JP4804525B2 - 翻訳同伴システムを利用した抗菌ペプチドの大量発現方法 - Google Patents
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Description
実質的に中和させることができる酸性ペプチドの遺伝子を一つのプロモーターの下で別個のペプチドに翻訳同伴されて発現させる2−シストロンシステムのDNA構造物を製造する段階と、(ii)前記2−シストロンのDNA構造物を発現ベクターに挿入し、これを微生物に導入させ、前記塩基性抗菌ペプチドと前記酸性ペプチドとの封入体を発現させる段階と、(iii)前記微生物細胞から封入体を収得した後、電荷の差を用いて塩基性抗菌ペプチドを分離して収得する段階と、からなる抗菌ペプチドの製造方法を提供する。
本発明は、前記製造方法において、前記酸性ペプチドは、一つ以上の二硫化結合を有することである方法を提供する。
さらに具体的に、本発明では、抗菌ペプチドの強い塩基性によって宿主のDNAまたはRNAを攻撃して招来される細胞毒性を減らすか無くすことによって、すなわち、抗菌ペプチドの強い塩基性を一時的に中和させて抗菌ペプチドを大量発現できるシステムを開発したものである。
韓国特許第2001−0314721号(生物学的活性がある新規のペプチド)によって公開された配列番号15番のペプチドと同一のアミノ酸配列の強力な抗菌ペプチドであるヒストニンII(アミノ酸配列:RAGLQFPVGRLLRRLLRRLLR)(配列番号10)とを発現するため、ヒストニンIIの電荷分布を考慮して、次のような特徴の酸性ペプチドを探索した。
1.ヒストニンIIの正電荷の数及び分布と類似している負電荷の数及び分布を有すること。
2.アミノ末端部位にシステイン残基を有すること。
3.微生物内のタンパク質分解酵素の攻撃から安定的になるように、不溶性の封入体の形態に発現されること。
4.効率的な抗菌ペプチドの生産のために、可能な限り長さが短いこと。
人間ガンマインターフェロン(hIFN−γ)は、146個のアミノ酸で構成されたタンパク質であって、大腸菌から過発現させる場合、総タンパク質の90%以上が不溶性の封入体を形成する特徴を有したタンパク質である。酸性を帯びており、アミノ末端近くにシステイン基を有しているので、同伴発現酸性タンパク質として適する。hIFN−γのカルボキシ末端には、インターシストロン(intercistronic)部位を有するように変形構成して、−5の酸性電荷を帯びるように製作した。これを暗号化するように、複数の単一鎖のオリゴヌクレオチド種類を合成し(表1の1〜9番(配列番号11〜19))、組替え(recombinant)PCR方法(Smith H.O.et.al,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2003,100(26)15440−15445)を通じて150個のアミノ酸で構成された同伴発現タンパク質mIF1の二重鎖のDNA切片を完成した(図1A、配列番号1,2)。
前記段階1で提示したhIFN−γは、発現しようとする抗菌ペプチドに比べて約7倍ほど分子量が大きいので、抗菌ペプチドの効果的な量産のためにさらに小さい同伴発現タンパク質が必要である。hIFN−γアミノ末端の88個のアミノ酸からなるタンパク質にインターシストロン部位(アミノ酸EEVEを暗号化)を添加して92個のアミノ酸からなり、−6の酸性電荷を有したmIF2を製作した。表1で提示した単一鎖のオリゴヌクレオチド(表1の1〜5番(配列番号11〜15))を用いて組替えPCR方法を通じて92個のアミノ酸で構成された同伴発現タンパク質mIF2の二重鎖のDNA切片を完成した(図1B、配列番号3,4)。
前記段階2よりhIFN−γの長さをさらに減らして、アミノ末端に位置する59個アミノ酸からなるタンパク質にインターシストロン部位(EEVE暗号化)を添加して63個のアミノ酸からなり、−6の酸性の電荷値を有したmIF3を製作した。表1で提示した単一鎖のオリゴヌクレオチド(表1の1〜3番(配列番号11〜13))を用いて組替えPCR方法を通じて63個のアミノ酸で構成された同伴発現タンパク質mIF3の二重鎖のDNA切片を完成した(図1C、配列番号5,6)。
抗菌ペプチドヒストニンII遺伝子を暗号化するDNA切片を作るため、表1のプライマー12、13番のような単一鎖のオリゴマーを合成した。そして、DNA重合化を通じて二重鎖のヒストニンIIを暗号化する遺伝子切片を製造した(図2A(配列番号7))。この際、ヒストニンIIのカルボキシ末端には、pET21cのクローニング時に使うため、制限酵素BamHI認識部位(GGATCC)を挿入した。
実施例1と実施例2とから製造された酸性ペプチド遺伝子と抗菌ペプチド遺伝子とが2−シストロン発現ベクターで構成されるために、図2A〜図2Cのように二つのシストロンが翻訳同伴しているが、独立的に存在するか重なっている状態に発現されるように製作した。最初のシストロンには、塩基性の抗菌ペプチドを中性化させることができ、封入体を形成させることができる酸性ペプチドを同伴発現パートナーに置いて、二番目のシストロンには、抗菌ペプチドが発現されるように前記実施例2から製作したmIF1H、mIF2H、mIF3H DNA切片を制限酵素NdeIとBamHIとを用いて切断した後、ゲル抽出キット(Gel extraction kit)(Qiagen、ドイツ)を用いて所望の大きさのDNA切片を分離した。そして、これらをNdeIとBamHIとに切断したpET21ベクターに連結させ、酸性ペプチドと抗菌ペプチドとの翻訳同伴ベクターpmIF1H、pmIF2H、pmIF3Hを製造した(図3)。
前記実施例3から製造した酸性ペプチドと抗菌ペプチドとの翻訳同伴ベクターpmIF1H、pmIF2H、pmIF3HをCaCl2を利用した形質転換方法でE.coli BL21(DE3)にそれぞれ導入した。LB(Luria Botani、トリプトン1%、酵母抽出物0.5%、NaCl0.5%)培地を使い、培養液がOD600=0.5〜0.6の間である時、1mM IPTG(isopropyl−β−D−thiogalactopyranoside)を添加してペプチド発現を誘導した。
最適化された酸性同伴発現ペプチドmIF3を用いて抗菌ペプチドを大量発現して分離及び精製した。pmIF3Hに形質転換されたE.coli BL21(DE3)を100mlのLB培地で育てて、培養液の懸濁程度がOD600=0.5〜0.6である時、1mMのIPTGを添加してペプチドの発現を誘導した後、4時間後に培養液を除去してTris緩衝溶液で細胞を破砕した後、遠心分離して沈殿物を収穫した。この沈殿物を3Mウレア溶液で2時間常温放置してから溶かした後、15Sリソース(Resource)陽イオン交換カラムにローディングした後、0.5M NaClで溶出して抗菌ペプチドヒストニンIIを分離した、分離されたヒストニンIIをC−18カラム(3.9x300mm、Millipore)を利用した逆相HPLCでもう一度精製して純粋に分離した。
最適化された酸性同伴発現ペプチドmIF3を用いてヒストニンII以外の他の塩基性の抗菌ペプチドパラシンとペキシガナンとを発現して、多様な抗菌ペプチドの発現に本発明で提示した方法が包括的に利用されるということを確認した。pmIF3−パラシンとmIF3−ペキシガナンとに形質転換されたE.coli BL21(DE3)を100mlのLB培地で育てて、培養液の懸濁程度がOD600=0.5〜0.6である時、1mMのIPTGを添加してペプチドの発現を誘導した後、4時間後に培養液を除去してTris緩衝溶液で細胞を破砕した後、遠心分離して沈殿物を収穫した。この沈殿物を3Mウレア溶液で2時間常温放置してから溶かした後、抗菌ペプチドパラシンとペキシガナンとの発現程度を確認した。
Claims (12)
- (i)塩基性抗菌ペプチドの遺伝子及び前記塩基性抗菌ペプチドの正電荷を実質的に中和させることができる酸性ペプチドの遺伝子を、一つのプロモーターの下で別個のペプチドに翻訳同伴されて発現させる2個のシストロンからなる2−シストロンDNA構造物を製造する段階と、
(ii)前記2−シストロンDNA構造物を発現ベクターに挿入し、これを微生物に導入させ、前記塩基性抗菌ペプチドと前記酸性ペプチドとの封入体を発現させる段階と、
(iii)前記微生物細胞から封入体を収得した後、電荷の差を用いて塩基性抗菌ペプチドを分離して収得する段階と、からなることを特徴とする抗菌ペプチドの製造方法。 - 前記DNA構造物で2個のシストロンは、最初のシストロンの終結コドンであるUAAまたはUGAと二番目のシストロンの開始コドンであるAUGとが重なっているUAAUGまたはUGAUG配列で連結されることを特徴とする請求項1に記載の抗菌ペプチドの製造方法。
- 前記段階(i)には、二番目のシストロンの翻訳を増進させるために、最初のシストロンの終結コドン前にシャイン・ダルガノ配列(AGGAGGT)を含む塩基配列を導入する段階が含まれることを特徴とする請求項1に記載の抗菌ペプチドの製造方法。
- 前記塩基配列は、アミノ酸配列EEVEを暗号化するGAGGAGGTGGAA(配列番号9)であることを特徴とする請求項3に記載の抗菌ペプチドの製造方法。
- 前記塩基性抗菌ペプチドは、ヒストニンII、パラシン及びペキシガナンのうち何れか一つであることを特徴とする請求項1に記載の抗菌ペプチドの製造方法。
- 前記酸性ペプチドは、1つ以上の二硫化結合を有することを特徴とする請求項1に記載の抗菌ペプチドの製造方法。
- 前記酸性ペプチドは、配列番号1のアミノ酸配列を有するmIF1、配列番号3のアミノ酸配列を有するmIF2または配列番号5のアミノ酸配列を有するmIF3のうち何れか一つであることを特徴とする請求項1ないし請求項6のうち何れか一項に記載の抗菌ペプチドの製造方法。
- 配列番号1のアミノ酸配列を有することを特徴とするmIF1ペプチド。
- 配列番号3のアミノ酸配列を有することを特徴とするmIF2ペプチド。
- 配列番号5のアミノ酸配列を有することを特徴とするmIF3ペプチド。
- 塩基性抗菌ペプチドの遺伝子及び前記塩基性抗菌ペプチドの正電荷を実質的に中和させることができる酸性ペプチドの遺伝子を一つのプロモーターの下で別個のペプチドに翻訳同伴されて発現させる2個のシストロンからなることを特徴とする2−シストロンDNA構造物。
- 前記抗菌ペプチドは、ヒストニンII、パラシン及びペキシガナンのうち一つであり、
前記酸性ペプチドは、請求項7ないし請求項8のうち何れか一項に記載のペプチドであり、
前記2個のシストロンは、最初のシストロンの終結コドンであるUAAまたはUGAと二番目のシストロンの開始コドンであるAUGとが重なっているUAAUGまたはUGA
UG配列で連結されることを特徴とする請求項11に記載の2−シストロンDNA構造物。
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