KR102643064B1 - 발현 수준 및 가용성이 증대된 인간 엔테로키나제 융합 단백질 및 그 제조방법 - Google Patents

발현 수준 및 가용성이 증대된 인간 엔테로키나제 융합 단백질 및 그 제조방법 Download PDF

Info

Publication number
KR102643064B1
KR102643064B1 KR1020210087134A KR20210087134A KR102643064B1 KR 102643064 B1 KR102643064 B1 KR 102643064B1 KR 1020210087134 A KR1020210087134 A KR 1020210087134A KR 20210087134 A KR20210087134 A KR 20210087134A KR 102643064 B1 KR102643064 B1 KR 102643064B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
gly
ala
ekl
trx
leu
Prior art date
Application number
KR1020210087134A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20230006225A (ko
Inventor
이중재
유이슬
권진학
조형준
Original Assignee
강원대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 강원대학교 산학협력단 filed Critical 강원대학교 산학협력단
Priority to KR1020210087134A priority Critical patent/KR102643064B1/ko
Publication of KR20230006225A publication Critical patent/KR20230006225A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102643064B1 publication Critical patent/KR102643064B1/ko

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14Hydrolases (3)
    • C12N9/48Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/24Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • C07K14/245Escherichia (G)
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10Transferases (2.)
    • C12N9/12Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1217Phosphotransferases with a carboxyl group as acceptor (2.7.2)
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12YENZYMES
    • C12Y207/00Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/02Phosphotransferases with a carboxy group as acceptor (2.7.2)
    • C12Y207/02003Phosphoglycerate kinase (2.7.2.3)
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12YENZYMES
    • C12Y304/00Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21009Enteropeptidase (3.4.21.9), i.e. enterokinase
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2319/00Fusion polypeptide
    • C07K2319/35Fusion polypeptide containing a fusion for enhanced stability/folding during expression, e.g. fusions with chaperones or thioredoxin

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 인간 엔테로키나제 경쇄 (EKL)의 촉매 도메인; 티오레독신(Trx); 및 포스포글리세레이트 키나제(PGK) 또는 말토오스 결합 단백질 (MBP)를 포함하는 효소 활성, 발현 수준 및 가용성이 증대된 인간 엔테로키나제 융합 단백질 및 그 제조방법에 관한 것으로, 본 발명의 융합 단백질은 광범위한 다운 스트림 공정에 비용 효율적인 방식으로 재조합 단백질 생산에 사용될 수 있다.

