CN109415411B - 表现出抗革兰氏阴性菌的抗微生物活性的断开或折叠的螺旋肽或肽类似物及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种断开或扭折的螺旋肽或肽类似物及其用途，并且更具体地涉及一种革兰氏阴性菌膜穿透肽或肽类似物，其中由疏水性氨基酸和亲水性氨基酸组成的两亲性α‑螺旋肽具有扭折结构，或者涉及一种采用所述肽抗革兰氏阴性菌膜的特异性活性的抗微生物组合物，或者用于共同施用的抗微生物组合物，或者包含连接至所述肽或肽类似物的药物的缀合物，或者包含所述组合物或缀合物的抗生素。

Description

表现出抗革兰氏阴性菌的抗微生物活性的断开或折叠的螺旋 肽或肽类似物及其用途

技术领域

发明涉及一种断开或扭折的螺旋肽或肽类似物及其用途，并且更具体地涉及一种革兰氏阴性菌膜穿透肽或肽类似物，其中由疏水性氨基酸和亲水性氨基酸组成的两亲性α-螺旋肽具有扭折结构，或者涉及一种采用所述肽抗所述革兰氏阴性菌膜的特异性活性的抗微生物组合物，或者用于共同施用的抗微生物组合物，或者包含连接至所述肽或肽类似物的药物的缀合物，或者包含所述组合物或缀合物的抗生素。

背景技术

由于被分类为革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌的针对抗微生物药物的抗性细菌的比例逐渐增高，不久之后，对所有现有药物都具有抗性的细菌将会传播开来。由这类抗性细菌导致的医院获得性感染是最严重的。例如，在2014年，在美国仅医院获得性感染患者的数量就约一百七十万，并且由医院获得性感染导致的死亡数量达到约100,000。该死亡数量比占美国女性死亡最大比例的乳腺癌死亡的数量和占美国男性死亡最大比例的前列腺癌死亡的数量的总和还要多。

为了解决这些抗性细菌，必须连续引入新的抗微生物剂。幸运的是，已经在2000年代又引入了抗革兰氏阳性菌的新药。然而，从1980年代开始尚未出现抗革兰氏阴性菌的抗微生物治疗剂。此外，由于在用于开发能够抑制革兰氏阴性菌的新药的渠道中没有候选化合物，因此需要至少10至20年来开发新药。

虽然必须非常快速地开发新的抗革兰氏阴性菌的抗生素，由于没有抗革兰氏阴性菌的药物，因此需要抗革兰氏阴性菌的专门措施用于该疾病。已经尝试了重新定位或重定用途的努力，以对所有目前被FDA批准的被开发用于其它用途的药物进行筛选，以筛选出具有抗革兰氏阴性菌能力的药物，并且将它们用作新的抗生素。报道了772个药物中的42个抗革兰氏阳性菌有效，并且其中的两个抗革兰氏阴性菌有效。但是，这两个药物在非常高的浓度才有效。因此，鉴于化合物的毒性等，看起来不存在通过筛选选择的可以重新定位能够起抗革兰氏阴性菌作用的药物。

在这点上，存在显著大量的抗革兰氏阳性菌的药物，而只有很少抗革兰氏阴性菌的药物。认为这是因为抗生素候选物不能穿过革兰氏阴性菌的外膜。

由于从LPS(脂多糖)层起始的外膜通过LPS层而具有亲水特性和疏水特性，大多数低分子量药物不能自由穿过该膜。已知大多数抗革兰氏阴性菌无效而抗革兰氏阳性菌有效的抗生素不能穿过外膜。代表性药物包括利奈唑胺(Linezolid)、氯唑西林(Cloxacillin)等。

因此，革兰氏阴性菌的外膜是用于开发新药的主要靶标，并且能够降解或弱化外膜的化合物可用作抗革兰氏阴性菌的治疗剂。事实上，许多种抗微生物肽(AMP)由于分解该膜的机制而具有抗微生物作用。已经考虑了通过使用这类AMP引入不能穿过该膜的抗生素的方法。这种假设能够通过共同施用抗微生物肽和抗生素的协同作用被证实。

但是，以前报道的共同施用的协同作用由于实验方法的错误而是假阳性的，并且在抗微生物肽和抗生素之间不存在协同作用。换言之，证明了通过使用降解该膜的抗微生物肽来增加现存抗生素的协同作用的方法，不能如预期般有效。通过由抗微生物肽引起的膜降解而使抗生素穿透进入细菌不具有协同作用的事实，可能是由于时滞错配(time-lagmismatch)。该事实可能是因为抗微生物肽非常快速地降解该膜，而大多数抗生素以低于该膜降解速率的速率显示功效。

因此认为，不是快速降解和破坏细菌的膜的肽，而是可不破坏该膜就通过细菌的膜进入细菌或者可通过激活该膜本身而使该膜松散的肽，可有效地提供协同作用。即，认为由于该膜的坚硬性而不能穿过膜的抗生素，可穿过该膜并且能够展示出协同作用。

在该技术背景下，本发明的发明人已经发现革兰氏阴性菌膜激活肽或肽类似物，其具有通过特异性地仅在该膜上起作用而使革兰氏阴性菌的外膜松散的能力，以及其用途，从而完成本发明。

发明内容

技术问题

本发明的目标是提供一种具有α-螺旋结构的肽或肽类似物，其中由疏水性氨基酸和亲水性氨基酸组成的两亲性α-螺旋肽的一个或多个疏水性氨基酸是通过取代而被扭折或断开。

本发明的另一个目标是提供一种用于共同施用的抗微生物组合物，其包含上述肽或肽类似物。

本发明的又一个目标是提供一种缀合物，其包含：肽或肽类似物；和连接至所述肽的药物。

技术方案

为了实现以上目标，本发明提供一种革兰氏阴性菌膜穿透肽或肽类似物，其中由疏水性氨基酸和亲水性氨基酸组成的两亲性α-螺旋肽具有扭折结构，所述肽或肽类似物包含：i)α-螺旋结构，其中所述两亲性α-螺旋肽或肽类似物的一个或多个疏水性氨基酸通过用选自由以下组成的组的一个或多个取代而被扭折：脯氨酸(P)、天冬氨酸(D)、天冬酰胺(N)、谷氨酸(E)、谷氨酰胺(Q)、其D-型氨基酸以及其衍生物；或

ii)α-螺旋结构，其中所述两亲性α-螺旋肽的两个或更多个氨基酸通过经由二硫键、碳-碳键、马来酰亚胺键或酰胺键的连接在选自由以下组成的组的一个或多个位置被扭折：i、i+3、i+4、i+7、i+8、i+10和i+11(其中i是整数)。

本发明还提供一种具有扭折的α-螺旋结构的肽或肽类似物，所述扭折的α-螺旋结构通过由脯氨酸(P)、天冬氨酸(D)、天冬酰胺(N)、谷氨酸(E)或谷氨酰胺(Q)取代两亲性抗生素肽的疏水部分而得到。

