KR100267889B1 - 인간 알파 심방성나트륨이뇨인자의 미생물학적 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 엔테로키나아제 단백질분해효소에 의해 절단되어지는 부위를 갖는 Gene-9 단백질과 인간 알파 심방성나트륨이뇨인자(α-hANF)와의 융합단백질을 암호화한 염기서열을 포함하여 고 수율로 그 융합 단백질을 발현하는 DNA 재조합 플라스미드 및 이 재조합 플라스미드로 형질전환된 미생물을 고밀도 세포배양하여, 융합단백질을 분리 및 정제하고, 효소적으로 Gene-9 단백질 부위를 제거함을 포함하여 고 수율로 α-hANF를 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

인간 알파 심방성나트륨이뇨인자의 미생물학적 제조 방법(Microbiological Process for Producing α-hANF)

본 발명은 박테리아 숙주에서는 일반적으로 불안정한 α-hANF의 발현율을 높여 고수율로 제조하는 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 DNA 재조합 기술에 의해 화학적 및 효소학적으로 합성된 기술과 단백질공학에 관한 것이다. 구체적으로는 재조합 DNA 기술에 의해 화학적 및 효소학적으로 합성된 α-hANF와 방어적 단백질의 융합단백질을 암호화한 복합유전자를 포함한 재조합 발현 플라스미드를 이용하여 α-hANF를 고 수율로 제조하는 방법에 관한 것이다.

α-hANF는 체액양의 조절과 혈압의 항상성에 관계하는 심장 유래의 펩타이드 호르몬으로 알려져 있다. 따라서, α-hANF는 고혈압과 그에 따른 심장질환에 대하여 항 고혈압 나트륨 뇨 배출제로서 임상적으로 유용할 것으로 관망된다. 이는 대부분 28개의 아미노산으로 이루어진 고리모양의 펩타이드로서 7번째의 시스테인 잔기와 23번째의 시스테인 잔기가 황 공유결합(disulfide bond)으로 연결되어 있다.

많은 진핵생물의 작은 단백질들(예, 호르몬들)은 대장균에서 발현될 때 숙주에 의한 외래 단백질의 분해작용 때문에 충분한 수율로 발현되기 어려우므로, 많은 연구자들은 적당한 프로텍터 단백질과 결합시킨 융합단백질 형태로 발현시킴으로써 이러한 문제를 해결하고자 하였다. α-hANF의 경우 이러한 목적으로 사용된 프로텍터(결합)단백질들의 예로는 크로람페니콜 아세틸 전이효소[Hobden 등 (1986) GB 2180539A], 베타 갈락토시다제의 리더펩티드[Magota 등 (1991) USP 4,987,070], 파지 fr 외피단백질[Berzins V. 등 (1993) J. Biotechnol. 30, 231-243] 등이 있다.

