KR20170089583A

KR20170089583A - 항균 펩타이드를 포함하는 불용성 융합단백질 및 이를 이용한 항균 펩타이드의 제조 방법

Info

Publication number: KR20170089583A
Application number: KR1020160009970A
Authority: KR
Inventors: 박찬규
Original assignee: 건국대학교 산학협력단
Priority date: 2016-01-27
Filing date: 2016-01-27
Publication date: 2017-08-04
Also published as: US20210032295A1; EP3409685A4; CN108779152B; WO2017131279A1; EP3409685B1; US11230575B2; CN108779152A; EP3409685A1; KR101830792B1

Abstract

본 발명은 항균 펩타이드의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 항균 펩타이드 유전자를 대장균 내에서 불용성으로 발현되는 녹색형광단백질 유전자와 융합시켜 대장균에 도입 및 발현시킨 후 녹색형광단백질을 제거하고 항균 펩타이드를 수득하는 과정을 통하여 항균 펩타이드를 대량으로 제조하는 방법을 포함한다.
상기와 같은 본 발명에 따르면, 제조공정이 간단하고 경제적이며 생산 수율이 높은 항균 펩타이드의 제조방법을 제공함으로써, 다중약물내성 미생물이 급증하고 있어, 이들 내성 균주를 퇴치할 수 있는 새로운 작용 메커니즘을 가지는 항생제의 개발이 시급한 제약 및 사료 산업에 기존의 항생제를 대체할 천연 항생제를 제공하는 효과가 있다.
또한 본 발명에 따르면, 기존의 시안화브롬을 이용하는 대신 산처리를 통해 아미노산을 절단하는 방법을 이용함으로써 불용성 단백질로부터 목적 단백질을 정제하는 데 있어 비용을 절감하고 공정의 위험성을 낮추며 더욱 신속하게 진행할 수 있는 효과가 있다.

Description

항균 펩타이드를 포함하는 불용성 융합단백질 및 이를 이용한 항균 펩타이드의 제조 방법{METHOD FOR PRODUCING ANTIMICROBIAL PEPTIDE USING INSOLUBLE FUSION PROTEIN CONTAINING ANTIMICROBIAL PEPTIDE}

본 발명은 녹색형광단백질(Green Fluorescent protein, GFP)과 항균 펩타이드(Antimicrobial peptide, AMP)가 결합된 융합단백질 및 이를 이용한 항균 펩타이드의 대량 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 항균 펩타이드를 대장균 내에서 불용성으로 발현되는 녹색형광단백질과 융합시켜 대장균에 도입 및 발현시킨 후 녹색형광단백질을 제거하고 항균 펩타이드를 수득하는 과정을 통하여 항균 펩타이드를 대량으로 제조하는 방법에 관한 것이다.

미생물을 비롯하여 고등생물에 이르기까지 모든 생물은 외부의 유해환경으로부터 자신을 보호하기 위해 자기 자신만의 고유 방어체계를 갖추고 있다. 주변에 존재하는 미생물과 심지어 균사류에 이르기까지 항균활성을 보이는 자기 방어 물질인 항균 펩타이드를 생산하여 선천적 면역체계를 갖춤으로써, 항원-항체 반응 이전에 일차적으로 외부 유해요소로부터 자기 자신을 보호하는 것으로 알려져 있다.

한편, 인류는 페니실린 이후 수많은 종류의 항생제가 개발되어 사용되어 왔으나, 근래에 들어서 이들 항생제에 내성을 가지는 균주들이 과거와는 달리 빠른 속도로 등장하고 있다. 특히 서로 다른 두 개 이상의 항생, 항균제에 내성을 나타내는 다중약물내성 미생물이 급증하고 있어, 이들 내성 균주를 퇴치할 수 있는 새로운 작용 메커니즘을 가지는 항생제의 개발이 시급하다.

이로 인해 천연에 존재하는 항균 펩타이드는 새로운 항생제의 후보물질로서 대두되었고, 이는 기존에 사용되고 있는 화합물성 항생제와 다른 작용 기작을 통하여 항균 활성을 나타내므로 항생제 내성 균주에 대한 문제를 해결할 수 있을 것으로 기대되고 있다.

이에 따라 자연계에 존재하는 항균 펩타이드들을 그대로 이용하거나 유사체들을 합성하여 이용하고자 하는 시도들이 있었으나, 항균 펩타이드는 항균 활성의 증가와 동시에 세포독성의 척도인 적혈구 용혈현상도 동시에 증가시키기 때문에 실제적인 응용에 많은 제약을 받고 있다.

또한, 항균 펩타이드의 상용화란 측면에서 가장 중요한 요소인 대량생산을 위한 연구도 다양하게 시도되어 왔으나 현재까지 산업적으로 활용할만한 수준에 이르지 못하였다. 왜냐하면 화학합성으로 항균 펩타이드를 생산하는 경우에는 경제성이 낮고, 미생물을 이용한 유전공학적 기법으로 항균 펩타이드를 생산하는 경우에는 경제성은 있으나, 발현된 항균 펩타이드가 숙주 미생물의 성장을 저해하여 펩타이드 생산의 수율이 매우 낮다는 문제점이 있기 때문이다.

이에 따라, 본 발명자는 유전자 조작이 용이하고 경제적인 대장균 발현 시스템을 이용하되, 대장균 내에서 불용성으로 발현되는 녹색형광단백질을 지지체로서 항균 펩타이드에 결합시킨 융합단백질의 발현을 유도한 후 상기 융합단백질로부터 항균 펩타이드만을 분리하는 과정을 통하여 펩타이드를 제조함으로써, 단백질 가수분해로 인한 항균 펩타이드 생성 저해 및 항균 펩타이드가 대장균의 성장을 저해하여 펩타이드의 생산 수율이 낮아지는 문제를 해결함으로써, 간단하고 경제적으로 항균 펩타이드를 대량 제조하는 방법에 관한 발명을 완성하였다.

관련 종래기술로는 대한민국 등록특허 제10-0958095호(번역 동반 시스템을 이용한 항균 펩타이드의 대량 발현방법), 대한민국 공개특허 제10-2012-0062504호(세포표면에서 발현되는 항균 펩타이드 다중합체) 등이 있다.

본 발명의 목적은, 지지체로서 불용성의 녹색형광단백질을 이용하고 또한 대장균 발현 시스템을 활용하여 항균 펩타이드를 제조함으로써, 제조공정이 간단하고 경제적이며 생산 수율이 높은 항균 펩타이드의 제조방법을 제공함에 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 산처리를 통해 절단되어 활성화될 수 있는 항균 펩타이드와 녹색형광단백질이 결합된 불용성 융합단백질을 제공한다.

상기 항균 펩타이드는 연속적으로 배열되며, 상기 항균 펩타이드들의 N-말단, C-말단 또는 이들의 연결부에 Asp-Pro 아미노산 서열이 연결될 수 있다. 상기 연속적으로 배열된 항균 펩타이드는 3카피로 존재할 수 있다. 상기 Asp-Pro 아미노산 서열은 산처리를 통해 절단될 수 있으며, 상기 산처리는 HCl을 투입하여 수행될 수 있다.

또한 본 발명은 서열번호 24로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 불용성 융합단백질을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 불용성 융합단백질을 암호화하는, 서열번호 21로 기재되는 염기서열을 포함하는 유전자를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 재조합 발현벡터를 숙주세포에 도입한 형질전환체를 제공한다. 상기 숙주세포는 대장균일 수 있다.

