KR100805212B1 - 부포린 유도체 카이신을 포함하는 항암제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 한국산 두꺼비 (Bufo bufo gargarizans)에서 분리한 펩타이드 부포린의 유도체를 유효성분으로 함유하는 항암제에 관한 것이다. 본원의 부포린 유도체 카이신, 카이신 I 및 카이신 II은 정상 세포에는 작용하지 않으면서 암세포에 대하여서만 선택적으로 작용할 수 있어 항암활성이 탁월한 항암제를 제공할 수 있다.

부포린 유도체, 항암제

Description

부포린 유도체 카이신을 포함하는 항암제{ANTICANCER AGENTS COMPRISING KAISIN OF BUFORIN DERIVATIVES}

도 1a는 기존에 알려진 부포린 유도체인 부포린 IIb와 본원의 카이신, 카이신 I 및 카이신 II를 처리한 인간의 폐섬유아세포주의 생존률을 나타내는 그래프이며,

도 1b는 기존에 알려진 부포린 유도체인 부포린 IIb와 본원의 카이신, 카이신 I 및 카이신 II를 처리한 헬라세포주의 생존률을 나타내는 그래프이며,

도 2는 본원의 부포린 유도체 카이신(B, E) 및 머게이닌 G(C, F)를 처리하고, 또한 그 어느 것도 처리하지 않은 암세포(A, D)의 FACS 분석을 나타내는 도이며,

도 3은 본원의 부포린 유도체 카이신과 세포표면성분과의 반응을 나타내는 도면으로서, 강글리오시드(A) 및 시알산(B)에 의한 암세포의 생존율, 강글리오시드(C) 및 시알산(D)이 존재할 때 부포린 유도체의 암세포에 대한 침투저해율 및 강글리오시드 분해효소인 PPMP(E) 및 시알산 분해효소인 시알리다아제(F)를 처리하였을 때의 암세포 생존율을 나타내고 있는 도면이며,

도 4는 종양을 가진 마우스에 대해 본원의 부포린 유도체 카이신을 첨가하였을 경우, 종양의 크기(A 및 B) 및 종양 세포의 사멸여부(C 및 D)를 나타내는 도면 이다.

본 발명은 부포린(buforin) 유도체를 유효성분으로 포함하는 항암제에 관한 것이다.

모든 생물은 외부의 침입이나 자체 내에서 발생한 이상에 대하여 자신을 보호하기 위하여 여러가지 방어수단을 갖추고 있다. 세포에 의해 매개되는 면역반응과 생물체에서 만들어지는 여러 생리활성 물질들이 대표적인 예이다. 그 중, 천연 펩타이드들은 미생물에 대한 항생효과를 나타내며, 생리활성 호르몬, 신경 신호 조절 물질 등 다양한 기능을 한다고 알려져 있다. 항생 스펙트럼의 비교 검토뿐만 아니라 효능이 증진되면서도 길이가 짧은 유도체의 개발, 구조와 항생능과의 관련연구, 효모, 대장균, 곤충 세포 등에서 대량 생산 시스템 개발, 서열을 바꾸는 합성 펩타이드에 관한 연구들이 전세계 각 그룹에서 활발하게 수행중에 있다. 국제적 특허의 보호 아래 여러 바이오텍 기업에 의해 생산 시판되고 있는 머게이닌(Magainin)의 발견자인 Michael Zasloff 박사 그룹에 의해 발견된 머게이닌 2(Magainin2)가 항암 효능을 갖는다고 알려졌으나, 고형암에서 IC₅₀이 200㎍/㎖ 이상으로 낮은 활성을 띠는 것으로 밝혀졌다. 또한 항암 펩타이드제로서 한국산 옴개구리에서 발견된 펩타이드들 중 항암활성을 갖는 개구린5를 대량으로 분리하여 그 효능을 분석하고 절단 돌연변이 및 아미노산 치환체를 제조하여 항암활성의 주요 부위를 결정하여 이를 바탕으로 기능이 향상된 펩타이드 유도체를 개발하기도 하였다.

