(2-(Z)-amincviny 1) D—cys te in, lysinoalanin a kyselinu beta-hydroxyasparagevou. Struktura zbytků těchto kyselin je znázorněna na obr. 5.

Bylo neočekávaně prokázáno, že multienzymatický kompLex, který je zodpovědný za posttranslační modifikaci preepiderminu je uložen v plasmidu pTu.32 o 54 kb ze Staphyiococcus epidermis Tiž 3293/DSM 3095.

Šest genů (ORF), zodpovědných za produkci epiderminu se označuje epiA, B, C, D, 0 a P, tyto geny jsou uloženy v oblasti o 8 kb a bílkoviny, pro něž jsou tyto geny kódem se označují £pi A, 0, C, D, Q a P; epiA je kódem pro preepidermin s délkou 52 zbytků aminokyselin. Jak bude dále podrobněji popsáno, epiB, C a D se účastní čtyř enzymatických modifikačních reakcí, a to i) odštěpení vody působením serin/threonin dehydratázy, ii) adice síry působením lanthioninsynthetázy, iii) C-terminální dekarboxyláce působením cysteindekarboxylázy a iv) tvorba dvojné vazby. Má se za to, že bílkovina EpiP je zodpovědná za odštěpení epiderminu od N-terminálního vedoucího řetězce peptidu vzhledem ke své překvapující homologii se základní oblastí serínproteáz (Koide a další, J. Bacierioi.

167: 110-116, 1986, Meloun a další, FESS Lett. L83:195-200, 1985 a Stáhl a další, J. BacterioL. 158, 411-413, 198-4), EpiQ je patrně bílkovina, která řídí biosyntézu epiderminu vzhledem ke své zřetelné homologii s genem phoB z E. coli (Makáno a další, j. Mol. Biol. 190:37-4/1, 1986), obě bílkoviny mají podobnou délku řetězce, 205 (epiQ) a 229 (phoB), pozorovaná homologie 24,2 % zasahuje 153 C-termínálnich zbytků aminokyselin a obdobná je i hydrctilnost obou bílkovin.

V důsledku neočekávaného zjištění úplné genetické informace pro biosyntézu epiderminu a vzhledem k osvětlení genů pro bílkoviny epi 3, C, D, Q a P je nyní možno získat isolovanou kódovou DMA pro tyto bílkoviny a zkonstruovat plasmidy, obsahující jeden nebo větší počet těchto genů, takže při kultivaci hostitele, obsahujícího takové plasmidy může docházet k expresi jedné z těchto bílkovin nebo předem určených kombinací těchto bílkovin a tyto bílkoviny je pak mošno izolovat .

Podstatu vynálezu tedy tvoří rovněž řetězce DNA, které jsou kódovými řetězci pro bílkoviny EpiB nebo EpiC, EpiD, Epi? nebo EpiQ. Těmito řetězci mohou být izolované řetězce DNA s jednoduchým nebo dvojitým řetězcem, získané štěpením a izolací z pTu32 známým způsobem nebo získané chemickou syntézou nebo jakýmkoliv jiným obvyklým způsobem. DNA může rovněž být integrována v plasmidu, s výhodou v plasmidu pro expresi a pod řízením promotoru. Při použití těchto konstrukcí k transformaci vhodného hostitele, který se pak kultivuje dochází k expresi bílkovin EpiB, EpiC, EpiD, EpiP nebo EpiQ nebo kombinací těchto bílkovin, jejichž DNA byla uložena do ,2^

- 'Χ plasmidu. Je také možno postupovat tak, žs se na pLasmid p'Tu32 působí vhodnými restrikčními endonukleázami k vyjmutí jednoho nebo· druhého řetězce DNA, načež se po jakékoliv nezbytné úo^avě volných zakončení rozštěpeného plasmidu řetězce opět naváží za· vzniku modifikovaného clasmidu, obsahujícího řetězce DNA, které jsou kódovými řetězci prc některou z bílkovin epi 3, o, D, P nebo Q.

Další možné provedení spočívá v tom, žs se gen, který je kódem pro epidermin v plasmidu pTu32 nahradí řetězcem DNA, který je kódem pro předem určený řetězec aminokyselin a pak se hostitel s modifikovaným plasmidem pěstuje, čímž dojde k expresi bílkoviny, odlišné od epiderminu.

Je tedy možné nahradit v plasmidu pTů32 řetězec, který je kódem pro epidermin řetězcem DNA, který je kodovým řetězcem pro gallidermin, mutovaný epidermin, jiné lantibiotikum nebo jinou bílkovinu a výsledný plasmid užít k transformaci vhodného hostitele, přičemž může jít o hostitele, který za obvyklých podmínek není schopen produkovat Lantibietikum nebo některou z bílkovin Epi 3, C, D, P nebo Q. Tento hostitel se pak pěstuje za podmínek, při nichž dochází k expresi nahrazeného řetězce DNA a genů epi 3, C, D, P a Q za zívkání bílkoviny, kterou je galiidermin, mutovaný epidermin nebo jiná bílkovina, obsahující alespoň jeden strukturní znak 1 antibiotika.

Je také možno postupovat tak, že se geny, které jsou kódem pro bílkoviny Epi 3, C, D, P nebo Q uloží do vhodného vektoru spolu s řetězcem DNA, který je kódem pro předem určený řetězec aminokyselin, přičemž kódové geny pro bílkoviny Epi a pro předem určený řetězec aminokyselin jsou operativně spojeny s vhodným funkčním promotorem, výsledný plasmid se užije k transformaci vhodného hostitele, kterým může být hostitel, který za běžných podmínek není schopen produkce lantibiotika ani žádné bílkoviny ze skupiny Epi 3, C, D, P nebo Q a hostitel se pak pěstuje za podmínek, při nichž dochází k expresi bílkoviny, odvozené od předem určeného řetězce aminokyselin, avšak se strukturními vlastnostmi lancibiotiká, touto bílkovinou může být galLidermin, epidermin, mutovaný epidermin nebi jmá bílkovina.

