KR20020051124A

KR20020051124A - 부포린 유도체를 포함하는 함암제

Info

Publication number: KR20020051124A
Application number: KR1020000080607A
Authority: KR
Inventors: 이한웅; 박찬배; 김선창; 박인엽
Original assignee: 이한웅; 윤덕용; 한국과학기술원; 서 레이몬드지원; 주식회사 바이오비젠
Priority date: 2000-12-22
Filing date: 2000-12-22
Publication date: 2002-06-28

Abstract

본 발명은 부포린 유도체 및 전기 부포린 유도체를 유효성분으로 하는 항암제에 관한 것이다. 본 발명의 부포린 유도체 BUF(5-13)[RLLR]3는 RAGLQFPVGRLLRRLLRRLLR의 아미노산 서열을 갖는다. 본 발명의 BUF(5-13)[RLLR]3는 실험실 조건 및 생체내에서 암세포에만 선별적으로 작용하므로, 효과적인 항암제의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

Description

부포린 유도체를 포함하는 함암제{Anti-cancer Agent Comprising Bufforin Derivatives}

본 발명은 부포린(Bufforin) 유도체를 포함하는 함암제에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 부포린 유도체 및 전기 부포린 유도체를 유효성분으로 하는 항암제에 관한 것이다.

모든 생물은 외부의 침입이나 자체내에서 발생한 이상에 대하여 자신을 보호하기 위하여 여러가지 방어수단을 갖추고 있다. 그 중, 세포에 의해 매개되는 면역반응과 생물체에서 만들어지는 여러 생리활성 물질들이 널리 알려져 있다. 항균펩타이드는 생물체가 자신의 방어로 만들어내는 생리활성 물질 중의 하나로 가장 최근에 알려져서, 현재 활발히 연구되어 약 2,000여종 이상의 항균펩타이드가 발견되었으며, 이들 펩타이드는 발견된 종에 따라 그 아미노산 조성이 상이하나, 항균활성을 나타내는 작용기작은 유사한 것으로 알려져 있다.

이러한 항균펩타이드들은 새로운 의약품으로서 각광받을 수 있는 다음과 같은 몇가지 우수한 점을 가지고 있다: 첫째, 항균펩타이드는 기존의 항생제보다 폭넓은 범위의 미생물에 대하여 강한 항균력을 가진다; 둘째, 항균펩타이드는 숙주세포는 파괴하지 않고 외부에서 침입한 병원균에 대해서만 항균활성을 나타내므로, 인체에 유효한 항생물질로서의 개발 가능성이 높다; 셋째, 모든 항균펩타이드는 글리코실화(glycosylation) 등의 2차 변형이 없기 때문에, 유전자 조작을 통하여 기존의 원핵 미생물에 의한 대량생산이 가능하다.

박테리아에서부터 사람에 이르는 모든 생물에서 발견되고 있는 항균펩타이드는 40개 내외의 아미노산으로 구성된 작은 펩타이드이고, 현재까지의 연구를 통하여 알려진 바에 의하면, 주로 항균펩타이드는 중합체를 이루어 미생물의 세포막에 구멍을 만들거나 또는 이온채널(ion-channel)을 형성하여 세포막의 투과능력에 이상을 유발시킴으로써 미생물을 사멸시킨다. 이로 인하여, 항균펩타이드는 기존의 항생제에 비하여 폭넓은 범위의 미생물에 작용하고, 미생물 내성을 유발하지 않아, 새로운 항균제로서 각광받고 있으며, 이의 응용에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.

최근 들어, 전기 항균펩타이드의 생체내에서의 역할이 미생물의 침입에 대한 방어수단으로서만이 아니라, 다른 여러가지 역할도 수행하고 있음이 밝혀지고 있다(참조: Cancer Research, 53:3052-3057, 1993; International Journal of Peptide and Protein Research, 43:573-582, 1994; Nature medicine, 6:49-55, 2000). 특히, 수 종의 항균펩타이드가 생체내에서 암세포의 성장을 억제하는 역할을 수행하고, 이들의 항암작용기작도 세포의 세포막과 관련된 것임이 알려지게 되었다(참조: Trends in Biotechnology, 16:82-88, 1998). 그러나, 전기 항균펩타이드를 항암제로서 적용하기에는 큰 문제점이 있었다. 즉, 암세포가 성장하고 있는 생물에 전기 항균펩타이드를 주입할 경우, 암세포와 정상세포를 구별하지 못한다는 치명적인 문제점이 알려지게 되었다. 이러한 문제점을 극복하기 위하여 다각적인 연구가 진행되고 있으나, 아직까지는 이렇다 할 성과가 없는 실정이다. 그러나, 작은 크기를 갖으면서도, 항암활성이 우수한 항균펩타이드를 항암제로서 사용할 수 있다면, 항암제의 개발에 큰 전기를 마련할 수 있을 것으로 기대되고 있다.

따라서, 암세포와 정상세포를 선별하여, 암세포에만 작용할 수 있는 항균펩타이드를 개발하여야 할 필요성이 끊임없이 대두되었다.

