CN104004726A - 穿膜型的带有荧光标签的talen-r11蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents

穿膜型的带有荧光标签的talen-r11蛋白及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN104004726A
CN104004726A CN201410269990.9A CN201410269990A CN104004726A CN 104004726 A CN104004726 A CN 104004726A CN 201410269990 A CN201410269990 A CN 201410269990A CN 104004726 A CN104004726 A CN 104004726A
Authority
CN
China
Prior art keywords
talen
albumen
desred
egfp
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201410269990.9A
Other languages
English (en)
Inventor
覃启红
黄龙
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
GUANGDONG GUTENLAND BIOSCIENCE CO., LTD.
Original Assignee
覃启红
黄龙
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 覃启红, 黄龙 filed Critical 覃启红
Priority to CN201410269990.9A priority Critical patent/CN104004726A/zh
Publication of CN104004726A publication Critical patent/CN104004726A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/60—Fusion polypeptide containing spectroscopic/fluorescent detection, e.g. green fluorescent protein [GFP]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/80—Fusion polypeptide containing a DNA binding domain, e.g. Lacl or Tet-repressor

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种穿膜型的带有荧光标签的TALEN-R11蛋白及其制备方法和应用，旨在提供一种可以敲除细胞内源基因，达到基因治疗的目的穿膜型的带有荧光标签的TALEN-R11蛋白，其技术要点：所述的TALEN蛋白的L链和R链的N端分别带有荧光蛋白EGFP和DesRed，TALEN蛋白的L链和R链的C端都带有穿膜肽R11，即为EGFP-TALEN-R11和DesRed-TALEN-R11的蛋白；该TALEN-R11蛋白可以敲除细胞内源性基因，从而得到内源性基因被敲除的细胞；属于生物技术领域。

Description

穿膜型的带有荧光标签的TALEN-R11蛋白及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种TALEN-R11蛋白，具体涉及一种穿膜型的带有荧光标签的TALEN-R11蛋白，本发明还涉及该TALEN-R11蛋白的制备方法和应用；属于生物技术领域，
背景技术
细胞穿透肽多数为长度小于30个氨基酸的多肽分子，已经发现其可以携带多种物质，包括亲水性蛋白、多肽、DNA甚至颗粒性物质等进行细胞间或细胞内的运输，且不受细胞类型的限制，在细胞生物学、基因治疗学以及药学等领域具有很大的研究价值。
基因定点修饰是研究基因功能的重要手段之一，也可被用于人类遗传性疾病的治疗和药物靶点筛选，因此这类技术成为现代分子生物学的研究热点。
近年来兴起的类转录激活因子效应物核酸酶(transcription activator-likeeffector nuclease,TALEN)技术是一种崭新的分子生物学工具。科学家发现，来自植物细菌Xanthomonassp.的TAL蛋白的核酸结合域的氨基酸序列与其靶位点的核酸序列有恒定的对应关系。利用TAL的序列模块，可组装成特异结合任意DNA序列的模块化蛋白，从而达到靶向操作内源性基因的目的。目前TALE技术主要应用是用TALEN技术构建针对任意特定核酸靶序列的重组核酸酶，在特异的位点打断目标基因DNA，进而在该位点进行DNA操作，如Knock-out。它克服了常规的ZFN方法不能识别任意目标基因序列，以及识别序列经常受上下游序列影响等问题，而具有ZFN相等或更好的活性，使基因操作变得更加简单、方便。
目前，利用shRNA库做药物靶点筛选已经很普遍。而且其只限于质粒或者修饰后的核苷酸的形式来转染细胞。其效率比低，脱靶效应严重。
发明内容
针对上述问题，本发明的提供一种可以特异性敲除细胞内源基因，达到基因治疗的目的穿膜型的带有荧光标签的TALEN-R11蛋白，本发明还提供该TALEN-R11蛋白的制备方法以及敲除细胞内源基因的方法。
为解决前一技术问题，本发明提供的第一个技术方案是这样的：该穿膜型的带有荧光标签的TALEN-R11蛋白，其所述的TALEN蛋白的L链和R链的N端分别带有荧光蛋白EGFP和DesRed，TALEN蛋白的L链和R链的C端分别带有穿膜肽R11，即为EGFP-TALEN-R11和DesRed-TALEN-R11的蛋白。
上述的穿膜型的带有荧光标签的TALEN-R11蛋白，所述的EGFP-TALEN-R11的碱基编码如SEQ ID NO.1所示。
上述的穿膜型的带有荧光标签的TALEN-R11蛋白，所述的EGFP-TALEN-R11的碱基编码如SEQ ID NO.2所示。
本发明提供的另外一技术方案是这样的：该穿膜型的带有荧光标签的TALEN-R11蛋白的制备方法，依次包括下述方法：
1)载体的构建
a)EGFP-TALEN-R11原核表达载体的构建：
用核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的引物TALE-GFP_F：NdeI58和核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的引物GFP_R，扩展质粒pTALEN_v2的EGFP蛋白，回收PCR片段；然后用核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的引物GFP_F，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的引物TALE_R1，核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的引物TALE_R2：BamHI扩展TALE-ccdB-Chl片段；两个片段融合后，克隆到原核表达载体PET-16b的NdeI和BamHI位点，得pET16b-EGFP-TALEN-R11原核表达载体；
b)DesRed-TALEN-R11原核表达载体的构建：
用核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的引物TALE-DesRed_F：NdeI58和核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的引物DesRed_R扩展粒pTALEN_v2的DesRed蛋白，回收PCR片段，然后用核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示的引物DesRed_F，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的引物TALE_R1，核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的引物TALE_R2：BamHI去扩展TALE-ccdB-Chl片段，回收PCR片段；
两个DNA片段融合，克隆到原核表达载体PET-16b的NdeI和BamHI位点，得核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示pET16b-DesRed-TALEN-R11原核表达载体
2)EGFP-TALEN-R11蛋白和DesRed-TALEN-R11蛋白的表达与纯化
步骤1制备的pET16b-EGFP-TALEN-R1原核表达载体与步骤2)制备的pET16b-DesRed-TALEN-R11原核表达载体同时转化到大肠杆菌BL21中诱导，分别收集所得到的EGFP-TALEN-R11蛋白与DesRed-TALEN-R11蛋白菌体，离心获得上清液，进行Ni柱亲和层析，待目的蛋白与Ni柱结合之后，先用漂洗液洗涤，之后用洗脱缓冲液冲洗，将洗脱组分中的高盐缓冲液置换成PBS溶液，最后进行SDS-PAGE的检测，所得即为纯化的EGFP-TALEN-R11蛋白与DesRed-TALEN-R11蛋白。
本发明还提供该穿膜型的带有荧光标签的TALEN-R11蛋白在敲除细胞内源性基因中的应用。
本发明所述的穿膜型的带有荧光标签的TALEN-R11蛋白敲除细胞内源基因的方法是将EGFP-TALEN-R11和DesRed-TALEN-R11原核表达载体与细胞孵育以敲除内源性基因。
进一步的，上述的穿膜型的带有荧光标签的TALEN-R11蛋白敲除细胞内源基因的方法，所述的孵化是用培养基对EGFP-TALEN-R11蛋白和DesRed-TALEN-R11蛋白进行不同浓度稀释，再分别与C57BL/6J小鼠ES细胞在37℃孵育1小时，然后用完全培养基更换细胞培养液以去除EGFP-TALEN-R11蛋白和DesRed-TALEN-R11蛋白，再分别进行37℃或者30℃的后续培养24小时，以此作为第一轮的蛋白处理，此过程重复两次。
与现有技术相比，本发明提供的技术方案具有如下优点：