Podstatu vynálezu tedy tvoří také řetězce DNA, schopné hybridízace, s výhodou za přísně vymezených podmínek, s řetězci DNA, které byly svrchu popsány a jsou kódem pro bílkoviny s účinností Epi B, C, D, P nebo Q. Za přísně vymezených hybridizačních podmínek dochází k selekci řetězců DMA s homclosií vyšší než 35 % nebo s výhodou vyšší než 90 %. Analýza banky cDNA muže být prováděny za pnsne vymezenycn podmíněn a podle publikace Kashima a další, Mature 313: 4Q2-^d04, 1965. Řetězce DNA, které jsou za přísně vymezených podmínek schopny hybridízace se svrchu uvedenými řetězci DNA mohou například být alelové varianty nových řetězců DNA, které mohcu být přirozeně přítomny v určitých mikroorganismech a jsou příbuzné novým řetězcům DNA, nebo mohou být odvozený z jiných zdrojů. Obecné postupy při hybridizaci nuklecvých kyselin jsou popsány v publikaci Maniatis T.a další, Molecular C loning, a Labcratory Manual, Cold Spring Harbor, NY, 1982 a Haymes 3.D. a další, Nucleic Acid Hybridization, a Practical Approach, IRE Press, Washington, DC, 1985. Bílkoviny Epi B, C, D, P a 0 jsou cenné a zajímavé látky, jichž je možno využít k přípravě nových bílkovin a dalších látek se strukturními vlastnostmi podobnými lan tibiotikům, jako jsou dehydroalanin, dehydrobutynin meso-lanthionin, 3-methyllanthion a S-(2-aminovinyl)-D-cystein

Získané látky mohou být užity jako izolované bílkoviny nebo jako chemická katalytická reakční činidla při výzkumu extracelulárního zpracování bílkovin působením enzymů.

.25Vynález se rovněž týká bílkovin Epi 3, C, D, P a Q ve v podstatě čisté formě. Pod pojmem v podstatě čistý se rozumí bílkovina, která je prostá nečistot, obvykle s ní spojených. Podstatnou čistotu je možno prokázat přítomností jediného pruhů oři eLektroforéze.

PoLypeptidy podle vynálezu je mošno izolovat a čis' a cit ze svrchu popsných rekcmbinantních molekul obvyklými postupy, například extrakcí, srážením, chromatografií, afinitní chromatografiί, elektroforézou a podobně.Peptidy jsou s výhodou produkovány jako Část složené bílkoviny, která mimoto obsahuje pomocnou bílkovinu. Tato pomocná bílkovina má usnadnit izolací a čištění požadovaného polypeptidu. Pomocná bílkovina například obsahuje typická sekreČní signály, bílkovinu pro vazbu maltózy z E. coli nebo bílkovinu A. Způsob výroby složené bílkoviny zahrnuje získání bílkoviny A, její čištění imunoafinitní chormatografií a její štěpení k uvolnění požadované bílkoviny, tak jak bylo popsáno například ve zveřejněné PTT patentové přihlášce č. WO 34/03103, 1984.

kutnou podmínkou pro štěpení složené bílkoviny je přítomnost jediného místa štěpení, které m^ůže být rozpoznáno a rozštěpeno vhodným prostředkem. Tímto místem štěpení může být určitý řetězec aminokyseLin, rozpoznávaný chemickou Látkou nebo enzymem a uložený mezi požadovanou bílkovinou a pomocnou biikobinou. Tento specifický řetězec m^Tnokyseiin se však nesmí nacházet v požadované bílkovině nebo v pomocné bíLkovině. Příkladem vhodných enzymů pro toto štěpení mohou být proteázy, například kolagenázy, schopné rozpoznávat řetězec aminokyselin NH_?-?ro-X-Gly-Pro-C00H, kde X znamená zbytek aminokyseliny, například Leucinu, dále chymosin (renin), štěpící vazbu Met-Phe, kallikrein 5, štěpící karboxylovou část Arg v řetězci X-Phe-Arg-Y, enterokináza, štěpící řetězec X-(Asp) -Lys-Y, kde n = 2 až 4, přičemž ke štěpení dochází na karboxylové straně Lys, tnrombin, štěpící specifickou argi-

nylovou vazbu. Příkladem chemických látek, které je možno pc užít ke štěpení složených bílkovin mohou být bromkyan, který řetězec štěpí za zbytkem Met, hydroxylamin, štěpící vazbu Asn-Z, kde 3- znamená Gly, Leu nebo Ala a kyselina mravenčí, která ve vysoké koncentraci přibližně 70 % specificky štěpí vazbu Asp-Pro.

Podle svrchu uvedeného návodu může každý odborník využít maximálně podstatu vynálezu. Dále uvedená specifick provedení jsou proto uváděna pouze k ilustrativním účelům a nemají sloužit k omezení rozsahu vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Přiklad i

1. Nadprodukce galiiderminu

Fragment DNA, obsahující otevřený čtecí rámec gal darminu může být klonován ve StaphyLococcus epidermidis DSM 3095, tj. v kmeni, produkujícím epidermin při použití plasmi' se středním počtem kopii, například pC194, pE194, pUB110, pTLSL nebo pMKlcs gallidermin. Při vzestupu množství genu obvykle dochází ke zvýšení produkce požadované Látky, korelace však nemusí být lineární. Jaká prostředek pro klonování je možno užít také deriváty plasmldů pCL94 nebo pTLBL s vysokým poč tem kooií .

2. Výměna vedoucího řetězce

Vedoucí řetězec epiderminu, odpovídající aminokyselinám -1 až -30 se účastní sekrece epiderminu. Tento řetězec může být použit i pro sekreci jiných peptidů v S. epidermidis, například pro sekreci galiiderminu.

'^2

Vedoucí řetězec DMA je možno učinit přenosným tak, že se uloží odpovídající vazné řetězce na začátek a konec tohoto řetězce. Tímto způsobem je možno izolovat vedoucí řetězec DMA z ptasmidu ve veLkém množství a uložit jej do odpovídající polohy v jiných peptidech a bílkovinách. Vedoucí řetězec DMA je také možno vyrobit chemickou cestou.

Příklad 2

Produkce gal1idermirtu při použití 3. epidermis jako hostit:

i. Příprava plasmidu (Cbr. 6) aj Plasmid pC'JI byl připraven navázáním plasmidu pCDRlOC po rozštěpení Pst! a plasmidu pUC18 po rozštěpení pUC18, rozštěpeného Mdel při použití Klenowova fragmentu způsobem, popsnaým v Moiecular genetische Untersuchungen zur plasmidkcdierten Arsenit und Arsenatresistent bei Staphyloccocen, Dr. Ralf Rose.nstein (možno získat od Technische Universita“, Mnichov, SRN). Výsledný plasmid byl pak rozštěpen enzymem FcoRI.

b) Chromosomální DNA byla izolována ze S. gallinarum (DMS 461S) a byla rozštěpena enzymem EcoRI. Byl izolován fragment o 4,7 kb s obsahem strukturního genu pro gallidermin v řetězci o délce 2,4 kb mezi místy štěpení restrikčními enzymy HindlII a FooRI, jako příměr byl užit řetězec

5'CAC ATC CAG GAG TAC 3'

c) Fragment o 4,7 kb byl pak navázán do místa působení enzymu FooRI v rozštěpeném plasmidu pCUI ze stupně a) za vzniku plasmidu, který byl označen pCUgdml.

