CN108779152A - 包含抗菌肽的不溶性融合蛋白以及利用上述不溶性融合蛋白的抗菌肽制造方法 - Google Patents

包含抗菌肽的不溶性融合蛋白以及利用上述不溶性融合蛋白的抗菌肽制造方法 Download PDF

Info

Publication number
CN108779152A
CN108779152A CN201680076161.6A CN201680076161A CN108779152A CN 108779152 A CN108779152 A CN 108779152A CN 201680076161 A CN201680076161 A CN 201680076161A CN 108779152 A CN108779152 A CN 108779152A
Authority
CN
China
Prior art keywords
mentioned
antibacterial peptide
fusion protein
protein
manufacturing
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201680076161.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108779152B (zh
Inventor
朴灿奎
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University Industry Cooperation Corporation of Konkuk University
Original Assignee
University Industry Cooperation Corporation of Konkuk University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University Industry Cooperation Corporation of Konkuk University filed Critical University Industry Cooperation Corporation of Konkuk University
Publication of CN108779152A publication Critical patent/CN108779152A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108779152B publication Critical patent/CN108779152B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • C07K14/245—Escherichia (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N33/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic nitrogen compounds
    • A01N33/02—Amines; Quaternary ammonium compounds
    • A01N33/08—Amines; Quaternary ammonium compounds containing oxygen or sulfur
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4723—Cationic antimicrobial peptides, e.g. defensins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/60—Fusion polypeptide containing spectroscopic/fluorescent detection, e.g. green fluorescent protein [GFP]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Mycology (AREA)

Abstract

本发明涉及一种抗菌肽的制造方法，尤其涉及一种通过将抗菌肽遗传基因融合到在大肠杆菌中以不溶性形态表达的绿色荧光蛋白遗传基因并引进到大肠杆菌中进行表达之后再去除绿色荧光蛋白并收取抗菌肽的过程而批量地制造抗菌肽的方法。如上所述的本发明能够通过提供一种制造工程简单、经济性良好且生产收率较高的抗菌肽的制造方法，在因为多重耐药性微生物的急剧增加而急需开发出具有能够对上述耐药性菌株进行杀灭的全新作用机制的抗生素的制药以及饲料产业，提供能够替代现有的抗生素的天然抗生素。此外，本发明能够通过利用以酸处理方式切割氨基酸的方式替代现有的使用氰化溴的方式，在从不溶性蛋白纯化出目标蛋白质的过程中节省成本、降低工程的危险性并更快速地完成所需的作业。