Description

발현 수준 및 가용성이 증대된 인간 엔테로키나제 융합 단백질 및 그 제조방법{Human enterokinase fusion protein with improved expression level and solubility and a preparing method thereof}
본 발명은 발현 수준 및 가용성이 증대된 인간 엔테로키나제 융합 단백질 및 그 제조방법에 관한 것이다.
생물학적 활성의 최적화와 함께, 재조합 활성 단백질의 가용성 발현은 생물학적 시약의 대량 생산 및 비용 효율성 측면에서 생명 공학 분야에서 고려해야 할 주요 문제 중 하나이다. 그러나 대부분 인간 및 기타 진핵 생물에서 유래한 일부 귀중한 단백질은 부적절한 단백질 접힘 및 변형으로 인해 박테리아 발현 시스템을 사용하면서 불용성 및 비활성 응집체를 형성하는 경향이 있다.
이 문제를 해결하기 위해 가용성 재조합 단백질의 효과적이고 안정적인 발현을 달성하기위한 몇 가지 고급 전략이 도입되었다.
융합 태그는 친화성 크로마토그래피에 의해 발현된 단백질의 손쉬운 정제에 활용될 수 있으며, 놀라운 순도로 고 수율 정제가 가능하다. 이러한 장점에도 불구하고 정제된 단백질에서 융합 파트너를 제거하는 것은 재조합 단백질의 생물학적 기능을 억제하고 치료제로 사용될 때 원치 않는 면역 반응을 유발할 수 있기 때문에 추가 적용을 위해 적극 권장된다. 이 과정에서 가용화 단백질과 관심 단백질 사이에 위치한 사전 설계된 펩타이드 링커의 절단에 다양한 엔도펩티다아제가 일반적으로 사용되었다.
가수 분해 효소는 다양한 생화학적 결합의 분해를 촉진하는 가수 분해 효소 그룹이다. 그 중에서 프로테아제(peptidase)는 생물학적 과정을 정밀하게 조절하고 항상성을 유지하기 위해 펩타이드와 단백질에서 아미드 결합을 절단하는데 특화된 역할을 한다. 엔테로 펩티다아제로도 알려진 엔테로키나아제는 세린 프로테아제의 한 부류에 속하며 중쇄 (87kDa)와 경쇄 (26kDa)로 구성된 이황화 결합 이종 이합체 효소이다. 소장에서 enterokinase는 주로 proenzyme trypsinogen을 활성 단백질 분해 효소인 trypsin으로 전환하여 소화계 활성화를 위해 십이지장 브러시 경계에서 생성된다. 흥미롭게도 엔테로키나제의 경쇄는 현저한 표적 특이성과 촉매 활성을 나타내어 펜타 펩티드 서열 Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (DDDDK)를 효과적으로 인식하고 라이신 잔기 뒤에 위치한 결합의 가수 분해를 가능하게 한다.
이 부위 특이적 활성을 통해 enterokinase는 광범위한 온도 (4 ~ 45 °C) 및 pH (4.5 ~ 9.5)에서 안정한 것으로 밝혀졌다. 이러한 특성을 바탕으로 엔테로키나아제는 정제된 재조합 단백질에서 가용화 융합 파트너 또는 친화성 태그를 분리하고 제거하는 과정의 핵심 효소로 널리 적용되고 있다.
그러나 엔테로키나아제 생산에는 몇 가지 어려움이 있다. 이전 연구는 박테리아에서 과발현된 엔테로키나아제가 불용성 응집체에서 우세하게 발현되고 봉입체를 형성하여 가용성 엔테로 키나아제의 생산 수율이 극히 낮다고 보고했다.
이러한 한계를 해결하기 위해 복잡하고 불편한 공정이라는 명백한 단점에도 불구하고 리폴딩 방법을 도입하고 구현했다.
또한 엔테로키나제의 주변 세포질 발현이 시도되었으나 낮은 발현 수준을 보였다.
박테리아에서 재조합 엔테로키나제를 얻기가 어렵기 때문에 대부분의 상용 엔테로키나제는 효모에서 발현되거나 높은 생산 비용으로 동물의 장에서 추출된다.
[선행 특허 문헌]
대한민국 특허공개 번호 제2003-0097036호
본 발명은 상기의 문제점을 해결하고 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 가용성 및 발현 레벨을 증가시킨 신규한 재조합 엔테로키나제 경쇄 (EKL)의 발현을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 인간 엔테로키나제 경쇄 (EKL)의 촉매 도메인;
티오레독신(Trx); 및
포스포글리세레이트 키나제(PGK) 또는 말토오스 결합 단백질 (MBP)를 포함하는 발현 수준 및 가용성이 증대된 인간 엔테로키나제 융합 단백질을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 융합 단백질은 N-말단부터 C-말단 방향으로 포스포글리세레이트 키나제(PGK) 또는 말토오스 결합 단백질 (MBP), 티오레독신(Trx) 및 인간 엔테로키나제 경쇄 (EKL)의 촉매 도메인 순서로 연결된 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 융합 단백질은 티오레독신(Trx) 및 인간 엔테로키나제 경쇄 (EKL) 사이에 서열번호 1의 서열이 삽입된 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 융합 단백질은 포스포글리세레이트 키나제(PGK) 또는 말토오스 결합 단백질 (MBP)와 티오레독신(Trx) 사이에 서열번호 2의 링커 1 및 티오레독신(Trx) 및 인간 엔테로키나제 경쇄 (EKL) 사이에 서열번호 3의 링크 2 서열이 삽입된 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
상기 링커 2는 pET32a 벡터에서 사용하는 Trx와 타겟 단백질 (클로닝 되어질, 여기서는 EK) 사이의 링커에 NdeI site만 mutation되어 있는 서열이다. 본 발명에서 사용한 단백질들은 Trx를 갖고 있게 끔 만들기 위해서 pET32a에 있는 그대로의 서열을 채택하였다. 다만 pET21a 벡터로 옮기기 위해 NdeI 서열만 mutation 시켰으며 (pET21a에 클로닝하기 위해 5' 프라이머에 NdeI 사이트를 이용해야하기 때문에), 링커에서 His-태그를 제거하였다 (His 태그는 C 말단에 노출되기 때문에), 그리고 링커 1의 아미노산 링커는 기존에 MBP-Trx 사이에 어떤 링커도 넣지 않았던 것과 비교할 시 단백질의 안정성에 좋은 영향을 주었는데, 이것은 정제 시 단백질의 aggregation이 생성되지 않게 끔 도와주었다(도시 안함).
또한 PGK-Trx의 경우 기존에 Glycine 하나의 아미노산 링커를 가지고 있을 때보다 정제 시에 좀 더 autocleavage가 잘 일어나는 것을 확인하였으며 이는 활성의 증대로 보여진다(도 9).
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 포스포글리세레이트 키나제(PGK), 티오레독신(Trx) 및 인간 엔테로키나제 경쇄 (EKL)의 촉매 도메인 순서로 연결된 융합 단백질은 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 말토오스 결합 단백질 (MBP), 티오레독신(Trx) 및 인간 엔테로키나제 경쇄 (EKL)의 촉매 도메인 순서로 연결된 융합 단백질은 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또 본 발명은 인간 엔테로키나제 경쇄 (EKL)를 코딩하는 유전자에 티오레독신(Trx) 유전자를 통합하고, 여기에 포스포글리세레이트 키나제 (PGK) 유전자 또는 말토오스 결합 단백질(MBP)를 코딩하는 유전자를 연결하여 구축물을 제조하고, 그 구축물을 증폭하고 그 증폭된 구축물을 재조합 발현 벡터에 클로닝하는 단계를 포함하는 효소 활성, 발현 수준 및 가용성이 증대된 인간 엔테로키나제 융합 단백질 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 구축물은 티오레독신(Trx) 및 인간 엔테로키나제 경쇄 (EKL) 유전자 사이에 서열번호 1의 서열을 코딩하는 유전자가 삽입된 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 구축물은 포스포글리세레이트 키나제(PGK) 또는 말토오스 결합 단백질 (MBP)와 티오레독신(Trx) 사이에 서열번호 2의 링커 1를 코딩하는 유전자 및 티오레독신(Trx) 및 인간 엔테로키나제 경쇄 (EKL) 사이에 서열번호 3의 링크 2를 코딩하는 유전자 서열이 삽입된 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 방법은 상기 재조합 발현 벡터를 숙주 세포에 형질전환시켜 배양하는 단계를 더욱 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 숙주 세포는 원핵 생물인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
이하 본 발명을 설명한다.
본 발명은 여러 용해도 향상 태그를 사용하여 대장균 (E. coli)에서 재조합 엔테로키나제 경쇄 (EKL)의 가용성 발현을 제시한다.
인간 엔테로키나아제는 동물 엔테로키나아제보다 10 배 더 높은 촉매 활성을 갖는 것으로 알려져 있으므로 본 발명에서 인간 엔테로키나아제를 선택했다.
도 6에서 볼 수 있듯이, 변형되지 않은 엔테로키나제는 E. coli에서 낮은 용해도와 낮은 발현 수준을 나타낸다. 발현된 엔테로키나제의 용해도를 높이기 위해 본 발명자들은 말토오스 결합 단백질 (MBP)와 포스포글리세레이트 키나제(PGK) 을 포함하는 두 타입의 융합 단백질을 채택하였다. 티오레독신(Trx)은 엔테로키나아제가 8 개의 시스테인 잔기를 포함하고 있기 때문에 정확한 이황화 결합 형성 및 단백질 폴딩을 촉진하기 위해서 사용되었다.
이러한 단백질 태그는 다양한 조합으로 엔테로키나제의 N- 말단에 유전적으로 통합되었다. 생성된 엔테로키나제는 본 발명에서 상세하게 입증된 바와 같이 상업적 단백질에 필적하는 단백질 분해 활성을 갖는 가용성 형태로서 대장균에서 고도로 발현되었다.
본 발명자들은 thioredoxin, phosphoglycerate kinase 또는 maltose-binding protein으로 구성된 탠덤하게 연결된 용해도 향상제를 사용하여 인간 enterokinase의 효과적인 생산 전략을 제시한다. 생성된 엔테로키나제는 효소 활성을 유지하면서 상당히 향상된 용해도 및 박테리아 발현 수준을 나타내었으며, 이는 융합 단백질의 조합 설계가 박테리아에서 재조합 단백질을 생산하는 효율적인 방법을 제공 할 가능성이 있음을 보여준다.
본 발명의 2 개의 기능화 태그(PGK-Trx 또는 MBP-Trx)를 사용하는 엔테로키나제는 광범위한 다운 스트림 공정, 특히 비용 효율적인 방식으로 실험실 또는 산업 규모에서 태그가 지정되지 않은 재조합 단백질 생산에 사용될 수 있다. 종합하면, 본 발명은 다양한 생물학적 활성 및 가용성 재조합 단백질 생산을 위한 박테리아 발현 시스템의 적용 범위를 비용 효율적인 방식으로 확장하는 데 기여할 수 있다.
도 1은 엔테로키나제의 효과적인 박테리아 발현을 위한 용해 단백질의 조합 접근법의 개략도. 티오레독신은 이황화 결합 형성과 적절한 단백질 폴딩을 촉진하기 위해 선택되었으며, Maltose-binding protein과 Phosphoglycerate kinase는 융합 파트너인 enterokinase의 용해도 향상을 위해 사용되었다.