또한 본 발명은 (1) 서열번호 21로 기재되는 염기서열로 재조합된 형질전환체를 배양액에서 배양하는 단계; (2) 상기 배양액으로부터 형질전환체를 회수하는 단계; (3) 형질전환체로부터 단백질을 수득하는 단계; 및 (4) 상기 단백질을 산처리하여 항균 펩타이드를 분리하는 단계를 포함하는 항균 펩타이드의 제조 방법을 제공한다.

상기 단백질은 응집체 형태로 발현될 수 있다.

상기와 같은 본 발명에 따르면, 간단하고 경제적이며 생산 수율이 높은 항균 펩타이드의 대량 제조방법을 제공함으로써, 다중약물내성 미생물의 급증으로 인하여 새로운 항생제의 개발이 시급한 현 시점에서, 천연에 존재하는 항균 펩타이드를 제약 및 사료 산업 등에 이용할 수 있는 효과가 있다.

또한 본 발명에 따르면, 기존의 시안화브롬을 이용하는 대신 산처리를 통해 아미노산을 절단하는 방법을 이용함으로써 불용성 단백질로부터 목적 단백질을 정제하는 데 있어 비용을 절감하고 공정의 위험성을 낮추며 더욱 신속하게 진행할 수 있는 효과가 있다.

도 1a는 불용성 녹색형광단백질과 항균 펩타이드의 융합을 위한 재조합 벡터의 모식도이다.
도 1b는 재조합된 r5M-172AMP173의 아미노산 서열이다[녹색 : r5M-GFP 서열, 노랑 : 링커 시퀀스 및 메티오닌 부위, 파랑 : AMP의 아미노산 서열 자리(단, 파랑으로 표기된 AMP는 아미노산 서열이 아니라 Antimicrobal peptide의 약자)].
도 1c는 불용성 녹색형광단백질로부터 항균 펩타이드를 정제하는 과정의 모식도이다.
도 2는 재조합된 r5M-172(PG1)₃173의 아미노산 서열이다(녹색 : r5M-GFP 서열, 분홍 : 아스파트산으로부터 세린으로 치환한 부위, 노랑 : 링커 시퀀스 및 Asp-Pro 결합부위, 파랑 : PG1의 아미노산 서열).
도 3은 r5M-172PG1173 유전자가 삽입된 pET30b 발현벡터가 도입된 대장균 내에서 단백질의 발현이 유도된 것과 유도되지 않은 것의 대장균 성장곡선을 광학 밀도를 통하여 측정한 그래프이다.
도 4a는 r5M-172PG1173 유전자가 삽입된 형질전환체로부터 생산된 단백질(화살표)이 응집체를 형성하는 것을 전자현미경으로 촬영한 것이다.
도 4b, 도 4c 및 도 4d는 r5M-172PG1173 유전자가 삽입된 형질전환체로부터 생산된 단백질(화살표)이 응집체를 형성하는 것을 면역화학적 표지 후 전자현미경으로 촬영한 것이다.
도 5는 대장균 내에서 r5M-172PG1173 유전자가 삽입된 pET30b 발현벡터의 시간 경과(3h, 4h, 5h)에 따른 r5M-172PG1173 단백질 생산을 전체 세포 단백질을 샘플로 하여 SDS-PAGE로 확인한 것이다.
도 6a는 발현된 r5M-172PG1173 단백질을 각 단계마다 SDS-PAGE를 통하여 확인한 것이다.
도 6b는 r5M-172PMAP36173 단백질을 각 단계마다 SDS-PAGE를 통하여 확인한 것이다.
도 7a 및 도 7b는 tris-tricine SDS-PAGE 로 단백질 정제의 각 단계 마다 추출되는 단백질 샘플의 순도를 분석한 것이다.
도 7c는 정제된 PG1을 western blot을 통하여 확인한 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 산처리를 통해 절단되어 활성화될 수 있는 항균 펩타이드(Antimicrobial peptide, AMP)와 녹색형광단백질(Green Fluorescent protein, GFP)이 결합된 불용성 융합단백질을 제공한다. 상기 불용성 융합단백질을 제조하기 위해, 항균 펩타이드의 지지체로서 녹색형광단백질을 이용할 수 있다. 녹색형광단백질과 항균 펩타이드가 결합된 불용성의 융합단백질의 구조로 발현을 유도함으로써 항균 펩타이드의 손상을 막고, 항균 펩타이드의 발현이 숙주에 미치는 성장저해 효과를 극소화함으로써, 숙주의 성장이 저해되여 펩타이드의 생산 수율이 낮아지는 문제를 방지할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 항균 펩타이드는 연속적으로 배열되며, 상기 항균 펩타이드들의 N-말단, C-말단 또는 이들의 연결부에 Asp-Pro[아스파트산(aspartic acid)-프롤린(proline), DP] 아미노산 서열이 연결될 수 있다. 상기 연속적으로 배열된 항균 펩타이드는 3카피(copies)로 존재할 수 있다. 상기 Asp-Pro 아미노산 서열은 산처리를 통해 절단될 수 있다. 상기 산처리는 HCl을 투입하여 수행될 수 있다.

또한 본 발명은 서열번호 24로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 녹색형광단백질을 제공한다.

상기 녹색형광단백질(이하, 'GFP' 라 칭함.)을 제작하기 위하여 GFP의 아미노산 서열에서 218번째 메티오닌(M218)부터 알라닌(alanine) 위치까지 돌연변이(mutation)를 유발할 수 있다. 그 후에 모든 내부 메티오닌(Met) 자리들에서 돌연변이를 유발시켜 메티오닌-결실 GFP(이하, "r5M-GFP" 라 칭함.)를 유도할 수 있다. 또한 76번째 및 204번째 아스파트산(D76, D204) 위치가 세린(Ser, S)으로 치환될 수 있다.

r5M-GFP에 항균 펩타이드를 삽입하는 방법에 있어서, 먼저 r5M-GFP를 NdeI과 XhoI 제한효소 자리를 이용하여 pET30b 벡터 안에 들어가도록 클로닝을 실시할 수 있다. 이는 제한효소를 이용한 분리 및 T4 ligase를 통한 라이게이션(ligation) 과정을 통해 수행될 수 있으며, 상세한 과정은 하기와 같다.

r5M-GFP가 삽입된 pET30b 벡터를 DNA 주형으로 하여 5' 방향은 NdeI (start codon을 포함) 제한 효소 자리 및 His-tag을 갖도록, 3' 방향은 172번째 아미노산 다음 링커(KpnI 제한효소자리 포함) 및 메티오닌을 갖도록 프라이머를 디자인하여 PCR을 수행함으로써 N-말단 쪽 단편(fragment)을 제조할 수 있다. C-말단쪽 단편도 이와 같은 방식으로 5' 방향에 메티오닌, 링커 및 173번째 아미노산이 위치하도록, 3' 방향에는 His-tag, stop codon 및 XhoI 제한효소자리가 위치하도록 프라이머를 설계하여 증폭할 수 있다.

PG1 또는 PMAP36을 코딩하는 유전자를 DNA 주형으로 하여 5' 방향에 KpnI 제한효소 자리, 링커(링커가 KpnI 제한효소 자리를 포함) 및 메티오닌을 코딩하는 염기 서열을 포함하고 3' 방향에 메티오닌, BamHI 제한효소 자리 및 링커(링커가 BamHI 제한효소 자리를 포함)를 코딩하는 염기서열을 포함하는 프라이머를 설계한 후 PCR을 수행할 수 있다.