이에, 본 발명자들은 암세포와 정상세포를 선별하여, 암세포에만 작용할 수 있는 항균펩타이드를 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, 항균펩타이드로 알려진 부포린의 다양한 유도체들 중의 하나인 BUF(5-13)[RLLR]3가 정상 포유동물의 세포에는 영향을 미치지 않고, 암세포에만 선별적으로 작용함을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 주된 목적은 암세포에만 선별적으로 작용하는 부포린 유도체 BUF(5-13)[RLLR]3를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 전기 부포린 유도체 BUF(5-13)[RLLR]3를 유효성분으로 포함하는 항암제를 제공하는 것이다.

도 1a는 부포린 유도체를 처리한 인간의 섬유아세포주의 생존률을 나타내는 그래프이다.

도 1b는 부포린 유도체를 처리한 헬라세포주의 생존률을 나타내는 그래프이다.

도 1c는 부포린 유도체를 처리한 저캣세포주의 생존률을 나타내는 그래프이다.

도 2a는 BUF(5-13)[RLLR]3을 처리하지 않은 생쥐의 암세포조직을 나타낸 현미경 사진이다.

도 2b는 BUF(5-13)[RLLR]3을 처리한 생쥐의 암세포조직을 나타낸 현미경 사진이다.

도 3은 BUF(5-13)[RLLR]3의 세포내 위치를 나타내는 현미경 사진이다.

본 발명의 부포린 유도체 BUF(5-13)[RLLR]3는 RAGLQFPVGRLLRRLLRRLLR(서열번호 1)의 아미노산 서열을 갖는다.

한국산 두꺼비로부터 발견된 부포린(Bufforin)으로 명명된 항균펩타이드와 이들의 유도체는 그램양성균과 음성균 및 곰팡이균에 이르는 넓은 범위의 미생물에 대하여 항균활성을 가지고, 그 항균활성의 정도가 종래의 항균펩타이드들 보다 우수함이 알려져 있다. 특이하게도, 부포린 및 그의 유도체들은 세포막에 작용하여 미생물을 사멸시키는 다른 항균펩타이드들과 달리, 미생물의 세포내부로 침투하여 대상 미생물의 단백질과 핵산 합성을 저해하여 미생물을 사멸시키므로, 정상 포유류세포에는 영향을 주지 않고, 미생물에만 영향을 준다(참조: Biochemical and Biophysical Research Communication, 218:408-413, 1996; Proceedings of National Academy of Science, 97:8245-8250, 2000; 대한민국 특허 제 149278호). 이러한 부포린 및 그의 유도체는 알려진 일부 항균펩타이드들 처럼 항암활성을 나타낼 것으로 기대되었으나, 암세포와 정상의 포유동물 세포에 부포린을 처리할 경우 항암활성을 거의 나타내지 않아 항암제로서 사용할 수 없었다. 이에, 본 발명자들은 지속적인 연구를 통하여 항암활성을 나타낼 수 있는 부포린 유도체를 개발하였다. 본 발명의 부포린 유도체 BUF(5-13)[RLLR]3는 RAGLQFPVGRLLRRLLRRLLR(서열번호 1)의 아미노산 서열을 가지는 올리고펩타이드로서, 부포린 II(Buforin II)와 같은 종래의 부포린 유도체와는 달리 실험실 조건(in vitro) 및 생체내조건(in vivo)에서 항암활성을 나타내고, 암세포의 세포막이 아닌 핵에서 작용함을 확인하였다.

이하, 실시예에 의하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 자명할 것이다.

실시예 1: 부포린 유도체의 실험실 조건에서의 항암활성

먼저, 2종의 부포린 유도체를 합성하였는데, 하나는 종래 알려진 부포린 유도체인 부포린 II(Buforin II)로서 TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK(서열번호 2)의 아미노산 서열을 가지고, 다른 하나는 본 발명의 BUF(5-13)[RLLR]3이다.

실험실 조건에서 전기 2종의 부포린 유도체의 항암활성을 측정하기 위하여, 암세포주인 헬라(HeLa), 저캣(Jurkat) 세포주 및 인간의 섬유아세포(human diploid fibroblast, HDF)의 정상세포주를 각각 배양하고, 각각의 배양한 세포 10⁴cell을 96웰 플레이트(96 well plate)에 분주한 후, 다시 24시간동안 배양하였다. 이어, 각 웰에 전기 부포린 II와 BUF(5-13)[RLLR]3의 농도를 달리하여 첨가하고, 4일 동안 배양한 후, MTT(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)를 첨가하고 발색되는 정도를 분광기(spectrophotometer)로 검출하여 살아있는 세포의 수를 측정하여, 각 세포의 생존률을 확인하였다(참조: 도 1a, 도 1b, 도 1c). 도 1a는 부포린 유도체를 처리한 인간의 섬유아세포주의 생존률을 나타내는 그래프이고, 도 1b는 부포린 유도체를 처리한 헬라세포주의 생존률을 나타내는 그래프이며, 도 1c는 부포린 유도체를 처리한 저캣세포주의 생존률을 나타내는 그래프이다. 도 1a 내지 도 1c에서, (■)은 부포린 II, (●)은 BUF(5-13)[RLLR]3 및 (▲)는 아무것도 처리하지 않은 대조군을 나타낸다. 도 1a 내지 도 1c에서 보듯이, BUF(5-13)[RLLR]3는 헬라와 저캣세포주는 25㎍/ml의 농도에서 모두 사멸시키지만, 정상세포인 HDF는 이보다 4배 높은 100㎍/ml의 농도에서 사멸시키는 것을 확인하였다. 반면, 부포린 II는 200㎍/ml 이상의 농도에서도 세포에 아무런 영향을 주지 않았다.

실시예 2: 부포린 유도체의 생체내에서의 항암활성

실시예 1에서 나타내었듯이, 암세포주에 대한 항암활성을 가지는 BUF(5-13)[RLLR]3의 실제 생체내에서의 항암활성을 확인하기 위하여, 암세포 억제유전자인 p53이 결실(knock-out)되어 암조직이 발생된 30.4g의 생쥐에 BUF(5-13)[RLLR]3를 150㎍ 투여하였다. 3일이 경과한 후, 생쥐의 암세포 조직을 절취하여 현미경으로 확인하였다(참조: 도 2a, 도 2b). 도 2a는 BUF(5-13)[RLLR]3을 처리하지 않은 생쥐의 암세포조직을 타나낸 현미경 사진이고, 도 2b는 BUF(5-13)[RLLR]3을 처리한 생쥐의 암세포조직을 나타낸 현미경 사진이다. 도 2a 및 도 2b에서 보듯이, 암세포 조직에 BUF(5-13)[RLLR]3을 투여하면, 대부분의 암세포 조직이 파괴된 것을 확인할 수 있었다.

실시예 3: 부포린 유도체의 항암작용 기작

실시예 1 및 2를 통하여, 본 발명의 부포린 유도체 BUF(5-13)[RLLR]3가 항암활성을 나타냄을 알 수 있었는데, 이의 작용기작이 부포린과 같이 세포내의 대사과정에 관여하는 것인지, 아니면 다른 항균펩타이드와 같이 세포막에 작용하는 것인지를 확인하였다.

이를 위하여, BUF(5-13)[RLLR]3에 바이오틴(biotin)을 표지(label)하고, 헬라 세포주에 투여하였다. 이어, FITC(fluorescein isothiocyanate)가 표지된 스트렙타비딘(streptoavidin)을 세포에 처리하고, BUF(5-13)[RLLR]3의 세포내 위치를 확인하였다(참조: 도 3). 도 3은 BUF(5-13)[RLLR]3의 세포내 위치를 나타내는 현미경 사진이다. 도 3에서 보듯이, BUF(5-13)[RLLR]3는 세포핵에서 작용함을 알 수 있었다.

투여방법 및 효과량

본 발명의 부포린 유도체 BUF(5-13)[RLLR]3을 유효성분으로 함유하고 약제학적으로 허용가능한 담체를 첨가한 약제학적 조성물은 주사 형태로 투여할 수 있다. 주사용 조성물은 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하고, 언급한 조성물은 멸균되고/되거나 보조제(예를 들면, 방부제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제 용액 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제)를 함유한다. 또한, 이들은 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있다.

부포린 유도체의 투여량은 환자의 연령, 체중 및 질환의 정도에 따라 차이가 있으나, 통상 성인(체중 60kg 기준)의 경우 비경구로 1일 1회 250 내지 350mg으로 투여하는 것이 바람직하며, 본 발명의 분야에서 통상의 지식을 가진 자의 경험에의하여 적절히 결정될 수도 있다.

급성독성 시험

본 발명에서 항암제로서 사용되는 BUF(5-13)[RLLR]3의 급성독성을 알아보기 위하여, BUF(5-13)[RLLR]3을 마우스에 피하주사하고, 투여후 7일간에 걸쳐 마우스의 사망수를 관찰하여 LD₅₀값을 결정하였는 바, LD₅₀값은 약 60mg/kg이었다. 따라서, 상기 표시하는 유효량의 범위에서, 본 발명의 BUF(5-13)[RLLR]3을 유효성분으로 함유하는 항암제는 충분히 안전한 약물임을 알 수 있었다.

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 부포린 유도체 및 전기 부포린 유도체를 유효성분으로 하는 항암제를 제공한다. 본 발명의 부포린 유도체 BUF(5-13)[RLLR]3는 실험실 조건 및 생체내에서 암세포에만 선별적으로 작용하므로, 효과적인 항암제의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

서열번호 1의 아미노산서열로 나타내어지는 부포린 유도체 BUF(5-13)[RLLR]3.
BUF(5-13)[RLLR]3을 유효성분으로 포함하고, 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 항암제.