도 2는 티오레독신 태그가 붙은 엔테로키나제의 발현 및 정제를 나타낸 그림으로
a) 인간 엔테로키나제 경쇄(EKL)는 티오레독신(Trx) 태그와 유전적으로 융합되었다. DDDDK 서열은 자가 절단 후 Trx 단백질로부터 EKL을 분리하기 위해 통합되었다.
b) 박테리아에서 발현된 Trx-EKL 단백질의 SDS-PAGE 분석. 발현된 단백질은 니켈-니트릴로트리아세트산(Ni-NTA) 수지를 사용하여 정제하였다. IX : IPTG 유도 전. IO: IPTG 유도 후. S : 가용성 분획. IB : 봉입체. FT: 니켈-니트릴로트리아세트산(Ni-NTA) 수지에 붙지 않고 흘러나온 분획. W : 세척 분획. E : 용출 분획.
c) 정제된 EKL 단백질의 크기 배제 크로마토그래피 프로파일. 고순도 EKL은 SDS-PAGE 분석으로 확인되었다.
d) 상업적으로 이용 가능한 소 엔테로키나제와 비교하여 생성된 EKL의 단백질 분해 활성을 확인하기 위한 단백질 절단 분석. Trx-fused repebody는 EKL의 기질로 사용되었으며 DDDDK 사이트는 Trx 태그와 repebody 사이에 내부적으로 배치되었다.
도 3은 phosphoglycerate kinase 태그가 붙은 enterokinase의 발현 및 정제를 나타낸 그림으로,
a) 포스포글리세레이트 키나제 (PGK)-융합 엔테로키나제(EKL)의 개략도.
b) PGK-EKL 단백질의 박테리아 발현. 친화성 크로마토그래피 후 정제된 단백질은 SDS-PAGE 분석으로 시각화되었다. 생성된 PGK-EKL은 Trx 태그가 붙은 EKL에 비해 상당히 증가된 용해도를 나타 냈다.
c) 정제된 PGK-EKL 단백질의 크기 배제 크로마토그래피 프로파일. PGK-EKL은 고순도의 단일 피크로 용리되었다.
d) 단백질 절단 분석은 PGK-EKL 단백질의 효소 활성이 부분적으로 감소되었음을 보여 주었다.
도 4는 말토오스 결합 단백질의 유전적 통합을 통한 티오레독신 태그 엔테로키나아제 (Trx-EKL)의 용해도 개선을 나타낸 그림으로,
a) Trx-EKL의 가용성 발현 수준을 높이기 위해 말토오스 결합 단백질 (MBP)을 Trx-EKL 단백질의 N- 말단에 융합시켰다.
b) SDS-PAGE 분석에 의해 현저하게 향상된 용해도 및 MBP 태그 Trx-EKL의 발현 수준이 확인되었다.
c) MBP-Trx-EKL의자가 절단 과정의 최적화. 절단된 EKL 단백질은 실온에서 고도로 얻을 수 있다.
d) MBP-Trx-EKL 단백질의 크기 배제 크로마토그래피 프로파일. 절단 반응 후, MBP-Trx-EKL을 이후 크로마토그래피에 도입하고 유리 EKL을 분해된 MBP-Trx에서 분리했다.
e) 단백질 절단 분석은 MBP-Trx-EKL이 높은 용해도를 갖는 모 Trx-EKL과 유사한 생물학적 활성을 갖는 것으로 나타났다.
도 5는 phosphoglycerate kinase (PGK)와 thioredoxin (Trx)의 유전적 조합을 통해 완전 생리 활성 enterokinase의 가용성 발현 촉진을 나타낸 그림으로,
a) 직렬로 연결된 용해도 향상제(PGK 및 Trx)는 엔테로키나아제 (EKL)의 N- 말단에 유전적으로 통합되었다.
b) PGK-Trx-EKL의 박테리아 발현 및 정제 패턴에 대한 SDS-PAGE 분석.
c) PGK-Trx-EKL 단백질의 크기 배제 크로마토그래피 프로파일. 모든 용출 분획은 SDS-PAGE를 통해 표시되었다.
d) 단백질 절단 분석은 PGK-Trx-EKL이 자발적으로 절단되었다는 것을 나타내고,
e) 모 PGK-EKL에 비해 개선된 단백질 분해 능력을 가짐을 나타냈다.
도 6은 인간 엔테로키나아제 (hEKL)의 세균 발현을 나타낸 그림으로,
a) 인간 엔테로키나제 경쇄 (EKL)를 pET21a 발현 벡터에 유전적으로 삽입했다.
b) SDS-PAGE 분석은 hEKL이 낮은 용해도로 잘 발현되지 않음을 보여 주었다. IX : IPTG 유도 전. IO : IPTG 유도 후. S : 가용성 분획. IB : 봉입체.
도 7은 인간 엔테로 키나아제 (hEKL)의 아미노산 서열 및 경쇄 구조를 나타낸 그림으로, hEKL의 완전한 아미노산 서열. 본 발명에 사용된 hEKL의 촉매 도메인 (Peptidase S1)은 빨간색으로 강조 표시함. 총 4 개의 이황화 결합은 hEKL의 경쇄 (PDB ID 4DGJ)의 3 차원 구조에서 확인됨.
도 8은 본 발명에서 조작된 엔테로 키나제의 완전한 아미노산 서열을 나타낸 표로. 그림에서 Enterokinase 단백질, thioredoxin, phosphoglycerate kinase 및 maltose-binding protein은 각각 파란색, 녹색, 자주색 및 주황색으로 채색됨. Enterokinase 인식 시퀀스는 빨간색으로 강조 표시됨.
도 9는 링커에 따른 효과를 나타낸 그림으로, PGK-Trx의 경우 기존에 Glycine 하나의 아미노산 링커를 가지고 있을 때보다 본 발명의 링커를 삽입한 경우에 정제 시에 좀 더 autocleavage가 잘 일어나는 것을 확인하였으며 이는 활성의 증대로 보여짐.
이하 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재한 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.
실시예1: 엔테로 키나제 단백질 생산을 위한 발현 벡터의 구축
인간 엔테로키나제 경쇄 (EKL)를 코딩하는 유전자를 합성하고(IDTdna, USA), NdeI 절단 부위를 포함하는 하기 서열의 정방향 프라이머와 XhoI가 있는 역방향 프라이머를 사용하여 PCR을 통해 증폭했다.
1) Nde1 EKL (F)
-ATATATCATATGCTATTGTGGGAGGCTCAAACGCTAAGGAAGGGG(서열번호 6)
2) Xho1-EKL (R)
-ATATATCTCGAGGTGAAGAAAGCTCTGAATCCATTCAGTAAAACGACTC(서열번호 7)
적절한 폴딩 및 향상된 용해도를 위해 티오레독신 (Trx) 또는 포스포글리세 레이트 키나제 (PGK) 유전자가 중첩 연장 PCR에 의해 hEKL (Trx-hEKL 및 PGK-hEKL) 전에 추가로 통합되었다.
Trx와 hEKL 사이의 링커는 NdeI 절단 부위의 돌연변이와 링커에서 His-태그의 제거를 제외하고는 pET-32a (+) 벡터 (Novagen, USA)에서 사용된 것과 동일하다. PGK-hEKL에는 두 단백질 사이에 15 개 아미노산 링커가 있다. 또한 적절한 이황화 결합 형성과 높은 용해도를 모두 부여하기 위해 말토오스 결합 단백질 (MBP) 또는 PGK 유전자를 10 개 아미노산 링커로 각 용해 태그와 Trx-hEKL을 PCR 템플릿으로 사용하여 중복 확장 PCR에 의하여 Trx-hEKL(MBP-Trx-hEKL 및 PGK-Trx-hEKL)에 연결했다.
PGK-hEKL을 제외한 모든 구축물은 hEKL 직전에 엔테로키나제 (DDDDK)에 의한 하나의 절단 부위를 보유했다. 이 네 가지 유형의 다르게 태그된 hEKL은 NdeI 절단 부위를 포함하는 순방향 프라이머와 XhoI가 있는 역방향 프라이머를 사용하여 PCR을 통해 최종적으로 증폭되었다. 생성된 5 개의 구축물을 NdeI 및 XhoI 부위 사이의 pET-21a (+) 벡터 (Novagen, USA)에 클로닝했다. 도 8은 본 발명에서 구축된 모든 완전한 아미노산 서열을 보여준다.
상기 본 발명에서 사용된 프라이머 서열정보는 하기와 같다.
1. Trx-EKL
- T7 promoter (F)
CGAAATTAATACGACTCACTATAGGGGAA(서열번호 6)
-EKL_R (overlap)
CGCGTGGCACCAGACCAGAAGAGCCAGAACCAG(서열번호 7)
- EKL_F (overlap)
CCTGGCCGGTTCTGGTTCTGGCTCTTCTGGTCTGGTG(서열번호 8)
-T7 terminator (R)
CCTTTCGGGCTTTGTTAGCAGCCGGAT(서열번호 9)
2. PGK-EKL
-PGK primer (F)
ATATATCATATGTCTGTAATTAAGATGACCGATCTGGATCTTGCTGGGAAACG(서열번호 10)
-PGK linker (R), overlap
ACTACCACCTCCACCTGATCCACCTCCACCGCTACCACCTCCTCCCTTCTTAGCGCGCTCTTCGAGCATCGCTACT(서열번호 11)
-EKL linker (F), overlap
GGAGGAGGTGGTAGCGGTGGAGGTGGATCAGGTGGAGGTGGTAGTATTGTGGGAGGCTCAAACGCTAAGGAAGGGG(서열번호 12)
- Xho1-EKL (R)
ATATATCTCGAGGTGAAGAAAGCTCTGGATCCATTCAGTAAAACG(서열번호 13)
또한 상기 PCR 조건은 하기와 같다.
<PGK-EKL>
1. PCR 조건 ( PGK-linker (22.9 ng/ul) , linker-Enterokinase (12.4 ng/ul) )
5X primestar buffer - 10 ul
dNTP mixture (2.5 mM) - 4 ul
primer (PGK-F , Enterokinase-R) - 각 1 ul (10 pmole/ul)
template - 0. 65 ul (Enterokinase pcr product ) + 0.35 ul (PGK pcr product)
PrimeSTAR HS DNA polymerase ( 2.5 U /ul) 0.5 ul
DDW - 32.5 ul
<Stage 1>
Denaturation 98℃ 10분
<Stage 2 , 30 cycle>
Denaturation 98℃, 10초
Annealing 60℃, 5초
Extension 72℃, 2분
<Stage 3 >
72℃, 2분
4℃
2. Trx-EKL
1. PCR 조건 ( PGK-linker (22.9 ng/ul) , linker-Enterokinase (12.4 ng/ul) )
5X primestar buffer - 10 ul
dNTP mixture (2.5 mM) - 4 ul
primer (Nde1-Trx : T7 promoter / EKL_R, EKL-Xho1 : T7 terminator /EKL_F, overlap 진행시 : T7 promoter / T7 terminator) - 각 1 ul (10 pmole/ul)
template - 1 ul , overlap 시에는 Nde1-Trx 0.5 ul, EKL-Xho1 0.5 ul)
PrimeSTAR HS DNA polymerase ( 2.5 U /ul) 0.5 ul
DDW - 32.5 ul
<Stage 1>
Denaturation 98℃, 10분
<Stage 2 , 30 cycle>
Denaturation 98℃, 10초
Annealing 60℃, 5초
Extension 72℃, 22초(Nde1-Trx) / 52초 (EKL-Xho1) / 1분 10초 (overlap PCR, Nde1-Trx-EKL-Xho1) )
<Stage 3 >
72℃, 2분
4℃
3. <EKL>
1. PCR 조건
5X primestar buffer - 5 ul
dNTP mixture (2.5 mM) - 2 ul