PCR을 거쳐 증폭된 PG1 또는 PMAP36의 각 유전자와, 앞서 r5M-GFP로부터 증폭된 두 개의 단편들을 연장 PCR(overlap PCR)을 통해 증폭하면 항균 펩타이드를 코딩할 수 있는 시퀀스를 포함한 유전자(r5M-172-PG1-173 또는 r5M-172-PMAP-173)를 수득할 수 있다. 이는 각각의 단편과 유전자들이 앞선 PCR 단계에서 추가한 메티오닌, 링커 부분의 염기서열이 상보적이기 때문에 가능할 수 있다(이하 상기 GFP에 항균 펩타이드가 결합된 도 1a와 같은 구조를 “r5M-172AMP173”로 표기한다).

상기 r5M-172-PG1-173 또는 r5M-172-PMAP-173 유전자는 PCR 이후 gel extraction 과정을 통해 아가로즈 젤로부터 얻을 수 있다. 이후 NdeI과 XhoI 제한효소로 상기 유전자를 각각 절단하고, 동일한 두 제한효소로 절단한 pET30b 벡터에 T4 ligase를 이용하여 라이게이션시키고 형질전환함으로써 클로닝을 완성할 수 있다(도 1b).

r5M-GFP에 유전자를 삽입하는 상기 시스템에 있어서, 상기와 같은 overlap PCR을 통해서 클로닝을 수행할 수 있으며 여러번의 PCR 과정 및 각 PCR 과정마다 후행되는 gel extraction 과정이 필요할 수 있다.

상기 클로닝 후 클론으로부터 얻어진 벡터를 KpnI과 BamHI 제한효소로 절단하면 삽입되었던 유전자는 분리될 수 있다. 클로닝 하고자 하는 유전자에 대하여 상기 PG1 및 PMAP36 유전자와 동일한 방식으로 프라이머를 디자인하고, PCR 증폭 후 KpnI과 BamHI 제한효소로 절단하여, 삽입했던 유전자가 분리된 벡터에 라이게이션하면 클로닝 과정을 간소화할 수 있다. 바람직하게, r5M-172AMP173 유전자가 포함하는 제한효소는 NdeI, KpnI, BamHI 및 XhoI의 순서대로 배치될 수 있다.

또한 본 발명은 상기 녹색형광단백질을 암호화하는, 서열번호 21로 기재되는 염기서열을 포함하는 유전자를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.

재조합된 상기 유전자(r5-M172AMP173)는 pET30b 발현벡터의 NdeI과 XhoI 제한효소 자리로 삽입될 수 있는데, 이 때 r5M-172AMP173 의 양 말단에 히스티딘 태그(his-tag)가 부착되도록 상기 PCR 프라이머 설계시 his-tag 서열을 추가할 수 있다. his-tag는 재조합 단백질 말단에 붙인 여러 개의 histidine를 가리키며, histidine의 금속이온에 대한 선택적 결합능을 이용하면 재조합 단백질을 쉽게 분리·정제할 수 있다.

histidine은 이미다졸기를 가진 아미노산으로 주로 Ni²⁺또는 Fe²⁺등의 2가 금속이온과 용이하게 결합할 수 있다. his-tag 는 재조합 단백질의 발현벡터를 만드는 단계에서부터 부착 여부를 고려해야 하는데, 재조합 단백질 염기서열의 앞부분이나 뒷부분에 여러 개의 histidine이 발현되도록 하며, 보통 발현시키는 histidine의 개수는 6개 이상일 수 있다.

또한 본 발명은 상기 재조합 발현벡터를 숙주세포에 도입한 형질전환체를 제공한다. 상기 숙주세포로는 대장균을 선택하여 바람직하게 수행될 수 있다. 상기 대장균은 E.coli BL21일 수 있다.

또한 본 발명은 (1) 서열번호 21로 기재되는 염기서열로 재조합된 형질전환체를 배양액에서 배양하는 단계; (2) 상기 배양액으로부터 형질전환체를 회수하는 단계; (3) 형질전환체로부터 단백질을 수득하는 단계; 및 (4) 상기 단백질을 산처리하여 항균 펩타이드를 분리하는 단계를 포함하는 항균 펩타이드의 제조 방법을 제공한다. 상기 단백질은 불용성 단백질일 수 있다.

상기 단계 (1)에서, 상기 형질전환체는 E. coli BL21일 수 있고, 37℃의 1L LB 배지(Luria-Bertani broth)에서 배양될 수 있으며, IPTG(Isopropyl β-D thiogalactoside)의 투입으로 단백질의 발현이 유도될 수 있다.

상기 단계 (2)에서, 상기 회수는 원심분리기를 이용하여 수행될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 불용성 단백질은 응집체(inclusion bodies) 형태로 발현될 수 있다.

상기 불용성 단백질을 추출하기 위하여 초음파 분쇄기(sonicator)를 이용하여 세포를 파쇄하고, 파쇄된 용해물(lysate)을 원심분리 하여 가용성 및 불용성 분획물을 수득할 수 있다. 불용성 분획물을 용해버퍼(lysis buffer)로 재부유시킨 후 라이소자임(lysozyme)을 투입하여 세포벽을 파괴할 수 있고, DNA 분해효소(DNase)를 투입하여 DNA를 절단한 후, 원심분리하여 응집체(inclusion bodies) 형태로 발현된 불용성 단백질을 분리할 수 있다.

상기 분리된 불용성 단백질의 수율을 높이기 위하여 라이소자임과 DNA 분해효소를 포함하는 sodium phosphate buffer 를 이용하여 cell wall, cell debris, gDNA 를 제거하는 세척 단계(washing step)를 실시할 수 있다.

상기 불용성 단백질은 응집체 형태로 발현됨으로써, 항균 펩타이드가 독성으로 작용하여 숙주세포의 성장을 저해하는 것을 극소화할 수 있게 되고, 또한 항균 펩타이드와 같이 분자량이 작은 크기의 폴리펩타이드의 경우 숙주세포 내에 존재하는 단백질 분해효소에 의해 분해되기 쉬우므로, 이 또한 막을 수 있어 항균 펩타이드의 제조과정에서 생산 수율을 높일 수 있다.

상기 응집체 형태로 발현된 불용성 단백질은 니켈-니트로트리아세트산 컬럼 크로마토그래피(Ni-NTA column chromatograph)에 의해서 정제되고, 용출된 분획(elution fraction)은 전기영동(SDS-PAGE)에 의해서 분석되고, 탈이온수를 투석액으로 하여 투석될 수 있다. 투석은 정제과정에서 투입된 우레아, 이미다졸, NaCl 을 제거하기 위한 것으로, 이 과정을 거친 후, 불용성 단백질을 동결건조시킴으로써 불필요한 물을 제거할 수 있다. 이와 같이 투석 및 동결건조 과정을 거쳐 고농도의 불용성 단백질을 수득할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 항균 펩타이드는 연속적으로 배열되며, 상기 항균 펩타이드들의 N-말단, C-말단 또는 이들의 연결부에 Asp-Pro 아미노산 서열이 연결될 수 있다. 상기 연속적으로 배열된 항균 펩타이드는 3카피로 존재할 수 있다. 상기 Asp-Pro 아미노산 서열은 산처리를 통해 절단될 수 있다. 상기 산처리는 HCl을 투입하여 수행될 수 있다.

상기 산처리는 산성 조건을 이용하여 아미노산 결합을 절단하는 방법으로, 기존에 이용되고 있던 시안화브롬은 독성이 강해 주의해서 사용해야 하므로 공정의 속도가 둔화되고, 값이 비싸기 때문에 경제성의 측면에서 유용하지 못하다는 단점이 있었기 때문에 이를 개선하여 저렴한 방법으로서 바람직하게 수행될 수 있다.

상기 항균 펩타이드(PG1, PMAP36)의 양측에 위치한 N-말단과 C-말단 부위가 절단되면 항균 펩타이드만을 수득할 수 있다(도 1c). 이후, 항균 펩타이드는 역상 고압액체크로마토그래피(reverse phase HPLC)에 의해 정제될 수 있다. 정제된 항균 펩타이드는 refolding buffer를 첨가하여 자연(native)상태로 재접힘 되고 동시에 투석에 의해서 refolding buffer가 탈이온수로 교체될 수 있다.

한편, 다양한 생물체로부터 지금까지 발견된 항균 펩타이드는 구조적으로 세 개의 그룹으로 나뉘어진다. 첫 번째는, 시스테인이 풍부한 β-쉬트(sheet) 펩타이드 이고, 두 번째는 α-회전형(helical)의 양친화성 분자이며, 세 번째는 프롤린이 풍부한 펩타이드이다. 이들 항균 펩타이드의 다양한 구조는 펩타이드 아미노산 서열에 의해 결정되며, 이러한 구조는 펩타이드의 항균 활성과 밀접한 관계를 가지고 있는 것으로 알려져 있다.

본 발명에서는 두 개의 이황화 결합에 의해 안정화 된, 전형적인 역-평행 베타-헤어핀 구조를 가지는 프로테그린1(Protegrin1, PG1)을 사용하였는데, 이는 돼지 백혈구에서 최초로 발견되었다. 이외에도 나선(helix) 구조를 가지는 돼지 골수 유래 항균 펩타이드36(Pig myeloid antibacterial peptide36, PMAP36)을 사용하였으나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 실시예에 따라 정제된 항균 펩타이드 PG1 및 PMAP36의 항균활성을 확인하기 위해서 E.coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 및 Staphylococcus aureus ATCC 29213 을 사용하여 spot-on-lawn test 를 수행한 결과, 항균 활성을 보임을 확인하였고, 그 결과는 표 1 과 같다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 불용성 녹색형광단백질과 항균 펩타이드가 결합된 융합단백질의 제조를 위한 DNA 증폭 및 발현벡터의 제조

항균 펩타이드 PG1을 코딩하는 유전자(하기 서열번호 1) 및 PMAP36(하기 서열번호 2)을 코딩하는 유전자를 DNA 주형으로 하여, 각각 5' 방향에 KpnI 제한효소 자리, 링커(링커가 KpnI 제한효소 자리를 포함) 및 메티오닌을 코딩하는 염기 서열을 포함하고 3' 방향에 메티오닌, BamHI 제한효소 자리 및 링커(링커가 BamHI 제한효소 자리를 포함)를 코딩하는 염기서열을 포함하는 프라이머를 설계한 후 PCR을 수행하였다. 증폭에 필요한 각각의 프라이머 서열은 표 2와 같다.

서열번호 1;

5'-AGGGGAGGTCGCCTGTGCTATTGTAGGCGTAGGTTCTGCGTCTGTGTCGGACGAGGA-3＇

서열번호 2;

5-'GGACGATTTAGACGGTTGCGTAAGAAGACCCGAAAACGTTTGAAGAAGATCGGGAAGGTTTTGAAGTGGATTCCTCCCATTGTCGGCTCAATACCCTTGGGTTGTGGG-3'

또한 돌연변이가 유발된 r5M-GFP에 상기 항균 펩타이드를 삽입하는 방법에 있어서, r5M-GFP 유전자 및 항균 펩타이드에 대하여 5' 방향 및 3' 방향의 프라이머를 각각 디자인하였다. 증폭에 필요한 각각의 프라이머 서열은 표 2와 같다.

상기 프라이머 서열에서 서열번호 3의 염기서열에는 이후 발현벡터 pET30b 와의 결합을 위하여 제한효소 NdeI 인식 서열과 Ni-NTA 컬럼 크로마토그래피를 위한 6x His tag 서열(5′- CATCACCATCATCACCAT-3′)이 포함되어 있고, 이후 서열번호 4의 염기서열과 서열번호 5의 염기서열에는 시안화브롬 처리를 통한 펩타이드 절단을 위하여 메티오닌을 암호화하는 ATG 코돈이 포함되어 있다. 또한 서열번호 6의 염기서열에는 이후 발현벡터 pET30b 와의 결합을 위하여 제한효소 XhoI의 인식 서열이 포함되어 있고, 서열번호 7(annealing temperature:57℃)와 서열번호 9(annealing temperature:50℃)의 염기서열에는 제한효소 KpnI과 시안화브롬 처리를 통한 펩타이드 절단을 위한 ATG 코돈이 포함되어 있다. 또한, 서열번호 8과 서열번호 10의 염기서열에는 제한효소 BamHI의 인식 서열과 시안화브롬 처리를 통한 펩타이드 절단을 위한 ATG 코돈이 포함되어 있는 것을 특징으로 한다. 상기와 같이 메티오닌을 암호화하는 ATG 코돈을 넣어줄 경우, 차후 융합단백질에서 항균 펩타이드 PG1 과 PMAP36 만을 분리하는 단계에서, 시안화브롬(CNBr) 처리시 메티오닌 잔기 바로 뒤의 펩타이드 결합이 절단되도록 하여 항균 펩타이드만을 분리할 수 있다.

PCR을 거쳐 증폭된 PG1 또는 PMAP36의 각 유전자와, 앞서 r5M-GFP로부터 증폭된 두 개의 단편들을 연장 PCR(overlap PCR)을 통해 증폭하면 항균 펩타이드를 코딩할 수 있는 시퀀스를 포함한 유전자(r5M-172-PG1-173 또는 r5M-172-PMAP-173)를 수득할 수 있다. 이는 각각의 단편과 유전자들이 앞선 PCR 단계에서 추가한 메티오닌, 링커 부분의 염기서열이 상보적이기 때문에 가능할 수 있다(이하 상기 GFP에 항균 펩타이드가 결합된 도 1a와 같은 구조를 “r5M-172AMP173” 로 표기한다).

또한 PG1의 발현을 증가시키기 위해서 카피 수를 3개로 증가시켜 재조합을 시도하였다. 서열번호 11로 기재되는 정방향 5' 말단 및 서열번호 12로 기재되는 역방향 3' 말단 프라이머를 이용하여 PG1의 유전자 단편을 증폭시켰다. 각각의 PG1 단량체(monomer)는 T4 DNA Ligase(NEB)를 이용하여 연속적으로 연결되었다. 연속적으로 PG1 3카피를 포함하는 다량체[이하 (PG1)₃]는 3 % 저융점 아가로즈(low melting agarose) 겔에서 전기영동하여 150 내지 300 bp 크기의 DNA 밴드로 확인된 후, 페놀-클로로포름(phenol-chloroform)을 이용하여 (PG1)₃로 정제되었다.

서열번호 11( 5′-> 3′);

CCGAGGGGAGGTCGCCTGTGCTATTGTAGGCGTAGGTTCTGCGTCTGTGTCGGACGAGGAGAC

서열번호 12( 5′-> 3′);

TCCTCGTCCGACACAGACGCAGAACCTACGCCTACAATAGCACAGGCGACCTCCCCTCGGCTG

상기 과정에서 증폭된 DNA 단편을 라이게이션(ligation) 시켜 이들을 재조합하였는데, 항균 펩타이드 PG1, PMAP36 및 (PG1)₃ 유전자는 GFP의 아미노산 서열에서 172번과 173번 사이 루프(loop)지역으로 삽입되었다. 이 중 (PG1)₃ 유전자의 삽입은 서열번호 13 및 14로 기재되는 프라이머를 이용하여 수행되었다(표 3). 이에 따라 (PG1)₃은 3카피가 연속적으로 배열되는 PG1 각 카피의 N-말단, C-말단 또는 이들의 연결부에 Asp-Pro(아스파트산-프롤린, DP) 아미노산 서열이 연결되도록 구성되었다.

서열번호	유전자	프라이머	염기서열(5' -> 3')
서열번호 13	172AlwNI-DP-For	정방향	GTACCCAGGACCTGCCGGGATCCGGTGGCGATGGCAGCGT
서열번호 14	172AlwNI-DP-Rev	역방향	CAGCATCTGGGTACCAGAACCACCTTCCACG

(PG1)₃ 유전자를 삽입한 형질전환체로부터 생산된 단백질에서 추후 Asp-Pro 부위의 절단을 통해 PG1을 분리할 것이므로, 분리 공정을 위한 r5M-GFP의 위치지향적 돌연변이(site directed mutagenesis)를 (PG1)₃ 유전자 삽입에 앞서 수행하였다. 재조합 유전자의 76번째 및 204번째 아스파트산(D76, D204) 위치는 Asp-Pro 결합부위에 해당되므로, 각각 세린(Ser, S)으로 치환하여 단백질을 분리하는 과정에서 불필요한 결합부위의 절단을 방지할 수 있다(도 2). 상기 치환에 이용된 프라이머는 표 4와 같다. 하기 서열번호 15 및 16으로 기재되는 프라이머를 이용하여 76번째 아스파트산을, 서열번호 17 및 18로 기재되는 프라이머를 이용하여 204번째 아스파트산을 각각 세린으로 치환하였다.

서열번호	유전자	프라이머	염기서열(5' -> 3')
서열번호 15	r5M-76D-S-F	정방향	GCACGTTATCCGTCTCACATCAAACG
서열번호 16	r5M-76D-S-R	역방향	CGTTTGATGTGAGACGGATAACGTGC
서열번호 17	r5M-204D-S-F	정방향	CTGCTGAAATCTCCGAACGAAAAACGTG
서열번호 18	r5M-204D-S-R	역방향	CACGTTTTTCGTTCGGAGATTTCAGCAG

상기 과정에 의하여 재조합된 유전자는 “r5M-172PG1173”(항균 펩타이드 PG1 유전자 삽입), “r5M-172PMAP36173”(항균 펩타이드 PMAP36 삽입) 및 “r5M-172(PG1)₃173”(항균 펩타이드 (PG1)₃ 삽입)으로 표기한다. 상기 재조합 유전자 r5M-172PG1173의 염기서열은 서열번호 19이고, r5M-172PMAP36173 의 염기서열은 서열번호 20이고, r5M-172(PG1)₃173의 염기서열은 서열번호 21로 하기와 같다.

서열번호 19( 5′-> 3′);

CATATGCATCACCATCATCACCATCAGAGCAAAGGCGAAGAACTGTTTACCGGCGTGGTGCCGATTCTGGTGGAACTGGATGGCGATGTGAACGGCCATAAATTTAGCGTGCGTGGCGAAGGCGAAGGCGATGCGACCAACGGCAAACTGACCCTGAAATTTATTTGCACCACCGGTAAACTGCCGGTGCCGTGGCCGACCCTGGTGACCACCCTGGGTTATGGTGTGCAGTGCTTTGCACGTTATCCGGATCACATCAAACGTCATGATTTCTTTAAAAGCGCGCTGCCGGAAGGCTATGTGCAGGAACGTACCATTAGCTTTAAAGATGATGGCACCTATAAAACCCGTGCGGAAGTGAAATTTGAAGGCGATACCCTGGTGAACCGTATTGAACTGAAAGGCATTGATTTTAAAGAAGATGGCAACATTCTGGGCCATAAACTGGAATATAACTTTAACAGCCATAAAGTGTATATTACCGCGGATAAACAGAAAAACGGCATTAAAGCGAACTTTAAAATTCGTCATAACGTGGAAGGTGGTTCTGGTACCATGAGGGGAGGTCGCCTGTGCTATTGTAGGCGTAGGTTCTGCGTCTGTGTCGGACGAGGAATGGGATCCGGTGGCGATGGCAGCGTGCAGCTGGCGGATCATTATCAGCAGAACACCCCGATTGGCGATGATAACCATTATCTGAGCACCCAGAGCGTGCTGCTGAAAGATCCGAACGAAAAACGTGATCACGCGGTGCTGCTGGAATTTGTGACCGCGGCGGGCATTACCCACGGCAAAGATGAACTGTATAAACATCACCATCATCACCATTAATAACTCGAGATC

서열번호 20( 5′-> 3′);

CATATGCATCACCATCATCACCATCAGAGCAAAGGCGAAGAACTGTTTACCGGCGTGGTGCCGATTCTGGTGGAACTGGATGGCGATGTGAACGGCCATAAATTTAGCGTGCGTGGCGAAGGCGAAGGCGATGCGACCAACGGCAAACTGACCCTGAAATTTATTTGCACCACCGGTAAACTGCCGGTGCCGTGGCCGACCCTGGTGACCACCCTGGGTTATGGTGTGCAGTGCTTTGCACGTTATCCGGATCACATCAAACGTCATGATTTCTTTAAAAGCGCGCTGCCGGAAGGCTATGTGCAGGAACGTACCATTAGCTTTAAAGATGATGGCACCTATAAAACCCGTGCGGAAGTGAAATTTGAAGGCGATACCCTGGTGAACCGTATTGAACTGAAAGGCATTGATTTTAAAGAAGATGGCAACATTCTGGGCCATAAACTGGAATATAACTTTAACAGCCATAAAGTGTATATTACCGCGGATAAACAGAAAAACGGCATTAAAGCGAACTTTAAAATTCGTCATAACGTGGAAGGTGGTTCTGGTACCATGGGACGATTTAGACGGTTGCGTAAGAAGACCCGAAAACGTTTGAAGAAGATCGGGAAGGTTTTGAAGTGGATTCCTCCCATTGTCGGCTCAATACCCTTGGGTTGTGGGATGGGATCCGGTGGCGATGGCAGCGTGCAGCTGGCGGATCATTATCAGCAGAACACCCCGATTGGCGATGATAACCATTATCTGAGCACCCAGAGCGTGCTGCTGAAAGATCCGAACGAAAAACGTGATCACGCGGTGCTGCTGGAATTTGTGACCGCGGCGGGCATTACCCACGGCAAAGATGAACTGTATAAACATCACCATCATCACCATTAATAACTCGAG

서열번호 21( 5′-> 3′);

ATGCATCACCATCATCACCATCAGAGCAAAGGCGAAGAACTGTTTACCGGCGTGGTGCCGATTCTGGTGGAACTGGATGGCGATGTGAACGGCCATAAATTTAGCGTGCGTGGCGAAGGCGAAGGCGATGCGACCAACGGCAAACTGACCCTGAAATTTATTTGCACCACCGGTAAACTGCCGGTGCCGTGGCCGACCCTGGTGACCACCCTGGGTTATGGTGTGCAGTGCTTTGCACGTTATCCGTCTCACATCAAACGTCATGATTTCTTTAAAAGCGCGCTGCCGGAAGGCTATGTGCAGGAACGTACCATTAGCTTTAAAGATGATGGCACCTATAAAACCCGTGCGGAAGTGAAATTTGAAGGCGATACCCTGGTGAACCGTATTGAACTGAAAGGCATTGATTTTAAAGAAGATGGCAACATTCTGGGCCATAAACTGGAATATAACTTTAACAGCCATAAAGTGTATATTACCGCGGATAAACAGAAAAACGGCATTAAAGCGAACTTTAAAATTCGTCATAACGTGGAAGGTGGTTCTGGTACCGACCCGAGGGGAGGTCGCCTGTGCTATTGTAGGCGTAGGTTCTGCGTCTGTGTCGGACGAGGAGACCCGAGGGGAGGTCGCCTGTGCTATTGTAGGCGTAGGTTCTGCGTCTGTGTCGGACGAGGAGACCCGAGGGGAGGTCGCCTGTGCTATTGTAGGCGTAGGTTCTGCGTCTGTGTCGGACGAGGAGACCCGGGATCCGGTGGCGATGGCAGCGTGCAGCTGGCGGATCATTATCAGCAGAACACCCCGATTGGCGATGATAACCATTATCTGAGCACCCAGAGCGTGCTGCTGAAATCTCCGAACGAAAAACGTGATCACGCGGTGCTGCTGGAATTTGTGACCGCGGCGGGCATTACCCACGGCAAAGATGAACTGTATAAACACCATCACCACCATCACTAATAA

상기 서열번호 19 내지 21의 염기서열에는 하기 서열번호 22 및 서열번호 23 의 염기서열로 이루어진 링커(linker)가 포함되어 있다.

서열번호 22;

5′- GGTGGTTCT - 3′

서열번호 23;

5′- GGATCCGGTGGC - 3′

상기 r5M-172PG1173, r5M-172PMAP36173 및 r5M-172(PG1)₃173은 pET30b 발현벡터의 NdeI과 XhoI 제한효소 자리로 삽입되어 재조합 발현벡터가 제조되었다.

r5M-172(PG1)₃173의 아미노산 서열은 서열번호 24로 하기와 같다. 이로부터 항균 펩타이드 PG1을 분리하는 단계에서, HCl을 이용한 산성 조건 처리시 Asp-Pro 결합에서 아스파트산과 프롤린 사이의 아미노산 결합이 절단되도록 하여 항균 펩타이드만을 분리할 수 있다.

서열번호 24( 5′-> 3′);

MHHHHHHQSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVRGEGEGDATNGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLGYGVQCFARYPSHIKRHDFFKSALPEGYVQERTISFKDDGTYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNFNSHKVYITADKQKNGIKANFKIRHNVEGGSGTDPRGGRLCYCRRRFCVCVGRG DPRGGRLCYCRRRFCVCVGRGDPRGGRLCYCRRRFCVCVGRG DPGSGGDGSVQLADHYQQNTPIGDDNHYLSTQSVLLKSPNEKRDHAVLLEFVTAAGITHGKDELYKHHHHHH

실시예 2. 대장균 형질전환체의 배양 및 융합단백질의 발현 유도

상기 실시예 1.에서 얻어진 재조합 발현벡터를 E.coil BL21에 도입시킨 후, 37℃의 1L LB 배지(Luria-Bertani broth)에서 배양하고, 0.1mM IPTG(Isopropyl β-D thiogalactoside)를 투입하여 단백질의 발현을 유도하였다. 단백질의 발현은 배양물의 혼탁도가 OD600(Optical Density 600nm) 즉, 빛 파장의 600nm에서의 밀도값이 0.6 내지 0.8 에 이를 때까지 유도되었고, 이후, 5시간 더 발현이 유도되었다.

실시예 3. 불용성 융합단백질의 분리

상기 실시예 2.에서 발현이 유도된 배양물을 4℃, 8000rpm 조건에서 10분 동안 원심분리하여 대장균 세포를 회수하였다. 수거된 세포는 초음파 분쇄기(sonicator)에 의해서 파쇄되었고, 파쇄된 세포 파쇄물은 4℃,13000rpm 조건에서 20분 동안 원심분리하여 가용성 분획물과 불용성 단백질이 포함된 침전물(pellet)을 수득하였다. 불용성 침전물은 1L당 40ml의 용해버퍼(100mM sodium chloride 를 포함하는 pH 7.4의 20mM sodium phosphate buffer, 0.5% triton-X100, 0.1mM PMSF, 1mM DTT)로 재부유(resuspend)시켰다. 이후, 상기 용해물에 라이소자임(0.1mg/ml)과 DNA 분해효소(0.01mg/ml)를 넣고 상온에서 20분 동안 incubation 하였다. 이 과정에서 라이소자임에 의해 세포벽이 파괴되고, DNA 분해효소에 의해서 DNA가 절단되었다.

이후, 상기 라이소자임과 DNA분해효소가 첨가된 용해물을 4℃, 8000rpm 조건에서 10분간 원심분리하여 응집체(inclusion bodies) 형태로 발현된 불용성 단백질을 수득하였다. 수득된 불용성 단백질의 수율을 높이기 위하여 라이소자임과 DNA 분해효소를 포함하는 sodium phosphate buffer 를 이용하여 cell wall, cell debris, gDNA를 제거하는 세척 단계(washing step)를 2회 실시하였다.

다음으로, 상기 불용성 단백질은 8M urea 와 30mM imidazole 을 포함하는 pH7.4의 20mM sodium phosphate buffer 로 재부유되었고, Ni-NTA 컬럼 크로마토그래피(GE Healthcare Bio-Sciences, Sweden)에 의해서 정제되었다.

정제 후 용출된 분획은 SDS-PAGE에 의해서 분석되었고, 상온에서 탈이온수를 투석액으로 하여 투석되었다.

실시예 4. 항균 펩타이드 PG1, PMAP36의 분리 및 정제

상기 실시예 3.에서 정제 후 투석된 불용성 단백질은 동결건조되고, 70% 포르믹산(formic acid)에 의해서 용해된다.

재조합 유전자 r5M-172PG1173 및 r5M-172PMAP36173을 포함하는 형질전환체로부터 생산된 불용성 단백질 용액에 시안화브롬(CNBr) 용액을 첨가한 후, 암실에서 24시간 동안 incubation 시킴으로써, 항균 펩타이드 PG1과 PMAP36 의 양쪽에 위치한 GFP의 N-말단과 C-말단 부위는 절단되었다. 상기 포르믹산과 시안화브롬은 동결건조에 의해서 제거되고, 이후, 역상 고압크로마토그래피를 위한 버퍼에 의해서 용해되었다.

r5M-172(PG1)₃173로부터 항균 펩타이드 PG1을 정제하기 위해서는 산성 조건을 이용한 아미노산 결합 절단 방법을 사용하였다. 기존에 이용되고 있던 시안화브롬은 독성이 강해 주의해서 사용해야 하므로 공정의 속도가 둔화되고, 값이 비싸기 때문에 경제성의 측면에서 유용하지 못하다는 단점이 있었기 때문이다.

재조합 유전자 r5M-172(PG1)₃173을 포함하는 형질전환체로부터 생산된 불용성 단백질은 실시예 1에 따라 PG1 3카피가 연속적으로 배열되며, 상기 PG1 각 카피의 N-말단, C-말단 또는 이들의 연결부에 Asp-Pro(아스파트산-프롤린, DP) 아미노산 서열이 연결되도록 구성되었다. 상기 불용성 단백질을 80mM의 HCl로 75℃에서 4시간 동안 처리하여 Asp-Pro 아미노산 결합을 절단함으로써, 불용성 단백질로부터 PG1을 분리하였다.

정제된 단백질의 순도는 16% tris-tricine SDS-PAGE 에 의해서 각 단계에서마다 분석되었다.

항균 펩타이드 PG1과 PMAP36은 역 역상 고압크로마토그래피(Waters Deltapak C18 column 7.8, 300mm)에 의해서 정제되었는데, 0.1% 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid)이 포함되고, 아세토니트릴(acetonitrile)이 5 내지 90%까지 직선 구배농도를 지니고 있는 관에 2.5ml/min의 유속으로 1시간동안 시료를 흘려주었다. 흡광도는 220nm와 280nm 둘 다에서 관찰하였고, 일치하는 피크는 16% tris-tricine SDS-PAGE 에 의해서 분석되었다.

정제된 분획은 refolding condition을 만들어주기 위해 동결건조를 통하여 불필요한 버퍼를 제거하는 과정을 거친 후, 8M 우레아, 5mM 환원된 글루타치온(glutathione) 및 0.5mM 산화된 글루타치온(glutathione)을 포함하는 20mM sodium phosphate buffer(pH7.4)로 구성된 refolding buffer를 첨가하여 자연상태로 refolding 되고, 동시에 투석에 의해서 refolding buffer가 탈이온수로 교체되었다. 이후, 정제 및 투석된 펩타이드는 동결건조시켰다.

실험예 1. r5M-172PG1173 유전자가 삽입된 pET30b 발현벡터의 단백질 발현이 유도 및 비유도 된 E.coli BL21의 성장 곡선 측정· 비교

r5M172-PG1-173 유전자가 삽입된 pET30b 발현벡터가 도입된 E.coli BL21에서 r5M172-PG1-173의 단백질 발현이 유도된 것과 유도되지 않은 E.coli BL21 의 성장을 광학 밀도(optical density) 측정을 통하여 비교하였다.

그 결과, 도 3에서 보는 바와 같이 r5M-172PG1173 단백질 발현은 대장균의 성장률에 크게 영향을 미치지 않음을 알 수 있다. 즉, 지지체로서 불용성 GFP 로 삽입된 항균 펩타이드는 대장균의 성장에 큰 영향을 미치지 않는다. 도 4에서 보는 바와 같이, r5M-172PG1173 단백질은 응집체 형태로 발현되었다.

비록, 항균 펩타이드의 안정적인 생산을 위하여 퓨전 파트너들과 결합시키는 많은 시도들이 있어왔지만, 낮은 생산 수율로 인하여 고영양의 배지 투입, 퓨전파트너 사이에 유전자의 복수 카피 삽입 등 추가적인 생산비용이 따르는 보완책이 필요하였다. 그러나 불용성의 상태로 고도로 발현되도록 제작된 GFP에 항균 펩타이드의 삽입만으로 제조된 본 발명의 융합단백질은 숙주세포의 성장 저해가 극소화 되어 높은 수율로 항균 펩타이드를 생산할 수 있다.

실험예 2. r5M-172PG1173 유전자가 삽입된 pET30b 발현벡터의 시간 경과에 따른 단백질 생산성 측정

대장균 내에서 r5M-172PG1173 유전자가 삽입된 pET30b 발현벡터의 시간 경과(3h, 4h, 5h)에 따른 r5M-172PG1173 단백질 생산을 전체 세포 단백질을 샘플로 하여 전기영동(Sodiumdodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)을 통하여 확인하였다.

그 결과, 도 5에서 보는 바와 같이 r5M-172PG1173 단백질 발현이 유도되지 않은 lane(UI)에서와 달리 단백질 발현이 유도된 lane(3h,4h,5h)을 살펴보면 E.coli BL21 내에서 r5M-172PG1173 단백질이 3 내지 5시간에서 모두 뚜렷하게 발현됨을 알 수 있다.

실험예 3. E.coli BL21에서 도입된 pET30b 발현벡터 내의 r5M-172PG1173 및 r5M-172PMAP36173의 단백질 생산성 측정

r5M-GPF 유전자로 각각 삽입된 PG1 및 PMAP36 유전자는 pET30b 발현벡터로 클로닝 된 후 E.coli BL21에서 5시간 동안 발현이 유도되었다.

상기 재조합 단백질은 세포 내 전체 댄백질의 약 45 내지 50 % 를 구성할 것으로 예상된다. 세포 배양물 1리터 당 1.4g 수득된 r5M-172PG1173 불용성 단백질(31kDa) 과 세포 배양물 1리터 당 1.3g 수득된 r5M-172PG1173 불용성 단백질(33kDa)은 전기영동의 최종 불용성 분획 부분에서 보여지는 바와 같이 최종적으로 목적 단백질의 거의 90%를 차지하였다(도 6a 및 도 6b).

상기 불용성 단백질은 Ni-NTA 크로마토그래피에 의해서 정제되고, 정제된 목적 단백질은 풀(pool)화 하였고, 탈이온수를 투석액으로 하여 투석되었다.

실험예 4. 항균 펩타이드 PG1 및 PMAP36의 수율 측정

상기 실험예 3.에서 투석된 단백질 샘플에서 r5M-GPF로부터 PG1과 PMAP36은 각각 절단되었고, 이후, PG1(2.4kDa) 및 PMAP36(4.2kDa)은 HPLC에 의하여 정제된 후 그 수율을 측정하였다.

그 결과, 표 5에서 보는 바와 같이 PG1을 3카피 포함한 재조합체(r5M-172(PG1)₃173)로부터 생산된 단백질이 약 2.3배의 수율을 보였다.

실험예 5. 항균 펩타이드 PG1 및 PMAP36의 순도 분석

순도 높은 PG1 및 PMAP36을 얻기 위하여 tris-tricine SDS-PAGE 로 단백질 정제의 각 단계 마다 추출되는 단백질 샘플을 로딩(laoding) 후 전기영동하고 순도를 분석하여 제조과정을 진행한 결과 95% 이상의 순도를 나타내는 항균펩타이드 PG1 및 PMAP36을 수득하였다(도 7a 및 6b).

또한, 정제된 PG1은 항-PG1 항체를 사용하여 웨스턴 블롯(western blot)으로 확인하였다. 도 7c에서 보여지는 바와 같이 2.4kDa 위치에서 PG1이 뚜렷하게 확인되었다.

이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.

<110> Konkuk University Industrial Cooperation Corp <120> METHOD FOR PRODUCING ANTIMICROBIAL PEPTIDE USING INSOLUBLE FUSION PROTEIN CONTAINING ANTIMICROBIAL PEPTIDE <130> P151184 <160> 24 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 57 <212> DNA <213> Sus scrofa <400> 1 aggggaggtc gcctgtgcta ttgtaggcgt aggttctgcg tctgtgtcgg acgagga 57 <210> 2 <211> 108 <212> DNA <213> Sus scrofa <400> 2 ggacgattta gacggttgcg taagaagacc cgaaaacgtt tgaagaagat cgggaaggtt 60 ttgaagtgga ttcctcccat tgtcggctca atacccttgg gttgtggg 108 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 3 catatgcatc accatcatca ccatcagagc 30 <210> 4 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 4 catggtacca gaaccacctt ccacgttatg ac 32 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 5 atgggatccg gtggcgatgg cagcgt 26 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 6 gtggtggtgc tcgagttatt aatggtg 27 <210> 7 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 7 gcggttctgg tggtaccatg aggggaggtc gcctgtg 37 <210> 8 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 8 gccaccggat cccattcctc gtccgacaca gacg 34 <210> 9 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 9 gcggttctgg tggtaccatg ggacgattta gacggttg 38 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 10 caccggatcc catcccacaa cccaagggta 30 <210> 11 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 11 ccgaggggag gtcgcctgtg ctattgtagg cgtaggttct gcgtctgtgt cggacgagga 60 gac 63 <210> 12 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 12 tcctcgtccg acacagacgc agaacctacg cctacaatag cacaggcgac ctcccctcgg 60 ctg 63 <210> 13 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 13 gtacccagga cctgccggga tccggtggcg atggcagcgt 40 <210> 14 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 14 cagcatctgg gtaccagaac caccttccac g 31 <210> 15 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 15 gcacgttatc cgtctcacat caaacg 26 <210> 16 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 16 cgtttgatgt gagacggata acgtgc 26 <210> 17 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 17 ctgctgaaat ctccgaacga aaaacgtg 28 <210> 18 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 18 cacgtttttc gttcggagat ttcagcag 28 <210> 19 <211> 843 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 19 catatgcatc accatcatca ccatcagagc aaaggcgaag aactgtttac cggcgtggtg 60 ccgattctgg tggaactgga tggcgatgtg aacggccata aatttagcgt gcgtggcgaa 120 ggcgaaggcg atgcgaccaa cggcaaactg accctgaaat ttatttgcac caccggtaaa 180 ctgccggtgc cgtggccgac cctggtgacc accctgggtt atggtgtgca gtgctttgca 240 cgttatccgg atcacatcaa acgtcatgat ttctttaaaa gcgcgctgcc ggaaggctat 300 gtgcaggaac gtaccattag ctttaaagat gatggcacct ataaaacccg tgcggaagtg 360 aaatttgaag gcgataccct ggtgaaccgt attgaactga aaggcattga ttttaaagaa 420 gatggcaaca ttctgggcca taaactggaa tataacttta acagccataa agtgtatatt 480 accgcggata aacagaaaaa cggcattaaa gcgaacttta aaattcgtca taacgtggaa 540 ggtggttctg gtaccatgag gggaggtcgc ctgtgctatt gtaggcgtag gttctgcgtc 600 tgtgtcggac gaggaatggg atccggtggc gatggcagcg tgcagctggc ggatcattat 660 cagcagaaca ccccgattgg cgatgataac cattatctga gcacccagag cgtgctgctg 720 aaagatccga acgaaaaacg tgatcacgcg gtgctgctgg aatttgtgac cgcggcgggc 780 attacccacg gcaaagatga actgtataaa catcaccatc atcaccatta ataactcgag 840 atc 843 <210> 20 <211> 891 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 20 catatgcatc accatcatca ccatcagagc aaaggcgaag aactgtttac cggcgtggtg 60 ccgattctgg tggaactgga tggcgatgtg aacggccata aatttagcgt gcgtggcgaa 120 ggcgaaggcg atgcgaccaa cggcaaactg accctgaaat ttatttgcac caccggtaaa 180 ctgccggtgc cgtggccgac cctggtgacc accctgggtt atggtgtgca 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Leu Glu Tyr Asn Phe Asn Ser His Lys Val Tyr Ile Thr 145 150 155 160 Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Ala Asn Phe Lys Ile Arg His 165 170 175 Asn Val Glu Gly Gly Ser Gly Thr Asp Pro Arg Gly Gly Arg Leu Cys 180 185 190 Tyr Cys Arg Arg Arg Phe Cys Val Cys Val Gly Arg Gly Asp Pro Arg 195 200 205 Gly Gly Arg Leu Cys Tyr Cys Arg Arg Arg Phe Cys Val Cys Val Gly 210 215 220 Arg Gly Asp Pro Arg Gly Gly Arg Leu Cys Tyr Cys Arg Arg Arg Phe 225 230 235 240 Cys Val Cys Val Gly Arg Gly Asp Pro Gly Ser Gly Gly Asp Gly Ser 245 250 255 Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Asp 260 265 270 Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Val Leu Leu Lys Ser Pro Asn Glu 275 280 285 Lys Arg Asp His Ala Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile 290 295 300 Thr His Gly Lys Asp Glu Leu Tyr Lys His His His His His His 305 310 315

Claims

산처리를 통해 절단되어 활성화될 수 있는 항균 펩타이드(Antimicrobial peptide, AMP)와 녹색형광단백질(Green Fluorescent protein, GFP)이 결합된 불용성 융합단백질.
제 1 항에 있어서,
상기 산처리가 HCl을 투입하여 수행되는 것을 특징으로 하는 불용성 융합단백질.
제 1 항에 있어서,
상기 항균 펩타이드가 연속적으로 배열되며, 상기 항균 펩타이드들의 N-말단, C-말단 또는 이들의 연결부에 Asp-Pro 아미노산 서열이 연결되는 것을 특징으로 하는 불용성 융합단백질.
제 3 항에 있어서,
상기 연속적으로 배열된 항균 펩타이드가 3카피(copies)로 존재하는 것을 특징으로 하는 불용성 융합단백질.
제 3 항에 있어서,
상기 Asp-Pro 아미노산 서열이 산처리를 통해 절단되는 것을 특징으로 하는 불용성 융합단백질.
서열번호 24로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 불용성 융합단백질.
제 6 항의 불용성 융합단백질을 암호화하는, 서열번호 21로 기재되는 염기서열을 포함하는 유전자.
제7항의 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터.
제8항의 재조합 발현벡터를 숙주세포에 도입한 형질전환체.
제 9 항에 있어서,
상기 숙주세포가 대장균인 것을 특징으로 하는 형질전환체.
(1) 서열번호 21로 기재되는 염기서열로 재조합된 형질전환체를 배양액에서 배양하는 단계;
(2) 상기 배양액으로부터 형질전환체를 회수하는 단계;
(3) 형질전환체로부터 단백질을 수득하는 단계; 및
(4) 상기 단백질을 산처리하여 항균 펩타이드를 분리하는 단계
를 포함하는 항균 펩타이드의 제조 방법.
제 11 항에 있어서,
상기 단백질이 응집체(inclusion bodies) 형태로 발현되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
제 11 항에 있어서,
상기 항균 펩타이드가 연속적으로 배열되며, 상기 항균 펩타이드들의 N-말단, C-말단 또는 이들의 연결부에 Asp-Pro 아미노산 서열이 연결되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
제 13 항에 있어서,
상기 Asp-Pro 아미노산 서열이 산처리를 통해 절단되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
제 14 항에 있어서,
상기 산처리가 HCl을 투입하여 수행되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
제 13 항에 있어서,
상기 연속적으로 배열된 항균 펩타이드가 3카피로 존재하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.