Description

包含抗菌肽的不溶性融合蛋白以及利用上述不溶性融合蛋白 的抗菌肽制造方法
技术领域
本发明涉及一种由绿色荧光蛋白(Green Fluorescent protein， GFP)和抗菌肽(Antimicrobial peptide，AMP)结合而成的融合蛋白以及利用上述融合蛋白的抗菌肽的批量制造方法，尤其涉及一种通过将抗菌肽融合到在大肠杆菌中以不溶性形态表达的绿色荧光蛋白并引进到大肠杆菌中进行表达之后再去除绿色荧光蛋白并收取抗菌肽的过程而批量地制造抗菌肽的方法。
背景技术
从微生物到高等生物位置的所有生物，均具有用于保护自己免受外部有害环境侵害的自身独有的固有防御系统。周边所存在的微生物甚至于菌丝类都会通过生成具有抗菌活性的自身防御物质即抗菌肽而构建先天性免疫系统，提供在抗原-抗体反应之前保护自身免受外部有害因素侵害的第一轮屏障。
此外，人类在继青霉素之后开发出了很多种类型的抗生素并进行使用，但是近年来与过去不同，对如上所述的抗生素具有耐药性的菌株呈现出了非常快速的增长趋势。尤其是，对两种以上的不同抗生素、抗菌剂呈现出耐药性的多重耐药性微生物急剧增加，所以目前急需开发出一种能够对如上所述的耐药性菌株进行杀灭的具有全新作用机制的抗生素。
因为如上所述的原因，存在于大自然中的抗菌肽作为全新抗生素的候选物质而备受关注，因为是通过与目前所使用的化合物物性的抗生素不同的作用机制呈现出抗菌活性，因此有望解决对抗生素具有耐药性的菌株相关的问题。
因此，很多人在努力尝试直接使用自然界中所存在的抗菌肽或合成使用其类似物，但是因为抗菌肽在提升抗菌活性的同时还会导致细胞毒性的标准即红细胞溶血现象的增加，因此在实际应用方面受到很多限制。
而且，为了实现在抗菌肽的商用化方面最为重要的因素即大规模生产，同样进行了各种各样的研究与尝试，但是直至目前为止并没有达到可适用于产业领域的水准。这是因为当通过化学合成的方法生产抗菌肽时，其经济性较差，而当通过利用微生物的遗传基因工程技法生产抗菌肽时，虽然其经济性良好，但却会因为所表达的抗菌肽阻碍宿主微生物的生长而导致抗菌肽的生产收率极低的问题。
因此，本发明人发明了一种可通过简单且经济性良好的方式实现抗菌肽的批量生产的方法，通过利用可轻易实现遗传基因操作且经济性良好的大肠杆菌表达系统并将在大肠杆菌中以不溶性形态表达的绿色荧光蛋白作为载体对结合到抗菌肽中的融合蛋白的表达进行诱导之后再通过从上述融合蛋白中分离出抗菌肽的过程而制造抗菌肽，从而解决因为蛋白质的加水分解而导致的阻碍抗菌肽生成的问题以及因为抗菌肽阻碍大肠杆菌的生长而导致的抗菌肽生产收率降低的问题。
作为相关的现有技术，包括大韩民国注册专利第10-0958095 号(利用翻译偶联系统的抗菌肽的批量表达方法)、大韩民国公开专利第10-2012-0062504号(在细胞表面表达的抗菌肽聚合物)等。
专利内容
本发明的目的在于提供一种能够通过将不溶性的绿色荧光蛋白作为载体进行使用并利用大肠杆菌表达系统制造出抗菌肽的制造工程简单、经济性良好且生产收率较高的抗菌肽制造方法。
为了实现上述目的，本发明提供一种由能够通过酸处理实现切割以及活性化的抗菌肽与绿色荧光蛋白结合而成的不溶性融合蛋白。
上述抗菌肽连续排列且在上述抗菌肽的N-末端、C-末端或上述的连接部上能够连接Asp-Pro氨基酸序列。上述连续排列的抗菌肽能够以3拷贝存在。上述天冬氨酸-脯氨酸(Asp-Pro)氨基酸序列能够通过酸处理实现切割，上述酸处理能够通过投入HCl而执行。
此外，本发明提供一种包括以序列编号24记录的氨基酸序列的不溶性融合蛋白。
此外，本发明提供一种包括用于对上述不溶性融合蛋白进行编码的以序列编号21记录的碱基序列的遗传基因。
此外，本发明提供一种将上述重组表达载体引进到宿主细胞中的转化体。上述宿主细胞能够是大肠杆菌。
此外，本发明提供一种包括：(1)在培养液中对利用以序列编号21记录的碱基序列进行重组的转化体进行培养的步骤；(2)从上述培养液回收转化体的步骤；(3)从转化体获取蛋白质的步骤；以及，(4)通过对上述蛋白质进行酸处理而分离出抗菌肽的步骤；的抗菌肽的制造方法。
上述蛋白能够以包涵体形态表达。
上述抗菌肽连续排列且在上述抗菌肽的N-末端、C-末端或上述的连接部上能够连接天冬氨酸-脯氨酸(Asp-Pro)氨基酸序列。上述连续排列的抗菌肽能够以3拷贝存在。上述天冬氨酸-脯氨酸 (Asp-Pro)氨基酸序列能够通过酸处理实现切割，上述酸处理能够通过投入HCl而执行。
如上所述的本发明能够通过提供一种制造工程简单、经济性良好且生产收率较高的抗菌肽的批量制造方法，在因为多重耐药性微生物的急剧增加而急需开发出全新抗生素的时代背景下将存在于大自然中的抗菌肽适用于制药以及饲料产业等。
此外，本发明能够通过利用以酸处理方式切割氨基酸的方式替代现有的使用氰化溴的方式，在从不溶性蛋白纯化出目标蛋白质的过程中节省成本、降低工程的危险性并更快速地完成所需的作业。
附图说明
图1a是用于不溶性绿色荧光蛋白与抗菌肽的融合的重组载体的模式图。
图1b是重组的r5M-172AMP173的氨基酸序列(下划线： r5M-GFP序列，黑色阴影：连接序列以及蛋氨酸部分，灰色阴影： AMP的氨基酸序列位(需要注意的是，以灰色阴影标记的AMP并不是氨基酸序列，而是抗菌肽(Antimicrobal peptide)的缩写))。
图1c是从不溶性绿色荧光蛋白纯化出抗菌肽的过程的模式图。
图2是重组的r5M-172(PG1)3173的氨基酸序列(下划线： r5M-GFP序列，灰色阴影且有下划线：从天冬氨酸置换成丝氨酸的部位，黑色阴影：连接序列以及天冬氨酸-脯氨酸(Asp-Pro)结合部位，灰色阴影但无下划线：PG1的氨基酸序列)。
图3是在对已插入r5M-172PG1173遗传基因的pET30b表达载体进行引进的大肠杆菌中，通过光学密度对已诱导以及未诱导蛋白质表达时的大肠杆菌的生长曲线进行测定的图表。
图4a是利用电子显微镜对从已插入r5M172PG1173遗传基因的转化体生成的蛋白质(箭头)形成包涵体的过程进行拍摄的照片。
图4b、图4c以及图4d是在进行免疫化学标记之后利用电子显微镜对从已插入r5M172PG1173遗传基因的转化体生成的蛋白质 (箭头)形成包涵体的过程进行拍摄的照片。
图5是以所有细胞蛋白为样本并利用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，对大肠杆菌中已插入r5M-172PG1173 遗传基因的pET30b表达载体在时间流逝(3小时、4小时、5小时) 时的r5M-172PG1173蛋白生成情况进行确认的结果。
图6a是利用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)对各个步骤中所表达的r5M-172PG1173蛋白进行确认的结果。
图6b是利用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)对各个步骤中的r5M-172PMAP36173蛋白进行确认的结果。
图7a以及图7b是利用三羟甲基氨基甲烷-三(羟甲基)甲基甘胺酸(tris-tricine)十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)对蛋白质纯化的各个步骤中所提取出的蛋白质样本的纯度进行分析的结果。
图7c是利用蛋白印记法(western blot)对所纯化的PG1进行确认的结果。
具体实施方式
接下来，将对本发明进行详细的说明。
本发明提供一种由能够通过酸处理实现切割以及活性化的抗菌肽(Antimicrobial peptide，AMP)与绿色荧光蛋白(Green Fluorescent protein，GFP)结合而成的不溶性融合蛋白。为了制造出上述不溶性融合蛋白，能够将绿色荧光蛋白作为抗菌肽的载体进行使用。通过利用由绿色荧光蛋白与抗菌肽结合而成的不溶性融合蛋白结构对表达进行诱导，能够防止抗菌肽受到损伤并将抗菌肽的表达对宿主造成的成长阻碍效果降至最低，从而预防因为宿主的成长受到阻碍而导致的生产收率下降的问题。
在适用本发明的一实施例中，上述抗菌肽连续排列且在上述抗菌肽的N-末端、C-末端或上述的连接部上能够连接Asp-Pro(天冬氨酸(aspartic acid)-脯氨酸(proline)，DP)氨基酸序列。上述连续排列的抗菌肽能够以3拷贝(copies)存在。上述天冬氨酸- 脯氨酸(Asp-Pro)氨基酸序列能够通过酸处理而实现切割。上述酸处理能够通过投入HCl而执行。
此外，本发明提供一种包括以序列编号24记录的氨基酸序列的绿色荧光蛋白。
为了制造出上述绿色荧光蛋白(以下简称为“GFP”)，能够在 GFP的氨基酸序列中的第218个蛋氨酸(M218)开始到丙氨酸 (alanine)为止的位置上诱发突变(mutation)。接下来，能够通过在所有的内部蛋氨酸(Met)位上诱发突变而诱导出蛋氨酸-缺失 GFP(以下简称为“r5M-GFP”)。此外，能够使第76个以及第204 个天冬氨酸(D76，D204)位置被置换成丝氨酸(Ser，S)。
在向r5M-GFP插入抗菌肽的方法中，能够首先利用Ndel和 Xhol限制酶位执行使r5M-GFP进入到pET30b载体内部的克隆处理。这能够通过利用限制酶的分离以及通过T4连接酶(ligase)的连接(ligation)过程而执行，其详细的过程如下所述。
能够将已插入r5M-GFP的pET30b载体作为DNA模板，通过设计出在5'方向上具有Ndel(包括起始密码子(start codon))限制酶位以及组氨酸标记(His-tag)而在3'方向上的第172个氨基酸之后具有连接肽(包括Kpnl限制酶位)以及蛋氨酸的引物并执行聚合酶链反应(PCR)而制造出N-末端侧断片(fragment)。C-末端侧短片也能够通过如上所述的方式，通过设计出在5'方向上具有蛋氨酸、连接肽以及第173个氨基酸而在3'方向上具有组氨酸标记 (His-tag)、终止密码子(stop codon)以及Xhol限制酶位的引物而进行扩增。
能够将对PG1或PMAP36进行译码的遗传基因作为DNA模板，设计出在5'方向上具有对Kpnl限制酶位、连接肽(连接肽包括Kpnl 限制酶位)以及蛋氨酸进行译码的碱基序列而在3'方向上具有对蛋氨酸、BamHI限制酶位以及连接肽(连接肽包括BamHI限制酶位) 进行译码的碱基序列的引物之后执行聚合酶链反应(PCR)。
在通过重叠延伸聚合酶链反应(overlap PCR)对通过聚合酶链反应(PCR)扩增的PG1或PMAP36的各个遗传基因以及上述从 r5M-GFP扩增的两个断片进行扩增时，能够获取到包括可对抗菌肽进行译码的序列的遗传基因(r5M-172-PG1-173或r5M-172-PMAP-173)。因为在各个断片以及遗传基因中，通过之前的聚合酶链反应(PCR)步骤添加的蛋氨酸、连接肽部分的碱基序列相辅，因此能够得到上述结果(接下来，将抗菌肽被结合到上述 GFP上的如图1A所示的结构标记为“r5M-172AMP173”)。