本发明还提供一种用于共同施用的抗微生物组合物，其包含上述肽或肽类似物。

本发明还提供一种缀合物，其包含：上述肽或肽类似物；和连接至所述肽的药物。

本发明还提供一种抗生素，其包含上述组合物或缀合物。

附图说明

图1示出了用荧光标记物TAMRA标记五个突变肽(P、N、D、Q和E)后进行FACS以确认根据本发明的肽是否确实穿透革兰氏阴性菌的外膜的结果。

图2示出了进行FACS以确定本发明的肽的穿透MDA MB231真核细胞的能力的结果。

图3示出了在LK或KL肽中表现出最低溶血活性的肽。

图4示出了检测根据本发明的肽是否具有穿透革兰氏阴性菌的能力并且具有抗膜的能力的结果。

图5示出了为了证实根据本发明的肽激活膜的机制，在大肠杆菌的存在下使用萘基苯基胺(NPN)观察荧光的结果。

图6示出了观察根据本发明的肽是否降解或破坏革兰氏阴性菌的外壁或内壁的结果。

图7示出了通过DLS测量由LPS组成的脂质体的尺寸或在肽的存在下脂质体的尺寸的变化的结果。

图8示出了用TAMRA-缀合的肽处理的大肠杆菌的NDm-1染色的共聚焦显微成像。

图9示出了评价KL-L9P和利奈唑胺或氯唑西林的协同作用的结果。

图10示出了评价KL-L9P和白藜芦醇(resveratrol)的协同作用的结果。

图11按照图示示出了共同施用的化合物的协同作用与指示亲水性或疏水性的logP之间的相关性。

图12按照图示示出了共同施用的化合物的协同作用与分子量之间的相关性。

图13按照图示示出了共同施用的全部候选化合物的协同作用与logP之间的相关性。

图14按照图示示出了带负电荷的或带正电荷的化合物的协同作用与极性表面积和分子量之间的相关性。

图15比较了具有两亲性α-螺旋结构的肽与根据本发明的具有扭折或断开结构的肽。

图16描绘了本发明中的三个肽的轮图(wheel diagram)，示出了由于它们的抗革兰氏阴性菌的外膜的活性而与抗生素的协同作用。一般地，其示出了其中的两亲性肽的疏水侧被脯氨酸破坏和扭折的结构(参见图15)。

图17示出了用于评价协同作用的Wimley方法(BBA,2015,v.1848(1),pp.8-15.)。

图18分成与KL-L9P具有协同作用的抗生素(由黑色指示)和与KL-L9P不具有协同作用的抗生素(由灰色指示)。

图19分成与KL-L9P具有协同作用的非抗生素药物(黑色)和与KL-L9P不具有协同作用的非抗生素药物(灰色)。

具体实施方式

直至现在，已知若干能够根除革兰氏阴性菌的抗微生物肽(AMP)。然而，这些肽大多数通过降解细菌的细胞壁的机制根除致病性细菌。这些肽不仅降解革兰氏阴性菌的细胞壁，还降解宿主细胞真核细胞，因此使用这些肽作为抗生素会导致许多副作用。然而，当以不同形式突变这些AMP时，其性质渐渐改变。其中，特异性突变体具有降低的降解真核细胞的细胞壁的能力，并且还具有特异性穿过革兰氏阴性菌的膜或者仅激活外膜的能力，因此表现出仅对革兰氏阴性菌特异的特性。

因此，本发明的发明人尝试通过连续突变具有两亲性螺旋结构的肽，发现在保留穿透革兰氏阴性菌细胞的特性的同时不溶解或穿透宿主真核细胞的肽。

1950年代早期就被开发但是由于其严重的毒性未频繁用作抗革兰氏阴性菌的治疗剂的化合物粘菌素(colistin)，是一种基于多粘菌素的抗生素。粘菌素是一种环状两亲性肽，其富含阳离子并且在一侧具有长碳链。关于粘菌素的反应机制，已知粘菌素识别存在于革兰氏阴性菌的外膜中的LPS脂质层，进入外膜以使外膜松散，并且还通过长碳链部分穿透内膜，从而杀死细菌。即，关于粘菌素抗微生物肽的机制，粘菌素不像其它抗微生物肽一样快速降解细菌的膜，而是能够使膜松散，同时停留在膜中很长时间。因此，报道了可实际观察到粘菌素与一些低分子抗生素分子的协同作用。该粘菌素被用作使外膜松散的金标准，并且除了革兰氏阴性菌以外对真核细胞的膜具有相对较低的活性。本发明意图找到两亲性肽突变体，其刺激外膜的能力类似于粘菌素，但是具有更低的毒性和具有最大化的破坏外膜的能力。

在对一些突变肽的多个突变研究中，所述突变肽具有能够在具有降低的α-螺旋含量的同时根除革兰氏阴性菌的扭折或断开结构，发现当肽的疏水一侧的最敏感部分被亲水性氨基酸残基取代时，肽抗宿主细胞的活性由于扭折或断开的α-螺旋结构而被消除，使得肽的副作用能够被最小化。此外，发现一些具有扭折或断开结构的突变肽可降解或穿过革兰氏阴性菌大肠杆菌的膜以进入细菌，因此能够杀死革兰氏阴性菌或至少使膜松散。

基于这些发现，在一方面，本发明涉及一种革兰氏阴性菌膜穿透肽或肽类似物，其具有通过取代由疏水性氨基酸和亲水性氨基酸组成的两亲性α-螺旋肽的一个或多个疏水性氨基酸而得到的扭折或断开的α-螺旋结构。在这种情况下，取代的疏水性氨基酸是选自下组的一个或多个：脯氨酸(P)、天冬氨酸(D)、天冬酰胺(N)、谷氨酸(E)、谷氨酰胺(Q)、其D-型氨基酸以及其衍生物(例如，图16中的B(KL-L9P)和C(KL-L8D)结构)。

在一些实施方案中，本发明涉及一种具有α-螺旋结构的肽或肽类似物，其中天然存在的两亲性肽(例如Buforin5-21)的疏水部分通过用脯氨酸(P)、天冬氨酸(D)、天冬酰胺(N)、谷氨酸(E)、或谷氨酰胺(Q)取代而被扭折(图16中的结构A)。在整个说明书中，如本文所使用的“扭折的”可以与术语“弯曲的或断开的”相同含义或可互换的含义使用。“扭折的”结构可以是通过由亲水性氨基酸和疏水性氨基酸组成的两亲性氨基酸的一个或多个疏水性氨基酸的取代而形成的结构，或者是其中所述α-螺旋对于两亲性α-螺旋肽中的氨基酸取代的部分而弯曲的结构。

在这种情况下，所述取代的氨基酸可以是选自下组的一个或多个：脯氨酸(P)、天冬氨酸(D)、天冬酰胺(N)、谷氨酸(E)、谷氨酰胺(Q)、其D-型氨基酸以及其衍生物。

具体地，发现当由疏水性氨基酸组成的疏水一侧被脯氨酸(P)突变由此构建肽时，所述构建的肽可在不破坏膜的情况下特异性地激活膜，这与AMP的一般特性不同。即，预期根据本发明的肽会进入膜或者使膜松散，使得具有低分子量的其它化合物(例如小分子)会容易地穿透细菌。预期这些肽的使用会与使膜松散的粘菌素类似，与抗生素产生协同作用，并且还会使用于其它目的的治疗性药物的重新定位成为可能。

与此相关，图15中的A对应于具有非扭折或非断开结构的两亲性α-螺旋KL肽，B-1显示通过在第9位用脯氨酸取代L而形成的KL-L9P，B-2显示通过在第7位和第8位用脯氨酸取代L而形成的LK-L7PL8P，并且B-3显示通过在第8位用天冬氨酸取代L而形成的LK-L8D。