본 발명자들은 대장균에서 과량 생산되고 매우 안정한 박테리오파지 T7의 Gene-9 단백질을 본 발명에서 방어적 기능을 가진 결합단백질의 구성요소로 선택하였다.상기 Gene-9 단백질은 원래 박테리오파지의 외피를 구성하는 단백질의 구성원으로서 "골격 단백질(scaffolding protein)"로도 호칭되며, 이와 같은 Gene-9 단백질응 사용하여 융합단백질 형태로 성공적으로 발현시킨 예로는 Howell 등이 신경독소인 뉴로톡신(neurotoxin) B-IV를 대장균에서 발현시킨 예[Howell M. L., Blumenthal K. M. (1989) J. Biol. Chem. 264, 15268-15273]가 있다. 본 발명자들은 광범위하고도 집중적인 결과, 진핵생물의 단백질인 α-hANF는 Gene-9 단백질과 융합되어 발현되는 동안 분해작용을 받지 않게 되므로 대장균에서 상업적으로 회수 가능한 수율로 성공적으로 발현될 수 있었다. 종래에는, 실제로 대장균에서 다양한 단백질을 발현시키고자 할 때, 대부분 세포내에 내포체(inclusion body)가 형성되는 경우가 일반적이었다.이렇게 형성된 내포체는 워심분리에 의해 정제될 수 있어서 어느 정도의 단백질 순도를 달성할 수는 있었고, 침전 형태로 존재하게 되어 세포내의 다양한 단백질 분해효소들로부터 보호될 수 있는 장점을 제공할 수는 있었으나, 정작 상기 내포체 자체를 용해시키기 위해 사용되는 요소(Urea), 구아니딘-영산,SDS 등이 단백질의 구조를 변형시키게 되어 차후로 단백질의 폴딩을 수행해야 하는 문제가 있었다. 본 발명자들이 Gene-9 융합단백질의 발현 및 정제에 관한 상기 연구결과 새롭게 발견하게 된 장점들은 다음과 같은 것들이 있다: 1) Gene-9 단백질이 시스테인 잔기를 가지고 있지 않으므로 생산코자 하는 목적 단백질의 황 공유결합의 형성에 영향을 미치지 않을므로 단백질 폴딩에 아무런 방해를 하지 않는다. 2) Gene-9 단백질은 세포내 용해도가 높으므로 봉입체(Inclusion Body)가 형성되지 않고 구조적 변형이 일어나지 않으며, 발현율이 대장균 전체 단백질의 25% 내지 30% 정도로서 문헌에 나타나는 통상의 발현율인 20% 내지 25% 보다 높다. 3) 본 발명의 융합단백질이 Gene-9 융합단백질 형태로 발현되었을 때 이 융합 단백질은 세포외질(periplasm)로 발현되어 나오게 되므로,세포내듸 다양한 단백질 분해효소들로부터 융합단백질이 보호되어 발현율이 높고, -대장균 세포를 파쇄하지 않고도 삼투압 용출(Osmotic Shock)법에의해 용이하며 회수된 융합 단백질을 80%수준으로 용이하게 정제할 수 있고,-단백질의 3차원 구조가 보존되므로 후속의 단백질 폴딩(folding)공정이 불필요하고,-세포질 부분은 환원조건이지만 세포외질(periplasm)부분은 산화조건이므로 ANF 펩티드의 생리적 활성에 필수적인 황 공유결합(disulfide bond)이 이미 형성되어 있다.

도1a 내지 도1c는 엔테로키나아제 단백질분해효소에 의해 절단되어지는 부위를 갖는 Gene-9 단백질과 인간 알파 심방성나트륨이뇨인자(α-hANF)와의 융합단백질의 339개 아미노산 서열과 그에 상응하는 염기서열을 나타낸 것이다.

도2는 Gene-9-α-hANF 융합단백질을 클로닝하고 발현시키기 위한 본 발명의 DNA 재조합 플라스미의 제작도이다.

도3은 융합단백질의 발현을 분석하기 위하여 대장균 세포를 증류수에 현탁한 것(a, 레인2)과 삼투압 용출법으로 융합단백질을 용출한 부분(a, 레인3)에 SDS-PAGE 로딩 버퍼를 넣고 끓인후 전기영동하여 쿠마시 염색한 결과(a)와 항 Gene-9 단항체를 이용하여 웨스턴 블럿을 실시한 결과(b)를 보여주고 있다.

도4a 및 도4b는 엔테로키나아제 반응 후 재조합 α-hANF 시료(a)를 RP-HPLC로 용출한 양상을 표준품 α-hANF(b)를 RP-HPLC로 용출한 양상과 비교하여 보여주고 있다.

도5는 재조합 α-hANF, Gene-9 단백질 및 Gene-9-ANF 융합단백질의 농도 증가에 따른 토끼 동맥의 이완반응을 생체외 바이오어세이법으로 분석한 결과이다.

본 발명의 일면에 따르면, 본 발명은 원핵생물 숙주에서 인간 심방성나트륨이뇨인자(α-hANF) 단백질을 생산하는 방법을 제공하며,본 발명의 방법은 보통의 박테리아 발현계에서는 회수가 되지 않는 포유동물의 펩티드 호르몬의 유전자 서열을 연결자 서열을 통하여 파지의 Gene-9 단백질 유전자와 연결하여 박테리아의 발현계에서도 회수 가능한 수율로 융합단백질을 생산하도록 복합유전자를 구성하는 단계; 이 복합유전자의 발현을 위한 발현벡터의 제조단계; 발현벡터를 형질전환시킨 원핵생물 숙주를 고밀도 세포배양법으로 배양하는 단계; 상기 숙주에서 융합단백질의 회수하고 이를 삼투압 용출법에 의해 확인하는 단계; 및 회수된 융합 단백질을 절단, 분리 및 정제하여 α-hANF를 수득하고, 이를 생리학적 방법으로 시험하는 단계로 이루어지게 된다.