2. Příprava hostitele S. epidermis

V tomto příkladu byla izolován mutovaný kmen S. epidermis DSM 3095, který není schopen produkovat enidermin.

Mutagenze byla prováděna na kmenu, který byl charakterizován chromosomálně zakódovanou resistenci proti Rifampicinu v koncentraci 20 mikrogramů/ml.

S. epidermis, pěstovaný na agarových plotnách byl užit (kmen DSM 3095) k naočkování 30 ml základního kapalného prostředí, které bylo kultivováno přes noc. 0,5 ml prostředí, v němž byl mikroorganismus přes noc kultivován pak bylo ušito k naočkování 50 ml produkčního živného prostředí, které bylo , . , - o kultivováno na třepacim zařízeni tri hodiny pn 37 0.

Pak byly buňky od kultivačního prostředí odděleny a uvedeny do suspenze ve 4,5 ml předem zahřátého prostředí, kterým byl pufr TM (30 mM tris-maieátu o pH 6,5, výsledný roztok byl označen jako roztok A).

Roztok A byl zkontrolován, zsa v něm nedochází ke spontánním mutacím a buňky byly upraveny na množství buněk

1,25 χ 10~θ buněk/ml.

ml roztoku A byly důkladně protřepávány s 1 ml ethylmethyisulfonátu (konečná koncentrace 47 mikrogramů/ml) a pak udržovány za protřepávání hodinu při 37 °C.

Pak byly buňky od živného prostředí odděleny, dvakrát promyty pufrem TM a znovu uvedeny do suspenze v 5 ml pufru TM (výsledný roztok byl označen jako roztok B a obsahoval mutované buňky).

ί

- X - ί i

g

Bylo prokázáno, že roztek 3 obsahuje 2 x 10 buněk/ml, což odpovídá přežití 1,6 %.

tu ml roztoku 3 bylo přidáno do 5 ml produkčního prostředí a kultura byla pěstována přes noc při teplotě 37 (fenctypická exprese). Výsledný roztok byl označen jako rozO tok C. Obsahoval 7,3 x 10 buněk/ml.

Roztok byl nanesen na plotny agaru BM a byly odebírány jednotlivé kolonie. Tyto kolonie byly použity k naočkování zkušebních ploten, obsahujících agar BM, na jehož povrch byly uloženy buňky Micrococcus luteus. Ty kolonie, které neměly žádný inhibiční účinek na Micrococcus luteus byly vybrány jako kolonie buněk, neprodukujících epidermin.

Agar BM obsahuje v 1 litru následující složky;

g peptonu č. 140 5 g extraktu z kvasnic 1 mg glukózy mg chloridu sodného 1 mg hydrogenfosforečnanu draselného pří prostředí je 7,5.

Bylo možno prokázat výskyt mutací v množství přibližně 3 %. Ze 45 kolonií, neprodukujících epidermin, které byly nalezeny byly všechny kolonie subklonovány 2okrát, čímž bylo získáno 15 typu buněk, u nichž stabilně nedocházelo k produkci epičerminu.

Všechny buňky, stabilně neprodukující epidermin obsahovaly plasmid divokého typu pEpi32. Podle mapy restrikčnich míst je možno tento plasmid považovat za totožný s plasmidem z divokého kmene.

Transformace reprodukčního S. epidermis

750 ml prostředí BM se naočkuje přidáním 5 ml prostředí, získaného kultivací stálého neprodukujícího kmene přes noc a naočkované prostředí bylo oak uloženo ve 2-litrové baňce na třepací zařízení s počtem otáček 120 za minutu při tep1 O p

Počáteční optická hustota naočkovaného prostředí 3M byla 0,03 - 0,04. jakmile dosáhla optická hustota hodnoty Q,as až 0,55, byly buňky odstraněny odstředěním při použití rotoru GS-3 15 minut při 8500 otáčkách za minutu při teplotě 4- °C. Pak byly izolované buňky postupně promyty 750, 350, 40 a 10 ml 10% giycsrclu, načež byly uvedeny do suspenze ve 2 až 3 mi 10% glyceroiu a zmrazený po podílech 110 ml v ERG při o ¹ teplotě -70 0. Počet buněk byl L az 5 x 10“ .ml.

Zmrazené buňky byly rozmrszovány 5 minut při teplotě místnosti, pak cylo Inkubováno 50 ^ui suspenze buněk v ERG s 2 _zul plasmidu pCUgdml v pufru ΤΞ 30 minut při teplotě místnosti .

Pak byla směs přenesena do kyvety pro otevření póru pomocí elektrického proudu se štěrbinou mezi elektrodami 0,2 cm a okamžitě se provede otevření pórů. Pak se buňky rachle uvedou opět do suspenze v 950 ^ul prostředí SMMP50, přenesou do ERG o 2,5 ml s protřepávají 90 minut při teplotě o - Oo

C. ERG se ulozr pod uhlem 451 , aby bvio možno zajistit dd dobré provzdušnění prostředí.

Prostředí SMMP50 obsahuje ve 100 ml celkem 55 ml 2SMM, 40 ml 4 PAS a 5 m^% BSA. 2SMM obsahuje 1 mol sacharosy, χ-—

0,04 mel kyseliny maleinové, 0,04 mol chloridu horečnatého a NaOH do pH 5,5. 4 PAS je roztok 7 g/100 ml Gibco antibiotického prostředí 3.

Suspenze buněk se zředí a nanese na agar BM, obsa bující gallidermin a živné prostředí se inkubuje 20 hodin př replotě 37 °C.

Testování rostoucích kmenů produkujících gallider min bylo prováděno selekcí kolonií ze zkušební plotny M. Luteus a kultivací vybraných kolonií při stanovení přítomnosti galiiderminu pomocí HPLC.

Tímto způsobem byly získány tři mutanty, transfor mované plasmidem pCUgdml, schopné produkovat gallidermin.

Stanovení přítomnosti galLiderminu, predukovaného kmenem

3. epidermin, transformovaným plasmidem pCUgdml

a) 3iologická zkouška

Agar FP byl naočkován M. luteus ATCC 93-41 a ínkubován 13 hodin při teplotě 37 °C . Polovina produkované kultury byla odstraněna kličkou a uvedena do suspenze ve 100 ml prostředí F? a pěstována 8 hodin při teplotě 36 °C. Kultivace byla zastavena pří dosažení optické hustoty 1,0. Agar F? byl naočkován 0,5 % teto suspenze, vždy 10 ml bylo vlito do Petriho misky a skladováno 3 týdny při 4 °C.