此外，如图16中所示，具有非扭折或非断开结构的两亲性α-螺旋肽保持了一种全圆柱形结构，而扭折或断开的肽可以在氨基酸取代的部分中具有弯曲形状。

在上述氨基酸中，与L-型氨基酸不同，D-型氨基酸是非天然存在的氨基酸，并且用D-型氨基酸取代可以提供与最初的肽非对映的肽。当肽用D-型氨基酸取代时，α-螺旋可被进一步断开，同时肽的氨基酸序列被改变，并且因此肽对于宿主细胞的毒性可被进一步降低并且可保护肽免于被天然酶攻击，使得其体内半衰期可增加。

上述氨基酸衍生物可以在氨基酸上含有多种保护基团。例如，脯氨酸的衍生物可以是氮杂环丁烷-2-羧酸、高脯氨酸、羟基脯氨酸、α-甲基脯氨酸或4-氟脯氨酸，并且谷氨酸的衍生物可以是α-氨基己二酸、γ-羟基谷氨酸、2-氨基庚二酸或α-氨基辛二酸，但不限于此。上述定义和示例可等同地用于本文使用的衍生物。

此外，根据本发明的革兰氏阴性菌膜穿透肽具有α-螺旋结构，其中两亲性α-螺旋肽的两个或更多个氨基酸在选自由以下组成的组的一个或多个位置被二硫键、碳-碳键、马来酰亚胺键或酰胺键连接并扭折：i、i+3、i+4、i+7、i+8、i+10和i+11(其中i是整数)。U形钉(staple)结构在国际专利公开号WO2016/085280中公开，该申请由本发明的发明人提交，其内容通过引用并入本文。

所述肽或肽类似物可以表现出以下特征中的任一个：

i)其具有抗革兰氏阴性菌的活性，不具有抗宿主细胞的溶血活性或抗革兰氏阳性菌的活性；

ii)其能够结合至革兰氏阴性菌外膜表面上的LPS层；

iii)其能够结合至革兰氏阴性菌外膜表面上的LPS层，同时进入外膜并仅停留在外膜中；

iv)其具有穿透革兰氏阴性菌外膜并仅停留在外膜中的特性，同时不具有降解外膜或内膜的能力；

v)在根据本发明的两亲性肽中，两亲性α-螺旋肽(其中在特定位置(例如选自从N-末端至C-末端方向的第6、7、8、9、11和12位的一个或多个位置)的疏水性氨基酸被脯氨酸(P)、天冬氨酸(D)、天冬酰胺(N)、谷氨酸(E)、谷氨酰胺(Q)、其D-型氨基酸及其衍生物取代)，与具有相同氨基酸组成的肽(例如，包含亲水性氨基酸和疏水性氨基酸并且其中的一些氨基酸被脯氨酸(P)、天冬氨酸(D)、天冬酰胺(N)、谷氨酸(E)、谷氨酰胺(Q)、其D-型氨基酸及其衍生物取代的肽)相比具有相对强的亲水性；

vi)其具有以下结构：其中α-螺旋通过脯氨酸(Pro)被扭折，并且扭折的部分是疏水性的；

vii)带正电荷的氨基酸的含量是基于氨基酸的总含量的35％(6/16)或更多，或者疏水性氨基酸的含量是基于氨基酸的总含量的35％(6/16)或更多；

viii)其不具有抗宿主细胞的溶血活性或不具有抗革兰氏阳性菌的活性；和

ix)其抗革兰氏阴性菌的活性保持微弱(MIC＝10-20μM)。

本发明还涵盖“肽类似物”。肽类似物可以包括其中α-氨基酸侧链或α-氨基酸骨架被一个或多个其它官能团取代的类似物。侧链-或骨架-修饰的肽类似物的实例包括其中的吡咯烷环被羟基取代的羟基脯氨酸肽，或N-甲基甘氨酸“类肽(peptoid)”。

在一个实施方案中，所述两亲性α-螺旋肽的亲水性氨基酸可以包含选自由精氨酸、赖氨酸和组氨酸组成的带正电荷的氨基酸组的一个或多个。此外，所述疏水性氨基酸可以是选自由亮氨酸、缬氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、异亮氨酸、其D-型氨基酸以及其衍生物组成的组中的一个或多个。

在上述氨基酸中，D-型氨基酸是上述非天然存在的氨基酸。被D-型氨基酸取代可提供与初始肽非对映的肽。

在一个实施方案中，所述两亲性α-螺旋肽可以包含由下式(1)或(1-1)表示的五氨基酸序列、其反向序列或重复含有该序列的序列：

XXZYX(1)

XYZYY(1-1)

其中，X是亲水性氨基酸；Y是疏水性氨基酸；并且Z是扭折或断开结构的取代的氨基酸脯氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺或其衍生物。在这种情况下，所述亲水性氨基酸可以是精氨酸、赖氨酸、组氨酸或其衍生物，并且所述疏水性氨基酸可以是亮氨酸、缬氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、异亮氨酸或其衍生物。

由式(1)或(1-1)表示的肽的序列的具体实例可以是KKPLK、KLDKK或QFPVG。

反向序列意指通过以3’至5’方向读取由式(1)或(1-1)(其以5’至3’方向读取)定义的序列所获得的序列。例如，由式(1)表示的五氨基酸序列的反向序列可以是XYZXX。

“重复含有该序列的序列”可以意指以5’至3’方向重复若干次例如2至10次，优选2至5次包含式(1)或(1-1)的序列的序列。例如，当由式(1)或(1-1)定义的序列被重复两次时，重复含有该序列的序列可以包含XXZYXXXZYX序列。

在一些情况下，所述氨基酸序列可以被构造为二聚体或四聚体形式。

此外，所述两亲性α-螺旋肽可以包含由下式(2)或(2-1)表示的七氨基酸序列、其反向序列或重复含有该序列的序列：

YXXZYXY(2)

YXYZYYX(2-1)

其中，X、Y和Z与在式(1)中定义的相同。

由式(2)或(2-1)表示的肽的序列的具体实例可以是LKKPLKL或LKLDKKL。

此外，所述两亲性α-螺旋肽可以包含由下式(3)或(3-1)表示的九氨基酸序列、其反向序列或重复含有该序列的序列：

YYXXZYXYY(3)

YYXYZYYXY(3-1)

其中，X、Y和Z与在式(1)中定义的相同。

由式(3)或(3-1)表示的肽的序列的具体实例可以是LLKKPLKLL、LLKLDKKLL或GLQFPVGRV。

此外，所述两亲性α-螺旋肽可以包含由下式(4)或(4-1)表示的十一氨基酸序列、其反向序列或重复含有该序列的序列：

XYYXXZYXYYX(4)

YYYXYZYYXYX(4-1)

其中，X、Y和Z与在式(1)中定义的相同。

由式(4)或(4-1)表示的肽的序列的具体实例可以是KLLKKPLKLLK、KLLKLDKKLLK或AGLQFPVGRVH。

此外，所述两亲性α-螺旋肽可以包含由下式(5)表示的六氨基酸序列、其反向序列或重复含有该序列的序列：

YXZZXX(5)