또한 본 발명에 따르면,리가제(ligaase)에 의해 연결된 상기 파지 Gene-9 단백질 유전자와 α-hANF 단백질 유전자의 융합단백질응 고수울로 박테리아에서 발현시키기에 적합한 재조합 DNA 발현 플라스미드가 제공된다.

본 발명에 따른 상기 방법 및 플라스미드에 있어서의 주요 특징은 306개 아미노산 서열을 암호화한 Gene-9 단백질 유전자와 이 단백질 유전자의 프로모터 부위를 사용하였다는 것이다. 본 발명에서 사용된 Gene-9 단백질 유전자는 306개 아미노산의 Gene-9 단백질 염기 서열과 그 3'-말단에 복합유전자를 구성하는데 편리한 수 개의 유용한 제한효소 절단부 염기 서열을 갖는다.

본 발명에 따라 발현된 융합단백질의 아미노산 서열은 Gene-9 단백질의 아미노 말단 부위에서 시작하여 연결자를 거쳐서 ANF 단백질의 카복시 말단에서 끝난다. 융합단백질로부터 절단 산물을 회수할 수 있도록 Gene-9 단백질 서열 아래쪽에 효소적 또는 화학적 절단부위를 포함시킨다. 절단 후에는 원하는 단백질을 기지의 단백질 정제방법을 사용하여 회수할 수 있다. 적당한 절단서열의 예로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 메티오닌 잔기, 트립토판 잔기, 라이신 잔기, 글루탐산 잔기 후위부와 아스파라긴과 라이신 잔기 사이 등이 포함된다.

원핵생물계는 Gene-9 단백질의 발현과 클로닝에 가장 편리하게 사용될 수 있는데, 일반적으로 대장균의 다양한 균주들이 사용될 수 있다. 복제오리진, 제한효소 절단부, 선별마커, 조절인자부위 등을 가진 플라스미드 벡터들은 사용될 적합한 숙주가 잘 알려져 있다. 예를 들면, 대장균을 암피실린과 테트라사이클린 내성 유전자와 복제기원점을 가지는 pBR322의 유도체를 사용하여 형질전환한다. 본 발명에 따라 제조된 본 발명의 재조합 발현 벡터에 적합할 수 있는 숙주세포로는 예를 들면 BL21, JM83, RR1, HB101, K802, MM294, VL902 등의 대장균 균주들을 들 수 있다.

대장균에서 Gene-9-α-hANF 융합단백질을 생산하기 위하여 본 발명에서 사용된 발현벡터 pGene9-ANF는 엔테로키나아제 절단부위의 암호 서열과 함께 306개 아미노산으로 구성된 Gene-9 단백질 유전자를 포함하고 있다. 그에 따라 발현된 본 발명의 융합단백질은 Gene-9 단백질 유전자의 전체 부위(아미노산 1-306)가 결합서열(asp-asp-asp-asp-lys)을 통해서 α-hANF(28개 아미노산)와 결합되어 있다. α-hANF는 융합단백질 구성 아미노산의 8.3%를 차지한다.

본 발명의 한가지 대표적인 재조합 발현 벡터는 플라스미드 pSR9와 합성 α-hANF 유전자로부터 제조된 것이며, 플라스미드 본체, T7 프로모터, Gene-9 단백질 암호 염기서열, 절단부위 서열 및 α-hANF 유전자를 포함한다.