本发明的穿透型EGFP-TALEN-R1和DesRed-TALEN-R11蛋白表达系统，通过克隆针对任意基因的TALE模块到这两个载体里面，可以特异性敲除细胞内源基因，达到基因治疗的目的，以及基因敲除模式动物和在药物筛选方面的应用。
附图说明
图1是本发明实验例1中测序验证验证图。
具体实施方式
为了更好的理解、实施本发明的权利要求，下面结合具体实施例，对本发明的权利要求做进一步的详细说明，但本发明并不限于下述实施例，而是以权利要求为限。
实施例1
该穿膜型的带有荧光标签的TALEN-R11蛋白，其所述的TALEN蛋白的L链和R链的N端分别带有荧光蛋白EGFP和DesRed，TALEN蛋白的L链和R链的C端都带有穿膜肽R11，即为碱基编码如SEQ ID NO.1所示的EGFP-TALEN-R11和碱基编码如SEQ ID NO.2所示的DesRed-TALEN-R11的蛋白。
该穿膜型的带有荧光标签的TALEN-R11蛋白的制备方法，依次包括下述方法：
1)载体的构建
a)EGFP-TALEN-R11原核表达载体的构建：
用核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的引物TALE-GFP_F：NdeI58和核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的引物GFP_R，扩展质粒pTALEN_v2(从Addgene上购买质粒pTALEN_v2(Plasmid#32191))的EGFP蛋白，回收PCR片段；然后用核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的引物GFP_F，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的引物TALE_R1，核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的引物TALE_R2：BamHI扩展TALE-ccdB-Chl片段；两个片段融合后，克隆到原核表达载体PET-16b的NdeI和BamHI位点，得pET16b-EGFP-TALEN-R11原核表达载体；
b)DesRed-TALEN-R11原核表达载体的构建：
用核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的引物TALE-DesRed_F：NdeI58和核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的引物DesRed_R扩展粒pTALEN_v2的DesRed蛋白，回收PCR片段，然后用核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示的引物DesRed_F，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的引物TALE_R1，核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的引物TALE_R2：BamHI去扩展TALE-ccdB-Chl片段，回收PCR片段；
两个DNA片段融合，克隆到原核表达载体PET-16b的NdeI和BamHI位点，即得pET16b-DesRed-TALEN-R11原核表达载体；
2)EGFP-TALEN-R11蛋白和DesRed-TALEN-R11蛋白的表达与纯化
将带有重组质粒pET16b-EGFP-TALEN-R1、pET16b-DesRed-TALEN-R11的大肠杆菌BL21菌种扩大培养，经IPTG16℃过夜诱导，分别收集所得到的EGFP-TALEN-R11蛋白与DesRed-TALEN-R11蛋白菌体，经过高压破碎后离心获得可溶性的上清，进行Ni柱亲和层析。待目的蛋白与Ni柱结合之后,先用漂洗液(20mM Tris-HCl,500mM NaCl,5％(v/v)甘油，60mM咪唑，pH8.0)洗涤，之后用洗脱缓冲液(20mM Tris-HCl,500mM NaCl,5％(v/v)甘油，500mM咪唑，pH8.0)。利用PD-10脱盐柱将洗脱组分中的高盐缓冲液置换成含有20％甘油的PBS溶液，之后进行SDS-PAGE的检测。所得即为纯化的EGFP-TALEN-R11蛋白与DesRed-TALEN-R11蛋白。
3、EGFP-TALEN-R11蛋白和DesRed-TALEN-R11蛋白的细胞穿透能力检测
分别将1.5uM EGFP-TALEN-R11蛋白与DesRed-TALEN-R1蛋白与C57BL/6J小鼠ES细胞细胞37℃孵育2小时之后用1mg/ml肝素溶液洗涤细胞并收集细胞样品进行RT-PCR检测EGFP和DesRed。结果说明EGFP-TALEN-R11蛋白与DesRed-TALEN-R1蛋白具有细胞穿透性质。
该穿膜型的带有荧光标签的TALEN-R11蛋白的应用，所述的细胞内源性基因可以敲除细胞内源性Gpr52基因。
实验例1
首先找到细胞内源性基因Gpr52的靶位点如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示的序列；然后设计结合这个靶位点的蛋白EGFP-TALEN-R11-Gpr52_L Gpr52和DesRed-TALEN-R11-Gpr52_R表达质粒。
针对这两个靶位点的TALEs序列通过Golden gate的方法克隆到EGFP-TALEN-R11原核表达载体和DesRed-TALEN-R11原核表达载体上。并原核表达这两个蛋白，并用Ni柱做纯化。
用无FBS的DMEM培养基对EGFP-TALEN-R11蛋白和DesRed-TALEN-R11蛋白进行稀释，使其终浓度分别为1μM、2μM、3μM，再分别与C57BL/6J小鼠ES细胞在37℃孵育1小时，然后用含10％FBS的DMEM完全培养基跟换细胞培养液以去除EGFP-TALEN-R11-Gpr52_L蛋白和DesRed-TALEN-R11-Gpr52_R蛋白，再分别进行37℃或者30℃的后续培养24小时，以此作为第一轮的蛋白处理，处理完毕后再进行第二轮的蛋白处理，具体为后续培养24小时的C57BL/6J小鼠ES细胞再与不同浓度(1μM、2μM、3μM)的EGFP-TALEN-R11-Gpr52_L蛋白和DesRed-TALEN-R11-Gpr52_R蛋白37℃孵育1小时用含10％FBS的DMEM完全培养基跟换细胞培养液以去除EGFP-TALEN-R11Gpr52_L蛋白和DesRed-TALEN-R11-Gpr52_R蛋白，再分别进行37℃或者30℃的后续培养24小时。经过三轮的处理后，提取细胞的基因组。利用针对该基因SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示的引物扩增含有打靶位点的片段，并作测序验证(见说明书附图1)，测序结果显示：缺失8个碱基(gaatgtgt)，该结果说明EGFP-TALEN-R11Gpr52_L蛋白和DesRed-TALEN-R11-Gpr52_R蛋白能够成功敲除细胞内源性基因Gpr52。

Claims (7)

1.一种穿膜型的带有荧光标签的TALEN-R11蛋白，其特征在于，所述的TALEN蛋白的L链和R链的N端分别带有荧光蛋白EGFP和DesRed，TALEN蛋白的L链和R链的C端分别带有穿膜肽R11，即为EGFP-TALEN-R11和DesRed-TALEN-R11蛋白。
2.根据权利要求所述的穿膜型的带有荧光标签的TALEN-R11蛋白，其特征在于，所述的EGFP-TALEN-R11的碱基编码如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求所述的穿膜型的带有荧光标签的TALEN-R11蛋白，其特征在于，所述的DesRed-TALEN-R11的碱基编码如SEQ ID NO.2所示。
4.权利要求1所述的穿膜型的带有荧光标签的TALEN-R11蛋白的制备方法，其特征在于，依次包括下述方法：
1)载体的构建
a)EGFP-TALEN-R11原核表达载体的构建：
用核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的引物TALE-GFP_F：NdeI58和核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的引物GFP_R，扩展质粒pTALEN_v2的EGFP蛋白，回收PCR片段；然后用核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的引物GFP_F，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的引物TALE_R1，核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的引物TALE_R2：BamHI扩展TALE-ccdB-Chl片段；两个片段融合后，克隆到原核表达载体PET-16b载体的NdeI和BamHI位点，得pET16b-EGFP-TALEN-R11原核表达载体；
b)DesRed-TALEN-R11原核表达载体的构建：
用核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的引物TALE-DesRed_F：NdeI58和核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的引物DesRed_R扩展粒pTALEN_v2的DesRed蛋白，回收PCR片段，然后用核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示的引物DesRed_F，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的引物TALE_R1，核苷酸序列如SEQ IDNO.7所示的引物TALE_R2：BamHI去扩展TALE-ccdB-Chl片段，回收PCR片段；
两个DNA片段融合，克隆到原核表达载体PET-16b载体的NdeI和BamHI位点，得核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示pET16b-DesRed-TALEN-R11原核表达载体
2)EGFP-TALEN-R11蛋白和DesRed-TALEN-R11蛋白的表达与纯化
步骤1制备的pET16b-EGFP-TALEN-R1原核表达载体与步骤2)制备的pET16b-DesRed-TALEN-R11原核表达载体同时转化到大肠杆菌BL21中诱导，分别收集所得到的EGFP-TALEN-R11蛋白与DesRed-TALEN-R11蛋白菌体，离心获得上清液，进行Ni柱亲和层析，待目的蛋白与Ni柱结合之后，先用漂洗液洗涤，之后用洗脱缓冲液冲洗，将洗脱组分中的高盐缓冲液置换成PBS溶液，最后进行SDS-PAGE的检测，所得即为纯化的EGFP-TALEN-R11蛋白与DesRed-TALEN-R11蛋白。
5.权利要求1所述的穿膜型的带有荧光标签的TALEN-R11蛋白在敲除细胞内源性基因中的应用。
6.权利要求5所述的穿膜型的带有荧光标签的TALEN-R11蛋白敲除细胞内源基因的方法是将EGFP-TALEN-R11和DesRed-TALEN-R11原核表达载体与细胞孵育以敲除内源性基因。
7.根据权利要求6所述的穿膜型的带有荧光标签的TALEN-R11蛋白敲除细胞内源基因的方法，其特征在于，所述的孵化是用培养基对EGFP-TALEN-R11蛋白和DesRed-TALEN-R11蛋白进行不同浓度稀释，再分别与C57BL/6J小鼠ES细胞在37℃孵育1小时，然后用完全培养基更换细胞培养液以去除EGFP-TALEN-R11蛋白和DesRed-TALEN-R11蛋白，再分别进行37℃或者30℃的后续培养24小时，以此作为第一轮的蛋白处理，此过程重复两次。
CN201410269990.9A 2014-06-17 2014-06-17 穿膜型的带有荧光标签的talen-r11蛋白及其制备方法和应用 Pending CN104004726A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410269990.9A CN104004726A (zh) 2014-06-17 2014-06-17 穿膜型的带有荧光标签的talen-r11蛋白及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410269990.9A CN104004726A (zh) 2014-06-17 2014-06-17 穿膜型的带有荧光标签的talen-r11蛋白及其制备方法和应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN104004726A true CN104004726A (zh) 2014-08-27