Test na difusi na plotnách byl prováděn způsobem podle publikace Záhner a Maas, Biology of Antibiotics, Springer Verlag, Berlin 1972. 10 ^ul filtrátu kultury z kultivace transformovaného S. epidermin bylo naneseno na filtrační papír a usušeno. Pak byl papír uložen na zkušební plotnu a plotna pak byla inkubována 24 hodin při teplotě 37 °C.

b) HPLC

Transformovaný kmen byl po selekci pěstován 26 hodin v produkčním prostředí. Pak bylo produkční prostředí odstředěno celkem 10 minut při 13 000 otáčkách za minutu.

Izolované živné prostředí pak hylo podrobeno HPL· v zařízení pro kapalinovou chromatograi'i i (Sr 8.700, Spectr Phvsics, DArmstadt, SRN), jako mobilní fáze A byla užita v z5 0,5 % 70% kyseliny chloristé a jako fáze 3 acetonitril. 3ylo užito náplně sloupce Nuclecsi1-100C-18 se střední velí· kostí částic 7 mikrometrů oři rozměrech sloupce 125 mm x 4_t< mm vnitřního průměru a 20 mm x 4,6 mm vnitřního průměru pro předřazený sloupec.

3vlo užito následujících gradientů:

doba (mm.)

A (%' (%’

7?

22,5

7 o,

100

7 c.

lu

77,5

Výsledný chromatogram je znázorněn na obr. 7A. Standardní křivka je znázorněna na obr. 73. Je zřejmé, že se gallidermin vymývá po době 7,54 minut.

Dále bude uvedeno složení jednotlivých živných pro středí, užitých při pěstování.

L. Agar F?
Extrakt z masa	4	σ o
·— V*. t“ r*, FH l 5J L· v 1 1	10	σ
Chlorid sodný.	o	σ o
Hydroger.fosforečnan sodný		σ o
C-1 u k o z a	13
Enmplexní azar	15	litr
Voda	1	litr
pH	! ,	9
O x' ů ρ C ’ “ ED , r ’ O ůo v - tť -
Extrakt z masa	4	£r
Pep ton	10	<7 o -
Chlorid sodný	-n	g
Hydrogenfosfcrečnan sodný	ς	σ o
Glukóza	LQ	37 •to
Voda	i	lit
oH	7	o 1

3. Produkční orostředí

Extrakt	z masa	ůq o* o
Extrakt	ze sladu	30 g
Chlorid	sodný	40 g
Hydroxi	d vápenatý	3,3 g
Voda		1 lit
pH		6,5

Příklad 3

Izolace plasmidu

Plasmidová DNA ze S. epidermis Tli 3298 byla izolo vána modifikovaným způsobem podle publikace Norick a další,

Ann. NY Acač. Sci. 182:279-294, 1971. S. epidermis byl pěstován na prostředí BM ;(1 % peptcru 140, Cibco, Neu-Isenburg,SRN, —0-75-%-^-ex-trak-tu—z-kvásn-ic-,—Dí-f-covDetroi-t·,—USA-, 0-,l % glukózy, 0,5 % NaCl a 0,1 % K^HPO^xS H^O) až do stacionární fáze. Pak byly buňky'odstředěny a dvakrát'promyty 0,5 M EDTA. Usazenina byla znovu uvedena do suspenze v 80 ml NaCl-pufru (50 mM tris/ HCI o pH 7, 50 mM EDTA, 2,5 M NaCl)s 1,5 ml roztoku Lysostaphinu (0,5 mg/ml, Sigma, Heidlberg, SRN) a suspenze byla 20 minut inkubována při teplotě 37 °C. Pak byly buňky rozrušeny přidáním 80 ml pufru pro rozrušení buněk (50 mM tris/HCl o pH 8, 300 mM EDTA, 500 mM Brij., 40 mM deoxycholátu sodného, směs byla udržována v ledu 1 hodinu. Pak byl-lysát odstředěn 30 minut-při 13 000 otáčkách za minutu a teplotě 4 C a supernatant byl smísen s 1/4 svého objemu 50% roztoku PEC—8000.

DNA plasmidu pak byla vysrážená přes noc při teplotě 4 °C. Suspenze DNA pak byla odstředěna 20 minut při 13 000 otáčkách za minutu a teplotě 4 °C, materiál byl znovu uveden do suspenze v 8 ml pufru TE a 50 ^ul roztoku proteinázy K (20 mg/ml).

Po inkubaci směsi 15 minut při teplotě 37 °C byla DNA vysrážená ethanclem a pak dále čištěna odstředěním s CsCl (1 g CsCl/ ml, 40 hodin, 40.000 otáček/min., 20 °C).

Izolace RNA a elektroforéza

S. epidermin byl pěstován na minimálním prostředí SMS.(Terzaghi a další, Appl. Microbiol. 29:807-313, 1975) a byla izolována RNA při použití modifikovaného postupu, podobného tomu, který byl popsán pro RNA Bacillus subtilis (U.lmanen a další, J. Bacteriol 162: 176-182, 1985). Buňky byly rozrušeny lysostaphinem (0,1 mg/ml) v pufru pro rozrušení buněk a inkubace byla prováděna při teplotě 37 °C. Celková RNA pak byla glyoxylována (McMaster a další, Proč.Nati. Acad. Sci,

USA 74: 4835-4839, 1977) a oddělena na 1,2% agarozovém gelu při použití 10 mM fosforečnanu sodného o pH 7 jako pufru pro elektroforézu. RNA byla barvena ethidiumbromidem a blotována na nitrocelulózovou membránu (Schneider a Schuell, Dassel, SRN), kapilárním přenosem při použití 20 x SSC-pufru (0,15 M NaCl, 0,015 M citronanu sodného o pH 9). Jako standardy pro velikost molekuly byly užity 23 SrRNA a lSSrRNA.

Transkripce in vitro

Sondy RNA s jednoduchým řetězcem byly získány klonováním odpovídajících fragmentu ve vektorovém systému pSPTlS/19 (Boehringer Mannheim, Mannheim, SRN). Plasmidy byly linearizovány EcoRO'nebo HindlII, čímž byla získána lineární matrice DNA. Při transkripci bylo užito modifikovaného způsobu podle publikace Meltcn a další, Nuci. Acid Res. 12: 7C357055, 1984, postup byl prováděn pode! instrukcí výrobce. Byla užita T7-RNA-polymeráza nebo SP6-RNA-?olymeráza v přítomnosti ^2 * alfa¹ P-CTP (800 ci/mmol). Neinkorporované ribonukleotidy byly odděleny od značené RNA chromatografií na Sephadexu G-50.