대장균에서 융합단백질의 발현시 많은 경우는 세포내에 봉입체(Inclusion body)를 형성하는데, 봉입체의 형성은 원심분리를 통한 봉입체의 정제만으로도 어느 정도의 단백질 순도를 얻을 수 있다는 점과 세포내에서 침전물 형태로 존재하므로 세포내의 다양한 단백질 분해효소들로부터 방어될 수 있는 장점이 있으나, 봉입체를 용해시키기 위하여 사용되는 요소(Urea), 구아니딘-염산(Guanidine-HCl), SDS 등이 단백질의 구조를 변형시키므로 이후에 단백질 폴딩을 수행해야 하는 단점이 있는 것으로 알려져 있다. 그러나, 본 발명자들이 Gene9 융합단백질 형태로 발현하였을 때 융합단백질이 페리플라즘으로 발현되어 나오므로 1) 세포내의 다양한 단백질 분해효소들로부터 보호되어 발현율이 높은 점, 2) 삼투압 용출법으로 회수가 용이하며, 회수된 융합단백질의 순도가 80% 정도의 수준으로 정제가 용이하며, 3) 단백질의 3차원적 구조가 보존되어 이후에 단백질 폴딩의 공정이 불필요하며, 4) 세포질 부분은 환원조건인데 반해 페리플라즘 부위는 산화조건이므로 ANF 펩타이드의 생리적 활성에 필수적인 황공유결합(Disulfide bond)이 이미 형성되어 있다는 장점들을 새롭게 발견할 수 있었다.

이하, 본 발명은 하기의 실시예를 통하여 구체적으로 설명된다. 그러나, 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하고자 제공되는 것으로서, 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것으로 이해되어서는 안될 것이다.

실시예 1. α-hANF 유전자의 합성

α-hANF는 28개 아미노산으로 구성된 펩타이드로서 유전자의 크기가 작으므로 DNA 합성기로 합성한 적당한 크기의 올리고뉴클레오티드 절편들을 접합함으로써 원하는 α-hANF 유전자의 전체서열을 제조하였다. 이때 각 아미노산을 암호화한 염기서열들은 발현 균주인 대장균에서 널리 사용되는 코돈들로 디자인되었다. α-hANF의 아미노산 서열과 그에 대응하는 염기서열이 하기 서열 1로 표시된다.

α-hANF를 Gene-9와 연결된 융합단백질 형태로 발현시킬 때의 연결부위로는 엔테로키나아제의 특이한 인지서열인 asp-asp-asp-asp-lys-↑-X을 이용하였다. 그리고 발현벡터에 클로닝하기 위하여 5'-말단쪽에는 제한효소인 SalI ( G^↓TCGAC )의 인식부위를, 3'-말단쪽에는 제한효소인 HindIII ( A^↓AGCTT )의 인식부위를 부가적으로 사용하였다.

1) DNA합성기에 의한 올리고뉴클레오티드 절편의 합성

DNA 합성기(모델: Applied Biosystems 392 DNA Synthesizer)를 사용하여 엔테로키나아제의 인지서열과 α-hANF를 암호화한 8개의 올리고뉴클레오티드 (서열 2)를 염기의 수가 30개 내외인 크기로 합성하였다.

또한, 발현 벡터에 클로닝할 링커인 SalI ( G^↓TCGAC )과 HindIII( A^↓AGCTT) 인식부위를 포함하는 2개의 하기 올리고뉴클레오티드 (서열 3)를 합성하여 PCR을 이용한 유전자 증폭용 프라이머로 사용하였다:

2) 합성 올리고뉴클레오티드의 정제

DNA 합성기로 합성한 올리고뉴클레오티드 용액을 부탄올로 침전시킨 후, 150 ul의 TE 용액에 녹였다. HPLC를 이용하여 합성된 올리고뉴클레오티드를 정제하였다. 사용한 컬럼은 Nucleogen-DEAE 60-7(10 x 125mm, Macherey-Nagel Cat. No. 736597)이었으며, 이동상으로는 20% 아세토나이트릴, 20 mM 초산 나트륨 용액(pH 6.0)으로부터 20% 아세토나이트릴, 20 mM 초산 나트륨 용액(pH 6.0), 1 M 염화칼륨 용액까지의 직선농도구배법을 이용하였다. 이때 유속은 분당 1 ml이었고 120분 동안 용출하였다. 90분 근처에서 용출되는 가장 큰 피크부분을 받아 에탄올 침전을 하였다.

3) 인산화 반응

T₄폴리뉴클레오티드 키나아제(NEB사)를 이용하여 정제된 올리고뉴클레오티드들을 각각 인산화하였다. 반응조건은 아래 표 2와 같다. 열처리(65℃, 20분)를 이용하여 반응을 종료하였고, 페놀추출후 에탄올 침전을 하였다.

올리고뉴클레오티드 샘플 41 ul 반응 버퍼(10배) 5 ul 10 mM ATP 2 ul T4폴리뉴클레오티드 키나아제 2 ul (37℃, 1시간 반응)

4) 어닐링 반응

위에서 얻은 침전물을 0.1 M 염화나트륨을 포함하는 10 mM 트리스 염산 완충용액(pH 8.0)에 녹인후 서로 상보적인 올리고뉴클레오티드(ANF A는 ANF 1과, ANF B는 ANF 2와, ANF C는 ANF 3과, ANF D는 ANF 4와)를 섞어 어닐링하였다. 어닐링은 100℃에서 5분간 가열한 후 서서히 식힘으로써 이루어질 수 있었다. 어닐링된 사슬을 각각 A1, B2, C3, D4로 명명하였다.

5) 접합(Ligation)반응

어닐링후 각각의 올리고뉴클레오티드를 연결하고자 접합반응을 시도하였다. 1차 접합은 A1은 B2와, C3는 D4와 섞은 후 T₄DNA 리가아제(NEB)와 반응버퍼를 첨가하여 25℃에서 하룻밤 반응시켰다. 4% 아크릴아마이드 젤에서 55 bp 근처의 밴드부위를 잘라 Mermaid 키트(BIO 101)로 용출하였다. 이렇게 접합된 시료를 각각 A1B2와 C3D4로 명명하였다. 2차 접합을 위해 A1B2와 C3D4를 섞은 후 T₄DNA 리가아제(NEB)를 첨가함으로써 원하는 α-hANF 유전자를 합성하였다. 합성된 α-hANF 유전자의 크기는 108 bp였으며, 마찬가지로 Mermaid 키트를 사용하여 용출하였다.

6) PCR 증폭

접합반응을 통해 합성한 유전자를 증폭함과 동시에 발현벡터에 클로닝하기 위하여 SalI, HindIII를 양 끝에 포함하는 프라이머(ANF-AP, ANF-4P)를 사용하여 PCR을 수행하였다. 사용한 조건은 아래 표 3과 같으며, 효소는 Vent DNA 폴리머라제(NEB)를 사용하였다.

1차 1 cycle	2차 28 cycle	3차 1 cycle
94℃ 1분 60℃ 1분 72℃ 1분	94℃ 1분 60℃ 1분 72℃ 10분	94℃ 5분 60℃ 1분 72℃ 1분

실시예 2. 발현벡터 pGene-9-ANF의 제조

α-hANF를 T7 Gene-9과 융합된 형태로 대장균 균주로부터 발현시키기 위하여 pSR9 벡터에 클로닝하였다. 발현벡터 pSR9는 Gene-9 단백질의 306개 아미노산 서열(도 1)과 몇 개의 제한효소 인식부위를 포함하고 있다. PCR 증폭한 α-hANF 유전자를 Gene-Clean 키트(BIO 101)를 이용하여 2% 아가로스 젤로부터 용출하여 pGEM-T 벡터(Promega)에 접합한 후, 대장균 NM522에 형질전환하였다. X-gal/IPTG를 도말한 LB-암피실린 고체배지에서 하룻밤 키운 후, 흰색 콜로니들로부터 플라스미드 DNA를 정제한 후 제한효소( SalI, HindIII )와 반응시켜 α-hANF 유전자가 삽입되어 있는 콜로니를 선별하였다. 이때 얻은 α-hANF 유전자를 미리 제한효소(SalI, HindIII)로 반응시켜 얻은 pSR9 발현벡터와 접합시키고(도 2), BL21 대장균 균주에 형질전환하여 융합단백질의 발현에 사용하였다. pSR9 플라스미드 벡터는 Blumental 등[Howell M. L., Blumenthal K. M. (1989) J. Biol. Chem. 264, 15268-15273]이 제조한 것을 사용하였다. α-hANF 유전자의 염기서열을 분석한 결과 원하는 유전자의 염기서열과 일치함을 확인하였다.

실시예 3. 융합단백질 발현의 확인 및 삼투압 용출법

벡터 pGene-9-ANF는 T7 프로모터의 조절하에 Gene-9-α-hANF 융합단백질을 발현하였다. 플라스미드를 대장균 BL21(DE3)에 형질전환시킨 후 암피실린 저항성을 갖는 한 콜로니를 선별하여 5 ml의 LB 배지(암피실린 50 ug/ml 포함, 37℃)에서 배양하면서 OD₆₀₀이 0.8에 도달하면 이소프로필(Isopropyl)-β-D-티오갈락토시드(thiogalactoside)(IPTG)를 0.5mM 되게 넣는다. 37℃에서 3시간 더 배양한 후 세포를 원심분리법으로 회수하였다. 회수한 세포의 일부를 증류수에 현탁하여 로딩버퍼를 넣고 5분 동안 끓인 후 SDS-PAGE 전기영동을 수행하고 쿠마시 염색하였다(도 3, a의 레인 2). 덴시토미터를 사용하여 젤을 분석하였을 때 전체 세포 단백질의 25% 내지 30%가 발현된 융합단백질임을 알 수 있었다. 한편, 삼투압 용출(Osmotic Shock)법으로 융합단백질의 발현여부와 발현되어 나오는 위치를 확인하였다. 회수한 나머지 세포를 10 mM 트리스-염산, 5 mM EDTA를 포함하는 20% 수크로스 용액에 현탁한 후 얼음 속에 10분간 두었다가, 12,000 rpm에서 2분간 원심분리한 후 재빨리 상등액을 버리고 차가운 증류수를 넣고 격렬하게 현탁하여 얼음속에 10분간 방치하였다. 5분간 원심분리하여 상등액을 취하여 원하는 융합단백질을 용이하게 회수할 수 있었다. 이것을 마찬가지로 SDS-PAGE 전기영동을 수행하고 쿠마시 염색법으로 염색하였다(도 3, a의 레인 3).

한편, 이 단백질을 니트로셀룰로스 막으로 옮긴 후 토끼의 항 Gene-9 단백질 혈청을 이용한 웨스턴 블럿을 수행하여 발색시킴으로써 Gene-9 단백질의 발현을 확인하였다(도 3, b).

실시예 4. Gene-9-α-hANF 융합단백질의 정제

pGene-9-ANF를 포함하는 대장균 BL21 균주를 10ml의 LB 배지(암피실린 포함)에서 밤새 키웠다. 이것을 1 L의 복합배지[Sciloach and Bauer (1975) Biotechnol. Bioeng. 17, 227-239]가 들어있는 발효조에 넣고 37℃에서 키우면서, OD₆₀₀이 50 정도의 값을 보이면 0.5 mM의 농도로 IPTG를 첨가하여 발현을 유도하였다. 주기적으로 영양소를 공급하고 용존 산소량을 25% 내지 30% 되게 유지하여 배양액 1 리터당 180 g의 세포 중량을 얻을 수 있었다. 10 g의 대장균 세포를 100 ml의 50 mM 트리스-아세테이트(pH 8.0)에 현탁한 후 세포 분쇄기로 2회 세포를 파쇄하였다. 15,000g에서 30분간 원심분리한 후 상등액을 셀룰로스 MN 300 막에 통과시켰다. 시료액을 다시 DE 32 SH 셀룰로스 막에 통과시킨 후 흡착되지 않은 분획을 초산으로 pH 5.0되게 만든 후 50 mM 트리스-아세테이트(pH 5.0)용액으로 평형화된 SP-Toyopearl 칼럼(2.5 x 14cm)에 통과시켰다. 같은 완충용액으로 세척한 후 0 내지 200 mM 염화나트륨 농도구배로 용리하였다. 농도구배 80 mM 근방의 분획을 모아서 10 mM 트리스-염산 완충용액(pH 7.2)으로 투석하였다. 융합단백질 시료를 10 mM 트리스-염산 (pH 7.2) 완충용액으로 평형화시킨 Q-세파로즈(sepharose) FF 컬럼에 로딩한 후, 0.1 내지 0.4 M 염화나트륨 농도구배법으로 용출하였다. 융합단백질을 포함하는 분획을 모아서 10 mM 트리스-염산 완충용액(pH 8.0)으로 밤새 투석시켰다.

실시예 5. 엔테로키나아제 절단 반응

10 mM 트리스-염산 완충용액(pH 8.0)으로 투석시킨 융합단백질 1.2 ml(1mg/ml)에 25 ul의 5 M 염화나트륨 용액과 5 ug의 엔테로키나아제(베링거 만하임사)를 넣은 후 25℃에서 2시간 반응시켰다. 최종 농도가 0.2%되게 10% TFA를 첨가하여 반응을 정지시켰다. 10 mM 초산나트륨 완충용액(pH 5.0)으로 평형화시킨 CM-세파로즈 FF(파마시아사) 컬럼에 용액을 통과시켰다. 5 ml의 동일 완충용액으로 세척한 후, 3 ml의 10 mM 인산 완충용액(pH 8.0)으로 차례로 세척하였다. α-hANF 펩타이드는 0.5 M의 염화나트륨을 포함하는 10 mM 인산완충용액(pH 8.0)에 용출되어 나왔다.

실시예 6. 역상 고압액체크로마토그래피(RP-HPLC)를 이용한 정제

CM-세파로즈 FF 칼럼을 통과한 135 ug의 부분 정제된 α-hANF용액에 0.1배 부피의 10% TFA를 넣었다. HPLC 사용조건은 다음과 같다. 사용한 컬럼은 LKB Ultrapack TSK ODS-120T Semi preparative (7.8 x 300mm)이고, 용출은 아세토나이트릴 직선농도구배법(0-60%)을 사용하였는데, 이때의 유속은 분당 1 ml이었다. 엔테로키나아제 반응후 α-hANF의 용출시간(13.77분)은 구입한 α-hANF(베링거 만하임사)의 용출시간(13.32분)과 유사한 값을 보였다(도 4).

실시예 7. 생리활성 측정방법

생체외 바이오어세이법으로 α-hANF의 혈관확장 능력을 측정하였다. 토끼(2.5-3.3 kg)의 흉부경동맥으로 부터 얻은 대동맥관 절편을 크렙스 용액이 담긴 10 ml 용기에 넣고, 37℃에서 95% O₂/5% CO₂의 기체로 불어주었다. 절편을 노르에피네프린(1 uM)으로 수축시킨 후 0.5 g의 하중을 걸었다. 수축작용이 안정화된 후 α-hANF를 가하면서 용량반응곡선을 그렸다(J. M. Van Rossum (1963) Arch. Int. Pharmacodyn. Ther. 143, 299-330, 1963). 도 5에서 정제된 α-hANF의 혈관확장 작용을 엔테로키나아제 반응전의 융합단백질 형태와 비교하여 나타내었다.

이상의 실험 결과로부터 본 발명에 따라 α-hANF를 고수율로 제조할 수 있게 됨에 따라, 장차 고혈압과 그에 따른 심장질환에 대한 항고혈압 나트륨 뇨배출제로서 α-hANF를 임상적으로 유용게 사용할 수 있을 것으로 전망된다.

Claims (2)

1. 미생물에 의한 α-hANF의 제조방법으로서, α-hANF 및 박테리오파지 T7의Gene-9 단백질을 결합햐여 하기 아미노산 및 염기서열을 가진 융합단백질을 코딩하는 유전자로 대장균을 형질 전환시키는 단계; 상기 형질 전환된 대장균을 배양하는 단계 및 상기 배양된 대장균으로부터 생산된 융합단백질을 분리 및 정제하고, Gene-9 단백질 부위를 제거하여 를 수득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 α-hANF의 제조방법:
2. 제 1 항에 있어서, 형질전환 및 배양된 대장균 세포를 완전히 파쇄하지 않고 그 세포 외질(periplasm)만을 취하여 융합단백질을 분리 및 정제한 다음, Gene-9 단백질 부위를 제거하여 α-hANF를 수득하는 것을 특징으로 하는α-hANF의 제조방법.