上述r5M-172-PG1-173或r5M-172-PMAP-173遗传基因能够在聚合酶链反应(PCR)之后通过凝胶抽提(gel extraction)过程从琼脂糖凝胶获得。接下来，能够利用Ndel和Xhol限制酶分别对上述遗传基因进行切割，然后通过在利用相同的两个限制酶进行切割的pET0b载体上利用T4连接酶(ligase)进行连接以及转化而完成克隆处理(图1B)。
在向r5M-GFP插入遗传基因的上述系统中，能够通过如上所述的重叠延伸聚合酶链反应(overlap PCR)执行克隆处理，且可能需要执行多次聚合酶链反应(PCR)过程以及在各个聚合酶链反应 (PCR)过程之后执行的凝胶抽提(gel extraction)过程。
通过利用Kpnl和BamHI限制酶对在上述克隆处理之后克隆获得的载体进行切割，能够分离出已插入的遗传基因。通过利用与上述PG1以及PMAP36遗传基因相同的方式设计出需要进行克隆的遗传基因的引物，并在通过聚合酶链反应(PCR)扩增之后利用 Kpnl和BamHI限制酶进行切割，再连接到对已插入的遗传基因进行分离的载体中，能够对克隆过程进行简化。较佳地， r5M-172AMP173遗传基因所包含的限制酶能够按照Ndel、Kpnl、 BamHI以及Xhol的顺序进行配置。
此外，本发明提供一种包括用于对上述绿色荧光蛋白进行编码的以序列编号21记录的碱基序列的遗传基因。
此外，本发明提供一种包括上述遗传基因的重组表达载体。
重组的上述遗传基因(r5-M172AMP173)能够被插入到pET30b 表达载体的Ndel和Xhol限制酶位，此时，为了在r5M-172AMP173 的两侧末端黏附组氨酸标记(his-tag)，能够在设计上述聚合酶链反应(PCR)引物时添加组氨酸标记(his-tag)序列。组氨酸标记 (his-tag)是指黏附于重组蛋白末端的多个组氨酸(histidine)，通过利用组氨酸(histidine)对金属粒子的选择性结合能力，能够轻易地对重组蛋白进行分离和纯化。
组氨酸(histidine)是具有咪唑基的氨基酸，主要能够轻易地与如Ni2+或Fe2+等2价金属粒子实现结合。组氨酸标记(his-tag) 需要从重组蛋白表达载体的制造步骤开始考虑其粘附与否，使得在重组蛋白碱基序列的前端部分或后端部分表达多个组氨酸(histidine)，而通常所表达的组氨酸(histidine)的数量能够是6 个以上。
此外，本发明提供一种将上述重组表达载体引进到宿主细胞中的转化体。较佳地，作为上述宿主细胞能够选择大肠杆菌。上述大肠杆菌能够是大肠杆菌(E.coli)BL21。
此外，本发明提供一种包括：(1)在培养液中对利用以序列编号21记录的碱基序列进行重组的转化体进行培养的步骤；(2)从上述培养液回收转化体的步骤；(3)从转化体获取蛋白质的步骤；以及，(4)通过对上述蛋白质进行酸处理而分离出抗菌肽的步骤；的抗菌肽的制造方法。上述蛋白质能够是不溶性蛋白。
在上述步骤(1)中，上述转化体能够是大肠杆菌(E.coli)BL21，能够在37℃的1LLB培养基(Luria-Bertani broth)中进行培养，能够通过投入IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，Isopropyl β-D thiogalactoside)而诱导蛋白质的表达。
在上述步骤(2)中，上述回收能够利用离心分离机执行。
在适用本发明的一实施例中，上述不溶性蛋白能够以包涵体 (inclusionbodies)的形态表达。
为了提取出上述不溶性蛋白，能够利用超声波震碎机 (sonicator)震碎细胞并通过对所震碎的裂解物(lysate)进行离心分离而获取可溶性以及不溶性分离物。在利用裂解缓冲液(lisys buffer)对不溶性分离物进行再悬浮之后，能够通过投入溶菌酶(lysozyme)破坏细胞壁，而在通过投入脱氧核糖核酸酶(DNase) 对DNA进行切割之后，能够通过离心分离对以包涵体(inclusion bodies)形态表达的不溶性蛋白进行分离。
为了提升上述所分离出的不溶性蛋白的收率，能够执行利用包括溶菌酶(lysozyme)和脱氧核糖核酸酶的磷酸钠缓冲溶液(sodium phosphate buffer)去除细胞壁(cell wall)、细胞碎片(cell debris) 以及基因组DNA(gDNA)的洗涤步骤(washingstep)。
上述不溶性蛋白是以包涵体形态表达，因此能够将因为抗菌肽的毒性作用而对宿主细胞的生长造成的阻碍降至最低，此外还能够防止如抗菌肽等分子量较小的多肽因为存在于宿主细胞内部的蛋白酶而发生分解，从而提升抗菌肽制造过程中的生产收率。
上述以包涵体形态表达的不溶性蛋白能够通过镍-次氮基三乙酸柱色谱法(Ni-NTA column chromatograph)进行纯化，洗脱分离物能够通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行分析，再以脱离子水作为透析液进行透析。透析用于去除在纯化过程中所投入的尿素、咪唑、NaCl，在经过上述过程之后，能够通过对不溶性蛋白进行冻结干燥而去除不必要的水。通过如上所述的透析以及冻结干燥过程，能够获取到高浓度的不溶性蛋白。
在适用本发明的一实施例中，上述抗菌肽连续排列且在上述抗菌肽的N-末端、C-末端或上述的连接部上能够连接天冬氨酸-脯氨酸(Asp-Pro)氨基酸序列。上述连续排列的抗菌肽能够以3拷贝存在。上述天冬氨酸-脯氨酸(Asp-Pro)氨基酸序列能够通过酸处理而实现切割。上述酸处理能够通过投入HCl而执行。
上述酸处理是利用酸性条件对氨基酸键进行切割的方法，目前所使用的氰化溴会因为其毒性较强而需要非常小心地进行使用并因此导致工程速度变慢的问题，同时还会因为其价格较高而导致经济性不良的问题，酸处理方法能够对上述问题进行改善，从而以较低的成本实现所需要的目的。
通过对位于上述抗菌肽(PG1，PMAP36)两侧的N-末端与C- 末端部位进行切割，能够仅获取到抗菌肽(图1C)。接下来，能够通过反相高压液相色谱法(reverse phase HPLC)对抗菌肽进行纯化。通过向纯化出的抗菌肽添加重折叠缓冲液(refolding buffer)，能够使其以天然(native)状态重折叠，同时还能够通过透析将重折叠缓冲液(refoldingbuffer)替换成脱离子水。
此外，迄今为止从各种不同的生物体发现的抗菌肽，能够根据其结构分成三种类型。第一种为富含半胱氨酸的β-折叠(sheet) 肽，第二种为α-螺旋(helical)两亲性分子，而第三种为富含脯氨酸的肽。如上所述的抗菌肽的各种不同的结构取决于肽氨基酸序列，而上述结构与肽的抗菌活性具有非常密切的关系。
在本发明中，使用了通过两个二硫键实现稳定化的，具有典型的反平行β-转角结构的猪源抗菌肽(Protegrin1，PG1)，这最初是在猪的白细胞中被发现。除此之外，还使用了具有螺旋(helix)结构的猪骨髓源抗菌肽36(Pig myeloid antibacterial peptide36，PMAP36)，但是并不以此为限。
为了对按照适用本发明的实施例进行纯化的抗菌肽PG1以及 PMAP36的抗菌活性进行确认，通过利用大肠杆菌(E.coli)ATCC 25922、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)ATCC 27853以及金黄色酿脓葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC 29213执行 Spot-On-Lawn测试确认了其具有抗菌活性，具体结果如下述表1 所示。
【表1】
表所生成的重组AMP的抗菌活性试验
接下来，将结合实施例对本发明进行更为详细的说明。下述实施例只是用于对本发明进行示例性说明，具有本领域一般知识的人员应该理解，本发明的范围并不因为下述实施例而受到限定。
实施例1。用于制造由不溶性绿色荧光蛋白与抗菌肽结合而成的融合蛋白的DNA扩 增以及表达载体的制造
以对抗菌肽PG1进行译码的遗传基因(下述序列编号1)以及对PMAP36(下述序列编号2)进行译码的遗传基因作为DNA模板，设计出在5'方向上具有对Kpnl限制酶位、连接肽(连接肽包括Kpnl 限制酶位)以及蛋氨酸进行译码的碱基序列而在3'方向上具有对蛋氨酸、BamHI限制酶位以及连接肽(连接肽包括BamHI限制酶位) 进行译码的碱基序列的引物之后执行聚合酶链反应(PCR)。扩增所需的各个引物序列如下述表2所示。
序列编号1；
5'-AGGGGAGGTCGCCTGTGCTATTGTAGGCGTAGGTTCTGC GTCTGTGTCGGACGAGGA-3'
序列编号2；
5-'GGACGATTTAGACGGTTGCGTAAGAAGACCCGAAAACGTTTGAAGAAGATCGGGAAGGTTTTGAAGTGGATTCCTCCCATTGT CGGCTCAATACCCTTGGGTTGTGGG-3'
此外，在将上述抗菌肽插入到已诱发突变的r5M-GFP的方法中，对r5M-GFP遗传基因以及抗菌肽分别设计了5'方向以及3'方向上的引物。扩增所需的各个引物序列如下述表2所示。
【表2】
在上述引物序列的序列编号3的碱基序列中，包括用于在后续工程中与表达载体pET30b进行结合的限制酶Ndel的识别序列以及用于Ni-NTA柱色谱法的6x组氨酸标记(Histag)序列 (5'-CATCACCATCATCACCAT-3')，而在接下来的序列编号4的碱基序列以及序列编号5的碱基序列中，包括为了利用氰化溴的肽切割而对蛋氨酸进行编码的ATG密码子。此外，在序列编号6的碱基序列中，包括用于在后续工程中与表达载体pET30b进行结合的限制酶Ndel的识别序列，在序列编号7(退火温度：57℃)以及序列编号9(退火温度：50℃)的碱基序列中，包括限制酶Kpnl以及用于利用氰化溴的肽切割的ATG密码子。此外，在序列编号8以及序列编号10的碱基序列中，包括限制酶BamHI的识别序列以及用于利用氰化溴的肽切割的ATG密码子。通过按照如上所述的方式添加用于对蛋氨酸进行编码的ATG密码子，能够在后续的从融合蛋白仅分离出抗菌肽PG1以及PMAP36的步骤中，使得在利用氰化溴(CNBr)进行处理时能够对紧邻蛋氨酸残基之后的肽结合进行切割，从而仅分离出抗菌肽。
在通过重叠延伸聚合酶链反应(overlap PCR)对通过聚合酶链反应(PCR)扩增的PG1或PMAP36的各个遗传基因以及上述从 r5M-GFP扩增的两个断片进行扩增时，能够获取到包括可对抗菌肽进行译码的序列的遗传基因(r5M-172-PG1-173或 r5M-172-PMAP-173)。因为在各个断片以及遗传基因中，通过之前的聚合酶链反应(PCR)步骤添加的蛋氨酸、连接肽部分的碱基序列相辅，因此能够得到上述结果(接下来，将抗菌肽被结合到上述 GFP上的如图1A所示的结构标记为“r5M-172AMP 173”)。