Northernová hybridizace

Přenes RNA byl uskutečněn po elektroforéze podle publikace Tjomas P.C., Proč. Nati.Acad. Sci. USA 77:52015205,, 198Q..Po 2 hodinách inkubace při teplotě 80 °C byl filtr krátkou dobu inkubován ve 20 Tris/HCl o pH 8 při teplotě 100 °C ke. zvratu glyoxylace. Pak byly filtry podrobeny předběžné hybridizaci při teplotě 42 °C v 50% formamidu, 5 x SSC (0,15 M NaCl, 0,015 M citronanu sodného, pH 9), 50 mM NAP0₄ o pH

6,5, 0,1 % Ficoll 400 (pharmazia, Freiburg, SRN), 0,1 % polyvinylpyrrolidonu, 0,1 % sérového aLbuminu skotu a 0,25 mg/ml DNA z denaturovaného spermatu lososa, inkubace trvala 2 hodiny. Po přidání sondy byla hybridizace prováděna v tomtéž pufru 12 hodin při teplotě 42 °C. Pak byly filtry promyty lxSSC, 0,1% SDS 15 minut při teplotě 42 °C a exponovány při použití filmu Kodak-X Omat 4 hodiny při teplotě -70 °C. Pak byly filtry dvakrát promyty 0,5 x SSC, 0,1% SDS 15 minut při teplotě 70 °C a autoradiogramy byly exponovány 16 hodin při teplotě -70 °C. Následujícího dne promývání pokračovalo při použití

Μ

0,1 χ SSC, 0,1% SDS při teplotě 70 °C celkem 30 až 50 minu” a pak byly filtry znovu užity pro exposici filmu Kodak-X

Omat 3 dny při teplotě -70 °C.

Southernova hvbridizace

Pro tento typ hyonídizace (Southern Ξ.Μ., J. Mol. Biol. 93: 503-317, 1575) byly jako sondy užity 5 -jpancené oli gonukleotidy při teplotě 23 °C. 01igonukleotidy byly značeny

O pomocí gamrna^-p-AT? a 4T-polynukieotidkinázy (Boehringer Ma.nn heim, Mannheim, SRN). Oligonukleotiby a příměry byly syntheti zovány na synthetizátoru DMA 391 (Applied 3iosyste~3, Weiterstadt, SRN) a užity bez dalšího čistění.

Stanoveni řetězce DMA

Řetězec DNA byl analyzován radioaktivním a neradio aktivním způsobem terminačni metodou (Sanger a další, Proč. Mátl. Acad. Sci. USA 74; 5453-5467, 1977) při použití T7-DMApolymerázy (Pharmazia, Freiburg, SRN). Stanovení řetězce plas midu radioaktivním způsobem bylo provedeno podle publikace Hattori a další, Anal. Biochem. 152: 232-238, 1954 při použití příslušných primeru. Analýza řetězce 8amHI(PstI o 3,5 kb byla provedena ne radioaktivně na automatickém analyzátoru (Applied 373A DMA seuenator, Applied Biosystems, Weiterstadt, SRN). Odpovídající fragment byl klonován ve fagemidu pBSK-/-f-. Konstrukce byla rozštěpena působením BamHI a Sací a línearizováná DMA byla jednosměrně štěpena od zakončení 5 působením exonukleázy III (Boehringer Mannheim, Mannheim, SRN za vzniku serie delecí, pak byl materiál zpracován nukleátou z bobů (Boehringer Mannheim, Mannheim, SRN) k získání zarovnaných zakončení. Po elektroforéze na 1% agarozovém gelu, opětném navázání a transformaci kmene E, coli XL-1 Blue byla DNA s jednoduchým řetězcem izolována při použití pomocného fágu OSM 13 a byla provedena analýza řetězce při použití Taq-Polymerázy /Promega, Freiburg, SRN), postup byl prováděn podle pokynů výrobce.

?*. ω cď i y z ct β n ki >c

An s 1 y z -S r z τ ~ ním gertem pro epidermin, otevřených otecích rámců mentu plasmidu pTu32 o 13,5 kbp e oclasci uNA, sous;

ok turi A, prokázala oět dalších úplných i B, C, D, ? a 0 uvnitř BglII-fragJak je zřejmé z ocr. 9, bezprostředně v blízkosti řetězce, který je kódem pro Epi A, oddělený pouze 50 nukleotidy od kočenu epiA ochre se nachází velký otevřený čtecí rámec, :rec nim;

je uležen řetězec S/D c 2 970 bp. Kodon TTC- pro Leuý je také funkčním kodoneti-pro počátek translace u stafylokoků je v příslušné vzdálenosti (36 p) c^, řetězce S/3. Tento otevřený čtecí rámec je označen epiS a jak bude dále popsáno, může být úspěšně použit pro doplnění mutant pro biosyntézu epiderminu, hraje nestatnou úlohu při ciosyntéze této sloučeniny.

Bílkovina, pro niž je kódem epi3, počínaje od kocenu TTG (Leu) má molekulovou hmotnost přibližně 115 000 a náboj -3 při pK 7, je mírně hydrofobní (al % hydrofobních zbytků) a její struktura může být předpověděna z křivky pro hydrofilnost podle publikace Kyte a další, J, Mol. Biol. 157: 105132, 1932.

Na 3 -zakončení epi3 není možno pozorovat žádnou strukturu, charakteristickou pro terminaci transkripce. Je však možno prokázat překrývající se část (122 bp) s dalším čtecím rámcem epíC, posunutým o -L bp je možno tento rámec pozorovat také na obr. 9.

Tento útvar není možno považovat za artefakt, jak bylo prokázáno nezávislým klonováním a analýzou řetězce odpo- yl vídajícího fragmentu HindlII o 47 visle izolovaných plasmidu- Totéž tací mutanty fragmentem s obsahem kbp dvakrát ze bylo potvrzeno epiC, jak bude dvou nezái komplemendále popsáno

Uvnitř překrývající se oblasti čtecích rámců epi3 a epiC slouží první kodon TTG (leu), který je uložer^ze vzdálenosti pouze 36 bp směrem 3 od prvku AGGA, jako kodon pro počátek translace, což prokazuje, žc ze oba čtecí rámce překrývají v šířce přibližně cq kodonů. Aminoterminální zakončení bílkoviny EpiC bylo stanoveno analýzou N-termmalmho retezce. Čtecí rámec epiC je kódem pro bílkovinu se 445 zoytky ami nokyselin, počínaje od kodonu TTG (Leu) pro počátek translace čtecí rámec epiD přímo následuje 2'od epiC, začátkem je kodon ATG 86 bp 3 směrem k řetězci AGC-AC-G S/D. 3 k epiD je uložena klasická rho-závislá struktura terminátoru translace; epiD je kódem pro bílkovinu, obsahující 181 zbytků aminokyselin, počátečním kodonem je ATG (Met).