항생 펩타이드를 이용한 항암제의 경우 기존의 항암제들과 그 표적이 다르며 또한 다른 항암제의 세포 내 전달을 높여주고 효과를 높여줄 수 있다는 의미에서 다른 항암제와 함께 사용하는데 유용하다. 따라서 강력한 항암능력을 갖는 항생 펩타이드를 개발할 경우 많은 수요가 있을 것으로 예상된다. 현재 항암제 시장은 연간 63억 달러를 넘고 있으며 이에 대한 연구비도 연간 15억 달러에 이르고 있다. 제약업계 분석 전문 기관인 데이터 모니터에 따르면 2010년 치료용 펩타이드/단백질 분야는 연간 매출 규모가 590억 달러에 달할 전망인데 이는 2001년의 두 배에 달하는 것이다. 항생 펩타이드를 이용한 항암제는 아직 연구단계로 제품화된 것이 없으며 따라서 이를 빨리 개발할 경우 새로운 항암제시장을 선점할 수 있는 것으로 사료된다.

항균펩타이드는 생물체가 자신의 방어로 만들어내는 생리활성 물질 중의 하나로 가장 최근에 알려져서, 현재 활발히 연구되어 약 2,000여종 이상의 항균펩타이드가 발견되었으며, 이들 펩타이드는 발견된 종에 따라 그 아미노산 조성이 상이하나, 항균활성을 나타내는 작용기작은 유사한 것으로 알려져 있다. 이러한 항균펩타이드들은 새로운 의약품으로서 각광받을 수 있는 다음과 같은 몇가지 우수한 점을 가지고 있다: 첫째, 항균펩타이드는 기존의 항생제보다 폭넓은 범위의 미생물에 대하여 강한 항균력을 가진다. 둘째, 항균펩타이드는 숙주세포는 파괴하지 않고 외 부에서 침입한 병원균에 대해서만 항균활성을 나타내므로, 인체에 유효한 항생물질로서의 개발 가능성이 높다. 셋째, 모든 항균펩타이드는 글리코실화(glycosylation) 등의 2차 변형이 없기 때문에, 유전자 조작을 통하여 기존의 원핵 미생물에 의한 대량생산이 가능하다.

박테리아에서부터 사람에 이르는 모든 생물에서 발견되고 있는 항균펩타이드는 40개 내외의 아미노산으로 구성된 작은 펩타이드이고, 현재까지의 연구를 통하여 알려진 바에 의하면, 주로 항균펩타이드는 중합체를 이루어 미생물의 세포막에 구멍을 만들거나 또는 이온채널(ion-channel)을 형성하여 세포막의 투과능력에 이상을 유발시킴으로써 미생물을 사멸시킨다. 이로 인하여, 항균펩타이드는 기존의 항생제에 비하여 폭넓은 범위의 미생물에 작용하고, 미생물 내성을 유발하지 않아, 새로운 항균제로서 각광받고 있으며, 이의 응용에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.

최근 들어, 전기 항균펩타이드의 생체내에서의 역할이 미생물의 침입에 대한 방어수단으로서만이 아니라, 다른 여러가지 역할도 수행하고 있음이 밝혀지고 있다(Cancer Research, 53, pp3052-3057, 1993; International Journal of Peptide and Protein Research, 43, pp573-582, 1994; Nature medicine, 6, pp49-55, 2000). 특히, 수종의 항균 펩타이드가 생체내에서 암세포의 성장을 억제하는 역할을 수행하고, 이들의 항암작용기작도 세포의 세포막과 관련된 것임이 알려지게 되었다(Trends in Biotechnology, 16, pp82-88, 1998).

그러나, 전기 항균펩타이드를 항암제로서 적용하기에는 큰 문제점이 있었다. 즉, 암세포가 성장하고 있는 생물에 전기 항균펩타이드를 주입할 경우, 암세포와 정상세포를 구별하지 못한다는 치명적인 문제점이 알려지게 되었다. 이러한 문제점을 극복하기 위하여 다각적인 연구가 진행되고 있으나, 아직까지는 이렇다 할 성과가 없는 실정이다. 그러나, 작은 크기를 가지면서도, 항암활성이 우수한 항균펩타이드를 항암제로서 사용할 수 있다면, 항암제의 개발에 큰 전기를 마련할 수 있을 것으로 기대되고 있다. 따라서, 암세포와 정상세포를 선별하여, 암세포에만 작용할 수 있는 항균펩타이드를 개발하여야 할 필요성이 끊임없이 대두되었다.

항균펩타이드 중의 하나인 한국산 두꺼비로부터 발견된 부포린(Buforin) 및 이들의 유도체 역시 그램 양성균과 음성균 및 곰팡이균에 이르는 넓은 범위의 미생물에 대하여 항균활성을 가지고, 그 항균활성의 정도가 종래의 항균펩타이드들보다 우수함이 알려져 있다. 이러한 부포린 및 그의 유도체는 알려진 일부 항균 펩타이드들처럼 항암활성을 나타낼 것으로 기대되었으나, 암세포와 정상의 포유동물 세포에 부포린을 처리할 경우 항암활성을 거의 나타내지 않아 항암제로서 사용할 수 없었다.

이에, 본 발명자들은 암세포와 정상세포를 선별하여, 암세포에만 작용할 수 있는 항균펩타이드를 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, 항균펩타이드로 알려진 부포린의 다양한 유도체들이 정상 포유동물의 세포에는 영향을 미치지 않고, 암세포에만 선별적으로 작용함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 정상세포에는 작용하지 않고, 암세포에만 선택적으로 작용 하는 부포린 유도체 및 이를 유효성분으로 함유하는 항암제를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 항암활성을 갖는 부포린 유도체 카이신, 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 항암활성을 갖는 부포린 유도체 카이신 I 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 항암활성을 갖는 부포린 유도체 카이신 II를 제공한다.

또한 상기 부포린 유도체 카이신, 카이신 I 및 카이신 II 중 어느 하나 이상을 포함하는 항암제를 제공한다.

또한, 상기 항암제는 약학적으로 허용가능한 담체를 더 포함할 수 있다.

본원의 약학적 조성물은 주사형태로 환부에 투여할 수 있다. 주사용 조성물은 등장성 수용액이 바람직하다. 언급한 조성물은 방부제, 습윤제, 완충제 등을 함유한다. 상기 부포린 유도체 카이신의 투여량은 환자의 연령,체중 및 질환의 정도에 따라 차이가 있으나, 통상 성인(체중 60kg 기준)의 경우 비경구로 1일 1회 10 내지 500mg, 바람직하게는 100 내지 120mg으로 투여하는 것이 바람직하다.

이하, 실시예 및 실험예에 의하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명의 예시일뿐, 본 발명의 권리범위가 이에 의하여 한정되지 아니한다.

실시예 1. 부포린 유도체의 제조

기존에 이미 알려진 한국 특허 출원 제2000-80607호에 의해 공개된 부포린 IIb의 아미노산 서열을 토대로 N-,C- 말단부위의 아미노산을 변형시켜 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 부포린 유도체 카이신, 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 부포린 유도체 카이신 I 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 부포린 유도체 카이신 II를 제조하였다.

실험예 1. 본원의 부포린 유도체의 in vitro 에서의 항암활성

in vitro에서 본원의 부포린 유도체의 항암활성을 측정하기 위하여 암세포주인 헬라(HeLa) 세포주 및 인간의 폐섬유아세포(human embryo lung fibroblast, HEL299)의 정상세포주를 각각 배양하고, 각각의 배양한 세포 1×10⁴cell을 96웰 플레이트(96 well plate)에 분주한 후, 다시 24시간 동안 배양하였다. 이어, 각 웰에 공지의 부포린 IIb와 본원의 카이신, 카이신I 및 카이신II을 0 내지 100㎍/㎖의 농도로 첨가하고, 4일 동안 배양한 후 MTT(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)를 첨가하여 발색되는 정도를 분광기(spectrophotometer)로 검출하여 살아있는 세포의 수를 측정함으로써 각 세포의 생존률을 확인하였다.

상기 실험 수행의 결과, 도 1a 및 도 1b에서 보는 바와 같이, 도 1a의 부포린 유도체를 처리한 인간의 폐섬유아세포주의 생존률과 도 1b의 부포린 유도체를 처리한 암세포주인 헬라세포의 생존률을 비교하여보면, 정상세포에 대하여는 100㎍ /㎖의 농도에서도 세포에 아무런 영향을 끼치지 않음에 반하여, 암세포주인 헬라 세포주에 대하여는 25㎍/㎖의 낮은 농도에서도 모두 사멸시키는 것을 확인할 수 있었다. 도 1a 및 도 1b의 (■)은 부포린 IIb, (●)은 카이신II를, (▲)는 카이신을, (▼)는 카이신I을 의미한다. 특히 10~25㎍/㎖농도에서는 카이신II(●), 카이신(▲), 카이신I(▼)이, 부포린 IIb(■)에 비해 1.1~5배까지의 높은 항암력을 보여주는 것으로 보아, 카이신II(●), 카이신(▲), 카이신I(▼)이 기존의 부포린 IIb보다, 낮은 농도에서 더 빠른 효과를 나타냄을 알 수 있었다.

실험예 2: 항암 펩타이드 카이신이 처리된 암세포의 FACS 분석

저캣세포(1×10⁵cell)을 본원의 카이신 및 머게이닌 G와 37℃에서 30분 동안 배양하였다. 대조군으로는 어떠한 펩타이드도 첨가하지 않은 저캣세포를 배양하였다. 이들 세포 내 K⁺ 양은 세포와 세포 투과성 K⁺ 결합 PBFI-AM(benzofuran isophthalate-AM, 5ul; Molecular Probes)을 30분 동안 반응시킨 후 플로우 사이토미트리(flow cytometry)로 측정하여 분석하였다. 세포 내 펩타이드의 작용 위치를 확인하기 위해, 글래스 커버슬립(glass coverslip)상의 헬라세포 또는 인간섬유아세포(2×10⁵ cell)를 37℃에서 하룻밤동안 배양한 후 비오틴-표지된 펩타이드 (20ug/㎖)와 배양하였다. 펩타이드와 24시간 배양한 세포를 PBS로 2번 세척한 후 상온에서 30분간 0.2% 트리톤 X-100에서 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)와 반응시켜 세포를 고정, 투과시키고 이렇게 투과된 세포는 PBS로 2번 세척한 후 10% BSA가 첨가된 PBS에서 1시간 동안 배양하였다. 카이신과 저캣세포의 세포막 사이의 상호작용은 PBFI-AM을 이용하여 세포 내 K⁺의 양을 측정하여 분석하였다.

상기 실험 수행의 결과, 도 2에서 보는 바와 같이 PBFI-AM와 반응시켰을 때,카이신을 처리한 저캣 세포주(B)는 카이신을 처리하지 않은 저캣 세포주(A)와 동일한 형광정도를 나타내는 것으로 보아 카이신을 처리한 경우 세포막 보전이 잘 유지됨을 확인할 수 있었다. 그러나 비교군으로 처리한 머게이닌 G를 처리한 경우에는 어떠한 펩타이드도 처리하지 않은 세포(A)와 비교하였을 때 형광정도가 낮게 나타나는 것으로 보아 세포내 K⁺ 방출과 관계있음을 알 수 있었다.

상기 실험결과를 종합하여 볼 때, 본 발명의 카이신은 세포막에 작용하는 펩타이드 머게이닌 G와 달리 헬라세포막을 파괴하지 않고 그대로 통과하여 세포막이 아니라 세포내 분자를 주 표적으로 하고 있음을 알 수 있었다(도 2의 D 참조). 정상세포(non-transformed human fibroblasts)의 경우, 헬라세포 IC₅₀의 7배를 초과하는 농도에서도 카이신은 정상세포를 투과하지 않았다(도 2의 F 참조).

실험예 3. 카이신과 세포표면성분과의 반응

세포표면 물질과 본 발명의 카이신 사이의 반응을 연구하기 위해서 다양한 농도의 헤파린, 강글리오시드(ganglioside)와 암세포를 가지고 경합결합분석(competitive binding assay)을 수행하였다.

암세포인 저캣과 헬라 세포를 완전배지가 들어있는 96-웰 플레이트(1×10⁴ cells/well)에서 배양한 뒤 1 내지 50ug/㎖의 강글리오시드와 헤파린을 항암 펩타이드 카이신 (저캣세포에 대해 6ul/㎖, 헬라세포에 대해 12ug/㎖ 처리)과 함께 암세포에 처리하고 48시간 배양 후, 세포 생존율을 MTT분석법으로 측정함으로써 카이신과 강글리오시드, 헤파린을 처리하지 않은 세포와의 생존율을 비교하였다.

암세포 표면에 카이신이 결합하는 물질을 추가적으로 확인하기 위해 강글리오시드 및 시알산이 없는 세포를 만들고, 세포 표면에서 강글리오시드를 제거하기 위하여 완전배지에서 키운 암세포에 강글리시드 생합성 저해제인 PMPP(1-phenyl-2-palmitoylamino-3-morpholino-1-propanol)를 0.625에서 5uM의 농도로 처리하고 이틀동안 배양한 뒤 저캣 세포에 대해서는 6ug/㎖, 헬라 세포에 대해서는 12ug/㎖의 농도로 카이신을 처리하고 48시간 배양 후 세포 생존도와 생존율을 앞에서의 방법과 같이 측정하였다.

세포 표면의 시알산은 분해효소 시알리다아제(sialidase)로 제거한 뒤, 시간 반응 후 배지를 항암 펩타이드가 포함된 완전 배지로 바꾼 뒤, 48시간 동안 키워 세포 생존 정도를 측정하였다. 카이신이 암세포에 침투하기 위해 세포막에서 결합하는 물질을 찾기 위해, 외부 강글리오시드와 헤파린이 카이신의 항암성에 끼치는 영향을 분석하였다.

상기 실험 수행의 결과, 도 3에서 보는 바와 같이, 배지 속 강글리오시드가 카이신이 암세포에 침투하는 것을 저해함을 알 수 있었고(도 3의 A 참조), 헤파린 의 경우에는 농도에 따른 카이신의 항암활성에 큰 영향을 미치지 않음을 확인할 수 있었다(도 3의 B 참조). 이 결과로부터 세포 표면의 강글리오시드가 카이신의 암세포내 침투에 중요한 역할을 담당하며, 강글리오시드에 의한 카이신의 침투저해를 플로우 사이토미트로로 확인한 결과, FITC-표지된 카이신의 농도에 따라 카이신 처리된 세포의 형광 세기가 비례함을 알 수 있었다(도 3의 C 및 D 참조). 카이신의 결합과 침투에 있어 강글리오시드의 역할을 추가적으로 확인하기 위해 강글리오시드의 합성저해제인 PPMP을 처리한 암세포에서는 카이신의 세포 독성을 관찰하였을 때 상기 PPMP를 처리하지 않을 때보다 암세포의 생존율이 50%보다 훨씬 높은 생존율(헬라 세포 85%, 저캣 세포 93%)을 나타냄을 확인할 수 있었다(도 3의 E 참조).

또한 시알산의 카이신의 세포독성에 미치는 영향의 경우, 시알산 분해효소 시알리다아제로 표면의 시알산이 제거된 암세포에서는 카이신의 항암 활성이 크게 감소됨을 확인할 수 있었다. 카이신 처리 48시간 후에, 시알산이 제거되지 않은 세포의 생존율이 50%임에 반하여 시알산이 제거되었을 경우에는 헬라세포는 85%, 저캣 세포는 90%로서 높았음을 확인할 수 있었다(도 3의 F 참조).

이들 실험 결과로부터, 본 발명의 항암 펩타이드인 카이신의 항암활성은 강글리오시드가 있을 경우 낮아짐으로서 강글리오시드가 제거될 경우에는 높은 항암 활성을 나타내며, 시알산의 경우에는 이것이 존재할 때 카이신의 항암활성이 높아짐을 확인할 수 있었다.

실험예 4. 본 발명의 카이신의 in vivo 에서의 항암활성

종양에 대한 본 발명의 카이신의 in vivo에서의 항암활성을 측정하기 위해 누드 마우스 BALB/c-nu에서 생성된 6개의 종양에 대하여 2주 동안 사흘에 한번씩 15g의 종양에 0.3mg의 카이신을 처리한 후, 21일째에 쥐를 죽여 암의 크기를 측정하고, 암세포 조직을 현미경으로 관찰하였다.

상기 실험 수행의 결과, 도 4에서 보는 바와 같이 카이신은 마우스의 암덩어리에 대하여 강력한 항암 활성을 나타냄을 확인할 수 있었다. 본 발명의 카이신을 처리하기 전의 종양의 직경은 2.4cm였으나, 본 발명의 카이신을 처리하고 2주 후에는 종양의 직경이 0.3cm로써 그 크기가 현저히 감소되었음을 알 수 있었고(도 4의 A 및 B 참조), 카이신을 처리한 암 조직을 검사한 결과 크기가 감소된 종양 내의 세포들도 거의 다 사멸되었음을 확인할 수 있었다(도 4의 C 및 D).

상술한 바와 같이, 본 발명은 정상세포에는 작용하지 않고 암세포에만 선택적으로 작용하는 부포린 유도체 및 이를 유효성분으로 함유하는 항암제를 제공하고 있다.

본원의 부포린 유도체 카이신, 카이신I 및 카이신II은 in vitro 뿐만 아니라 in vivo에서도 강력한 항암활성을 나타내어 항암제로서 아주 유용하게 이용될 수 있다.

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Claims (5)

1. 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 항암활성을 나타내는 부포린 유도체 카이신.
2. 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 항암활성을 나타내는 부포린 유도체 카이신I.
3. 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 항암활성을 나타내는 부포린 유도체 카이신II.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 부포린 유도체를 유효성분으로 포함하는 항암제.
5. 제4항에 있어서, 상기 항암제는 약학적으로 허용가능한 담체를 더 포함하는 것인 항암제.

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