其中，X、Y和Z与在式(1)中定义的相同。

由式(5)表示的肽的序列的具体实例可以是LKPPKK。

此外，所述两亲性α-螺旋肽可以包含由下式(6)表示的八氨基酸序列、其反向序列或重复含有该序列的序列：

YYXZZXXY(6)

其中，X、Y和Z与在式(1)中定义的相同。

由式(6)表示的肽的序列的具体实例可以是LLKPPKKL。

此外，所述两亲性α-螺旋肽可以包含由下式(7)表示的十氨基酸序列、其反向序列或重复含有该序列的序列：

XYYXZZXXYY(7)

其中，X、Y和Z与在式(1)中定义的相同。

由式(7)表示的肽的序列的具体实例可以是KLLKPPKKLL。

此外，所述两亲性α-螺旋肽可以包含由下式(8)表示的十二氨基酸序列、其反向序列或重复含有该序列的序列：

XXYYXZZXXYYX(8)

其中，X、Y和Z与在式(1)中定义的相同。

由式(8)表示的肽的序列的具体实例可以是KKLLKPPKKLLK。

在一个实施方案中，所述两亲性α-螺旋肽可以由包含疏水性氨基酸和亲水性氨基酸的12-20个，优选12-18个，更优选12-16个，甚至更优选12-14个氨基酸组成。

在一些情况下，所述两亲性α-螺旋肽可以以等于所述肽的总氨基酸的35％或更多的量包含选自由带正电荷的精氨酸、赖氨酸和组氨酸组成的组的一个或多个残基。

此外，所述两亲性α-螺旋肽可以以等于所述肽的总氨基酸的35％或更多的量包含选自由亮氨酸、色氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和异亮氨酸组成的组的一个或多个疏水性氨基酸残基。

在一个实施方案中，所述两亲性α-螺旋肽可以包含由以下SEQ ID NO:1或2表示的序列、其反向序列或重复含有该序列的序列：

KLLKL(SEQ ID NO:1)

LKKLL(SEQ ID NO:2)。

在这点上，(LK)_n或(KL)_n的氨基酸序列可以额外地结合到SEQ ID NO:1或2的上游，或者(LK)_m或(KL)_m的氨基酸序列可以结合到SEQ ID NO:1或2的下游。在此，n或m可以是从0至2的整数。

在一个实施方案中，所述两亲性α-螺旋肽可以包含由以下SEQ ID NO:3或4表示的序列、其反向序列或重复含有该序列的序列：

LKKLLKL(SEQ ID NO:3)

KLLKLLK(SEQ ID NO:4)。

在这点上，(LK)_n或(KL)_n的氨基酸序列可以额外地结合到SEQ ID NO:3或4的上游，或者(LK)_m或(KL)_m的氨基酸序列可以结合到SEQ ID NO:3或4的下游。在此，n或m可以是从0至2的整数。

为了在该两亲性α-螺旋肽中形成扭折或断开的肽结构，可以取代选自由从N-末端至C-末端方向的第6、7、8、9、11和12位组成的组的一个或多个位置处的氨基酸。在这种情况下，所述取代的氨基酸可以是脯氨酸、天冬氨酸或其衍生物。

在本发明的一个实施方案中，所述两亲性α-螺旋肽可以是LKKLLKLLKKLLKL(SEQID NO:5)或KLLKLLKKLLKLLK(SEQ ID NO:6)，并且可以在SEQ ID NO:5的第7和8位(亮氨酸)或SEQ ID NO:6的第9位包含扭折结构的取代的氨基酸。在这种情况下，所述取代的氨基酸可以包含用脯氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺或其衍生物，优选脯氨酸、天冬氨酸或其衍生物取代的氨基酸序列。

在又另一方面，本发明涉及一种包含所述肽或肽类似物的用于共同施用的抗微生物组合物。具体地，本发明涉及一种抗革兰氏阴性菌的抗微生物组合物或用于共同施用的抗微生物组合物。具体地，本发明涉及一种用于预防或治疗由微生物引起的传染病的方法，其包括施用所述组合物。在一个另外的方面，本发明涉及一种包含所述组合物的抗生素。

在这点上，所述微生物意指致病性微生物或耐药性细菌，优选革兰氏阴性致病性微生物或耐药性细菌。如本文所使用的术语“预防”是指通过施用所述组合物抑制由所述致病性微生物或耐药性细菌引起的传染病或延迟由所述致病性微生物或耐药性细菌引起的传染病的发病的所有活动。如本文所使用的“治疗”是指由于施用所述组合物导致由所述致病性微生物或耐药性细菌引起的传染病的症状改善或者由所述致病性微生物或耐药性细菌引起的传染病有利改变的任何活动。

所述组合物可以进一步包含药学上可接受的载体。如本文所使用的术语“药学上可接受的载体”是指参与将感兴趣的组合物或组分从身体的一个器官或一部分携带或运送到身体的另一器官或另一部分的药学上可接受的物质、组合物或媒介物，诸如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封物质(encapsulating material)。除了上述活性成分之外，为了其施用的目的，本发明的组合物可以进一步包含药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。所述载体、赋形剂或稀释剂的实例可以包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯树胶、藻酸盐、凝胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油。

此外，根据本发明的组合物可依据常规方法配制。例如，其可以配制成粉末剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、悬浮剂、乳剂、糖浆、喷雾剂、用于口服和外部施用的剂、栓剂或无菌注射溶液的形式。具体地，使用通常使用的稀释剂或赋形剂诸如填充剂、膨胀剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂或表面活性剂配制根据本发明的药物组合物。用于口服施用的固体制剂包括片剂、丸剂、粉末剂、颗粒剂、胶囊剂等，但不限于此。通过将本发明的组合物与至少一种赋形剂诸如淀粉、碳酸钙、蔗糖、乳糖、凝胶等混合来制备这类固体制剂。除了简单的赋形剂以外，也可以添加润滑剂诸如硬脂酸镁、滑石等。用于口服施用的液体制剂包括悬浮剂、内溶液(internal solution)、乳剂、糖浆等，但不限于此，并且可以通过添加简单的稀释剂例如水和液体石蜡，以及多种赋形剂例如润湿剂、甜味剂、芳香剂、防腐剂等来制备。用于胃肠外施用的制剂包括灭菌的水性溶液、非水性溶剂、悬浮剂、乳剂、冻干剂和栓剂。非水性溶剂和悬浮剂可以使用丙二醇、聚乙二醇、植物油诸如橄榄油、或可注射酯诸如油酸乙酯来制备。作为栓剂的基质，可以使用Witepsol、Macrogol、吐温61、可可脂、月桂脂(laulin fat)、甘油明胶等。

根据本发明的组合物可以根据所需目的口服、或胃肠外(例如，静脉内、皮下、腹膜内或局部)施用。本发明的组合物的优选剂量的改变取决于多种因素，包括患者的状况和体重、疾病严重性、药物类型、施用途径和施用期，但是可由本领域技术人员适当地确定。如果必要的话，所述组合物可以以每天单一剂量或多剂量施用。本发明的组合物可以单独使用或与为了预防或治疗由致病性细菌或耐药性细菌引起的传染病的手术、激素治疗、药物治疗以及使用生物应答调节剂的方法结合使用。