Ani jedna z bílkovin EpiC. D, P a Q nemá žádnou podobnost 3 řetězci bílkovin, uvedeným i v databazi bílkovin Swiss Prot a Gene 3ank a jde tedy o dosud neznámé typy enzymů a řídicích bílkovin.

Transkripce biosynthetických genů

Sondy PNA s jednoduchým řetězcem byly získány klonováním požadovaného fragmentu ve vektorovém systému ρΞΡΤ 18/19 (Boehringer Mannheim, Mannheim, SRN), jak již bylo svrchu popsáno.

Byly získány dva transkripty, které se od sebe velikostí podstatně lišily, jak je zřejmé z obr. 10. Hybridizační sonda, specifická pro epiA identifikovala malý transkript o přibližně 300 bp. Pro lantíbiotikum nisin (Buchmann a další, J. Biol.Chem. 263: 16260-16266, 1988) a subti 1in(Baněrjee a

další, J. 3iol. Chem. 263:9508-9514, 1988) byly nalezeny trans kripty podobné velikosti. Mimoto je možno identifikovat pomocí specifické hybridizační sondy pro epi3 ještě velký trar.sxnpt o přiupižně 5 kb. Vzhledem k“nmu. že před epiB nebyly uloženy žádné -promotorové řetězce, obdobné řetězcům z Ξ. coli a příslušné řetězce byly uloženy 5 vzhledem k epiA je možno uzavřít, že promotor epiA působí jako promotor pro polycistroAZ 7 p ' ' ¹ ’ m í? ř,f ů

L L ± L· h V UA i u* U · Λ .

Otevřené čtecí rámce po směru exprese genu

Otevřené čtecí rámce epiP a epiQ jsou uleženy v DNA na opačné straně než epi3, epiC a epiD, přičemž epiQ má společnou terminač.ní strukturu s epiD, úplnou vlásenku se smyt kou o 3 bp.

Přesné v oblasti této smyčky mají stop kodony TAA pro oba čtecí rámce epiD a epiQ společné dva ze tří nukleotidů .

Čtecí rámec epiP začíná kodonem ATG, který je uložen v příslušné vzdáleností 6 bp od řetězce S/D. V případě, žese považuje kodon ATG za kodon pro počátek translace bílkoviny epi?, obsahující 4G1 zbytků aminokyselin s molekulovou hmotností 51 3G0, vykazuje epiP charakteristické homoLogie a konservovanými motivy aminokyselin v serinproteázách (Cbr. 11), což ukazuje, že epiP se patrně účastní odštěpení úplné formy lantibiotika od modifikovaného prepeptidu.

Čtecí rámec epiQ rovněž začíná kodonem ATG a je kódem pro 205 zbytků aminokyselin (Obr. 9). Řetězec S/D je přítomen ve vzdálenosti 5 bp od kodonu ATG, moLekulovou hmotnost 243 000 je možno odvodit od řetězce DNA. Bílkovina epiQ má charakteristickou homologíi s PhoS (Obr. 12), což je positivní řídicí faktor pro fosfáty v E. coLi, takže epiQ je patrně řídicím faktorem syntézy Lantibiotik.

Před epiP se nachází oblast -10, ( 5 12 bp před řetězcem S/D, podobná obdobné oblasti která může sloužit jako promotor u stafylokoků, med epi? stoo kodonem a kodonem ATG pro počátek v epiQ je pouze 10 nukleotidů a řetězec S/D epiO 5 terminačním kodonem epi.-, jak je zřejmé z obr.

TATAAA) o v E. coli, Vzdálenost translace se překrývá g , vzhledem k epiA, 3, C, D je další čtecí rámec s opačnou orientací, který je potenciálně kódem pro maximálně 148 aminokyselin. Charakteristický řetězec S/D je přítomen, avšak schází kodon pro počátek, dříve popsaný pro stafylokoky (ATG, TTG, GTG). S posunem -1 následuje další čtwcí rámec, který přesahuje izolovaný 3gll1-fragment, znázorněný na obr.9.

Cba uvedené čcecí rámce jsou homoLogní k jedinému otevřenému čtecímu rámci, gdmY, který byl identifikován v blízkosti strukturálního zenu pro gallidermín (Sohnell N., 3iosyntnese der Peptid-Ar.zibioitika Epidermin und Gallidermín, Doctorai Thesis, University of Tubingen, SRN, 1989. Homologní čtecí rámce v plasmidu 3. epidermis byly označeny epiY a epiY

3. carnosus byl transformován při použití plasmidu pTepilk, který byl připraven svrchu uvedeným způsobem při použití standardních postupů. Pak byl transformovaný kmen pěstován na prostředí 3M, které bylo popsáno svrchu.

Bylo zjištěno, že výsledné transformanty byly schop né způsobit inhibici zkušebního kmene Micrococcus luteus ATCC 9341, citlivého na epidermin. Při tomto pokusu byla přidána kultura M. luteus, pěstovaná přes n oc, a to 1 ml kultury, upravené na ODtickou hustotu 0D_c„_o 1,0 ke 500 ml roztaveného agaru BM. Petriho misky obvykle obsahovaly 10 ml tohoto agaru. Na povrch agaru pak byly v různém ředění naneseny kultury S.

hO

X epídermis, Kolonie, positivní na epidermin byly detekovány tak, žs kolem těchto kolonií nedošlo k inhibici růstu M.luceus

Buňky byly pěstovány na prostředí, které obsahovalo 3 % extraktu z masa, 3,3 % sladového extraktu, 0,6 % Ca£y x 2 HO a 4,6 % NaCl o pn 6,5. V závislosti na použitém způsobu transformace byl přidán tetracyklin nebo chloramfenikoi. Po inkubaci 24 hodin při teplotě 37 Ca 160 tc./min. v Brier. meyerových baňkách s objemem 500 ml bylo živné prostředí odstředěno při 10 ooo otáčkách za minutu celkem 10 minut (odstři dívka Servali).

Supernatant'/ a kapalné kultury transformantů byly čištěny chromatografi bvlo užito adsorpční chromatografie na XAD11SC, nečistoty byly vymyty směsí vody a xethynolu 1:1 a eluce epiderminu byla prováděna směsí methanolu a 0,1 N HC1 9:1. Po odpaření bylo pH' eluátu upraveno přidáním 2M NaOH na 3,5 a objem byl doplněn vodou na 10 ml, načeš byla provedena detekce pomocí HPLC. Materiál s inhibičním účinkem postupoval společné s úplným epidermi.nem při 6,75 až 6,76 min., jak je zřejmé z obr. 13A a 133. Podobným způsobem zpracované živné prostředí netransformovaného kmene S. carnosus nemělo v této eluční oblasti 6,72 az 6,79 min. žádný vrchol (Obr, L3C). Tyto výsledky jasně potvrzují heterologní biosyntézu epiderminu u S. carnosus a prokazují, že pTepila obsahuje veškerou informaci, nutnou pro biosyntézu epiderminu.

Vzhledem k tomu, že pTepi!4 pbsahuje fragment BglII o 13,5 kbp, je zřejmé, že čtecí rámce epiY^?a epiY” nejsou nezbytné pro produkci epiderminu v tomto systému, protože epiY' neobsahuje kodon pro počátek translace a epiY je v tomto frag mentu neúplný.

Μ

Příklad 5

Byla připravena celá řada mutant Ξ. epidermin Tu 3298 mutagenezou pomoci ethylmeLhansulfcnátu (EMS). Tento postup byl proveden podle publikace Miller J.H., Experimente in

Molecular Gene nic3 Barbor, N.Y., 1972 minu, nepřítomnost luteus jako svrchu

Cold Soring Harbor Laboratoř;/, Cold Sprir.g Mutanty byly sledováni na produkci epiderléco prosukce byla prokazována pomocí M.

Mutanty Epi byly několikrát přeneseny do nového prostředí k ověření stálosti.

Ze 40 izolovsných mutant bylo pouze 10 stálých. Nestálé mutanty produkovaly epidermin znovu po dalším několikanásobném přenesení. Všechny stálé mutanty obsahovaly plasmid pTU32 bez delecí nebo změn v uspořádání, jak bylo prokázáno enzymů. Uvedených 10 mutant bylo analýzou pomocí restrikční poučíte pro komp lemencač.ní studie,

ΛRůzné pštrikční fragmenty plasmidu pTu22 byly klonovány v S. carnosus za účelem testování heterolozní produkce epiderminu. Fragmenty byly uloženy do vektorů TISimcs a pC’Jl*. taky jak byly svrchu popsány a subklonování různých úseků bylo prováděno tak, jak je znázorněno na obr. 153.

Klonování bylo prováděno nejprve v 3. carnosus transformací protoplastů podle Gotz a další, FE:4S MíorobioL. Lete. 40:285-288, 1987 nebo v E. coli při použití CaCl_? podle Cohen a další, Proč, Nati. Acad. Sci. USA 69:2110-2114, 1972 a pak byly izolovány rekombinantní plasmidy a přeneseny do různých epi mutant S, epidermis eLektroporací podle Augustin a další, FEMS Microbíol.Lett. 66:203-208, 1990. Použité enzymy byly získány od Soehringer Mannheim, BRL (Eggenstein, SRN) nebo Pharmacia(Švédsko). Tato nepřímá transformace byla nutná vzhledem k tomu, že transformace S. epidermin byla úspěšná pouze u cirkulárně kovalentně uzavřených plasmidu (ccc), při použití navázaných látek bylo možno izolovat transformanty jen náhodně. Výsledky jsou shrnuty v tabulce 1.

'1 ο

x rt rt e-

Μ >aů

Byla zkonstruována řada plasmidu, nesoucích různé geny ze skupiny epi (A, 3, C, D, P a 0) , jak je znázorněno na obr. 163. Dva plasmidy, pTepild a pTepiABCDQ byly schopny doplnit všechny mutynty epi. Ostatní zkonstruované plasmidy, oCUeoiABC, oTeoiAB, oCUeoiCĎQ, oCUeoiB, pCdccíA, pCUeci^., pCUepiA₀, pCUepiDO a pCUepiO obsar.cvaly geny, uvedené v názvu plasmidu.

Různé plasmidy byly schopny komplementace pouze některých skupin mutant, jak je dále uvedeno:

ΞΜ5 5 a 6 - mutanty'epiA,

ΞΜ3 18, 33 a ug _ mutanty epiB,

EMS 12, 12, 19 a 39 - mutanty epiO,

ΕΜΞ 11 - mutanta epíD.

Výsledky, které jsou dále uvedeny prokazují, že pro syntézu epiderminu je zapotřebí alespoň čtyř ORF epiA, epiB, epiC a epiD.

Plasmid pCUepiA^ nese strukturní gen epiA jako jedinců úplnou strukturu ORF a mimoto dalších 1400 'op proti směru exprese genu a 602 bp ve směru exprese genu, druhý z uvedených úseků je kódem pro 190 aminokyselin na M-terminálním konci epiB, Transformací při použití plasmidu pCUepiA došlo ke komplementaci mutant epiderminu EMS 5 a 6, které tak byly identifikovány jako mutanty epiA. Při klonování menšího z obou fragmentů Seal s obsahem epiA v obou orientacích v plasmidu pCuepiA nedošlo ke komplementaci mutant epi vzhledem k tomu, že promotor epiA byl tímto enzymem odštěpen.

Plasmid pCUepiB obsahuje fragment BstNl, obsahující úplný epiB a proti směru exprese oblast o 100 bp včetně 75 bp 3- terminálního zakončení epiA, promotor epiA schází. Při pokusu o transformaci při použití pCUepiB nedošlo ke komplementaci žádné z mutant S. epidermis tak, aby došlo k produkci epiderminu, což prokazuje, že epiB neobsahuje vlastní promotor a k jeho transkripci pravděpodobně dochází současně s epiA pod působením jeho promotoru.

Ťento předpoklad je v souladu s výsledky, jichž bylo dosaženo při použití pTepiAB, jak je zřejmé z obr. 158 a z Tabulky 1. Uvedený plasmid obsahuje promotor epiA a úplné geny eoiA a B a oři jeho použití dochází ke komplementaci mutant epiA i epiS.

Plasmid pCUepiZDQ je schopen komplementace mutant epiC i epiD, plasmid pCUepiDQ je sohooen pouze komplementace mutanty epiD (Tabulkal). KempLementace byla nezávislá na oríen žací klonovaného fragmentu DNA. Tyto výsledky ukazují, ze oba geny epiC a epiD mají své vlastní ppomotory.

Deriváty pTu32, mutované epiA byly izolovány z ΞΓ4Ξ 5 a δ a byl stanoven řetězec odpovídajícího OPE epiA.

Oba plasmidy obsahovaly bodové mutace v oblasti epiA. V £?4S 5 byl koden AGT (Ser) změněn na AAT (Asn¹) a v plasmidu EHS 6 ? Q 1 Q byl kodon GGA (Gly ) změněn na GAA (Gin’ ). Obě tyto mutace byly uloženy v kruciáLní oblasti nemodifikovaného epiderminu.