Family

ID=51365635

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410269990.9A Pending CN104004726A (zh) 2014-06-17 2014-06-17 穿膜型的带有荧光标签的talen-r11蛋白及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104004726A (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104497146A (zh) * 2014-12-01 2015-04-08 广州古藤兰生物科技有限公司 一种融合蛋白及其载体的构建方法和应用
WO2016086768A1 (zh) * 2014-12-04 2016-06-09 清华大学 特异识别并修复β地中海贫血症beta-globin基因的嵌合核酸酶
CN107254484A (zh) * 2017-07-28 2017-10-17 广州医科大学附属第五医院 一种cpp‑luc嵌合蛋白及其在检测细胞内atp中的应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130149781A1 (en) * 2011-11-30 2013-06-13 Massachusetts Institute Of Technology Nucleotide-Specific Recognition Sequences For Designer TAL Effectors
CN103255115A (zh) * 2013-04-10 2013-08-21 中国科学院广州生物医药与健康研究院 一种穿透型tat-talen蛋白及内源性基因被敲除的细胞的制备方法和应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130149781A1 (en) * 2011-11-30 2013-06-13 Massachusetts Institute Of Technology Nucleotide-Specific Recognition Sequences For Designer TAL Effectors
CN103255115A (zh) * 2013-04-10 2013-08-21 中国科学院广州生物医药与健康研究院 一种穿透型tat-talen蛋白及内源性基因被敲除的细胞的制备方法和应用