如本文所使用的术语“共同施用”可以与同时发生的施用(concurrentadministration)互换使用。共同施用的方式可以包括与其它化合物同时(concurrently)施用所述肽或肽类似物，或者与其它化合物分开施用所述肽或肽类似物。在这点上，根据本发明的肽或肽类似物可以与选自由以下组成的组的一个或多个共同施用：logP(分配系数)值为0.19或更高的疏水性化合物、在生理pH条件下带正电荷的化合物、以及粘菌素。

logP(分配系数)值为0.19或更高的疏水性化合物可以是例如氯唑西林、利奈唑胺、白藜芦醇、姜黄素(curcumin)、槲皮素(quercetin)、辛伐他汀(simvastatin)、洛伐他汀(lovastatin)、美伐他汀(mevastatin)、儿茶素(catechin)或麝香草酚(thymol)，但不限于此。

在生理pH条件下(例如在pH 7.3-7.4下)带正电荷的化合物可以是例如红霉素(erythromycin)、利福平(rifampicin)、粘菌素、多粘菌素B或烟碱，但不限于此。

在生理pH条件下(例如在pH 7.3-7.4下)带负电荷的化合物可以是例如布洛芬(ibuprofen)、阿托伐他汀(atorvastatin)、氟伐他汀(fluvastatin)、普伐他汀(pravastatin)、卡洛芬(carprofen)、反式阿魏酸(trans-ferulic acid)或溴芬酸(bromfenac)，但不限于此。

在一个实施方案中，当与根据本发明的肽或肽类似物共同施用时表现出协同效应的化合物可以是例如利奈唑胺、红霉素、布洛芬、辛伐他汀、姜黄素、白藜芦醇。与单一添加待共同施用的多种肽或肽衍生物或化合物时产生的作用相比，该化合物甚至在显著更低的浓度都表现出抗微生物作用。

在又另一方面，本发明涉及一种缀合物，其包含：所述肽或肽类似物；以及连接至所述肽或肽类似物的药物。本发明还涉及一种包含所述缀合物的抗生素。

所述药物可以是logP(分配系数)值为0.19或更高的疏水性化合物、在生理pH条件下带正电荷的化合物，或粘菌素。每种组分的定义与上述的相同。

所述肽或肽类似物和所述药物可以通过例如非共价键或共价键彼此连接。非共价键可以是选自由以下组成的组的一个或多个：例如，氢键、静电相互作用、疏水性相互作用、范德华相互作用、π-π相互作用和阳离子-π相互作用。共价键可以是可降解键或不可降解键。可降解键可以是二硫键、酸可降解键、酯键、酸酐键、生物可降解键或酶可降解键，但不限于此。非可降解键可以是酰胺键或磷酸键，但不限于此。

实施例

以下，将参考实施例进一步详细描述本发明。对本领域普通技术人员显而易见的是，这些实施例仅用作示例说明的目的，并且不被解释为限制本发明的范围。

实施例1：两亲性LK肽的变体的合成以及革兰氏阴性菌膜特异性肽的选择

自然界中存在许多抗微生物肽(AMP)。这些肽主要是在高等动物中被产生用于初级免疫应答的肽，并且其种类和形状是多种多样的。近年来，由于已经发现了这些抗微生物肽的新的体内功能，对这些抗微生物肽的兴趣持续增加。然而，尚未报道这些抗微生物肽作为抗微生物剂的实际用途。为何这些AMP尚未用作药物的原因是由于这些肽能够杀死致病性细菌的能力过分地低于其它低分子抗微生物物质的能力，这些肽的生产成本高于低分子抗微生物物质，并且这些抗微生物肽具有可损伤宿主真核细胞的副作用。

本发明的发明人为了确实使用AMP作为抗微生物剂，已经努力改善上述三个原因。许多天然存在的AMP历经许多年已经进化，并且已经经历了许多突变过程，使得它们的氨基酸序列会使AMP的特性最大化。鉴于这一事实，看起来增强这些天然存在的肽的能力或给予这些肽以选择性并不容易。为此，本发明的发明人尝试从模拟天然存在的AMP的模型肽LK肽引入多种突变，观察突变体的能力的改变、和得到改善的肽，而不是改善天然存在的AMP的能力，来解决上述三个困难。

在一个努力中，本发明的发明人在选择了由14或16个氨基酸组成的两亲性α-螺旋肽后，进行了多个突变过程。这是因为已经在许多天然存在的AMP中观察到两亲性特征和α-螺旋。为何选择该肽的另一个原因是由于该LK肽是由14至16个氨基酸组成的，制造该肽的经济负担比天然存在的肽的负担低。这是用于解决第二个原因的方法。本发明的发明人首先努力解决第三个原因。这是因为，即使该肽抗致病性细菌的能力增加(第一个原因)，当该肽非选择性地对宿主真核细胞产生毒性时，增加活性的努力将会白费。事实上，鉴于频繁使用的药物的特征，由于它们的高度选择性或治疗窗口(治疗指数)同时没有副作用而可以在高浓度使用的药物才可以是好的新药，虽然药物具有高度功效也很重要。具体地，该考虑应该在用于抗微生物肽时被强调。这是因为抗微生物肽的作用机制主要是破坏致病性细菌的膜，并且该能力也可破坏宿主真核细胞的壁。

由于本发明中使用的模型肽，与具有抗微生物能力一起，也具有杀死宿主真核细胞的能力，因此尝试第一突变以降低杀死宿主真核细胞的能力。由于该LK肽由在疏水侧的L和在亲水侧的K组成，引入其定点诱变是非常容易的。用A定点取代后，检测抗红细胞的溶血活性。当第8位的L被A取代时，溶血活性被最大程度地降低。为此，为了找到使溶血活性最小化的氨基酸，用其它氨基酸取代该L。发现，当将N(天冬酰胺)引入第8位时(下文被称为N突变)，与未突变的肽的溶血活性相比，溶血活性降低8,000倍。此外，N突变可以甚至在8倍稀释的浓度根除大肠杆菌，表明通过单突变获得了64,000倍的选择性增加。

虽然尚未清楚地发现N突变的作用机制，但是认为，由于通过N突变临时改变的螺旋肽的弯曲形状，肽可在消除其破坏真核细胞的能力的同时更加易于破坏革兰氏阴性菌的膜。除了AMP破坏膜的能力之外，还存在为何N突变肽具有更好的抗革兰氏阴性菌的抗微生物活性的另一个原因。即，N突变肽可通过激活膜的机制进入细菌，使得其可结合至细菌中的物质(substance)并且抑制致病性细菌的代谢，由此杀死细菌。事实上，N突变肽或类似物可强烈地结合至诸如DNA或RNA的分子，并且该结合可通过致病性细菌的DNA-或RNA-相关的代谢停滞(metabolic arrest)而导致致病性细菌死亡。

上述实验得到的选择性增加，是在以下条件下获得的：所述突变的肽对于真核细胞的细胞壁的溶血活性和穿透力被最小化。即，在选择性增加64,000倍的情况下，溶血活性是8,000倍，并且抗革兰氏阴性菌的抗微生物活性增加8倍。为了观察由该突变引起的抗微生物活性的增加，优选进行其溶血活性已经被很大程度地降低的突变，并且之前的研究结果表明，这类突变包括五个突变，D、E、N、P和Q。为了快速检测穿透致病性革兰氏阴性菌的细胞的能力，通过改变每个第8位的氨基酸来获得五个突变体(L8N、L8Q、L8D、L8E和L8P)。由于已经进行的实验表明，第8位是对于真核细胞的溶血性最敏感的，可预期在第8位的改变可以引起另一改变。为了证实这个预期，将该五个突变的肽用荧光标记物TAMRA做标记，并且进行FACS以确定这些肽是否会确实进入革兰氏阴性菌。结果在图1中示出。