Příklad 7

Gen epiB (ve fragmentu BstNi) byl uložen pod řízením promotoru do plasmidu pPS4 (obr. 17). Výsledný plasmid pPS4epiB byl schopen komplementáře mutant epiB plasmidu ΕΜΞ 13, 33 a 45. Plasmid, obsahující epiB v opačné orientaci nebyl schopen komplementace mutací. Z toho lze usoudit, že také plasmíd pCUepiB nebude schopen komplementace mutant EMS vzhledem k tomu, ze chybí promotor epiA.

— — x'

Příklad 8

Jak jíž bylo svrchu uvedeno, přítorrosc pTepil·^ (ohr. ifiA -ná za následek biosyntézu epiderminu v 5. oarnosus, ihincc> /kdežto/ pří domnost plasmidu pTepiABCDQ tento jev nevyvolá.

Nejmenší velikost DNA, která vede k he fcerologr.í expresi epiderminu v S. carnosus byla stanovena kompiementací 5. carnosus (pTepiASCDQ) s distálně uloženými fragmenty DNA (obr. 18). Transformace S. carnosus (pTepiABCDQ) plasmidy pCA^U-SO, pCA4U-9L a pCA44-92 vedla k produkci epiderminu, přičemž pCA44-92 obsahjící úplné ORF epiQ a epiP je nejmenším fragmentem DNA, schopným komplementáře produkce epiderminu. Tyto výsledky ukazují, že geny pro biosyntézu epiderminu jsou uzavřeny do fragmentu DNA o 8 kb s obsahem 6 ORF: epiA, 3, C, D, Q a P a žádné další geny se produkce epiderminu neúčastní.

V těchto příkladech byla DNA plasmizu stafylokoků připravena štěpením lysátu (Makino a další, J. Mol. Biol. 190: 37-44, 1986). Buňky byly rozrušeny přidáním lyscstaphinu (8 .ug/ml) a DNA byla izolována odstředěním v přítomnosti CsCl. Nadšroubovioová DNA plasmidu Ξ. coli byla připravena modifikovanou metodou lyže v alkalickém prostředí (Sirr.boim a další, Nucl. Acid Res. 7: 1513-1518, 1979 ).

Řetězce DNA z PCR-amp1 ifikovaného fragmentu, obsahujícího epiA a dvou mutovaných oblastí epiA ze S. epidermis, EMS 5 a 6 byly stanovena analýzou řetězce DNA s dvojitým řetězcem při použití čeoxymetody (McMaster a další, Proč. Nati.

Acad. Sci. USA 74: 4835-4839, 1977), seznamu řetězců¹¹ (Phar35 macia) a (alfa- S)-dATP (Amersham). Příměry, použité pro analýzu řetězce DNA a pro PCR-amplifikaci byly synthettzovány při použití DNA-synthetizátoru (Applied Siosys.tems). Dále jsou uvedeny řetězce dvou primerů pro PCR-amplifikaci epiA:

a) 5 '-GGGTTTTAGG(TA)ATCCTTTTT.AAW.A7TTTTAGGAG-3' b ) 5 ' -CCTCAAAATTAAGACG ( A} GAT {G ) CCTCTATTGAAGCCC- 3 '

Primer .a'i se váže před RES epiA a pri stop kočonem.’ Tyto base, uvedené velkými písmeny v závorkách oyly užity k tvorbě míst působení enzymu SamHI před a za zakc cením epiA. Promotor epiA v ampiifikcvaném fragmentu DNA chyb

Pro stanovení řetězce DNA mutovaného epiA v mursntácn ΕΓ4Ξ 5 a 5 byl izolován plasmid pTli32 a oblast DNA byla amplifikována pomocí PCR při použití jiné skupiny primerů DNA vážících se po směru předpokládané oblasti promotoru epiA (. 5' -GGTTTGGTCATTTTCC-2 b a směrem od stop kočenu (5 -CCTCAAAATTAAGACAGACCCTC-3 b něž uveden v publikaci Schnell a 276-278 (1988 b řetězec DNA pro· epiA byl rov další, Nátuře (Lond-b 338:

.ad 9

Gen epiD byl izolován z plasmidu pleci, množen PCR amolifikací a klonován v místě působení Stul vektoru pIH9C2 (New England, SioLabs) vazbou zarovnaných konců s tím výsledkem, že gen peiD byl spojen bez vložených baží přímo s místem vektoru plH9O2 pro štěpení faktorem Xa s následnou transforma c ί E. coli.

Při kultivaci E. coli pak došlo k expresi enzymu EpiD vázaného na bílkovinu pro vazbu maltosy v Ξ. coli. Výsledná složená bílkovina byla čištěna afinitní chromatografií na sloupci s obsahem amylózy.

Bylo zjištěno, že enzym epiD může být ze složené bílkoviny odštěpen v nízkém výtěžku působením faktoru Xa. Zavedením modifikace řetězce aminokyselin v oblasti štěpení je možno zlepšit výtěžek.

Řetězec složené bílkoviny byl analyzován na úrovn

DNA od místa spojení obou bílkoviny směrem ke 3 -zakončení epiD. Řetězec epiD opdcvídal řetězci divokého typu ze S. spi

ÍC ^Λ ~

De svrchu uvedeného popisu vynálezu múze snadno každý odborník poznat podstatné vlastnosti vynálezu a provés ještě další modifikace a změny, aniž by se od smyslu vynález odchýlil, pouze přizpůsobením vynálezu pro různé použití a různé podmί nky.

/'ztas-tucu j eu.y /· Dr.-ZDEHKA XOSEJZaVft-/

Claims (6)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Složená bílkovina, tvořená první doménou, sestávající z polypeptidu se sekvencí aminokyselin alespoň jedné z bílkovin Epi B nebo Epi C nebo Epi D nebo Epi H nebo Epi Q z obr. 9 a druhou doménou, tvořenou pomocnou bílkovinou.
2. 2. Složená bílkovina podle nároku 1, v níž spojení mezi první a druhou doménou obsahuje místo štěpení proteázou.
3. 3. Složená bílkovina podle nároku 1 nebo 2, jejíž druhá doménfl/ usnadňuje sekreci složené bílkoviny ze zvoleného hostitele.

   A
4. 4. Složená bílkovina podle nároku 1 nebo 2, v níž druhá doména usnadňuje čištění afinitní chromatografií.
5. 5. Složená bílkovina podle nároku 1 nebo 2, v níž druhou doménou je bílkovina schopná vázat maltozu z E. coli.
6. 6. Rekombinantní molekula DNA, obsahující kódovou sekvenci pro složenou bílkovinu podle některého z nároků 1 až 5.