primer (Nde1 EKL (F), Xho1-EKL_R) - 각 0.5 ul (10 pmole/ul)
template - 0.5 ul
PrimeSTAR HS DNA polymerase ( 2.5 U /ul) 0.5 ul
DDW - 16.25 ul
<Stage 1>
Denaturation 98℃, 10분
<Stage 2 , 30 cycle>
Denaturation 98℃, 10초
Annealing 60℃, 5초
Extension 72℃, 44 초
<Stage 3 >
72℃, 2분
4℃
실시예 2: 엔테로키나제의 발현 및 정제
모든 유형의 hEKL 함유 pET21a 플라스미드 벡터를 Origami B (DE3) 컴피턴트 세포로 형질전환하고, 형질전환된 세포를 암피실린(100μg/ml), 카나마이신 (50μg/ml) 및 테트라사이클린(10 μg/ml)이 함유된 LB 브로스 아가 플레이트에서 37 ℃에서 밤새 배양했다.
각 구조물의 단일 콜로니를 10ml LB 브로스 배지에 접종하고 37 ℃에서 밤새 배양하였다. 배양액을 3 종의 항생제가 들어있는 1L LB 배지에 100 배 희석하고, 600 nm (OD600)의 광학 밀도가 0.6-0.8이 될 때까지 진탕 배양기에서 37 ℃에서 더 배양하였다. OD600이 그 지점에 도달했을 때, Isopropyl-ß(IPTG)를 최종 농도 0.1mM에서 첨가하여 단백질 발현을 유도했다. 세포를 18 ℃에서 밤새 더 성장시켰다.
세포 수확은 4 ℃에서 30 분 동안 4000 rpm으로 원심 분리하여 수행하였다. 펠릿화된 세포를 45mL 용해 완충액 (20mM Tris-Cl (pH 8.0), 300mM NaCl 및 10mM 이미다졸)으로 재현탁하고 초음파 처리에 의해 파쇄하였다. 그 파쇄물을 13,000rpm에서 1 시간 동안 4 °C에서 원심 분리하여 상등액을 저장했다.
가용성 hEKL 단백질은 Ni-NTA 아가로스 수지 (Qiagen, 독일) 및 후속적으로 HiLoad 16/60 superdex 75 프랩 등급 컬럼 (GE Healthcare, 미국)을 사용하여 정제되었다. 각 hEKL의 순도는 SDS-PAGE에 의해 측정되었다.
실시예 3: 효소 절단 분석
재조합 hEKL 구축물의 절단 활성을 검출하기 위해 링커에 엔테로키나제 인식 서열 DDDDK를 포함하는 Trx-tagged repebody (Trx-rH9A4)를 기질 단백질로 사용했다.
이 기질 단백질은 rH9A4 유전자가 삽입된 pET32a 벡터를 사용하여 제조되었다. 절단 분석에 사용된 모든 단백질은 PD-10 탈염 컬럼 (GE Healthcare, USA)을 통해 엔테로키나아제 반응 완충액 (20mM Tris-HCl (pH 8.0), 50mM NaCl 및 2mM CaCl2)으로 완충액 교환되었다.
절단 반응은 37 ℃에서 밤새 엔테로키나제 반응 완충액에서 hEKL(370 nM) 및 Trx-rH9A4 (1 mg/ml, 12.3 μM)로 수행되었다. 재조합 hEKL의 상대적 활성을 분석하기 위해 시판 소 엔테로키나아제/PRSS67 단백질 (중국 Sino Biological)을 양성 대조군으로 사용했다. 각 hEKL의 절단 활성은 SDS-PAGE 분석에 의해 결정되었다.
실시예 4: Enterokinases의 세균 발현 수준 측정
가용성 hEKL 단백질의 발현 수준을 평가하기 위해 세포 용해 후 각 재조합 hEKL 단백질의 가용성 분획을 희석하여 SDS-PAGE를 통해 명확한 단백질 밴드를 검출했다.
hEKL 단백질의 정량화를 위해 알려진 농도의 BSA (Thermo Scientific, USA) 단백질 (1.0 mg/ml, 0.5 mg/ml 및 0.25 mg/ml)을 표준으로 사용하고 모든 단백질 샘플의 전기 영동을 수행했다.
SDS-PAGE 후 Image J 프로그램 (National Institutes of Health, USA)으로 겔을 분석하고 BSA 표준 곡선을 사용하여 희석된 가용성 분획에서 엔테로 키나제의 농도를 계산했다. 발현 수준 (mg/L)은 농도에 리터 배양물의 파쇄 부피를 곱하여 결정되었다.
실시예 5: 엔테로키나제의 용해도 결정
가용성 및 불용성 분획에 존재하는 엔테로키나제는 SDS-PAGE를 통해 분석되었다. 불용성 분획을 제조하기 위해 세포 용해 후 원심분리된 펠렛을 용해 완충액과 동일한 부피의 8M 요소 용액에 용해시켰다. 가용성 및 불용성 분획의 Enterokinase 단백질 밴드는 Image J 프로그램을 통해 정량화되었으며 상대 용해도는 다음과 같이 결정되었다.
가용성 분획의 밴드 강도/(가용성 분획의 BI + 불용성 분획의 BI) x 100 %.
상기 실시예의 결과는 하기와 같다.
티오레독신 태그와 융합된 인간 엔테로키나제의 세균 발현
인간 엔테로키나아제(EK)는 중쇄와 경쇄라는 두 가지 별개의 도메인으로 구성된다. 둘 중 경쇄 (26.5kDa)는 특정 펩티드 서열의 효소적 절단을 담당하는 촉매 도메인으로 알려져 있다.
본 발명에서는 박테리아 시스템에서 가용성 발현을 수행하기 위해 엔테로키나제의 시스테인이 풍부한 경쇄를 선택했다(도 7).
첫째, EK 단백질의 촉매 도메인은 단백질 안정성과 활성에 실질적으로 영향을 미치는 이황화 결합의 적절한 형성을 촉진하기 위해 티오레독신(Trx)과 유전적으로 융합되었다(도 2a). 이를 통해 엔테로키나아제의 표적 아미노산 서열 (DDDDK)을 Trx 태그와 EK 단백질 사이에 삽입하여 자가 절단에 의해 온전한 형태의 엔테로키나아제를 얻었다.
생성된 Trx-융합 엔테로키나제 경쇄(이하, 'Trx-EKL'이라 함)는 E. coli 균주 Origami B (DE3)에서 발현되었다. 도 2b에서 입증된 바와 같이, SDS-PAGE 분석은 대부분의 단백질이 이전에 보고된 바와 같이 불용성인 것으로 나타났지만 가용성 분획에서 Trx-EKL 단백질의 유도된 밴드를 나타내었다. 흥미롭게도 Trx-EKL 단백질은 친화성 정제 후 자가 절단을 겪었는데, 이는 정제 과정에서 E. coli 유래 단백질과 엔테로키나아제 간의 비특이적 결합을 제거하는 효과인 것으로 보인다.
단백질 순도를 높이기 위해 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)를 계속 수행하고 고순도 (~ 90 %)의 엔테로키나제의 촉매 서브 유닛을 최종적으로 얻었다(도 2c).
다음으로, 정제된 엔테로키나아제가 생물학적으로 활성이 있는지 확인하기 위해 DDDDK 서열을 포함하는 Trx-repebody 융합 단백질 (Trx-Rb)을 엔테로키나아제 절단 분석을 위한 기질로 사용했다. 결과적으로 생성된 EKL 단백질은 시판되는 것과 유사한 부위 특이적 프로테아제 활성을 갖는 것으로 나타내었다(도 2d).
이러한 결과는 thioredoxin 융합 태그가 완전한 효소 활성을 유지하면서 박테리아에서 난용성 EKL 단백질의 낮은 수준의 발현을 허용한다는 것을 보여준다.
phosphoglycerate kinase를 이용한 인간 enterokinase의 가용성 발현 개선
생명 공학에서 재조합 단백질의 높은 생산 수율을 달성하는 것은 생물학적 제품의 성공적인 개발을 위한 기본 요구 사항이며, 이는 고유한 생물 활성을 유지하는 것만큼이나 중요하다.
불행히도, thioredoxin-fused enterokinase (Trx-EKL)는 E. coli에서 매우 낮은 수준의 발현을 나타냈다. 생산 수율을 향상시키기 위해 E. coli phosphoglycerate kinase (PGK)를 도입하고 enterokinase의 N 말단에 유전적으로 융합했다 (도 3a).
PGK 단백질은 해당 과정에 관여하는 10 가지 효소 중 하나로서, 1,3- 비스 포스포글리세레이트에서 3-포스포글리세레이트로의 전환에 참여한다. 더 중요한 것은 다른 해당 효소와 마찬가지로 PGK 단백질은 박테리아에서 높은 수준으로 구성 적으로 발현된다는 것이다.
본 발명자들은 Origami B 숙주 세포에서 PGK 융합 엔테로키나아제(PGK-EKL)를 발현했다. 예상대로 PGK-EKL 단백질의 용해도는 Trx-EKL에 비해 극적으로 향상되었다(도 3b 및 표 1). 그러나 대부분의 가용성 단백질은 Ni-NTA 친화성 컬럼에 결합하지 않았으며 결합 완충액으로 세척되었다. 결과는 PGK 단백질이 적절한 단백질 폴딩에 크게 기여하지 않기 때문에 C- 말단 his-tag가 부적절하게 폴딩된 단백질에 묻혀 Ni-NTA 수지에 PGK-EKL이 제대로 고정되지 않을 수 있음을 시사한다.
세척 후, 결합된 PGK-EKL 단백질을 용리하고 후속 정제를 위해 SEC에 도입했다. 결과적으로 정제된 PGK-EKL은 고순도(~ 95 %)의 단일 및 좁은 피크로 용리된 것으로 보인다(도 3c). 최종적으로 정제된 PGK-EKL은 단백질 절단 분석을 수행하였다. 도 3d에서 볼 수 있듯이, PGK-EKL과의 절단 반응 후에 전체 형태의 기질 단백질의 현저한 양이 검출된 반면 거의 모든 단백질은 Trx-EKL에 의해 절단되었다.
단백질 접힘 및 구조적 완전성에서 이황화 결합의 중요성을 고려할 때, PGK-EKL 단백질의 기능 감소는 PGK가 이황화 결합이 풍부한 단백질을 생산하는 데있어 융합 파트너로서의 한계가 있음을 분명히 나타낸다.
단백질 크기 (kDa) 발현 수준 (mg/L culture) Solubility (%)
EKL 26.5 N.D N.D
Trx-EKL 43.5 N.D N.D
PGK-EKL 68.8 101.33 92.5
MBP-Trx-EKL 84.6 142.20 94.5
PGK-Trx-EKL 84.7 175.95 95.0
표 1은 본 발명에서 조작된 엔테로키나제의 생화학적 특성을 나타낸 표로, EKL : Enterokinase 경쇄, Trx : Thiroredoxin, PGK : Phosphoglycerate kinse, MBP : Maltose 결합 단백질을 나타내며, 가용성 분획 (S) 및 봉입체 (IB)에 대한 SDS-PAGE의 상대 밴드 강도를 비교하여 각 단백질의 용해도를 계산함.
기능성 인간 엔테로키나아제의 최적화된 발현을 위한 이중 용해도 향상 태그의 유전적 통합
위에 제시된 결과를 고려할 때, 이황화 결합의 형성은 박테리아에서 생리 활성 엔테로키나아제의 효과적인 발현을 위한 용해도 향상과 함께 매우 중요하다. 티 오레독신의 경우 EKL의 가용성 발현을 실질적으로 증가 시키지는 않았지만 생성된 단백질은 생물학적 활성을 완전히 유지하는 것으로 나타났다.
따라서 우리는 Trx 융합 형태를 기반으로 두 가지 추가 유형의 EKL 단백질을 구성했다(도 1).
본 발명자들은 간단한 유전자 융합을 통해 각 단백질을 활용함으로써 구조적, 기능적으로 접힌 엔테로키나아제를 효과적으로 생산할 수 있다고 가정했다. 이 개념을 기반으로 각 용해도 향상제(MBP 또는 PGK)는 Trx-EKL의 N-말단 끝에 유전적으로 도입되어 생체 활성 엔테로키나제의 고수준 가용성 발현을 달성했다 (도 4a 및 도 5a). 도 4b에 제시된 바와 같이, MBP 태그 Trx-EKL은 봉입체의 형성을 무시할 수 있는 수준으로 현저하게 향상된 용해도를 나타낸다.