此外，为了增强PG1的表达，通过将拷贝数量增加至3个而尝试实现重组。利用以序列编号11记录的正方向5'末端和以序列编号12记录的反方向3'末端引物，对PG1的遗传基因断片进行了扩增。各个PG1单体(monomer)是利用T4DNA连接酶(Ligase) (NEB)进行连续连接。对于连续包括PG1的3拷贝的聚合物(以下简称为(PG1)3)，在3％的低熔点琼脂糖(lowmelting agarose)凝胶中进行电泳并观察到150至300bp大小的DNA带之后，利用苯酚-氯仿(phenol-chloroform)纯化出(PG1)3。
序列编号11(5'->3')；
CCGAGGGGAGGTCGCCTGTGCTATTGTAGGCGTAGGTTCTG CGTCTGTGTCGGACGAGGAGAC
序列编号12(5'->3')；
TCCTCGTCCGACACAGACGCAGAACCTACGCCTACAATAGC ACAGGCGACCTCCCCTCGGCTG
通过对在上述过程中得到扩增的DNA断片进行连接(ligation) 而完成重组，其中抗菌肽PG1、PMAP36以及(PG1)3遗传基因被插入到GFP的氨基酸序列中的第172号以及第173号之间的环(loop) 区。其中，(PG1)3遗传基因的插入是利用以序列编号13以及14记录的引物执行(表3)。借此，(PG1)3形成了在3拷贝连续排列的 PG1的各个拷贝的N-末端、C-末端或上述之连接部上连接Asp-Pro (天冬氨酸-脯氨酸，DP)氨基酸序列的结构。
【表3】
因为在后续的步骤中，需要通过对从已插入(PG1)3遗传基因的转化体生成的蛋白质中的天冬氨酸-脯氨酸(Asp-Pro)部位进行切割而分离出PG1，因此在插入(PG1)3遗传基因之前，首先执行了分离工程所需的r5M-GFP的定点突变(site directed mutagenesis)。因为重组遗传基因的第76个以及第204个天天冬氨酸(D76、D204) 位置对应于天冬氨酸-脯氨酸(Asp-Pro)结合部位，因此还能够通过将其分别置换成丝氨酸(Ser，S)而防止在分离蛋白质的过程中发生不必要的结合部位被切断的现象(图2)。用于执行上述置换的引物如下述表4所示。利用下述以序列编号15以及序列编号16 记录的引物，将第76个天冬氨酸置换成丝氨酸，并利用以序列编号17以及18记录的引物，将第204个天冬氨酸置换成丝氨酸。
【表4】
通过上述过程完成重组的遗传基因，标记为“r5M-172PG1173” (插入抗菌肽PG1遗传基因)、“r5M-172PMAP36173”(插入抗菌肽PMAP36)以及“r5M-172(PG1)3173”(插入抗菌肽(PG1)3 )。上述重组遗传基因r5M-172PG1173的碱基序列的序列编号为19， r5M-172PMAP36173的碱基序列的序列编号为20， r5M-172(PG1)3173的碱基序列的序列编号为21，具体如下。
序列编号19(5'->3')；
CATATGCATCACCATCATCACCATCAGAGCAAAGGCGAAGAACTGTTTACCGGCGTGGTGCCGATTCTGGTGGAACTGGATGGCGATGTGAACGGCCATAAATTTAGCGTGCGTGGCGAAGGCGAAGGCGATGCGACCAACGGCAAACTGACCCTGAAATTTATTTGCACCACCGGTAAACTGCCGGTGCCGTGGCCGACCCTGGTGACCACCCTGGGTTATGGTGTGCAGTGCTTTGCACGTTATCCGGATCACATCAAACGTCATGATTTCTTTAAAAGCGCGCTGCCGGAAGGCTATGTGCAGGAACGTACCATTAGCTTTAAAGATGATGGCACCTATAAAACCCGTGCGGAAGTGAAATTTGAAGGCGATACCCTGGTGAACCGTATTGAACTGAAAGGCATTGATTTTAAAGAAGATGGCAACATTCTGGGCCATAAACTGGAATATAACTTTAACAGCCATAAAGTGTATATTACCGCGGATAAACAGAAAAACGGCATTAAAGCGAACTTTAAAATTCGTCATAACGTGGAAGGTGGTTCTGGTACCATGAGGGGAGGTCGCCTGTGCTATTGTAGGCGTAGGTTCTGCGTCTGTGTCGGACGAGGAATGGGATCCGGTGGCGATGGCAGCGTGCAGCTGGCGGATCATTATCAGCAGAACACCCCGATTGGCGATGATAACCATTATCTGAGCACCCAGAGCGTGCTGCTGAAAGATCCGAACGAAAAACGTGATCACGCGGTGCTGCTGGAATTTGTGACCGCGGCGGGCATTACCCACGGCAAAGATGAACTGTATAAACATCACCATCATCACCATTAATAACT CGAGATC
序列编号20(5'->3')；
CATATGCATCACCATCATCACCATCAGAGCAAAGGCGAAGAACTGTTTACCGGCGTGGTGCCGATTCTGGTGGAACTGGATGGCGATGTGAACGGCCATAAATTTAGCGTGCGTGGCGAAGGCGAAGGCGATGCGACCAACGGCAAACTGACCCTGAAATTTATTTGCACCACCGGTAAACTGCCGGTGCCGTGGCCGACCCTGGTGACCACCCTGGGTTATGGTGTGCAGTGCTTTGCACGTTATCCGGATCACATCAAACGTCATGATTTCTTTAAAAGCGCGCTGCCGGAAGGCTATGTGCAGGAACGTACCATTAGCTTTAAAGATGATGGCACCTATAAAACCCGTGCGGAAGTGAAATTTGAAGGCGATACCCTGGTGAACCGTATTGAACTGAAAGGCATTGATTTTAAAGAAGATGGCAACATTCTGGGCCATAAACTGGAATATAACTTTAACAGCCATAAAGTGTATATTACCGCGGATAAACAGAAAAACGGCATTAAAGCGAACTTTAAAATTCGTCATAACGTGGAAGGTGGTTCTGGTACCATGGGACGATTTAGACGGTTGCGTAAGAAGACCCGAAAACGTTTGAAGAAGATCGGGAAGGTTTTGAAGTGGATTCCTCCCATTGTCGGCTCAATACCCTTGGGTTGTGGGATGGGATCCGGTGGCGATGGCAGCGTGCAGCTGGCGGATCATTATCAGCAGAACACCCCGATTGGCGATGATAACCATTATCTGAGCACCCAGAGCGTGCTGCTGAAAGATCCGAACGAAAAACGTGATCACGCGGTGCTGCTGGAATTTGTGACCGCGGCGGGCATTACCCACGGCAAAGATGAACTGTATAAACATCACCATCATCACCATTA ATAACTCGAG
序列编号21(5'->3')；
ATGCATCACCATCATCACCATCAGAGCAAAGGCGAAGAACTGTTTACCGGCGTGGTGCCGATTCTGGTGGAACTGGATGGCGATGTGAACGGCCATAAATTTAGCGTGCGTGGCGAAGGCGAAGGCGATGCGACCAACGGCAAACTGACCCTGAAATTTATTTGCACCACCGGTAAACTGCCGGTGCCGTGGCCGACCCTGGTGACCACCCTGGGTTATGGTGTGCAGTGCTTTGCACGTTATCCGTCTCACATCAAACGTCATGATTTCTTTAAAAGCGCGCTGCCGGAAGGCTATGTGCAGGAACGTACCATTAGCTTTAAAGATGATGGCACCTATAAAACCCGTGCGGAAGTGAAATTTGAAGGCGATACCCTGGTGAACCGTATTGAACTGAAAGGCATTGATTTTAAAGAAGATGGCAACATTCTGGGCCATAAACTGGAATATAACTTTAACAGCCATAAAGTGTATATTACCGCGGATAAACAGAAAAACGGCATTAAAGCGAACTTTAAAATTCGTCATAACGTGGAAGGTGGTTCTGGTACCGACCCGAGGGGAGGTCGCCTGTGCTATTGTAGGCGTAGGTTCTGCGTCTGTGTCGGACGAGGAGACCCGAGGGGAGGTCGCCTGTGCTATTGTAGGCGTAGGTTCTGCGTCTGTGTCGGACGAGGAGACCCGAGGGGAGGTCGCCTGTGCTATTGTAGGCGTAGGTTCTGCGTCTGTGTCGGACGAGGAGACCCGGGATCCGGTGGCGATGGCAGCGTGCAGCTGGCGGATCATTATCAGCAGAACACCCCGATTGGCGATGATAACCATTATCTGAGCACCCAGAGCGTGCTGCTGAAATCTCCGAACGAAAAACGTGATCACGCGGTGCTGCTGGAATTTGTGACCGCGGCGGGCATTACCCACGGCAAAGATGAACTGTATAAACACCATCACCACCATCACTAATAA
在上述序列编号19至序列编号21的碱基序列中，包括由下述序列编号22以及序列编号23的碱基序列构成的连接肽(linker)。
序列编号22；
5'-GGTGGTTCT-3'
序列编号23；
5'-GGATCCGGTGGC-3'
上述r5M-172PG1173、r5M-172PMAP36173以及r5M-172(PG1)3173被插入到pET30b表达载体的Ndel和Xhol限制酶位，从而制造出重组表达载体。
r5M-172(PG1)3173的氨基酸序列的序列编号为24，具体如下。在从此分离出抗菌肽PG1的步骤中，在利用HCl进行酸性条件处理时，能够通过使天冬氨酸-脯氨酸(Asp-Pro)结合中的天冬氨酸与脯氨酸之间的氨基酸结合被切割而仅分离出抗菌肽。
序列编号24(5'->3')；
MHHHHHHQSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVRGEGEGDATNGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLGYGVQCFARYPSHIKRHDFFKSALPEGYVQERTISFKDDGTYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNFNSHKVYITADKQKNGIKANFKIRHNVEGGSGTDPRGGRLCYCRRRFCVCVGRGDPRGGRLCYCRRRFCVCVGRGDPRGGRLCYCRRRFCVCVGRGDPGSGGDGSVQLADHYQQNTPIGDDNHYLSTQSVLLKSPNEKRDHAVLLEFVTAAGITHGKDELYK HHHHHH
实施例2。大肠杆菌转化体的培养以及融合蛋白的表达诱导
在将通过上述实施例1制造出的重组表达载体引进到大肠杆菌(E.coli)BL21之后，在37摄氏度的1L LB培养基(Luria-Bertani broth)中进行培养，然后通过投入0.1mM的IPTG(异丙基-β-D- 硫代半乳糖苷，Isopropyl β-D thiogalactoside)而诱导了蛋白质的表达。在培养物的浑浊度达到OD600(光密度(Optical Density) 600nm)即在600nm波长下的密度值达到0.6至0.8为止对蛋白质的表达进行了诱导，并在此之后的5小时内继续对表达进行了诱导。
实施例3。不溶性融合蛋白的分离
在4℃、800rpm条件下对通过上述实施例2诱导表达的培养物进行了10分钟的离心分离，从而对大肠杆菌细胞进行了回收。在利用超声波震碎机(sonicator)震碎所获取到的细胞之后，在4℃、 13000rpm条件下对所震碎的细胞震碎物进行了20分钟的离心分离，从而获取到了包括可溶性分离物和不溶性蛋白质的沉淀物 (pellet)。按照向每1L不溶性沉淀物添加40ml的裂解缓冲液(包括100mM氯化钠(sodium chloride)且pH值为7.4的20mM磷酸钠缓冲溶液(sodium phosphate buffer)，0.5％triton-X100，0.1mM PMSF，1mM DTT)的比例对其进行了再悬浮(resuspend)处理。接下来，向上述溶解物添加溶菌酶(0.1mg/ml)以及脱氧核糖核酸酶(0.01mg/ml)并在常温下进行了20分钟的孵化(incubation) 处理。在此过程中，借助于溶菌酶对细胞壁造成了破坏并借助于脱氧核糖核酸酶对DNA进行了切割。
接下来，在4℃、8000rpm条件下对上述已添加溶菌酶以及脱氧核糖核酸酶的溶解物进行10分钟的离心分离，从而获取到了以包涵体(inclusion bodies)形态表达的不溶性蛋白。为了提升所获取到的不溶性蛋白的收率，执行了2次利用包括溶菌酶(lysozyme) 和脱氧核糖核酸酶的磷酸钠缓冲溶液(sodium phosphate buffer)去除细胞壁(cell wall)、细胞碎片(cell debris)以及基因组DNA (gDNA)的洗涤步骤(washing step)。
接下来，利用包括8M尿素(urea)以及30mM咪唑(imidazole) 且pH值为7.4的20mM磷酸钠缓冲溶液(sodium phosphate buffer) 对上述不溶性蛋白进行了再悬浮，并通过Ni-NTA柱色谱法(GE 医疗生命科学，瑞典)进行了纯化。
通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对纯化之后所溶出的分离物进行了分析，并在常温条件下以脱离子水作为透析液进行了透析。
实施例4。抗菌肽PG1、PMAP36的分离以及纯化
在上述实施例3中，对纯化并透析之后的不溶性蛋白进行冻结干燥处理，再利用70％的甲酸(formic acid)进行了溶解。
在向从包括重组遗传基因r5M-172PG1173以及r5M-172PMAP36173的转化体生成的不溶性蛋白溶液添加氰化溴 (CNBr)溶液之后，在暗室中进行24小时的孵化(incubation)，从而对位于抗菌肽PG1以及PMAP36两侧的GFP的N-末端以及C-末端部位进行了切割。通过冻结干燥对上述甲酸以及氰化溴进行去除，然后利用反相高压色谱法用的缓冲液进行了溶解。
为了能够从r5M-172(PG1)3173纯化出抗菌肽PG1，使用了利用酸性条件的氨基酸结合切割方法。这是因为目前所使用的氰化溴会因为其毒性较强而需要非常小心地进行使用并因此导致工程速度变慢的问题，同时还会因为其价格较高而导致经济性不良的问题。
从包括重组遗传基因r5M-172(PG1)3173的转化体生成的不溶性蛋白，通过实施例1形成了PG1的3拷贝连续排列且在上述PG1 的各个拷贝的N-末端、C-末端或上述之连接部上连接Asp-Pro(天冬氨酸-脯氨酸，DP)氨基酸序列的结构。通过在75℃的条件下利用80mM的HCl对上述不溶性蛋白进行4小时的处理而对天冬氨酸 -脯氨酸(Asp-Pro)氨基酸结合进行了切割，从而从不溶性蛋白分离出了PG1。
通过16％的三羟甲基氨基甲烷-三(羟甲基)甲基甘胺酸 (tris-tricine)十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，在各个步骤对所纯化出的蛋白质的纯度进行了分析。
抗菌肽PG1以及PMAP36是利用反相高压色谱法(沃特世 Deltapak C 18column7.8，300mm)进行了纯化，将试料以2.5ml/ 分钟的流速持续1小时倒入到包括0.1％的三氟乙酸(trifluoroacetic acid)且具有5至90％的线形浓度梯度的管中。在220nm以及280nm下对吸光度进行了观察，并通过16％的三羟甲基氨基甲烷-三(羟甲基)甲基甘胺酸(tris-tricine)十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对不一致的峰值进行了分析。
为了形成所纯化出的分离物的重折叠条件(refolding condition)，在执行通过冻结干燥而去除不必要的缓冲液的步骤之后，通过添加由包括8M尿素、5mM还原的谷胱甘肽(glutathione) 以及0.5mM氧化的谷胱甘肽(glutathione)的20mM磷酸钠缓冲溶液(sodiumphosphate buffer)(pH值为7.4)构成的重折叠缓冲液 (refolding buffer)而使其以天然状态重折叠(refolding)，同时通过透析将重折叠缓冲液(refolding buffer)替换成了脱离子水。接下来，对经过纯化以及透析的肽进行了冻结干燥。
试验例1。已插入r5M-172PG1173遗传基因的pET30b表达载体的蛋白质表达被诱导 或未被诱导时的大肠杆菌(E.coli)BL21的生长曲线的测定以及比较
在对已插入r5M172-PG1-173遗传基因的pET30b表达载体进行引进的大肠杆菌(E.coli)BL21中，通过光学密度(optical density) 测定的方式，对蛋白质表达被诱导或未被诱导时的大肠杆菌 (E.coli)BL21的生长进行了测定以及比较。
其结果如图3所示，可以发现r5M-172PG1173蛋白质的表达并没有对大肠杆菌的生长率造成过大的影响。即，作为载体被插入到不溶性GFP中的抗菌肽并不会对大肠杆菌的生长造成过大的影响。如图4所示，r5M-172PG1173蛋白以包涵体形态被表达。
虽然为了实现抗菌肽的稳定生产而做出了与融合标签进行结合的多种尝试，但是因为生产收率较低，因此必须采取如投入高营养的培养基、在融合标签之间插入遗传基因的多个拷贝等需要耗费额外的生产成本的完善措施。但是，通过向以不溶性状态高度表达的GFP插入抗菌肽而制造出的适用本发明的融合蛋白，能够将对宿主细胞的生长阻碍降至最低并借此以较高的收率生产出抗菌肽。
试验例2。已插入r5M-172PG1173遗传基因的pET30b表达载体在时间流逝时的蛋白 质生成性测定
以所有细胞蛋白为样本并利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，对大肠杆菌中已插入r5M-172PG1173遗传基因的pET30b表达载体在时间流逝(3小时、4小时、5小时)时的r5M-172PG1173蛋白生成情况进行了确认。
其结果如图5所示，与r5M-172PG1173蛋白表达未被诱导的泳道(lane)(UI)不同，在蛋白表达被诱导的泳道(lane)(3小时、4小时、5小时)中，3小时至5小时期间内大肠杆菌(E.coli) BL21中的r5M-172PG1173蛋白质均被明显表达。
试验例3。引进到大肠杆菌(E.coli)BL21中的pET30b表达载体内的r5M-172PG1173 以及r5M-172PMAP36173蛋白质生成性测定
对于被分别插入到r5M-GPF遗传基因中的PG1以及PMAP36 遗传基因，在被克隆到pET30b表达载体中之后在大肠杆菌(E.coli) BL21上进行了5小时的表达诱导。
预计上述重组蛋白在细胞内的所有蛋白质中占比约45至50％。从每1L细胞培养物获取到1.4g的r5M-172PG1173不溶性蛋白 (31kDa)以及从每1L细胞培养物获取到1.3g的r5M-172PG1173 不溶性蛋白(33kDa)，如电泳的最终不溶性分离物部分所示，最终占到了目标蛋白的几乎90％(图6A以及图6B)。
利用Ni-NTA柱色谱法对上述不溶性蛋白进行纯化并对所纯化出的目标蛋白进行了池(pool)化，然后以脱离子水作为透析液进行了透析。
试验例4。抗菌肽PG1以及PMAP36的收率测定
在通过上述试验例3进行透析的蛋白质样本中，从r5M-GPF 分别对PG1以及PMAP36进行了切割，接下来在利用HPLC对PG1 (2.4kDa)以及PMAP36(4.2kDa)进行纯化之后对其收率进行了测定。
其结构如表5所示，从包括PG1的3拷贝的重组体 (r5M-172(PG1)3173)生成的蛋白质呈现出了约2.3倍的收率
【表5】
试验例5。抗菌肽PG1以及PMAP36的纯度分析
为了获得高纯度的PG1以及PMAP36，通过三羟甲基氨基甲烷 -三(羟甲基)甲基甘胺酸(tris-tricine)十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对在蛋白质纯化的各个步骤中所提取出的蛋白质样本进行了加样(loading)，并通过电泳对其纯度进行了分析，最终获取到了纯度达到95％以上的抗菌肽PG1以及PMAP36 (图7A以及图6B)。
此外，利用抗-PG1抗体以及蛋白印记法(western blot)对所纯化的PG1进行了确认。如图7所示，在2.4kDa的位置上明确观察到了PG1。
在上述内容中，对本发明的特定部分进行了详细的说明，但是具有相关行业一般知识的人员应该理解，上述具体实施例知识较佳的实施形态，本发明的范围并不因此而受到限制。因此，本发明的实际范围应通过所附的权利要求书及其等价物做出定义。

Claims (16)

1.一种不溶性融合蛋白，其特征在于：
由能够通过酸处理实现切割以及活性化的抗菌肽(Antimicrobial peptide，AMP)与绿色荧光蛋白(Green Fluorescent protein，GFP)结合而成。
2.根据权利要求1所述的不溶性融合蛋白，其特征在于：
上述酸处理通过投入HCl而执行。
3.根据权利要求1所述的不溶性融合蛋白，其特征在于：
上述抗菌肽连续排列且在上述抗菌肽的N-末端、C-末端或上述的连接部上连接天冬氨酸-脯氨酸(Asp-Pro)氨基酸序列。
4.根据权利要求3所述的不溶性融合蛋白，其特征在于：
上述连续排列的抗菌肽以3拷贝(copies)存在。
5.根据权利要求3所述的不溶性融合蛋白，其特征在于：
上述天冬氨酸-脯氨酸(Asp-Pro)氨基酸序列通过酸处理而实现切割。
6.一种不溶性融合蛋白，其特征在于，包括：
以序列编号24记录的氨基酸序列。
7.一种遗传基因，其特征在于，包括：
用于对第6项所述的不溶性融合蛋白进行编码的以序列编号21记录的碱基序列。
8.一种重组表达载体，其特征在于，包括：
第7项所述的遗传基因。
9.一种转化体，其特征在于：
将第8项所述的重组表达载体引进到宿主细胞中。
10.根据权利要求9所述的转化体，其特征在于：
上述宿主细胞是大肠杆菌。
11.一种抗菌肽的制造方法，其特征在于，包括：
(1)在培养液中对利用以序列编号21记录的碱基序列进行重组的转化体进行培养的步骤；
(2)从上述培养液回收转化体的步骤；
(3)从转化体获取蛋白质的步骤；以及，
(4)通过对上述蛋白质进行酸处理而分离出抗菌肽的步骤。
12.根据权利要求11所述的制造方法，其特征在于：
上述蛋白以包涵体(inclusion bodies)的形态表达。
13.根据权利要求11所述的制造方法，其特征在于：
上述抗菌肽连续排列且在上述抗菌肽的N-末端、C-末端或上述的连接部上连接天冬氨酸-脯氨酸(Asp-Pro)氨基酸序列。
14.根据权利要求13所述的制造方法，其特征在于：
上述天冬氨酸-脯氨酸(Asp-Pro)氨基酸序列通过酸处理而实现切割。
15.根据权利要求14所述的制造方法，其特征在于：
上述酸处理通过投入HCl而执行。
16.根据权利要求13所述的制造方法，其特征在于：
上述连续排列的抗菌肽以3拷贝存在。
CN201680076161.6A 2016-01-27 2016-02-26 包含抗菌肽的不溶性融合蛋白以及利用上述不溶性融合蛋白的抗菌肽制造方法 Active CN108779152B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020160009970A KR101830792B1 (ko) 2016-01-27 2016-01-27 항균 펩타이드를 포함하는 불용성 융합단백질 및 이를 이용한 항균 펩타이드의 제조 방법
KR10-2016-0009970 2016-01-27
PCT/KR2016/001940 WO2017131279A1 (ko) 2016-01-27 2016-02-26 항균 펩타이드를 포함하는 불용성 융합단백질 및 이를 이용한 항균 펩타이드의 제조 방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108779152A true CN108779152A (zh) 2018-11-09
CN108779152B CN108779152B (zh) 2022-08-26

Family

ID=59398212

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201680076161.6A Active CN108779152B (zh) 2016-01-27 2016-02-26 包含抗菌肽的不溶性融合蛋白以及利用上述不溶性融合蛋白的抗菌肽制造方法

Country Status (5)

Country Link
US (1) US11230575B2 (zh)
EP (1) EP3409685B1 (zh)
KR (1) KR101830792B1 (zh)
CN (1) CN108779152B (zh)
WO (1) WO2017131279A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113614113A (zh) * 2019-03-19 2021-11-05 宁波鲲鹏生物科技有限公司 含有荧光蛋白片段的融合蛋白及其用途

Citations (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5994077A (en) * 1997-01-31 1999-11-30 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Flourescence-based isolation of differentially induced genes
US20040234609A1 (en) * 2003-05-14 2004-11-25 Collier Katherine D. Repeat sequence protein polymer active agent congjugates, methods and uses
CN1662657A (zh) * 2002-04-22 2005-08-31 陶氏环球技术公司 低成本生产肽
CN1926238A (zh) * 2004-02-27 2007-03-07 陶氏化学公司 植物细胞中的高效肽生产
US20080028078A1 (en) * 2004-12-20 2008-01-31 Fujitsu Limited Relay program, communication processing program, and firewall system
CN101198700A (zh) * 2005-04-26 2008-06-11 桑多斯股份公司 通过融合蛋白的自我蛋白剪切制备重组蛋白
CN101280021A (zh) * 2008-05-20 2008-10-08 广西天池海洋生物药业有限公司 抗对虾白斑综合症病毒工程蛋白vp28-cd及制备和用途
CN101287489A (zh) * 2005-06-01 2008-10-15 陶氏环球技术公司 多价病毒样颗粒的生产
CN101310023A (zh) * 2005-07-15 2008-11-19 韩国生命工学研究院 用于生产重组蛋白质的翻译融合配偶体文库和从中筛选的翻译融合配偶体
CN101365804A (zh) * 2005-10-27 2009-02-11 波士顿大学董事会 活化的分裂多肽及其制备方法和用途
CN101784655A (zh) * 2007-04-27 2010-07-21 菲尼克斯股份有限公司 可溶性重组二十面体病毒样颗粒的改良生成和体内装配
CN102399292A (zh) * 2011-09-14 2012-04-04 盛剑鹏 重组干细胞因子与免疫球融合蛋白及其制备
US20150051374A1 (en) * 2012-03-23 2015-02-19 Suzhou Kunpeng Biotech Co., Ltd. Fusion proteins of superfolder green fluorescent protein and use thereof
CN104530206A (zh) * 2015-01-30 2015-04-22 中国农业科学院油料作物研究所 一种油菜抗菌肽BnCRP1及其应用
KR101622373B1 (ko) * 2014-12-18 2016-05-19 건국대학교 산학협력단 지지체로서 불용성 녹색형광단백질을 이용한 항균 펩타이드의 제조방법
KR102040982B1 (ko) * 2017-05-29 2019-11-06 바이오위더스 주식회사 고용해성 녹색형광 단백질과 보툴리늄 독소 단백질의 융합단백질 구성을 통한 재조합 보툴리늄 독소 단백질의 대량생산 기술

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006076742A2 (en) * 2005-01-16 2006-07-20 Georgia Tech Research Corporation Methods and compositions for increasing membrane permeability
DK1874825T3 (da) 2005-04-26 2010-07-05 Sandoz Ag Affinitetsligander
KR100958095B1 (ko) * 2007-12-31 2010-05-14 한국과학기술원 번역 동반 시스템을 이용한 항균 펩타이드의 대량 발현방법
KR101286733B1 (ko) 2010-12-06 2013-07-16 재단법인 지능형 바이오 시스템 설계 및 합성 연구단 세포표면에서 발현되는 항균 펩타이드 다중합체
KR20150084152A (ko) * 2014-01-13 2015-07-22 대한민국(농촌진흥청장) 재조합 항균펩타이드를 생산하는 형질전환 누에
KR101550217B1 (ko) 2014-03-26 2015-09-04 전남대학교산학협력단 숙주세포의 생체 회로 간섭 없이 외래 유전자를 발현하기 위한 재조합 벡터 및 이의 용도

Patent Citations (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5994077A (en) * 1997-01-31 1999-11-30 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Flourescence-based isolation of differentially induced genes
CN1662657A (zh) * 2002-04-22 2005-08-31 陶氏环球技术公司 低成本生产肽
US20040234609A1 (en) * 2003-05-14 2004-11-25 Collier Katherine D. Repeat sequence protein polymer active agent congjugates, methods and uses
CN1926238A (zh) * 2004-02-27 2007-03-07 陶氏化学公司 植物细胞中的高效肽生产
US20080028078A1 (en) * 2004-12-20 2008-01-31 Fujitsu Limited Relay program, communication processing program, and firewall system
CN101198700A (zh) * 2005-04-26 2008-06-11 桑多斯股份公司 通过融合蛋白的自我蛋白剪切制备重组蛋白
CN101287489A (zh) * 2005-06-01 2008-10-15 陶氏环球技术公司 多价病毒样颗粒的生产
CN101310023A (zh) * 2005-07-15 2008-11-19 韩国生命工学研究院 用于生产重组蛋白质的翻译融合配偶体文库和从中筛选的翻译融合配偶体
CN101365804A (zh) * 2005-10-27 2009-02-11 波士顿大学董事会 活化的分裂多肽及其制备方法和用途
CN101784655A (zh) * 2007-04-27 2010-07-21 菲尼克斯股份有限公司 可溶性重组二十面体病毒样颗粒的改良生成和体内装配
CN101280021A (zh) * 2008-05-20 2008-10-08 广西天池海洋生物药业有限公司 抗对虾白斑综合症病毒工程蛋白vp28-cd及制备和用途
CN102399292A (zh) * 2011-09-14 2012-04-04 盛剑鹏 重组干细胞因子与免疫球融合蛋白及其制备
US20150051374A1 (en) * 2012-03-23 2015-02-19 Suzhou Kunpeng Biotech Co., Ltd. Fusion proteins of superfolder green fluorescent protein and use thereof
CN104619726A (zh) * 2012-03-23 2015-05-13 苏州鲲鹏生物技术有限公司 由超折叠绿色荧光蛋白构成的融合蛋白及其用途
KR101622373B1 (ko) * 2014-12-18 2016-05-19 건국대학교 산학협력단 지지체로서 불용성 녹색형광단백질을 이용한 항균 펩타이드의 제조방법
CN104530206A (zh) * 2015-01-30 2015-04-22 中国农业科学院油料作物研究所 一种油菜抗菌肽BnCRP1及其应用
KR102040982B1 (ko) * 2017-05-29 2019-11-06 바이오위더스 주식회사 고용해성 녹색형광 단백질과 보툴리늄 독소 단백질의 융합단백질 구성을 통한 재조합 보툴리늄 독소 단백질의 대량생산 기술

Non-Patent Citations (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHALFIE: "GREEN FLUORESCENT PROTEIN", 《PHOTOCHEMISTRY AND PHOTOBIOLOGY》 *
E LAZAR等: "Transforming growth factor alpha: mutation of aspartic acid 47 and leucine 48 results in different biological activities", 《MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY》 *
FUFAN等: "Expression and purification of two different antimicrobial peptides, PR-39 and Protegrin-1 in Escherichia coli", 《PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION》 *
GENBANK: "green fluorescent protein (mitochondrion) [synthetic construct]", 《GENBANK》 *
GENBANK: "RecName: Full=Green fluorescent protein", 《GENBANK》 *
MATEJA ZORKO 等: "Expression, purification and structural studies ofa short antimicrobial peptide", 《BIOCHIM BIOPHYS ACTA》 *
NAGASUNDARAPANDIAN SOUNDRARAJAN 等: "Green fluorescent protein as a scaffold for high efficiency production of functional bacteriotoxic proteins in Escherichia coli", 《SCI REP》 *
QING-FENG ZHOU等: "High-Level Production of a Novel Antimicrobial Peptide Perinerin in Escherichia coli by Fusion Expression", 《CURRENT MICROBIOLOGY》 *
TAKUYA KOBAYASHI 等: "Engineering a novel multifunctional green fluorescent protein tag for a wide variety of protein research", 《PLOS ONE》 *
VITALY S SKOSYREV 等: "Expression of the recombinant antibacterial peptide sarcotoxin IA in Escherichia coli cells", 《PROTEIN EXPR PURIF》 *
W H BURGESS等: "Possible dissociation of the heparin-binding and mitogenic activities of heparin-binding (acidic fibroblast) growth factor-1 from its receptor-binding activities by site-directed mutagenesis of a single lysine residue", 《JOURNAL OF CELL BIOLOGY》 *
徐晓晖 等: "绿色荧光蛋白及其突变体的特征与应用", 《安徽农业科学》 *
栾超: "利用SUMO融合技术在枯草芽孢杆菌中重组表达抗菌肽cathelicidin-BF及其生物学活性研究", 《中国博士学位论文全文数据库 基础科学辑》 *
王文辉: "猪源抗菌肽PG-1的表达及其生物活性的初步研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 基础科学辑》 *
陈玉清等: "抗菌肽CM4与绿色荧光蛋白融合基因的真核载体构建及表达", 《生物技术通讯》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113614113A (zh) * 2019-03-19 2021-11-05 宁波鲲鹏生物科技有限公司 含有荧光蛋白片段的融合蛋白及其用途

Also Published As

Publication number Publication date
US11230575B2 (en) 2022-01-25
US20210032295A1 (en) 2021-02-04
CN108779152B (zh) 2022-08-26
EP3409685B1 (en) 2023-04-05
WO2017131279A1 (ko) 2017-08-03
EP3409685A4 (en) 2019-07-31
KR20170089583A (ko) 2017-08-04
EP3409685A1 (en) 2018-12-05
KR101830792B1 (ko) 2018-02-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10662231B2 (en) Fusion proteins of superfolder green fluorescent protein and use thereof
Wei et al. Facilitation of expression and purification of an antimicrobial peptide by fusion with baculoviral polyhedrin in Escherichia coli
JP4423542B2 (ja) 抗菌性ポリペプチド及びその利用
CN101418290A (zh) 一种高效的elp融合蛋白酶及其制备和应用
US20050272864A1 (en) Method and device for improving protein stability and solubility
CN111574610B (zh) 大黄鱼抗菌肽piscidin 5-like type 4及其制备方法与应用
VerHeul et al. Rapid and simple purification of elastin-like polypeptides directly from whole cells and cell lysates by organic solvent extraction
KR20150027743A (ko) 재조합 플라스모디움 팔시파룸 포자소체 단백질의 정제 방법
CN108779152A (zh) 包含抗菌肽的不溶性融合蛋白以及利用上述不溶性融合蛋白的抗菌肽制造方法
TW201829774A (zh) 用以製備目標蛋白的表現構建體與方法
JP4088584B2 (ja) 融合タンパク質から目的タンパク質を分離する方法。
JP4804525B2 (ja) 翻訳同伴システムを利用した抗菌ペプチドの大量発現方法
CN102532325A (zh) 用羟胺切割法制备天蚕素AD和蛙Buforin II融合抗菌肽及其用途
Holtet et al. Receptor‐binding domain of human α2‐macroglobulin Expression, folding and biochemical characterization of a high‐affinity recombinant derivative
CN104004726A (zh) 穿膜型的带有荧光标签的talen-r11蛋白及其制备方法和应用
KR101622373B1 (ko) 지지체로서 불용성 녹색형광단백질을 이용한 항균 펩타이드의 제조방법
CN105968212A (zh) 一种鳗鲡创伤弧菌和迟钝爱德华氏菌二联重组蛋白及其制备方法
TWI591177B (zh) 一種胰高血糖素胜肽－２（ｇｌｐ－２）類似物的製備方法
US20190276501A1 (en) Engineered microcompartment protein and related methods and systems of engineering bacterial systems for non-native protein expression and purification
RU2698037C1 (ru) Способ получения рекомбинантного антимикробного пептида UBI18-35, рекомбинантная плазмидная ДНК pET31b-2хUBI18-35 и штамм-продуцент Escherichia coli BL21 Rosetta DE3 pLysS/ pET31b-2хUBI18-35 антимикробного пептида UBI18-35
CN110129329A (zh) 一种用于扩增日本鳗鲡干扰素相关因子的引物和制备方法
Kuo et al. cDNA sequence analysis and expression of α-bungarotoxin from Taiwan banded krait (Bungarus multicinctus)
RU2604796C1 (ru) СИСТЕМА ЭКСПРЕССИИ И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НЕМОДИФИЦИРОВАННЫХ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ В Escherichia coli С ЕЁ ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ
CN101967492A (zh) 重组人淀粉样多肽Aβ42的简易可溶性表达纯化方法
Duarte et al. An improved method for purification and refolding of recombinant HIV Vif expressed in Escherichia coli

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant