DE10261782A1

DE10261782A1 - Neue Gene und Genprodukte

Info

Publication number: DE10261782A1
Application number: DE2002161782
Authority: DE
Inventors: Friedrich Prof. Dr. Götz
Original assignee: DR PETRY GENMEDICS GmbH; Petry Genmedics Dr GmbH
Current assignee: DR PETRY GENMEDICS GmbH; Petry Genmedics Dr GmbH
Priority date: 2002-12-19
Filing date: 2002-12-19
Publication date: 2004-07-01

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Gene und deren Genprodukte, diesbezügliche Wirtszellen und Antikörper und Verwendung dieser sowie Verfahren zur Modifizierung von Molekülen.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Gene und deren Genprodukte, diesbezügliche Wirtszellen und Antikörper und deren Verwendung, sowie Verfahren zur Modifizierung von Molekülen.
Bei den Lantibiotika handelt es sich um biologisch aktive Polypeptide aus Gram-positiven Bakterien, welche die Thioetheraminosäuren Lanthionin und 3-Methyllanthionin enthalten. Die meisten Lantibiotika enthalten außerdem 2,3-ungesättigte Aminosäuren. Ein bekannter Vertreter dieser Gruppe ist Nisin, das zur Lebensmittelkonservierung, beispielsweise bei Käse und Obstkonserven, verwendet wird. Andere Vertreter dieser Gruppe sind z. B. Subtilin, Cinnamycin, Duramycin, Pep5 usw. Subtilin wirkt, ähnlich wie Nisin, auf in Teilung befindliche Bakterien und keimende Bakteriensporen durch Porenbildung in den bakteriellen Membranen, wobei die Hitzeresistenz der Bakteriensporen vermindert wird. Aufgrund dieser Eigenschaft werden Nisin und Subtilin in einigen Ländern von der Konservenindustrie genutzt. In der Gruppe der sogenann ten Typ A-Lantibiotika werden unter anderem Epilancin K7, Epidermin sowie Gallidermin zusammengefaßt.
Einige Lantibiotika, so z. B. Epidermin, werden als sogenannte Pro-Formen synthetisiert, d. h. in einer inaktiven Vorstufe, die erst nach Überführung (z. B. durch Proteolyse) in die aktive Form übergehen. Dies erfolgt häufig nach Abspaltung eines sogenannten Leaderanteils (einer Aminosäuresequenz, meistens N-terminal). Die Abspaltung erfolgt meist proteolytisch.

Gene, die allgemein für die Biosynthese der Lantibiotika wichtig sind, sind häufig in sogenannten Genclustern organisiert. Für das Lantibiotikum Epidermin ist das entsprechende Gencluster vollständig sequenziert worden. So ist im Epidermin-Gencluster von Staphylococcus epidermidis Tü3298 das Gen, das die Protease kodiert, welche den Leaderanteil von Pro-Epidermin abspaltet und dadurch erst das aktive Epidermin freisetzt, als das Gen epiP identifiziert worden (Geißler, S., Götz, F., and Kupke, T. (1996) Serine-protease EpiP from Staphylococcus epidermidis catalyzes the processing of the epidermin precursor peptide. J. Bacteriol. 178, 284-288). Dabei wurde das epiP-Gen mittels des Xylose-induzierbaren Staphylokokken-Vektors pCX15 heterolog in Staphylococcus carnosus exprimiert. Durch aminoterminale Sequenzbestimmung wurde bestätigt, daß es sich bei dem beobachteten Protein um EpiP handelte, und es wurde ferner gezeigt, daß EpiP ein Präpropeptid von 99 Aminosäuren besitzt. Bei der Inkubation mit EpiP-haltigen Kulturüberständen konnte durch Reversed Phase Chromatographie die Spaltung des unmodifizierten, aus MBP (maltose binding protein)-EpiA gewonnenen Epidermin-Präpeptids EpiA in zwei Produkte verfolgt werden, die durch IonSpray-Massenspektrometrie als Leitpeptid und Pro-Epidermin identifiziert wurden (Geißler, S., Götz, F., and Kupke, T. (1996) Serineprotease EpiP from Staphylococcus epidermidis catalyzes the processing of the epidermin precursor peptide. J. Bacteriol. 178, 284-288). Die Spaltung erfolgte dabei nur durch Kulturüberstände von induzierten Staphylococcus carnosus (pCX15epiP) Zellen, nicht aber durch solche von nicht induzierten. Die EpiP Protease stellte dabei eine spezifische Protease dar, die nur nach bestimmten Aminosäuresequenzen spaltet. So spaltet EpiP z. B. nach der Sequenz Alanin-Glutaminsäure-Prolin-Arginin(-AEPR-).

Über die Biosynthese, insbesondere Prozessierung weiterer Lantibiotika, wie z. B. Gallidermin, ist wenig bekannt. In einer wissenschaftlichen Publikation wurde gezeigt, daß der Bakterienstamm Staphylococcus gallinarum Tü3928 das Lantibiotikum Gallidermin (Schnell, N., Entian, K.-D., Götz, F., Hörner, T., Kellner, R., and Jung, G. (1988a) Structural isolation and prepeptide sequence of gallidermin, a new lanthionine containing antibiotic FEMS Microbiol. Lett. 58, 263-268) produziert. Außer dem Strukturgen gdmA und den vermuteten Progallidermin-Transportgenen gdmH und gdmT (Peschel, A., N. Schnell, M. Hille, K.-D. Entian, and F. Götz. (1997) Secretion of the lantibiotics epidermin and gallidermin: sequence analysis of the genes gdmT and gdmH, their influence on epidermin production and their regulation by EpiQ. Mol. Gen. Genet. 254: 312-318) ist bislang aber wenig über die anderen an der Biosynthese von Gallidermin beteiligten Gene bekannt. Die Entschlüsselung der Biosynthese von Gallidermin ist aber essentiell, um das aktive Peptidantibiotikum Gallidermin zur Verfügung zu stellen. Die Charakterisierung und funktionelle Zuordnung von Genen und Proteinen, die bei der Biosynthese von Gallidermin notwendig sind, ist essentiell für die Nutzbarmachung dieses Lantibiotikums.

Dementsprechend stellt sich die Erfindung die Aufgabe, neue Mitglieder des Gallidermingenclusters zu charakterisieren und diese als diagnostische, therapeutische und biotechnologische Targets nutzbar zu machen.

Diese Aufgabe wird gelöst durch den Gegenstand der unabhängigen Ansprüche 1, 8, 11, 14, 15, 19 sowie 25. Bevorzugte Ausführungsformen sind in den abhängigen Ansprüchen dargelegt. Der Wortlaut sämtlicher Ansprüche wird hiermit durch Bezugnahme zum Inhalt dieser Beschreibung gemacht.

Gegenstand der Erfindung ist ein Nukleinsäuremolekül, welches mindestens 82 %, vorzugsweise mindestens 85 %, und insbesondere mindestens 90 % identisch zu einer Sequenz wie in SEQ ID NO 1, oder zu einem Derivat dieser Sequenz, ist. Weiterhin kann das Nukleinsäuremolekül die Sequenz wie in SEQ ID NO 1, oder ein Derivat dieser Sequenz, sein. Die Erfindung beruht dabei auf dem überraschenden Ergebnis, daß mehrere Mitglieder des Gallidermingenclusters identifiziert und charakterisiert werden konnten, so z. B. das Gen gdmP, welches eine Serin-Protease kodiert, die das 52-Aminosäuren lange Pro-Gallidermin zum 22-Aminosäuren langen Gallidermin und dem Leaderpeptid (Leitpeptid) prozessiert. Die GdmP-Protease erkennt dabei eine 4-Aminosäuren lange Erkennungssequenz. Die Aminosäuresequenz, die von GdmP erkannt und gespalten wird, lautet: Ala-Glu-Pro-Arg (AEPR), wobei nach der Aminosäure Arg gespalten wird. An letzter Stelle kann auch Glutamin (Q) stehen. Diese erkannte Sequenz ähnelt den weltweit genutzten Säuger-Proteasen Faktor Xa und Enterokinase. GdmP ist daher geeignet, z. B. in der Pharmazie und Medizin verwendete Proteine und Peptide (z. B. Antikörper, Hormone, Lipoproteine, Glycoproteine, Peptide etc.), die über ein Affinitätstag gereinigt werden, von ihrem Affinitätsfusionspartner abzutrennen. Das Gen gdmP kodiert dabei für eine membranverankerte bzw. extrazelluläre Protease. Die Proteinsequenz weist Homologie zu EpiP auf, das in Staphylococcus epidermidis Tü3298 Pro-Epidermin zu Epidermin prozessiert. Homologie besteht auch zu Genen aus den Staphylococcus aureus Stämmen NCTC8325 und COL und zu den Subtilisin-ähnlichen Proteasen im Mutacin- und im Nisingencluster (siehe Tab. 1).

Tab.1: Homologievergleich von GdmP mit Datenbanksequenzen. In Klammern ist jeweils die Anzahl der Aminosäuren angegeben.

Literaturangabe:

EpiP, (Schnell, N., Egelke, G., Augustin, J., Rosenstein, R., Ungermann, V., Götz, F., and Entian, K.-D. (1992) Analysis of genes involved in the biosynthesis of lantibiotic epidermin Europ.J.Biochem. 204, 57-68).

NCTC8325-P, (Sequence Institution: University of Oklahoma: homology search at: TIGR: http://www.tigr) Col-P, (Sequence Institution: TIGR: http://www.tigr)

MutP, (Hillman, J.D., Novak, J., Sagura, E., Gutierrez, J.A., Brooks, T.A., Crowley, P.J., Hess, M., Azizi, A., Leung, K., Cvitkovitch, D., and Bleiweis, A.S. (1998) Genetic and biochemical analysis of mutacin 1140, a lantibiotic from Streptococcus mutans Infect Immun 66, 2743-2749).

NisP, (Kuipers, O.P., Beerthuyzen, M.M., Siezen, R.J., and De Vos, W.M. (1993) Characterization of the nisin gene cluster nisABTCIPR of Lactococcus lactis. Requirement of expression of the nisA and nisl genes for development of immunity Eur J Biochem 216, 281-291).

Weiterhin ist Gegenstand der Erfindung ein Nukleinsäuremolekül, wobei es sich bei dem Nukleinsäuremolekül um das RNA- oder DNA-Molekül, insbesondere das cDNA-Molekül oder die genomische DNA, der Se quenz wie in SEQ ID NO 1 handelt. Generell können die Nukleinsäuremoleküle mit mindestens einem Carrier verbunden sein, wie es erfin dungsgemäß in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform beansprucht wird. Auch kann das Nukleinsäuremolekül mit einem regulatorischen Element, vorzugsweise einem Promotor, insbesondere einem zell- und/oder speziesspezifischen Promotor, verbunden sein. Dem Fachmann sind eine ganze Reihe dieser regulatorischen Elemente bekannt, die zum Teil auch kommerziell vertrieben werden. Ergänzend zu diesen Ausführungen kann das Nukleinsäuremolekül auch mit einem Vektor, insbesondere mit einem Klonierungs- und/oder Expressionsvektor, verbunden sein. Auch hierbei sind dem Fachmann eine ganze Reihe von entsprechenden Vektoren bekannt, die z. B. von den Firmen Qiagen, Amersham Pharmacia etc. auch kommerziell vertrieben werden.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird das Peptid- oder Proteinmolekül, welches die translatierte Sequenz eines zuoberst beschriebenen Nukleinsäuremoleküls ist, beansprucht. Hierbei kann es sich beispielsweise um die Aminosäuresequenz handeln, wie sie in 6 unten dargestellt ist (SEQ ID NO. 2).

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird eine Wirtszelle, die mindestens ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül und/oder Peptid- oder Proteinmolekül enthält, beansprucht. Dabei kann es sich bei der Wirtszelle sowohl um eine prokaryotische als auch eine eukaryotische Wirtszelle handeln. Eine Reihe von Wirtszellen und Methoden zu deren Transfektion oder Transformation sind dem Fachmann bekannt. Einige Beispiele für Wirtszellen, die erfindungsgemäß genutzt werden können, sind z. B. MDCK, COS, Bakterienstämme wie Staphylococcus aureus etc. Dabei handelt es sich nicht um eine abschließende Aufzählung, und jede Wirtszelle, bekannte sowie noch unbekannte Wirtszellen, die ein erfindungsgemäßes Nukleinsäure- und/oder Peptid- oder Proteinmolekül enthalten, werden von der Erfindung umfaßt.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden Antikörper, die spezifisch für ein beschriebenes Nukleinsäure- und/oder Peptid- oder Proteinmolekül sind, beansprucht. Dabei kann es sich bei dem Antikörper sowohl um einen polyklonalen als auch um einen monoklonalen Antikörper handeln. Verfahren zur Herstellung solcher Antikörper sind dem Fachmann bekannt, und dementsprechende Fachliteratur, wie aus einer vorgegebenen Nukleinsäure-/Peptidsequenz ein spezifischer Antikörper hergestellt werden kann, sind publiziert. In diesem Zusammenhang sei z. B. auf die Internetseite von Medline verwiesen, in der unter http://shop.bmn.com/bookshop unter der Kategorie Immunology eine Reihe von Fachbüchern vertrieben werden, die diese Thematik zum Inhalt haben.

Die Erfindung umfaßt ferner eine pharmazeutische Zusammensetzung oder Medikament, die mindestens ein Nukleinsäuremolekül, Peptid- oder Proteinmolekül und/oder Antikörper wie oben beschrieben enthält, und gegebenenfalls einen pharmazeutischen Träger.

Weiterhin umfaßt die Erfindung die Verwendung mindestens einer der genannten Substanzen zur Behandlung von Erkrankungen, bei denen eine Modifizierung von Proteinen, insbesondere eine Proteinspaltung, erforderlich ist. Die Nukleinsäuremoleküle und Peptid- oder Proteinmoleküle der beschriebenen Art können auch zur Herstellung eines Medikamentes verwendet werden. Beispielsweise kann in diesem Zusammenhang ein bakterielles Toxin, wie z.B. Diphterie-Toxin, Pertussis-Toxin oder Shiga-Toxin an einer gegebenenfalls vorhandenen Schnittstelle für GdmP gespalten und damit inaktiviert werden. Somit können die genannten Substanzen bzw. eine entsprechende pharmazeutische Zusammensetzung oder ein Medikament beispielsweise zur Behandlung von Krankheiten eingesetzt werden, bei denen entsprechende Toxine auftreten. Andere Proteasen sind grundsätzlich auch in der Lage, Toxine zu spalten und zu inaktivieren. Durch die hohe Spezifität der GdmP- Protease ist eine derartige Verwendung des Enzyms jedoch besonders vorteilhaft, da hierdurch Nebenwirkungen durch unspezifische Spaltaktivität vermieden wird. Ein dementsprechendes Medikament oder eine dementsprechende pharmazeutische Zusammensetzung kann auch zur Modifizierung, vorzugsweise Prozessierung, insbesondere von Gallidermin, genutzt werden.

Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle und/oder Peptid- oder Proteinmoleküle können mit Vorteil zur Prozessierung von Pro-Gallidermin, Pre-Gallidermin und/oder Fusionsproteinen eingesetzt werden. Die Mitglieder des Gallidermingenclusters spielen bei der Biosynthese von Gallidermin eine wichtige Rolle. So sind z. B. die Gene gdmGEF bzw. die Genprodukte GdmGEF für die Immunität gegen Gallidermin zuständig. Die Gene gdmBCD bzw. Genprodukte GdmBCD sind für Modifizierungen, insbesondere posttranslationelle Modifizierungen, verantwortlich. GdmQ reguliert die Transkription von Gallidermin-Biosynthesegenen. GdmP ist, wie schon beschrieben, eine Serin-Protease und prozessiert das Pro-Gallidermin zum reifen Gallidermin. Weiterhin können diese Mitglieder des Gallidermingenclusters zur Modifizierung, vorzugsweise Prozessierung, insbesondere zur Modifizierung und/oder Prozessierung von Gallidermin, genutzt werden. So kann z. B. GdmP dazu genutzt werden, geeignete Moleküle wie z. B. die schon erwähnten, in der Pharmazie und Medizin häufig verwendeten Proteine und Peptide (Antikörper, Hormone, Lipoproteine, Glycoproteine, Peptide etc.), die über einen Affinitätstag gereinigt werden sollen, von ihrem Affinitätsfusionspartner exakt abzuspalten. Der Markt für solche Enzyme ist nicht unbedeutend und steigend, da mehr und mehr die Fusionstechnik für die Aufreinigung pharmazeutischer Produkte eingesetzt wird. Die anderen beanspruchten Gene bzw. deren Genprodukte können z. B. für die Modifi zierung von geeigneten Molekülen oder für die Regulation der Transkription nutzbar gemacht werden.

Weiterhin umfaßt die Erfindung ein Verfahren zur Modifizierung, insbesondere Prozessierung, von Molekülen, insbesondere Peptiden und/oder Proteinen, wobei ein Mitglied des Gallidermingenclusters, vorzugsweise GdmGEF, GdmBCD und/oder GdmQ, insbesondere GdmP, zur Modifizierung, insbesondere Prozessierung, von Molekülen, insbesondere Peptiden und/oder Proteinen, genutzt wird. Bezüglich der Moleküle, welche unter anderem erfindungsgemäß genutzt werden können, wird auf den entsprechenden Text der Beschreibung verwiesen. Auch Gallidermin selbst kann mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens modifiziert werden. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform haben die Moleküle, insbesondere Peptide und/oder Proteine, mindestens eine sogenannte Konsensus-Spaltsequenz, vorzugsweise eine Konsensus-Spaltsequenz vom Typ AEPR. Dabei wird vorzugsweise nach dem R (Arginin) gespalten. Es kann bevorzugt sein, daß es sich bei der Konsensus-Spaltsequenz um den Typ AEPQ handelt. Hierbei wird bevorzugterweise nach Q (Glutamin) gespalten. Bei den Peptiden und/oder Proteinen kann es sich dabei um z. B. Antikörper, Hormone, Lipopeptide, Glycopeptide, Lipoproteine und/oder Glycoproteine handeln. Diese Peptide und/oder Proteine können dabei mit mindestens einem Fusionspartner, insbesondere einem Affinitätsfusionspartner, verbunden sein. Schließlich kann dieser Fusionspartner, insbesondere Affinitätsfusionspartner, spezifisch vom Zielprotein abgetrennt werden, was auch von der Erfindung umfaßt wird. Entsprechende Affinitätsfusionspartner und Methoden zur Verbindung von Zielmolekülen mit einem Fusionspartner sind dem Fachmann bekannt. So ist insbesondere die His-Tag-Methode gängige Praxis in der Biotechnologie. Auch in diesem Zusammenhang wird auf die umfangreiche Fachliteratur verwiesen, die unter anderem im Internet unter der schon zuvor genannten Adresse in Medline recherchiert werden kann.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform dieses Aspektes der Erfindung wird das Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung oder eines Medikaments eingesetzt. Hierbei dient insbesondere die erfindungsgemäße Protease GdmP dazu, eine Vorform eines Wirkstoffes durch Spaltung zu prozessieren und insbesondere in eine reife und/oder wirksame Form zu überführen. Diese Wirkstoffe können beispielsweise antibiotisch oder auch biologisch wirksame Peptide sein. Bei der Vorform kann es sich beispielsweise um eine natürlich vorkommende Vorform (z. B. Pro-Gallidermin) handeln. Es kann sich aber auch um ein durch insbesondere gentechnische und/oder biotechnologische Methoden hergestelltes Peptid oder Protein, z.B. ein Fusionsprotein handeln, wie oben beschrieben. Voraussetzung ist lediglich, daß das zu prozessierende Protein oder Peptid eine geeignete Spaltsequenz, wie z. B. AEPR oder AEPQ aufweist.

Schließlich umfaßt die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung oder ein Medikament, welches gemäß dem beschriebenen Verfahren hergestellt ist.

Die bestehenden Merkmale und weitere Merkmale ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung von bevorzugten Ausführungsformen in Verbindung mit den Unteransprüchen. Hierbei können die einzelnen Merkmale jeweils für sich oder zu mehreren in Kombination miteinander verwirklicht sein.

In den Abbildungen zeigen:

1: (A) Vergleich der Prozessierungsstelle in den Leitpeptiden verschiedener Lantibiotika: EpiA, Epidermin v. S. epidermidis Tü3298 (Schnell, N., Entian, K.-D., Schneider, U., Götz, F., Zähner, H., Kellner, R., and Jung, G. (1988b) Prepeptide sequence of epidermin, a ribosomally synthesized polypeptide antibiotic containing four sulphide-rings Nature 333, 276-278.); GdmA, Gallidermin v. S. gallinarum (Schnell, N., Entian, K.-D., Schneider, U:, Götz, F., Zähnen, N., Kellner, R., and Jung, G. (1988b) Prepeptide sequence of epidermin, a ribosomally synthesized polypeptide antibiotic containing four sulphide-rings Nature 333, 276-278); PepA, Pep5 v. S. epidermidis 5 (Kellner, R., Jung, G., Josten, M., Kaletta, C., Entian, K.D., and Sahl, H.G. (1989) Pep5, a new lantibiotic: structure elucidation and amino acid sequence of the propeptide Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 28, 616-619); ElkA, Epilancin K7 v. S. epidermidis K7 (van de Kamp, M., van den Hooven, H.W., Konings, R.N., Bierbaum, G., Sahl, H.G., Kuipers, O.P., Siezen, R.J., de Vos, W.M., Hilbers, C.W., and van de Ven, F.J. (1995) Elucidation of the primary structure of the lantibiotic epilancin K7 from Staphylococcus epidermidis K7. Cloning and characterisation of the epilancin-K7-encoding gene and NMR analysis of mature epilancin K7 Eur J Biochem 230, 587-600); SpaA, Subtilin v. B. subtilis (Gross, E., Kiltz, H., and Nebelin, E. (1973) Subtilin. VI. Die Struktur des Subtilins Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 354, 810-812); NisA, NisZ, Nisin A bzw. Nisin Z v. Lactococcus lactis (Gross, E., and Morell, J.L. (1971) The structure of nisin J. Am. Chem. Soc. 93, 4634-4635).

2: Datenbankvergleich von GdmP-homologen Proteinen.

3: Schematische Darstellung des Gallidermingenclusters.

4: Nachweis von GdmP im Kulturüberstand von S. carnosus (pTX15gdmP) zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach der Induktion.

5: Nachweis von GdmP im Kulturüberstand von S. carnosus (pTX15gdmP) von nicht induzierten und induzierten Zellen.

6: HPLC-Analyse von EpiA ohne (oben) und nach Behandlung (unten) mit angereichertem GdmP. Durch GdmP wird EpiA in die beiden Fragmente 1 und 2 gespalten.

7: Oben ist die DNA-Sequenz (SEQ ID NO. 1) und unten die Proteinsequenz (SEQ ID NO. 2) von GdmP dargestellt.

Material und Methoden:

Die Typ A-Lantibiotika (Nisin, Pep5, Epilancin K7 und Epidermin) haben Leitpeptide mit den Konsensus-Spaltstelle ^-2P-^-1R/Q (1).

Für die Charakterisierung dieser Spaltspezifität bei Epidermin wurde das Protein EpiA als Substrat isoliert (Kupke, T., Stevanovic, S., Ottenwälder, B., Metzger, J.W., Jung, G., and Götz, F. (1993) Purification and characterization of EpiA, the peptide substrate for posttranslational modifications involved in epidermin biosynthesis FEMS Microbiol. Lett. 112, 43-48). Nach Inkubation mit EpiP-haltigen Extrakten wurden die Fragmente mittels HPLC aufgereinigt und die beiden entstandenen Spaltprodukte durch IonSpray-Massenspektrometrie analysiert (Geißler, S., Götz, F., and Kupke, T. (1996) Serine-protease EpiP from Staphylococcus epidermidis catalyzes the processing of the epidermin precursor peptide. J. Bacteriol. 178, 284-288). Die Spaltprodukte haben gezeigt, daß EpiP die Sequenz – AEPR – erkennt und nach R spaltet. Ferner erkennt EpiP auch noch die Sequenz AEPQ (Geißler, S., Götz, F., and Kupke, T. (1996) Serine-protease EpiP from Staphylococcus epidermidis catalyzes the processing of the epidermin precursor peptide. J. Bacteriol. 178, 284-288).

Beim Vergleich der Gesamtsequenzen von GdmP und homologer Proteine (2) fällt auf, daß NisP drei Sequenzabschnitte beinhaltet, die in keiner der anderen Proteasen zu finden sind. Identische Aminosäuren sind schwarz unterlegt, ähnliche Aminosäuren grau.

3 zeigt eine schematische Darstellung des Gallidermingenclusters. Dort ist das vollständige Gallidermingencluster dargestellt. Die verschiedenen Muster geben unterschiedliche Funktionsgruppen wieder. Pfeile markieren durch vermutlich GdmQ aktivierbare Promotoren.

Experiment 1:
Heterologe Expression von gdmP in Staphylococcus carnosus
Das gdmP-Gen wurde mittels des Xylose-induzierbaren Expressionsvektors pTX15 heterolog in Staphylococcus carnosus exprimiert. Dazu wurde gdmP mit den Primern gdmPBglIIl (GTA TAT TAA TAT TAG ATC TAA ATA ATA GG) (SEQ ID NO. 3) und gdmPMluI (CAT ATT ATT ACG CGT CAA TCT TTA AGT AAT TTG) (SEQ ID NO. 4) amplifiziert, mit den entsprechenden Restriktionsenzymen geschnitten und in den zuvor mit BamHI/MluI geschnittenen Vektor pTX15 kloniert.
Ammoniumsulfat gefällte Überstände des Stammes Staphylococcus carnosus (pTXgdmP) prozessierten das unmodifizierte Epidermin-Präpeptid EpiA in Leitpeptid und unmodifiziertes Epidermin. Dies konnte durch Reversed Phase Chromatographie und IonSpray-Massenspektrometrie verfolgt werden. Überstände des Kontrollstammes Staphylococcus carnosus (pTX15) wiesen diese proteolytische Aktivität nicht auf.
Experiment 2:
Konstruktion des Vektors pTX15gdmP Für die heterologe Expression von gdmP in Staphylococcus carnosus wurde der Xylose-induzierbare Expressionsvektor pTX15 verwendet. Es wurde ein Vektor gewählt, bei dem gdmP nicht konstitutiv exprimiert wird, da unbekannt war, welchen Effekt die Produktion der vermuteten Protease GdmP auf die Zellen haben würde. Der Vektor pTX15 enthält die Promotor-/Operatorsequenzen des xyl-Operons aus Staphylococcus xylosus sowie das Gen xylR, dessen Genprodukt in Abwesenheit von Xylose als Repressor des xyl-Operons dient. Da für die Klonierung in diesen Vektor 5' und 3' von gdmP keine geeigneten Schnittstellen vorhanden waren, mußten diese durch PCR eingeführt werden. Die oben bezeichneten Primer dienten zur Amplifikation. Das PCR-Produkt enthält die gesamte gdmP-Sequenz.
Die Sequenzen der PCR-Primer wurden so gewählt, daß eine BglII-Schnittstelle stromaufwärts und eine MluI-Schnittstelle stromabwärts von gdmP eingeführt wurden. Durch Zugabe von Xylose in das Medium wird die Expression von gdmP induziert.
Experiment 3:
Expression von gdmP in Staphylococcus carnosus
Die Staphylococcus carnosus (pTX15gmdP) Zellen wurden in B-Medium ohne Glucose mit 10 μg/ml Tetracyclin (Tc) unter Schütteln (120 Upm) bei 37 °C inkubiert und bei einer A₅₇₈ von ca. 0,5 mit 0,5 % Xylose induziert. Im Kulturüberstand der induzierten Zellen tauchte in der Tricine-SDS-PAGE ein 45-46 kDa-Protein auf, das im Kulturüberstand nicht induzierter Zellen nur sehr schwach nachweisbar war. Im Kulturüberstand von induzierten Staphylococcus carnosus (pTX15) Zellen fehlte in der Tricine-SDS-PAGE diese Bande.
Zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach der Induktion der S. carnosus (pTX15gdmP) Zellen wurde jeweils Kulturüberstand durch Lyophilisation ca. 14fach konzentriert und über 10 % Tricine-SDS-PAGE aufgetrennt (4). Kulturüberstände: 1: 3 h; 2: 6 h; 3: 10 h und 4: 24 h nach Induktion; S: Standardproteine. Die Zahlen auf der linken Seite geben die Molekülmassen der Standardproteine in kDa an. Der Pfeil zeigt GdmP an. In der Kontrolle S. carnosus (pTX15) war die mit Pfeil gekennzeichnete Proteinbande nicht zu sehen (nicht gezeigt).
Zwei 1 I-Kulturen von S. carnosus (pTX15gdmP) und eine 1 I-Kultur von S. carnosus (pTX15) wurden in B-Medium ohne Glucose mit 10 μg/ml Tc bis zu einer A₅₇₈ = 0,5 herangezogen. Eine Kultur von S. carnosus (pTX15gdmP) und die Kultur von S. carnosus (pTX15) wurden mit 0,5 % Xylose induziert und alle Kulturen weitere 20 h bei 37 °C unter Schütteln inkubiert. Die Kulturüberstände wurden durch Lyophilisation ca. 14-fach konzentriert (die Aufnahme des Lyophilisats erfolgte in 20 mM Tris/HCl, pH 8,0) und über 10 % Tricine-SDS-PAGE aufgetrennt. Die Proteine wurden mit Coomassie-Blau gefärbt bzw. für den Immunoblot auf Nitrozellulose übertragen. Die Entwicklung des Blots erfolgte mit Anti-MBP- GdmP-Antiserum. 5 zeigt den Nachweis von GdmP in den Kulturüberständen (SDS-PAGE und Coomassie-Färbung). Kulturüberstände von: 1, nicht induzierten S. carnosus (pTX15gdmP) Zellen; 2, induzierten S. carnosus (pTX15gdmP) Zellen; S, Standardproteine. Die Zahlen auf der rechten Seite geben die Molekülmassen der Standardproteine in kDa an.
In den Zellextrakten induzierter S. carnosus (pTX15gdmP) Zellen konnte im Vergleich zu den nicht induzierten Zellen eine deutlich sichtbare zusätzliche Proteinbande nachgewiesen werden.
Der Klon Staphylococcus carnosus (pTX15gdmP) wies auf Magermilch- und Caseinplatten keine Proteaseaktivität auf. Dies zeigt die sehr spezifische Aktivität der GdmP-Protease.
Experiment 4:
Anreicherung von GdmP
Zur Charakterisierung eines Enzyms ist es sinnvoll, dieses zu reinigen, um eine Beeinflussung der Aktivität durch andere Proteine weitgehend ausschließen zu können. Zur Reinigung von GdmP wurde von einer 5 l Kultur von Staphylococcus carnosus (pTX15gdmP) in B-Medium ohne Glucose ausgegangen. Die Zellen wurden unter Selektionsdruck (10 μg/ml Tetracyclin) bis zu einer A₅ ₇₈ = 0,5 angezogen, mit 0,5 % Xylose induziert und unterschiedlich lange (4-20 h) weiter inkubiert. Der Kulturüberstand wurde durch 60 % Ammoniumsulfatfällung konzentriert und die gefällten Proteine in 60 ml des nachfolgend verwendeten Säulenpuffers gelöst. Wegen des relativ großen Volumens der löslichen Proteine bot sich als erster Reinigungschritt nach der Ammoniumsulfatfällung eine Ionenaustauschchromatographie oder eine Affinitätschroma tographie an, um eine weitere Konzentrierung der Proteinlösung zu erreichen. GdmP zeigt eine schwache Bindung an Arginin-Sepharose.
Da der theoretische isoelektrische Punkt (pl) des von der DNA-Sequenz von gdmP (beginnend mit dem Startcodon) abgeleiteten Proteins mit 9,73 sehr basisch war, erschien eine Reinigung über Kationenaustauschchromatographie vielversprechend. Erstaunlicherweise zeigte GdmP aber unter den gewählten Pufferbedingungen im pH-Bereich von 5-7 nur eine schwache Bindung an Kationenaustauschermaterialien. Die Bindung war nicht quantitativ und die Elution erfolgte bei niedrigen NaCl-Konzentrationen von 0,15-0,25 M. Dagegen band GdmP bei pH 8,0 quantitativ an Anionenaustauschermaterialien. Von dem schwachen Anionenaustauscher DEAE-Sepharose eluierte GdmP bei ca. 0,5 M NaCl, von Q-Sepharose (HiTrap Q) als starkem Anionenaustauscher erst bei etwa 0,8 M NaCl, während die meisten anderen Proteine bei niedrigeren Salzkonzentrationen eluierten oder gar nicht an das Säulenmaterial banden. Die durch 60 % Ammoniumsulfat gefällten Proteine wurden daher routinemäßig in 20 mM Tris/HCl, pH 8,0 mit 1 mM CaCl₂ aufgenommen und über eine HiTrap Q-Säule aufgetrennt. Die Elution erfolgte mit einem linearen Salzgradienten von 0-1 M NaCl. EpiP wurde in einem Volumen von 15-20 ml gewonnen.
Nach der Anionenaustauschchromatographie bot sich die weitere Reinigung über hydrophobe Interaktionschromatographie an, da hierfür keine Dialyse notwendig war. Die Probe wurde auf eine entsprechend hohe NaCl- oder Ammoniumsulfatkonzentration eingestellt, wobei verschiedene Konzentrationen bis jeweils 1,5 M Salz getestet wurden. Die Elution erfolgte mit einem linearen Gradienten absteigender Salzkonzentration. Die verwendeten Säulenmaterialien zeigten eine unterschiedlich starke Bindung der Proteine, aber der Trenneffekt war in keinem Fall zufriedenstellend.
Durch Gelfiltration, nach Konzentrierung der Proteinlösung durch Lyophilisation ließen sich die Proteine ebenfalls nicht auftrennen. Ein geringer zusätzlicher Reinigungseffekt war durch einen zweiten starken Anionenaustauscher, eine Mono Q-Säule, zu erzielen.
Experiment 5:
Umsetzung des unmodifizierten Präpeptides EpiA mit GdmP
Der Kulturüberstand von Staphylococcus carnosus (pTXgdmP) und als Kontrolle von Staphylococcus carnosus (pTX15) wurden hinsichtlich der Spaltaktivität des EpiderminA-Proteins (EpiA) untersucht. EpiA wurde hergestellt wie früher bereits beschrieben (Kupke, T., Stevanovic, S., Ottenwälder, B., Metzger, J.W., Jung, G., and Götz, F. (1993) Purification and characterization of EpiA, the peptide substrate for posttranslational modifications involved in epidermin biosynthesis FEMS Microbiol. Lett. 112, 43-48). EpiA enthält folgende Sequenz: EpiA ......DSGAEPR-I.. (SEQ ID NO. 5)
Diese Sequenz ist auch in der GdmA-Sequenz enthalten.
Es wurde gezeigt, daß GdmP zwischen R und I spaltet. In der HPLC-Analyse (6) konnte eine Spaltung des Peptids im Extrakt von Staphylococcus carnosus (pTXgdmP), nicht aber im Extrakt des Stammes mit dem reinen Expressionsvektor (pTX15), nachgewiesen werden. Somit konnte gezeigt werden, daß GdmP die Prä-Gallidermin prozessierende Protease darstellt.
Weiterhin wurden Kulturüberstände und angereinigtes GdmP mit dem gereinigten unmodifizierten Vorläuferpeptid von EpiA versetzt und Spal tungsexperimente durchgeführt. Das eigentliche Substrat von GdmP ist höchstwahrscheinlich das voll modifizierte Präpeptid GdmA bzw. EpiA.
EpiA wurde aus dem MBP (maltose binding protein) -EpiA-Fusionsprotein durch Faktor Xa-Spaltung und nachfolgende Anionenaustauschchromatographie und Reversed-Phase Chromatographie (RPC) gewonnen. Die Reinigung von MBP-EpiA erfolgte aus einer 5 I-Kultur von E. coli TB1 (pIH902-epiA) wie bei Kupke et al. (Kupke, T., Stevanovic, S., Ottenwälder, B., Metzger, J.W., Jung, G., and Götz, F. (1993) Purification and characterization of EpiA, the peptide substrate for posttranslational modifications involved in epidermin biosynthesis FEMS Microbiol. Lett. 112, 43-48) beschrieben.
Die Inkubationsansätze a) von Kulturüberstand von induzierten S. carnosus (pTX15gdmP) Zellen mit EpiA, und b) von Kulturüberstand von induzierten S. carnosus (pTX15) Zellen mit EpiA wurden über Reversed Phase Chromatographie (RPC) aufgetrennt. Außerdem wurde der Inkubationsansatz von Kulturüberstand von nicht induzierten S. carnosus (pTX15gdmP) Zellen mit EpiA über RPC aufgetrennt, wobei sich ein zu b) äquivalentes Chromatogramm ergab. Die Kulturüberstände stammten von Kulturen, die nach der Induktion für weitere 4 h inkubiert worden waren.
Durch IonSpray Massenspektrometrie zeigte sich, daß die Peaks mit den Retentionszeiten 28 min (1) bzw. 29,1 min (2) das Leitpeptid des Epidermins bzw. das Proepidermin waren, während der Peak bei 30,6 min EpiA darstellte. Aus den Peaks der 1- und 2-fach geladenen Ionen bei 2297,5 und 1149 m/z ließ sich eine HyperMass von 2296 ± 0,4 Da berechnen. Bei dem bei 29,1 min von der RPC-Säule eluierten Peptid handelte es sich demnach um das Proepidermin mit einer theoretischen Masse von 2297,7 Da unter oxidierenden Bedingungen.
Es zeigte sich, daß EpiA nur in dem Ansatz mit Kulturüberstand von induzierten S. carnosus (pTX15gdmP) Zellen gespalten worden war. Nur hier waren die Spaltprodukte von EpiA, das hydrophile Leitpeptid, das bei 28 min von der Reversed Phase Säule eluierte und das hydrophobere Propeptid, das bei 29,1 min eluierte, im Chromatogramm sichtbar.
SEQUENCE LISTING

Claims

Nukleinsäuremolekül, dadurch gekennzeichnet, daß es mindestens 82 %, vorzugsweise mindestens 85 %, und insbesondere mindestens 90 % identisch zu einer Sequenz wie in SEQ ID NO. 1, oder zu einem Derivat dieser Sequenz, ist.
Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es die Sequenz wie in SEQ ID NO. 1, oder ein Derivat dieser Sequenz, ist.
Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es das entsprechende RNA- oder DNA-Molekül, insbesondere das cDNA-Molekül ist.
Nukleinsäuremolekül nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es mit mindestens einem Carrier verbunden ist.
Nukleinsäuremolekül nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es mit mindestens einem regulatorischen Element, vorzugsweise einem Promotor, insbesondere einem zell- und/oder organspezifischen Promotor, verbunden ist.
Nukleinsäuremolekül nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es mit einem Vektor, insbesondere mit einem Klonierungs- und/oder Expressionsvektor, verbunden ist.
Peptid- oder Proteinmolekül, dadurch gekennzeichnet, daß es die translatierte Sequenz eines Nukleinsäuremoleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 6 besitzt.
Wirtszelle, dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens ein Nukleinsäuremolekül und/oder Peptid- oder Proteinmolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 7 enthält.
Wirtszelle nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Wirtszelle eine prokaryotische Wirtszelle ist.
Wirtszelle nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Wirtszelle eine eukaryotische Wirtszelle ist.
Antikörper, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper spezifisch für ein Nukleinsäure- und/oder Peptid- oder Proteinmolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 7 ist.
Antikörper nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper ein polyklonaler Antikörper ist.
Antikörper nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung oder Medikament, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein Nukleinsäuremolekül, Peptid- oder Proteinmolekül und/oder Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 7 und 11 bis 13, und gegebenenfalls ein pharmazeutischer Träger, enthalten ist.
Verwendung mindestens eines Nukleinsäuremoleküls, Peptid- oder Proteinmoleküls und/oder Antikörpers nach einem der Ansprü che 1 bis 7 und 11 bis 13 zur Behandlung von Erkrankungen, bei denen eine Modifizierung von Proteinen, insbesondere eine Proteinspaltung erforderlich ist.
Verwendung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die zu modifizierenden Proteine Toxine sind, insbesondere bakterielle Toxine.
Verwendung mindestens eines Nukleinsäuremoleküls, Peptid- oder Proteinmoleküls und/oder Antikörpers nach einem der Ansprüche 1 bis 7 und 11 bis 13 zur Herstellung eines Medikamentes oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Erkrankungen, bei denen eine Modifizierungen von Proteinen, insbesondere eine Proteinspaltung erforderlich ist.
Verwendung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die zu modifizierenden Proteine Toxine sind, insbesondere bakterielle Toxine.
Verfahren zur Modifizierung, insbesondere Prozessierung, von Molekülen, insbesondere Peptiden und/oder Proteinen, dadurch gekennzeichnet, daß ein Mitglied des Gallidermin-Genklusters, vorzugsweise gdmGEF, gdmBCD und/oder gdmQ, insbesondere gdmP, zur Modifizierung, insbesondere Prozessierung, von Molekülen, insbesondere Peptiden und/oder Proteinen, genutzt wird.
Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Moleküle, insbesondere Peptide und/oder Proteine, mindestens eine AEPR- und/oder AEPQ-Konsensus-Spaltsequenz enthalten.
Verfahren nach Anspruch 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Peptiden und/oder Proteinen um Antikörper, Hormone, Lipopeptide, Glycopeptide, Lipoproteine und/oder Glycoproteine handelt.
Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß die Peptide und/oder Proteine mit mindestens einem Fusionspartner, insbesondere einem Affinitätsfusionspartner, verbunden sind.
Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß der Fusionspartner, insbesondere Affinitätsfusionspartner, spezifisch vom Zielprotein abgetrennt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung oder eines Medikaments eingesetzt wird.
Pharmazeutische Zusammensetzung oder Medikament, dadurch gekennzeichnet, daß es nach einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 19 bis 24 hergestellt ist.