정제 후 MBP-Trx-EKL의 단백질 분해 능력은 자가 절단 분석을 통해 검증되었다(도 4c). 두 가지 다른 온도 조건에서 MBP-Trx-EKL은 실온(RT)에서 효과적인 자가 절단을 겪었지만 절단된 EKL은 4º에서 고도로 응집되었다. 따라서 RT에서 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)를 사용하여 추가 정제 단계를 수행했다. 자가 절단 MBP-Trx-EKL은 두 개의 별개의 피크로 분리되었고 절단된 EKL은 초기 용리 피크 (분획 A)에서 관찰되었다(도 4d).
결과적인 EKL은 Trx-EKL과 유사한 모든 주어진 기질 단백질을 효과적으로 절단했다(도 4e). 이러한 결과는 두 가지 융합 단백질 (MBP 및 Trx)의 협력 작용이 박테리아에서 생물학적으로 활성인 인간 엔테로키나아제의 높은 수준의 가용성 발현으로 이어질 수 있음을 의미한다.
또한, 본 발명자들은 가용화 태그로 PGK 단백질을 사용하여 Trx-EKL을 유전자 조작했다. SDS-PAGE 분석은 PGK-융합 Trx-EKL (PGK-Trx-EKL)이 가용성 형태로 고도로 발현되고 Trx-EKL 단백질에 비해 불용성 응집체가 극적으로 감소했음을 보여주었다(도 5b).
SEC를 사용하여 PGK-Trx-EKL의 순도를 더욱 높였고 생성된 단백질은 고순도의 단일 피크로 용리되었다(도 5c).
버퍼를 EKL 반응 버퍼로 변경한 후 거의 모든 PGK-Trx-EKL 단백질이 자발적으로 PGK-Trx 및 EKL 단백질로 절단되는 것으로 확인되었다(도 5d).
도 3d에서 볼 수 있듯이, PGK 태그 EKL (PGK-EKL)의 단백질 분해 활성은 다른 조작된 EKL 단백질보다 상대적으로 낮았다. Trx 태그에 의해 촉진된 이황화 결합 형성이 PGK 태그 EKL의 생물학적 기능을 복원 할 수 있는지 확인하기 위해 단백질 절단 분석 (도 5e)을 수행하고 Trx 태그된 PGK-EKL 단백질이 부모 형태(PGK-EKL)보다 단백질 분해 활성이 더 높다는 것을 발견했다.
즉, 도 3d (PGK-)와 5e (PGK-Trx-)의 차이를 비교하여 보면, 상기에 기술한 것과 같이 PGK-Trx 혹은 MBP-Trx, 그리고 Trx만 달린 것 모두 bovine의 EK와 비슷한 활성을 보여주었으나, PGK-단독의 EK 경우는 활성이 떨어졌는데 PGK-Trx-EK를 이용한 경우 리피바디가 96.5% 이상 잘린 것이 얻어진 반면, PGK-EK를 이용한 경우, 65%만 잘린 것을 얻을 수 있었다.
이 결과를 바탕으로, 본 발명자들은 각 융합 단백질이 용해도 및 활성을 포함하여 EKL의 고유 특성에 심오하고 협력적인 효과를 가지고 있음을 입증했다.
<110> KANGWON NATIONAL UNIVERSITY RESEARCH & UNIVERSITY-INDUSTRY COOPERATION FOUNDATION <120> Human enterokinase fusion protein with improved expression level and solubility and a preparing method thereof <130> P21-0031HS <160> 13 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> enzyme recognition sequence <400> 1 Asp Asp Asp Asp Lys 1 5 <210> 2 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker 1 <400> 2 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 3 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker 2 <400> 3 Gly Ser Gly Ser Gly Ser Ser Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser Gly Met 1 5 10 15 Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln His Met Asp Ser Pro 20 25 30 Asp Leu Gly Thr 35 <210> 4 <211> 788 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Phosphoglycerate kinase-tagged Trx-EKL (PGK-Trx-EKL) <400> 4 Met Ser Val Ile Lys Met Thr Asp Leu Asp Leu Ala Gly Lys Arg Val 1 5 10 15 Phe Ile Arg Ala Asp Leu Asn Val Pro Val Lys Asp Gly Lys Val Thr 20 25 30 Ser Asp Ala Arg Ile Arg Ala Ser Leu Pro Thr Ile Glu Leu Ala Leu 35 40 45 Lys Gln Gly Ala Lys Val Met Val Thr Ser His Leu Gly Arg Pro Thr 50 55 60 Glu Gly Glu Tyr Asn Glu Glu Phe Ser Leu Leu Pro Val Val Asn Tyr 65 70 75 80 Leu Lys Asp Lys Leu Ser Asn Pro Val Arg Leu Val Lys Asp Tyr Leu 85 90 95 Asp Gly Val Asp Val Ala Glu Gly Glu Leu Val Val Leu Glu Asn Val 100 105 110 Arg Phe Asn Lys Gly Glu Lys Lys Asp Asp Glu Thr Leu Ser Lys Lys 115 120 125 Tyr Ala Ala Leu Cys Asp Val Phe Val Met Asp Ala Phe Gly Thr Ala 130 135 140 His Arg Ala Gln Ala Ser Thr His Gly Ile Gly Lys Phe Ala Asp Val 145 150 155 160 Ala Cys Ala Gly Pro Leu Leu Ala Ala Glu Leu Asp Ala Leu Gly Lys 165 170 175 Ala Leu Lys Glu Pro Ala Arg Pro Met Val Ala Ile Val Gly Gly Ser 180 185 190 Lys Val Ser Thr Lys Leu Thr Val Leu Asp Ser Leu Ser Lys Ile Ala 195 200 205 Asp Gln Leu Ile Val Gly Gly Gly Ile Ala Asn Thr Phe Ile Ala Ala 210 215 220 Gln Gly His Asp Val Gly Lys Ser Leu Tyr Glu Ala Asp Leu Val Asp 225 230 235 240 Glu Ala Lys Arg Leu Leu Thr Thr Cys Asn Ile Pro Val Pro Ser Asp 245 250 255 Val Arg Val Ala Thr Glu Phe Ser Glu Thr Ala Pro Ala Thr Leu Lys 260 265 270 Ser Val Asn Asp Val Lys Ala Asp Glu Gln Ile Leu Asp Ile Gly Asp 275 280 285 Ala Ser Ala Gln Glu Leu Ala Glu Ile Leu Lys Asn Ala Lys Thr Ile 290 295 300 Leu Trp Asn Gly Pro Val Gly Val Phe Glu Phe Pro Asn Phe Arg Lys 305 310 315 320 Gly Thr Glu Ile Val Ala Asn Ala Ile Ala Asp Ser Glu Ala Phe Ser 325 330 335 Ile Ala Gly Gly Gly Asp Thr Leu Ala Ala Ile Asp Leu Phe Gly Ile 340 345 350 Ala Asp Lys Ile Ser Tyr Ile Ser Thr Gly Gly Gly Ala Phe Leu Glu 355 360 365 Phe Val Glu Gly Lys Val Leu Pro Ala Val Ala Met Leu Glu Glu Arg 370 375 380 Ala Lys Lys Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 385 390 395 400 Met Ser Asp Lys Ile Ile His Leu Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr Asp 405 410 415 Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Ile Leu Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp 420 425 430 Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala Pro Ile Leu Asp Glu Ile Ala Asp 435 440 445 Glu Tyr Gln Gly Lys Leu Thr Val Ala Lys Leu Asn Ile Asp Gln Asn 450 455 460 Pro Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Gly Ile Arg Gly Ile Pro Thr Leu Leu 465 470 475 480 Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala Ala Thr Lys Val Gly Ala Leu Ser 485 490 495 Lys Gly Gln Leu Lys Glu Phe Leu Asp Ala Asn Leu Ala Gly Ser Gly 500 505 510 Ser Gly Ser Ser Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser Gly Met Lys Glu Thr 515 520 525 Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln His Met Asp Ser Pro Asp Leu Gly 530 535 540 Thr Asp Asp Asp Asp Lys Ala Met Ala Ile Val Gly Gly Ser Asn Ala 545 550 555 560 Lys Glu Gly Ala Trp Pro Trp Val Val Gly Leu Tyr Tyr Gly Gly Arg 565 570 575 Leu Leu Cys Gly Ala Ser Leu Val Ser Ser Asp Trp Leu Val Ser Ala 580 585 590 Ala His Cys Val Tyr Gly Arg Asn Leu Glu Pro Ser Lys Trp Thr Ala 595 600 605 Ile Leu Gly Leu His Met Lys Ser Asn Leu Thr Ser Pro Gln Thr Val 610 615 620 Pro Arg Leu Ile Asp Glu Ile Val Ile Asn Pro His Tyr Asn Arg Arg 625 630 635 640 Arg Lys Asp Asn Asp Ile Ala Met Met His Leu Glu Phe Lys Val Asn 645 650 655 Tyr Thr Asp Tyr Ile Gln Pro Ile Cys Leu Pro Glu Glu Asn Gln Val 660 665 670 Phe Pro Pro Gly Arg Asn Cys Ser Ile Ala Gly Trp Gly Thr Val Val 675 680 685 Tyr Gln Gly Thr Thr Ala Asn Ile Leu Gln Glu Ala Asp Val Pro Leu 690 695 700 Leu Ser Asn Glu Arg Cys Gln Gln Gln Met Pro Glu Tyr Asn Ile Thr 705 710 715 720 Glu Asn Met Ile Cys Ala Gly Tyr Glu Glu Gly Gly Ile Asp Ser Cys 725 730 735 Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Met Cys Gln Glu Asn Asn Arg Trp 740 745 750 Phe Leu Ala Gly Val Thr Ser Phe Gly Tyr Lys Cys Ala Leu Pro Asn 755 760 765 Arg Pro Gly Val Tyr Ala Arg Val Ser Arg Phe Thr Glu Trp Ile Gln 770 775 780 Ser Phe Leu His 785 <210> 5 <211> 767 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Maltose binding protein-tagged Trx-EKL (MBP-Trx-EKL) <400> 5 Met Lys Ile Glu Glu Gly Lys Leu Val Ile Trp Ile Asn Gly Asp Lys 1 5 10 15 Gly Tyr Asn Gly Leu Ala Glu Val Gly Lys Lys Phe Glu Lys Asp Thr 20 25 30 Gly Ile Lys Val Thr Val Glu His Pro Asp Lys Leu Glu Glu Lys Phe 35 40 45 Pro Gln Val Ala Ala Thr Gly Asp Gly Pro Asp Ile Ile Phe Trp Ala 50 55 60 His Asp Arg Phe Gly Gly Tyr Ala Gln Ser Gly Leu Leu Ala Glu Ile 65 70 75 80 Thr Pro Asp Lys Ala Phe Gln Asp Lys Leu Tyr Pro Phe Thr Trp Asp 85 90 95 Ala Val Arg Tyr Asn Gly Lys Leu Ile Ala Tyr Pro Ile Ala Val Glu 100 105 110 Ala Leu Ser Leu Ile Tyr Asn Lys Asp Leu Leu Pro Asn Pro Pro Lys 115 120 125 Thr Trp Glu Glu Ile Pro Ala Leu Asp Lys Glu Leu Lys Ala Lys Gly 130 135 140 Lys Ser Ala Leu Met Phe Asn Leu Gln Glu Pro Tyr Phe Thr Trp Pro 145 150 155 160 Leu Ile Ala Ala Asp Gly Gly Tyr Ala Phe Lys Tyr Glu Asn Gly Lys 165 170 175 Tyr Asp Ile Lys Asp Val Gly Val Asp Asn Ala Gly Ala Lys Ala Gly 180 185 190 Leu Thr Phe Leu Val Asp Leu Ile Lys Asn Lys His Met Asn Ala Asp 195 200 205 Thr Asp Tyr Ser Ile Ala Glu Ala Ala Phe Asn Lys Gly Glu Thr Ala 210 215 220 Met Thr Ile Asn Gly Pro Trp Ala Trp Ser Asn Ile Asp Thr Ser Lys 225 230 235 240 Val Asn Tyr Gly Val Thr Val Leu Pro Thr Phe Lys Gly Gln Pro Ser 245 250 255 Lys Pro Phe Val Gly Val Leu Ser Ala Gly Ile Asn Ala Ala Ser Pro 260 265 270 Asn Lys Glu Leu Ala Lys Glu Phe Leu Glu Asn Tyr Leu Leu Thr Asp 275 280 285 Glu Gly Leu Glu Ala Val Asn Lys Asp Lys Pro Leu Gly Ala Val Ala 290 295 300 Leu Lys Ser Tyr Glu Glu Glu Leu Ala Lys Asp Pro Arg Ile Ala Ala 305 310 315 320 Thr Met Glu Asn Ala Gln Lys Gly Glu Ile Met Pro Asn Ile Pro Gln 325 330 335 Met Ser Ala Phe Trp Tyr Ala Val Arg Thr Ala Val Ile Asn Ala Ala 340 345 350 Ser Gly Arg Gln Thr Val Asp Glu Ala Leu Lys Asp Ala Gln Thr Gly 355 360 365 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Ser Asp Lys Ile 370 375 380 Ile His Leu Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr Asp Val Leu Lys Ala Asp 385 390 395 400 Gly Ala Ile Leu Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp Cys Gly Pro Cys Lys 405 410 415 Met Ile Ala Pro Ile Leu Asp Glu Ile Ala Asp Glu Tyr Gln Gly Lys 420 425 430 Leu Thr Val Ala Lys Leu Asn Ile Asp Gln Asn Pro Gly Thr Ala Pro 435 440 445 Lys Tyr Gly Ile Arg Gly Ile Pro Thr Leu Leu Leu Phe Lys Asn Gly 450 455 460 Glu Val Ala Ala Thr Lys Val Gly Ala Leu Ser Lys Gly Gln Leu Lys 465 470 475 480 Glu Phe Leu Asp Ala Asn Leu Ala Gly Ser Gly Ser Gly Ser Ser Gly 485 490 495 Leu Val Pro Arg Gly Ser Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe 500 505 510 Glu Arg Gln His Met Asp Ser Pro Asp Leu Gly Thr Asp Asp Asp Asp 515 520 525 Lys Ala Met Ala Ile Val Gly Gly Ser Asn Ala Lys Glu Gly Ala Trp 530 535 540 Pro Trp Val Val Gly Leu Tyr Tyr Gly Gly Arg Leu Leu Cys Gly Ala 545 550 555 560 Ser Leu Val Ser Ser Asp Trp Leu Val Ser Ala Ala His Cys Val Tyr 565 570 575 Gly Arg Asn Leu Glu Pro Ser Lys Trp Thr Ala Ile Leu Gly Leu His 580 585 590 Met Lys Ser Asn Leu Thr Ser Pro Gln Thr Val Pro Arg Leu Ile Asp 595 600 605 Glu Ile Val Ile Asn Pro His Tyr Asn Arg Arg Arg Lys Asp Asn Asp 610 615 620 Ile Ala Met Met His Leu Glu Phe Lys Val Asn Tyr Thr Asp Tyr Ile 625 630 635 640 Gln Pro Ile Cys Leu Pro Glu Glu Asn Gln Val Phe Pro Pro Gly Arg 645 650 655 Asn Cys Ser Ile Ala Gly Trp Gly Thr Val Val Tyr Gln Gly Thr Thr 660 665 670 Ala Asn Ile Leu Gln Glu Ala Asp Val Pro Leu Leu Ser Asn Glu Arg 675 680 685 Cys Gln Gln Gln Met Pro Glu Tyr Asn Ile Thr Glu Asn Met Ile Cys 690 695 700 Ala Gly Tyr Glu Glu Gly Gly Ile Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly 705 710 715 720 Gly Pro Leu Met Cys Gln Glu Asn Asn Arg Trp Phe Leu Ala Gly Val 725 730 735 Thr Ser Phe Gly Tyr Lys Cys Ala Leu Pro Asn Arg Pro Gly Val Tyr 740 745 750 Ala Arg Val Ser Arg Phe Thr Glu Trp Ile Gln Ser Phe Leu His 755 760 765 <210> 6 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 cgaaattaat acgactcact ataggggaa 29 <210> 7 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 cgcgtggcac cagaccagaa gagccagaac cag 33 <210> 8 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 cctggccggt tctggttctg gctcttctgg tctggtg 37 <210> 9 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 cctttcgggc tttgttagca gccggat 27 <210> 10 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 atatatcata tgtctgtaat taagatgacc gatctggatc ttgctgggaa acg 53 <210> 11 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 actaccacct ccacctgatc cacctccacc gctaccacct cctcccttct tagcgcgctc 60 ttcgagcatc gctact 76 <210> 12 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 ggaggaggtg gtagcggtgg aggtggatca ggtggaggtg gtagtattgt gggaggctca 60 aacgctaagg aagggg 76 <210> 13 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 atatatctcg aggtgaagaa agctctggat ccattcagta aaacg 45

Claims (12)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 인간 엔테로키나제 경쇄 (EKL)를 코딩하는 유전자에 티오레독신(Trx) 유전자를 통합하고, 여기에 포스포글리세레이트 키나제 (PGK) 유전자를 연결하여 구축물을 제조하고, 그 구축물을 증폭하고 그 증폭된 구축물을 재조합 발현 벡터에 클로닝하는 단계를 포함하는 인간 엔테로키나제 융합 단백질의 발현 수준 및 가용성을 증대시키는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 구축물은 티오레독신(Trx) 및 인간 엔테로키나제 경쇄 (EKL) 유전자 사이에 서열번호 1의 서열을 코딩하는 유전자가 삽입된 것을 특징으로 하는 인간 엔테로키나제 융합 단백질의 발현 수준 및 가용성을 증대시키는 방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 구축물은 포스포글리세레이트 키나제(PGK)와
    티오레독신(Trx) 사이에 서열번호 2의 링커 1를 코딩하는 유전자 및 티오레독신(Trx) 및 인간 엔테로키나제 경쇄 (EKL) 사이에 서열번호 3의 링크 2를 코딩하는 유전자 서열이 삽입된 것을 특징으로 하는 인간 엔테로키나제 융합 단백질의 발현 수준 및 가용성을 증대시키는 방법.
  11. 인간 엔테로키나제 경쇄 (EKL)를 코딩하는 유전자에 티오레독신(Trx) 유전자를 통합하고, 여기에 포스포글리세레이트 키나제 (PGK) 유전자를 연결하여 구축물을 제조하고, 그 구축물을 증폭하고 그 증폭된 구축물을 재조합 발현 벡터에 클로닝하는 단계를 포함하고,
    여기서, 상기 구축물은 티오레독신(Trx) 및 인간 엔테로키나제 경쇄 (EKL) 유전자 사이에 서열번호 1의 서열을 코딩하는 유전자가 삽입되고,
    상기 구축물은 포스포글리세레이트 키나제(PGK)와
    티오레독신(Trx) 사이에 서열번호 2의 링커 1를 코딩하는 유전자 및 티오레독신(Trx) 및 인간 엔테로키나제 경쇄 (EKL) 사이에 서열번호 3의 링크 2를 코딩하는 유전자 서열이 삽입되는 것을 특징으로 하는 인간 엔테로키나제 융합 단백질의 발현 수준 및 가용성을 증대시키는 방법.
  12. 삭제
KR1020210087134A 2021-07-02 2021-07-02 발현 수준 및 가용성이 증대된 인간 엔테로키나제 융합 단백질 및 그 제조방법 KR102643064B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020210087134A KR102643064B1 (ko) 2021-07-02 2021-07-02 발현 수준 및 가용성이 증대된 인간 엔테로키나제 융합 단백질 및 그 제조방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020210087134A KR102643064B1 (ko) 2021-07-02 2021-07-02 발현 수준 및 가용성이 증대된 인간 엔테로키나제 융합 단백질 및 그 제조방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20230006225A KR20230006225A (ko) 2023-01-10
KR102643064B1 true KR102643064B1 (ko) 2024-02-29

Family

ID=84893683

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020210087134A KR102643064B1 (ko) 2021-07-02 2021-07-02 발현 수준 및 가용성이 증대된 인간 엔테로키나제 융합 단백질 및 그 제조방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR102643064B1 (ko)

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100690230B1 (ko) * 2005-06-16 2007-03-12 학교법인 성균관대학 단백질의 가용성 발현을 위한 고효율 발현벡터 시스템
KR101321890B1 (ko) * 2012-04-06 2013-10-28 (주)엔비엠 인간 엔테로키나아제 경사슬 단백질을 생산하는 식물체 및 이의 용도

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Biotechnology and Bioengineering, 2012, Vol.109, No.2, pp.325-335 1부.*
Protein Expression and Purification, 2003, Vol.31, pp.133-139 1부.*

Also Published As

Publication number Publication date
KR20230006225A (ko) 2023-01-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR960011919B1 (ko) IgA 단백질 분해효소를 이용한 재조합 단백질의 효소적 절단방법
JP5107055B2 (ja) ジスルフィド架橋二重鎖型のタンパク質の組換え発現法
EP0305500B1 (en) Process for the purification of recombinant polypeptides
JP4857279B2 (ja) カルボキシ末端をアミド化したペプチドの製造方法
US20160083713A1 (en) Novel peptidyl alpha-hydroxyglycine alpha-amidating lyases
Amarasinghe et al. The use of affinity tags to overcome obstacles in recombinant protein expression and purification
US10000544B2 (en) Process for production of insulin and insulin analogues
Yuan et al. Expression, purification, and characterization of a biologically active bovine enterokinase catalytic subunit in Escherichia coli
Kwon et al. A combination strategy of solubility enhancers for effective production of soluble and bioactive human enterokinase
KR102643064B1 (ko) 발현 수준 및 가용성이 증대된 인간 엔테로키나제 융합 단백질 및 그 제조방법
JP2016518855A (ja) 融合プロテアーゼ
JP7449000B2 (ja) 可溶性の組換えタンパク質の生成
KR20230165291A (ko) 폴리펩티드의 발현 증가를 위한 구축물 및 방법
EP1981978B1 (en) Affinity polypeptide for purification of recombinant proteins
CN114381471A (zh) 一种辅助蛋白在重组蛋白生产中的应用及融合表达系统
CN107586330B (zh) 替度鲁肽串联多肽及替度鲁肽制备方法
IL100623A (en) PROCESS FOR THE PRODUCTION OF RECOMBINANT IgA PROTEASE AND THE IgA PROTEASE PRODUCED THEREBY
Krachmarova et al. Production of Functional Recombinant Human Interferon-gamma by RTX CPD-fusion Technology
KR20170089583A (ko) 항균 펩타이드를 포함하는 불용성 융합단백질 및 이를 이용한 항균 펩타이드의 제조 방법
KR101814048B1 (ko) 대량 생산이 가능하도록 개선된 경구투여용 트롬보포이에틴 및 이의 대량 생산공정
WO2022263559A1 (en) Production of cross-reactive material 197 fusion proteins
US20230242961A1 (en) Production of Soluble Recombinant Protein
CN114181993A (zh) 产生基于类泛素或泛素蛋白的生化工具的方法
WO2009005201A1 (en) A method for producing stromal cell-derived factor-1a as an active soluble protein form
JPH0740926B2 (ja) 形質転換体およびペプチド前駆体タンパク質の製造方法

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant