KR100314721B1 - 생물학적 활성이 있는 신규한 펩타이드 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 종래의 항균 펩타이드보다 우수하거나 종래의 항균 펩타이드와 비슷한 항균력을 가지며, 또한 높은 염의 농도에도 항균력이 발휘되는 펩타이드에 간한 것이다.
Description
본 발명은 생물학적 활성이 있는 펩타이드에 관한 것이다.
지구상에 있는 모든 동물들은·자신을 바이러스나 세균과 같은 미생물의 감염으로부터 자신을 방어 또는 보호할 수 있는 생체방어기구들을 가지고 있으며 그중에 하나가 항균 펩타이드 등을 이용한 비선택적 면역체계(non-specific immunity)이다. 항균 펩타이드들은 다음과 같은 몇가지 우수한 점으로 인해 새로운 의약품으로서 각광을 받고 있다: 첫째, 항균 펩타이드는 기존의 항생제보다 폭넓은 범위의 미생물에 대하여 강한 항균력을 가진다; 둘째, 항균 펩타이드는 숙주세포는 파괴하지 않고 외부에서 침입한 병원균에 대해서만 항균활성을 나타내므로, 인체에 유용한 항균물질로의 개발 가능성이 높다; 셋째, 미생물의 내성 유발이 문제시되고 있는 종래의 항생제와는 전혀 다른 활성기작(mechanism)에 의해 항균활성을 나타내므로, 항균 펩타이드에 대한 미생물의 내성 유발 가능성이 적다. 항균 펩타이드에 대한 연구는 면역체계가 잘 발달하지 않은 곤충으로부터 세크로핀(cecropin)이 발견되면서 시작되어 그 후 양서류에서 머게이닌(magainin), 봄비닌(bombinin) 등이,포유류에서 디펜신(defensins)들이 발견되어지면서 활발히 연구되어지고 있으며 현재까지 약 2,000 여종의 항균 펩타이이드가 미생물에서 인간에 이르는 거의 모든 생물들로부터 발견, 보고되어지고 있다.
그러나, 전술한 항균 펩타이드의 실용화에 몇 가지 장애 요인들이 있는데 이는 첫째, 기존의 항균 펩타이드들이 다소 높은 농도에서 작용한다는 것이다. 예를 들어, 양서류의 표피에서 분리된 항균 펩타이드 머게이닌의 경우 그램 양성균 및 음성균 곰팡이 등에 작용을 하지만 그 작용 농도가 50-200 ㎍/ml(Zasloff M.(1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 5449-5453)로 이는 기존의 항생제들이 특정 세균에 대하여 O.1-l ㎍/ml의 범위에서·작용하는 것을 감안할 때 상당히 높은 농도에서 작용하는 것이다. 둘째, 항균 펩타이드들의 항균력이 염(salt)의 농도에 민감하다는 것이다. 예를 들어, 인간의 폐에서 발생하는 cystic fibrosis병의 경우 발병 부위의 염농도가 이상적으로 증가하여 항균 펩타이드가 작용을 못한다(Goldman, M.J. et al. (1997) Cell, 88: 553-560).
본 발명자들에 의해 Biochemical and Biophysical Research Communications 218, 408-413 (1996)에 한국산 두꺼비에서 발견되어진 항균 펩타이드가 개시되었다. 부포린 I 및 부포린 II로 명명된 이 항균 펩타이드는 그램양성균과 음성균 및곰팡이균에 이르는 넓은 범위의 미생물에 대하여 항균력을 가지며 그 항균력의 세기도 1-4 ㎍/ml로 기존의 항균 펩타이드들보다 강한 항균력을 가지고 있으나 이 항균 펩타이드 역시 염 농도에 민감하다.
따라서, 생체 내에서 충분한 항균력을 발휘할 수 있도록, 항균력을 더욱 증진시키고 염의 농도에 둔감한 항균 펩타이드의 개발이 요망되고 있다.
본 발명의 목적은 생물학적 활성이 있는 신규한 펩타이드를 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 종래의 항균 펩타이드에 비해 균종에 대한 작용범위가 넓으며 보다 강한 항균력을 가지는 펩타이드를 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 높은 염의 농도에서도 영향을 받지 않고 항균 활성을 발휘하는 펩타이드를 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 종래의 항균 펩타이드에 비해 보다 강한 항균력을가지며 염의 농도에 민감하지 않은 항균 펩타이드의 2차 구조를 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 생물학적 활성이 있는 펩타이드를 제조할 수 있는전구체 펩타이드를 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 생물학적 활성이 있는 펩타이드를 코딩할 수 있는cDNA를 제공하는 것이다.
도 1은 NMR 스펙트로메트리를 이용하여 부포린 II의 2차구조를 구조형성 촉진제인 50% 트리플루오로에탄올 하에서 측정한 그림이다.
도 2는 염농도에 따른, 펩타이드의 최소저해농도를 그래프로 나타낸 것이다
본 발명의 펩타이드는, 양쪽성을 갖는 α-헬릭스 구조를 가지는 펩타이드로 이루어진다.
또한 본 발명의 펩타이드는 부포린 II(Biochemical and Biophysical Research Communications 218, 408-413 (1996) 펩타이드의 2차 구조를 변경한 펩타이드로 이루어진다.
본 발명자들은 NMR(핵자기공명기)를 이용하여 부포린 II의 2차구조를 확인한결과 부포린 II의 2차구조는 N-말단으로부터 random coil 구조(1-4 잔기), 익스텐디드 헬릭스 (익스텐디드 helix)구조(5-10 잔기), 정상 α-헬릭스 구조(11-21 잔기)로 구성되어 있음을 밝혔다.
본 발명자들은 부포린 II 구조에서 정상 α-헬릭스 구조(11-21 잔기)로 이루어지는 펩타이드 즉, PVGRVHRLLRK를 포함하는 펩타이드는 여전히 우수한 항균 활성을 가지고 있었으며, 특히, random coil 구조를 형성하는 최소한 1-4번까지의 잔기를 삭제한 펩타이드는 매우 우수한 항균 활성을 나타냄을 확인하였다. 따라서 본발명에 따른 펩타이드 군은 부포린II의 α-헬릭스 구조를 포함하는, 특히 PVGRVHRLLRK 서열을 포함하는 펩타이드로 이루어진다. 이러한 α-헬릭스 구조를 이루는 서열, 예를 들어 PVGRVHRLLRK 서열은 C-말단 또는 N-말단에 추가의 아미노산을 포함할 수 있으며, 특히 N-말단에 익스텐디드 헬릭스 구조 또는 정상 헬릭스 구조를 이루는 아미노산을 포함하거나, C-말단이 아미드화된 펩타이드가 바람직하다.
본 발명에 따른 또다른 펩타이드 군은 부포린 II의 아미노산 서열 중 특정적으로 반복되어 있는 RLLR을 반복시킨 펩타이드로, [RLLR]n(n=1 내지 6인 정수)인 서열을 포함하는 펩타이드로 이루어지며, 특히 n=2-5인 펩타이드가 바람직하다.[RLLR]n서열의 C-말단 또는 N-말단에 추가의 아미노산을 포함할 수 있으며, N-말단에 부가되는 아미노산 서열은 random-coil을 이루지 않는 아미노산, 특히 익스텐디드 헬릭스를 이루는 서열이 바람직하다. 이러한 펩타이드 군에는 예를들어 RAGLQFPVG[RLLR], RAGLQFPVG[RLLR]2, [RLLR]3, RAGLQFPVG[RLLR]3, [RLLR]4, [ RLLR]5등이 포함된다.
또한 본 발명에 따른 펩타이드는 C-말단이 아미드화 된 형태일 수 있다.
본 발명에 따른 펩타이드는 이 분야에서 잘 알려진 방법 예를 들어 자동 펩타이드 합성기에 의해 합성할 수 있으며, 유전자 조작 기술에 의해 생산할 수도 있을 것이다. 예를 들어 유전자 조작을 통하여 융합파트너와 본 발명의 펩타이드로 된 융합 단백질을 코딩하는 융합 유전자를 제조하고 그것으로 숙주 미생물을 형질전환시킨 후 숙주 미생물에서 융합 단백질 형태로 발현시킨 후 단백질 분해효소 또는 화합물을 이용하여 융합 단백질로부터 본 발명의 펩타이드 항생물질을 절단, 분리하여 원하는 펩타이드를 생산할 수 있다. 이를 위하여 예를 들어 Factor Xa나 엔테로키나제와 같은 단백질 분해효소, CNBr 또는 하이드록실아민과 같은 화합물에 의해 절단될 수 있는 아미노산 잔기를 코딩하는 DNA 서열을 융합파트너와 펩타이드유전자 사이에 삽입할 수 있다.
예를 들어 CNBr에 의해 절단되는 자리를 부여하기 위하여, 융합 파트너의 3' 말단에 리딩 프레임이 맞는 Met 코돈(ATG)을 함유하는 제한효소 자리 예를 들어,AflIII,BsmI,BspH I,BspLU11 I,NcoI,NdeI,NsiI,Ppu10 I,SphI,StyI또는 이들의 아이소스키조머(isoschizomer) 자리를 삽입하여 제한효소로 절단하고, 이 제한효소에 상응(compatible)하는 말단을 생성하면서 리딩 프레임에 연결되는 제한효소 자리를 펩타이드 항생물질 유전자의 5□말단에 삽입하여 그 효소로 절단하고, 융합 파트너와 펩타이드 항생물질 유전자를 연결시킬 수 있다.
또 다른 예로, 하이드록실아민에 의해 절단되는 자리를 부여하기 위하여, 융합 파트너 유전자와 펩타이드 항생물질 유전자 사이에 Asn-Gly을 코딩할 수 있는 DNA 서열을 삽입할 수 있다. 예를 들어, 두 유전자를 융합시킬 경우 융합 파트너 3' 말단에 리딩 프레임이 맞는 Asn 코돈을 함유하는 제한효소 자리 또는 이들의 아이소스키조머 자리를 삽입한 후 이 효소로 절단하고, 이 효소와 양립되는(compatible) 말단 또는 블런트(blunt) 말단을 생성하면서 리딩 프레임이 연결되는 Gly 코돈을 포함하는 제한효소 자리를 펩타이드 항생물질 유전자의 5' 말단에 삽입하고 그 제한효소로 절단한 후 융합 파트너와 펩타이드 항생물질 유전자를 연결시켜 융합 파트너 유전자와 펩타이드 항생물질을 융합할 수 있다.
본 발명에 따른 유전자 구조물은 이 분야에서 통상적으로 이용되는 발현벡타, 예를 들어 플라즈미드, 바이러스 또는 그 외에 구조 유전자를 삽입(insertion) 또는 병합(incorporation)할 수 있는 비히클에 삽입하여 숙주 세포에 클로닝될 수 있다.
본 발명에 따른 펩타이드는 그램양성균, 그램음성균, 곰팡이, 프로토조아 등광범위한 미생물에 강력한 항균 활성을 나타낸다.
본 발명에 따른 펩타이드는 생물학적으로 활성이 있는 다른 제제, 예를 들어생물학적으로 활성이 있는 화합물, 다른 펩타이드 등과 같이 투여될 수 있다.
본 발명에서 사용된 아미노산 서열은 IUPAC_IUB 명명법에 따라 다음과 같이약어로 기재하였다.
아미노산
약어
아미노산
약어
알라닌 A 아르기닌 R
아스파라긴 N 아스파틴 산 E
시스테인 C 글루타민 산 D
글루타민 Q 글라이신 G
히스티딘 H 아이소루이신 I
루이신 L 라이신 K
메티오닌 M 페닐알라닌 F
프롤린 P 세린 S
트레오닌 T 트립토판 W
타이로신 Y 발린 V
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명할 것이다.
실시예 1. 펩타이드 제작
표 1에 기재된 서열에 따라, 자동 펩타이드 합성기를 이용하여 여러 종류의펩타이드를 합성하고, 이들 합성된 펩타이드를 C18 역상 고속액체 크로마토그래피(Waters Associates, USA)를 이용하여 순수 분리 하였다.
[표 1]
실시예 2. 펩타이드의 항균력 측정
실시예 1에서 제조한 펩타이드를 사용하여, 최소저해농도 측정법 (minimal inhibitory concentration test)으로 여러 가지 미생물에 대한 펩타이드의 최소 저해농도를 측정하였다. 박테리아와 곰팡이를 Muller-Hinton 배지와 Saboraud 배지에서 각각 37℃와 30℃에서 밤새워 키운 후 이들을 새 배지에 접종하여 2시간 키워 균주들이 대수기가 되도록 하였다. 이들을 1 ml 당 1O4-105균주가 되도록 희석한후 순차적으로 희석되어 있는 펩타이드가 들어 있는 96-웰 플레이트에 접종하여 다시18시간 키우고 이들의 흡광도를 측정하여 균주가 전혀 자라지 못하게 하는 최소농도를 최소저해농도로 정하였다. 결과를 표 2에 나타낸다.
[표 2]
(RLLR)3의 N-말단에 익스텐디드 헬릭스를 이루는 아미노산 서열을 융합시킨[RAGLQFPVG(RLLR)3]이 특히 우수한 항균력을 나타내었으며 RLLR을 4번 및 5번 반복시킨 펩타이드인 [(RLLR)4] 및 [(RLLR)5] 역시 강한 항균력을 나타내었다.
부포린 II에서 random coil 구조를 삭제한 펩타이드 역시 우수한 항균 활성을 나타내었으며, N-말단을 amidation한 펩타이드는 항균력이 더욱 증가하였다.
실시예 3. 염농도에 따른 펩타이드의 항균력 변화 측정
염농도에 따라 항균력이 변하는 정도를 밝히기 위해서, 염농도에 따른 펩타이드의 최소저해농도를 측정하였다. 최소저해농도를 측정하는 방법은 NaCl 농도를변화시키는 것을 제외하고는 실시예 2의 방법과 동일하게 실시하였다. 측정 결과를 도2에 나타낸다. 부포린과 머게이닌의 경우 염농도에 대하여 항균력이 민감하게 변하는 반면 본 발명에 따른 펩타이드, 염농도에 대하여도 항균력이 민감하게 변하지 않았다.
본 발명의 펩타이드는 종래의 항균 펩타이드에 비해 항균력이 뛰어날 뿐 아니라, 높은 염 농도에서도 항균 활성을 유지할 수 있다.
Claims (6)
- [RLLR]n(n=1 내지 6인 정수)인 서열을 포함하는 펩타이드.
- 제1항에 있어서, 상기 서열의 5'말단에 추가로 글라이신 잔기를 포함하는 펩타이드.
- 제1항에 있어서, 상기 서열의 C-말단이 아미드화된 펩타이드.
- PVGRVHRLLR인 서열을 포함하는 펩타이드.
- 제5항에 있어서, 상기 펩타이드의 C-말단이 아미드화된 펩타이드.
- 다음의 군으로부터 선택되는 펩타이드를 포함하는 펩타이드;RAGLQFPVGRVHRLLRK, RKGLQKLVGRVHRLLRK, RLLRRLLRRLLRRLLRRLLR, RAGLQFPVGRLLRRLLRRLLR, 이들의 5' 말단에 글라이신 잔기를 포함하는 펩타이드, 및 이들의 C-말단이 아미드화된 펩타이드.
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