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JIA LIU, ET AL.: "Cell-Penetrating Peptide-Mediated Delivery of TALEN Proteins via Bioconjugation for Genome Engineering", 《PLOS ONE》 *
NEVILLE E SANJANA, ET AL: "A transcription activator-like effector toolbox for genome engineering", 《NATURE PROTOCOLS》 *
RENLI RU, ET AL.: "Targeted genome engineering in human induced pluripotent stem cells by penetrating TALENs", 《CELL REGENERATION》 *
范晋海等: "小分子细胞穿膜肽-精氨酸多肽膀胱肿瘤摄入的体内体外研究", 《第十五界全国泌尿外科学术会议论文集》 *
郑银等: "细胞穿膜肽在经皮给药系统中的应用研究概况", 《中南药学》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104497146A (zh) * 2014-12-01 2015-04-08 广州古藤兰生物科技有限公司 一种融合蛋白及其载体的构建方法和应用
CN104497146B (zh) * 2014-12-01 2018-03-06 广州古藤兰生物科技有限公司 一种融合蛋白及其载体的构建方法和应用
WO2016086768A1 (zh) * 2014-12-04 2016-06-09 清华大学 特异识别并修复β地中海贫血症beta-globin基因的嵌合核酸酶
CN107254484A (zh) * 2017-07-28 2017-10-17 广州医科大学附属第五医院 一种cpp‑luc嵌合蛋白及其在检测细胞内atp中的应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2634395C1 (ru) Генетическая конструкция на основе системы редактирования генома crispr/cas9, кодирующая нуклеазу cas9, специфически импортируемую в митохондрии клеток человека
DE212020000516U1 (de) CRISPR-CAS-Effektorpolypeptide
Withey et al. A salvage pathway for protein synthesis: tmRNA and trans-translation
CN103951743A (zh) 人sfrp1变体及其应用
CN110117323B (zh) 一种可溶性人源角蛋白及其应用
CN103951733A (zh) 一种人肿瘤抑制蛋白变体及其应用
Gytz et al. Structural basis for RNA-genome recognition during bacteriophage Qβ replication
CN105683216B (zh) 人源egf结构域蛋白及其应用
CN104004726A (zh) 穿膜型的带有荧光标签的talen-r11蛋白及其制备方法和应用
CN104531632A (zh) 快速降解的Cas9-ODC422-461融合蛋白及其应用
KR20240055073A (ko) 클래스 ii, v형 crispr 시스템
Chinchilla et al. Identification of the functional regions of the viral haemorrhagic septicaemia virus (VHSV) NV protein: Variants that improve function
Chaudhuri et al. Localization elements and zip codes in the intracellular transport and localization of messenger RNAs in Saccharomyces cerevisiae
CN103194477B (zh) 一种融合型原核表达载体及其构建方法和应用
Nikolakaki et al. RNA association or phosphorylation of the RS domain prevents aggregation of RS domain-containing proteins
Libetti et al. The switch from NF-YAl to NF-YAs isoform impairs myotubes formation
Khan et al. Large-scale production of recombinant proteins: human leukocyte interferon
Da Lage et al. Amyrel, a paralogous gene of the amylase gene family in Drosophila melanogaster and the Sophophora subgenus
TWI660042B (zh) 用以製備目標蛋白的表現構建體與方法
CN111448320B (zh) 细胞膜穿透肽
CN106755042A (zh) 一种基于组合自剪切与蛋白支架的生物活性小肽制备方法
Couvillion et al. Biochemical approaches including the design and use of strains expressing epitope-tagged proteins
CN102703400A (zh) 热启动dna聚合酶及其应用
CN104974998A (zh) 用于适配子筛选的dna双链分离方法以及适配子筛选方法和新的适配子
CN106913864A (zh) 融合蛋白tat‑dcf1的新用途

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
ASS Succession or assignment of patent right

Owner name: GUANGZHOU GUTENGLAN BIOLOGICAL TECHNOLOGY CO., LTD

Free format text: FORMER OWNER: QIN QIHONG

Effective date: 20150210

Free format text: FORMER OWNER: HUANG LONG

Effective date: 20150210

C41 Transfer of patent application or patent right or utility model
COR Change of bibliographic data

Free format text: CORRECT: ADDRESS; FROM: 510660 GUANGZHOU, GUANGDONG PROVINCE TO: 510663 GUANGZHOU, GUANGDONG PROVINCE

TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20150210

Address after: 510663 Guangdong city of Guangzhou province high tech Industrial Development Zone of Guangzhou Science City Road No. 80 building on the base of technological innovation service building sixth unit 606

Applicant after: GUANGDONG GUTENLAND BIOSCIENCE CO., LTD.

Address before: 510660 Tianhe District, Guangzhou, Zhongshan, No. 45 Guangdong Avenue, good home, building T4, room 1001

Applicant before: Qin Qihong

Applicant before: Huang Long

C53 Correction of patent of invention or patent application
CB03 Change of inventor or designer information

Inventor after: Huo Yiran

Inventor after: Li Hongmei

Inventor after: Qin Qihong

Inventor after: Huang Long

Inventor before: Qin Qihong

Inventor before: Huang Long

COR Change of bibliographic data

Free format text: CORRECT: INVENTOR; FROM: QIN QIHONG HUANG LONG TO: HUO YIRAN LI HONGMEI QIN QIHONG HUANG LONG

C12 Rejection of a patent application after its publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20140827