如所预期的，本发明的发明人观察到显著高浓度的这些突变的肽可进入革兰氏阴性菌。如图1中所示，所述突变的肽进入革兰氏阴性菌的程度是P>>N＝D>Q＝E。对于进入最多的P，可见，当该肽以约2.5μM的浓度使用时，约60％的肽进入革兰氏阴性菌。在使用MDAMB231细胞进行的FACS中表明，该突变的肽甚至在至少100μM的浓度都不引起溶血，并且在5μM的浓度不会穿透真核细胞(图2)。此外，可见，该P突变肽不进入革兰氏阳性菌(数据未显示)。综上所述，P-突变肽可选择性地穿透革兰氏阴性菌的细胞膜或者激活膜，从而P-突变肽的使用使得选择性地将药物递送至革兰氏阴性菌成为可能。

实施例2：使用脯氨酸的突变肽的合成和对革兰氏阴性菌膜具有特异性的突变体 的选择

(1)使用固相肽合成方法制备脯氨酸(Pro)突变体LK和KL肽文库

将50mg的接头(linker)酰胺树脂(0.52g/mmol)添加到塑料柱用于合成，并且用DMF膨胀持续10分钟，并且然后向其中添加3mL的20％哌啶，并使用微波进行脱保护反应。脱保护之后，将所得的物质用DMF洗涤三次，用DCM洗涤五次，以及用DMF洗涤三次，并且用电子秤称重6当量的氨基酸和PyBOP，并且然后将其溶解于DMF中。将每种相当于6当量的氨基酸、PyBOP和DIPEA添加到合成柱中，使用微波形成酰胺键。偶联后，将所得的物质用DMF洗涤三次，用DCM洗涤三次以及用DMF洗涤三次。将一滴1％的TNBS测试溶液和一滴10％DIPEA溶液滴加到树脂上以确认反应是否完成。对应的氨基酸序列完全偶联后，使用6当量的HOBt和6当量的乙酸酐将肽的N-末端乙酰化。通过向柱中添加95％v/v TFA、2.5％v/v蒸馏水和2.5％v/v TIS溶液使在树脂上合成的肽从树脂上脱离(detach)，并且在800至1000rpm旋转2小时。将断肽溶液(broken peptide solution)转移到15mL的Falcon管中，并且然后用氮气蒸发TFA。将保存在-20℃的结晶溶液(50％v/v正己烷和50％v/v乙醚)倾倒入15mLFalcon管中至10mL的总体积，并且涡旋1分钟以形成晶体。涡旋后，将所得的物质用另一15mL Falcon管匀称平衡后在离心机中以4500rpm在4℃离心20分钟。从晶体中去除结晶溶液后，将剩余物再次涡旋和在上述相同的条件下离心。去除上清液，用氮气蒸发剩余的结晶溶液，此后将晶体溶解于DMSO中，过滤通过0.45μm过滤器，并且然后通过高效液相色谱进行分离。使用C-18柱作为高效液相色谱柱，并且使用乙腈(0.1％v/v TFA)和蒸馏水(0.1％v/vTFA)作为溶剂。通过使用MALDI TOFF测量m/z值确认通过高效液相色谱分离的肽。将通过高效液相色谱分离的肽冷冻于-80℃冰箱中持续2小时，并且然后冷冻干燥。冷冻干燥后，为了去除剩余的TFA，将肽溶解于蒸馏水中，将其转移到e-管，在-80℃冰箱中冷冻持续2小时，然后进一步冷冻干燥，由此获得肽粉末。

(2)对革兰氏阴性菌膜具有特异性的突变体的选择

如实施例1中所述，当使用脯氨酸(Pro)突变体制备弯曲的α-螺旋肽时，其显示出成为对革兰氏阴性菌膜具有特异性的肽的潜力。在本发明中，通过用脯氨酸(Pro)取代每个都由14个氨基酸组成的LK肽(氨基酸序列：LKKLLKLLKKLLKL；SEQ ID NO:5)和KL肽(氨基酸序列：KLLKLLKKLLKLLK；SEQ ID NO:6)的除了N-末端和C-末端之外的所有赖氨酸(Lys)和亮氨酸(Leu)残基来构建具有扭折结构的肽的文库，并且在这些突变体中，研究出了对革兰氏阴性菌的膜具有最高特异性的突变体。这些肽的N-末端是乙酰化的，并且C-末端是酰胺化的。扭折结构可快速减少α-螺旋含量，从而较大地降低该肽抗宿主细胞的毒性。此外，由于显示出对革兰氏阴性菌的膜具有特异性的潜力，通过定点诱变制备脯氨酸(Pro)突变体。使用制备的肽，检测它们对于革兰氏阴性菌大肠杆菌和革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌(S.aureus)的MIC以及它们对宿主细胞的溶血活性(表1)。

表1：LK肽脯氨酸突变体的氨基酸序列、对于大肠杆菌(ATCC 25922)和金黄色葡萄 球菌(ATCC 29213)的MIC值、以及对于溶血的MHC值

表2：KL肽脯氨酸(Pro)突变体的氨基酸序列、对于大肠杆菌(ATCC 25922)和金黄 色葡萄球菌(ATCC 29213)的MIC值、以及对于溶血的MHC值

通过溶血测定评价对于哺乳动物细胞的细胞毒性。用PBS洗涤人红细胞三次，并且将其悬浮于PBS缓冲液中至5v/v％，以得到5％的血细胞比容。用2倍PBS稀释肽，并且然后向其中添加5％血细胞比容。将样品在37℃恒温箱中孵育3小时，并且在1400rpm离心5分钟。将上清液转移到平底96孔板，测量405nm(背景700nm)的UV吸光度。使用蒸馏水作为阳性对照，使用PBS作为阴性对照。

如图3中所示，通过定点诱变制备的含有脯氨酸(Pro)的肽可以分成三类。第一类包括其中的所有赖氨酸(Lys)残基都用脯氨酸(Pro)取代的肽。这些肽显示出增加的杀死革兰氏阴性菌的能力、增加的杀死革兰氏阳性菌的能力以及增加的溶血活性，并且因此未表现出对革兰氏阴性菌的特异性。对应于第二类的肽是其中的亮氨酸(Leu)被脯氨酸(Pro)取代的一些肽，并且这些肽显示出增加的对于大肠杆菌的MIC值，还显示出相对高的溶血活性。属于这类的肽不仅具有抗革兰氏阴性菌的活性，还具有抗宿主细胞的活性，因此不能被评价为具有高的对革兰氏阴性菌的特异性。对应于第三类的肽也是其中的亮氨酸(Leu)被脯氨酸(Pro)取代的一些肽。这些肽显示出很低的或未显示出溶血活性和抗革兰氏阳性菌的活性，同时其对于大肠杆菌的MIC值，与其中的亮氨酸(Leu)未被取代的肽相比，未实质改变或轻微降低。虽然对于革兰氏阴性菌的MIC存在差异，但是这类肽显示出较大降低的溶血活性，以及抗革兰氏阳性菌的显著的MIC值，因此被用于以下实验中，假设这些肽会特异性地抗革兰氏阴性菌起作用。总之，两种方法可用于制造扭折的两亲性α-螺旋结构。这两种方法是通过将脯氨酸引入亲水侧而形成扭折结构的方法，以及通过将脯氨酸引入疏水侧而形成扭折结构的方法。示出溶血活性的以上的表1和表2和图3表明，只有通过将脯氨酸引入疏水侧而形成的扭折结构可改变革兰氏阴性菌而不会引起溶血。

实施例3：选择的对革兰氏阴性菌膜具有特异性的肽和抗生素氨甲蝶呤 (Methotrexate)之间的缀合，以及MIC值的降低

首先，检测三个选择的肽是否会具有抗革兰氏阴性菌膜的活性。为此目的，将三个肽的N-末端用荧光标记物TAMRA标记，并且检测所述肽是否会具有抗大肠杆菌膜的活性。幸运的是，观察到这三个肽全部在约2.5至5μM的浓度进入大肠杆菌(图4)，表明所有三个肽都可特异性激活革兰氏阴性菌膜。

在使用人红细胞进行的实验中，图4中的三个肽在1mM的浓度不具有溶血活性，因此可预期当这些肽被用于抗微生物目的时，它们不会产生副作用。然而，这些肽具有共有特征：其抗大肠杆菌的抗微生物活性不那么强(MIC＝10至20μM)。为了降低该MIC值，将MTX(氨甲蝶呤)(一种抑制叶酸生物合成的化合物)缀合至这些肽中每个的N-末端，并且测量三个缀合物化合物的MIC值。如下表3中所示，三个MTX-肽缀合物的MIC值比单独的那些肽的MIC值低约2倍至4倍。该现象表明，所述肽选择性地抗大肠杆菌膜起作用，并且其一部分进入细菌并有效地杀死细菌细胞。因此，将对革兰氏阴性菌膜具有特异性的肽与难以进入细菌的抗生素缀合的该方法可以被推荐为用于开发新抗生素的好方法。当难以穿透细菌的许多种抗生素被共价连接至引起较少副作用并且可激活大肠杆菌膜以进入细菌的肽时，它们可被用作新的抗革兰氏阴性菌的抗生素。

表3

实施例4：通过膜激活肽发现新的抗生素

使用具有最小化的溶血活性并可激活革兰氏阴性菌膜的所述三个肽，进行以下实验以研究所述肽是否会与粘菌素协同。由于粘菌素具有接触革兰氏阴性菌的外膜的作用，因此推测只要其增强接触大肠杆菌的外膜的粘菌素的抗微生物活性，所述肽中的任一个就都会具有大肠杆菌膜特异性活性。对具有容易地进入革兰氏阴性菌的特性的已经选择的三个肽(LK-L8P、KL-L6P、KL-L9P)，以及具有好的MIC值的包括LK-L11P在内的四个肽进行了关于它们是否会与粘菌素协同的研究。在该实验方法中，粘菌素被与每个肽简单混合，并且将代表革兰氏阴性菌的大肠杆菌用该混合物处理，以检测混合物的杀死大肠杆菌的能力与所述肽或粘菌素相比是否会增强。具体地，当粘菌素杀死革兰氏阴性菌的能力被较大程度增强时，可以确定所述肽具有良好的与粘菌素的协同作用(FICI<1.0)。“具有良好协同作用”意指两个化合物(粘菌素和本文中所述的肽)互相帮助使得它们可甚至在与所述两个化合物简单结合的作用相比(FICI＝1.0)显著更低的浓度杀死细菌。

如下表4中所示，对于KL-L9P肽，与粘菌素的协同作用是最高的，其中FICI(分级抑制浓度指数)值为0.57，并且KL-L9P肽与粘菌素的协同作用比其它肽显著更好。所述肽的特征是其具有良好的与粘菌素的协同，虽然所述肽单独的MIC值比其它三个肽的MIC值高5倍。可以推测，KL-L9P具有轻微不同的能力，而具有良好的MIC的三个肽具有降解膜的一般抗微生物肽的特性。所述肽被定义为大肠杆菌特异性膜激活肽，并且进行了以下研究。

表4：具有最小化的溶血活性的P-突变肽与粘菌素的协同作用

实施例5：选择的KL-L9P肽的膜激活机制

接下来，研究选择的KL-L9P肽如何激活膜的机制。通过NPN处理的大肠杆菌的荧光强度(λex＝355nm,λem＝405nm)测量穿透进入微生物的外膜内。将大肠杆菌悬液(8x 10⁷个细胞/mL)在13000rpm在25℃离心10分钟，并且悬浮于5mM的HEPES缓冲液(pH 7.2)中。将NPN添加到大肠杆菌悬液中至5μM的最终NPN浓度。使用FL-55荧光计测量大肠杆菌悬液的荧光强度。将所述肽与5μM的NPN一起添加到大肠杆菌悬液中。荧光强度(F.I.)＝肽添加到大肠杆菌悬液中的F.I.减去含有5μM NPN的大肠杆菌悬液的F.I.。

首先，在大肠杆菌存在的情况下观察到使用NPN(萘基苯基胺)的荧光，并且作为结果，显示KL-L9P和粘菌素具有接触外膜并且进入外膜的特性(图5)。这是使用KL-L9P和竞争性药物粘菌素来测量的，并且作为结果，可见当以单位摩尔比较时KL-L9P具有比粘菌素更好的使外膜松散的作用。已知穿孔于膜的蜂毒肽(Melittin)也具有高的增加NPN荧光的能力。然而，推测KL-L9P肽由于其短的长度而不能穿孔于膜。

在第二个实验中，检测肽是否会具有破坏细菌的外壁和内壁二者的能力。为了这个目的，使用能够特异性染色DNA的荧光染料Sytox绿，并且通过用SYTOX绿处理的大肠杆菌的平均荧光强度评价进入微生物膜的穿透性。在SYTOX绿(2.5μM)的存在下将大肠杆菌悬液(2x 10⁸个细胞/mL)分别与所述三个肽孵育10分钟。通过荧光激活细胞分选仪(FACS)对穿透性定量。检测到1x 10⁴个设门细胞(gate cell)的平均荧光强度。蜂毒肽(对照)是破坏微生物的细胞膜的孔形成肽。

确定了KL-L9P不染色DNA，而粘菌素容易染色DNA。这表明，KL-L9P肽不具有降解或穿透内壁的能力，而粘菌素和孔形成蜂毒肽具有该能力(图6)。

将LPS提取物(Sigma)和所述肽悬浮于PBS缓冲液中。在25℃，在三组中测量单独含有0.5mg/mL的LPS或含有0.5mg/mL LPS和500μM肽的每个样品。选择具有最大体积百分数的体积尺寸值，并且计算体积尺寸直径(nm)。

在KL-L9P和粘菌素的存在下检测由LPS组成的脂质体的稳定性，并且作为结果，可见粘菌素具有精细地分开脂质体的特性，而虽然KL-L9P具有该特性，但是KL-L9P的该特性的程度不严重(图7)。

当达到OD₆₀₀＝0.5时将大肠杆菌NDm-1稀释。将微生物用2.5μM的所述肽处理，在37℃恒温箱中持续30分钟。将LK-L12P用作阳性对照。该肽强烈地诱导从内膜和外膜的漏出。KL-L9P的共聚焦成像显示，TAMRA标记的KL-L9P散布在薄的细胞周质膜(peri-cytoplasmicmembrane)周围，这与LK-L12P不同。

事实上，当使用共聚焦显微镜观察荧光标记的KL-L9P肽的存在时，可见环状荧光L9P分子散布在基本上所有的大肠杆菌细胞中。该现象清楚地不同于以下现象：其中具有轻微较好的MIC值以及降解膜的能力的LK-L12P染色所有微生物细胞，或者其中较大部分的微生物细胞被荧光标记的肽标记(图8)。

从以上描述的四个实验的结果可见，KL-L9P肽与其它肽相比，具有卓越的穿透革兰氏阴性菌的外膜的能力，而其不具有破坏膜的能力，并且保持在穿透状态。因此，KL-L9P肽可使膜松散，使得不能进入的小疏水性分子可进入膜。

实施例6：KL-L9P与重新定位药物(Repositioned Drug)的协同作用

进行实验以证实其它化合物抗革兰氏阴性菌的抗微生物活性在KL-L9P肽的存在下是否会被改善。为了这个目的，选择了两个抗生素，利奈唑胺和氯唑西林。这两个化合物具有共有性质：它们是仅能用于抗革兰氏阳性菌的抗生素，并且具体是缺乏穿过革兰氏阴性菌的外膜的能力，因此具有很小或者不具有抗革兰氏阴性菌的功效。如果KL-L9P与这两个化合物(利奈唑胺和氯唑西林)在抗大肠杆菌的抗微生物活性方面具有协同作用，预期本发明的发明人需要的革兰氏阴性菌特异性膜激活肽有助于这两个化合物(利奈唑胺和氯唑西林)的细胞内穿透。

KL-L9P与利奈唑胺或氯唑西林具有协同作用，并且较大增强了利奈唑胺或氯唑西林的杀死革兰氏阴性菌的能力。此外，观察了竞争性药物粘菌素是否会与这两个药物具有协同作用，并且作为结果，可见粘菌素与这两个药物具有很小或不具有协同作用(图9)。膜激活肽KL-L9P与利奈唑胺或氯唑西林的协同作用。用膜激活肽KL-L9P与利奈唑胺或氯唑西林处理的(1)和(2)显示出小于0.5的FICI值，表明所述肽与所述药物具有协同作用。用粘菌素与利奈唑胺或氯唑西林处理的(3)和(4)显示出约1的FICI值，表明所述肽与所述药物不具有协同作用。

假如这样的话，为了研究其它类似的肽是否与已知具有抗微生物活性的化合物不具有协同作用，进行检测以确定具有最高的抗大肠杆菌的抗微生物活性的LK-L7P和LK-L11E是否会与已知具有微弱的抗微生物活性的白藜芦醇具有协同作用。如图10中所示，保留在膜中的KL-L9P具有良好的协同作用，而其它两个肽不具有协同作用，尽管它们具有强抗微生物活性。对于膜激活肽KL-L9P与白藜芦醇的协同作用，膜激活肽KL-L9P与白藜芦醇具有强协同作用(FICI＝0.2)，而抗大肠杆菌的MIC值比膜激活肽KL-L9P低(好)至少5倍的LK-L7P或LK-L11E，不具有协同作用(FICI＝1或更大)。

作为结果，上述两个实验证实了KL-L9P特异性地激活大肠杆菌的膜，并且显示出较大的协同作用。

接下来，进行实验以研究KL-L9P是否会与除了抗生素之外的非抗生素具有协同作用。为了检测协同作用，在最频繁使用的NSAID药物中，选择了以下药物：阿司匹林、布洛芬、对乙酰氨基酚等；保持销售第一位的高血脂治疗剂阿托伐他汀、洛伐他汀和辛伐他汀。此外，选择了已知具有药用效果但是在水溶性和功效方面产生问题的多种天然物质诸如姜黄素、黄连素(berberine)等。由于已经报道了化合物正准备检测与KL-L9P的协同作用可具有某种程度的抗革兰氏阴性菌的药用效果，因此在一定程度上已知这些化合物的抗微生物活性。然而，由于尚未报道这些化合物与革兰氏阴性菌膜激活肽的共同施用可在低浓度杀死革兰氏阴性菌，因此进行实验以检测这些药物是否会具有高协同作用，以确定这些药物是否会用作抗生素。

通过抗生素相互作用测定(Wimley,2015)评价协同作用。使用Wimley的方法(BBA,2015,第1848(1)卷,第8-15页)，通过FICI值测量膜激活肽和抗生素之间的协同作用(图17)。MIC测定显示取决于实验条件，约2-4倍的差异。因此，为了精确地检测协同作用，在统计学方面，在更密集的浓度间隔观察MIC的2/3稀释方法优于1/2稀释方法。即，开始于对应于3x MIC的膜激活肽的浓度(第一行)，进行2/3稀释，并且测量所述肽的MIC。以相同的方式，测量抗生素或重新定位药物的MIC(第二行)。在第三行，所述两个化合物每个放入一半量后混合，并且测量其MIC。如图7中可见，当两个化合物的混合物与单独每个化合物相比，可容易地在较低浓度杀死革兰氏阴性菌，可认为其具有高协同作用。

肉汤微量稀释技术(2/3稀释)与MH肉汤一起使用。将用抗生素和所述肽处理的大肠杆菌在37℃恒温箱中孵育18小时。

实验结果表明，对应于69％的许多药物与KL-L9P具有良好的协同作用(FICI<10)，并且可在比它们单独使用杀死大肠杆菌的浓度更低的浓度杀死大肠杆菌(表5)。例如，氯唑西林具有0.3μM的MIC值(128倍稀释的)，并且利奈唑胺具有10μM的MIC值(约16倍稀释的)。在NSAID中，布洛芬具有3μM的MIC值(约3000倍稀释的)，并且姜黄素具有4μM的MIC值(约330倍稀释的)。这些化合物全部能够展示出与1μM的革兰氏阴性菌膜激活肽KL-L9P的协同作用。

表5：抗生素和非抗生素药物和天然药物与KL-L9P的协同作用

实施例7：KL-L9P/粘菌素与重新定位药物的协同作用

虽然粘菌素当与常规抗生素或新鉴定的作为抗生素的重新定位药物共同施用时未表现出大的协同作用(与KL-L9P相比)，但是本发明中发明的膜激活肽和MOA(作用模式)能够以不同方式激活膜。由于粘菌素仍然用作使膜松散的金标准试剂，因此其可以用作外膜特异性激活肽。此外，由于本发明的发明人已经发现，在粘菌素和KL-L9P之间存在高度协同作用，因此进行实验以检测表现出与KL-L9P的协同作用的利奈唑胺和姜黄素在同时存在所述两个膜激活肽时如何表现协同作用。为了这个目的，在本发明中，检测在存在膜激活肽KL-L9P和粘菌素二者的情况下，重新定位药物的协同作用。将这三个化合物互相混合，然后共同施用用于根除革兰氏阴性菌。在这点上，所述两个化合物是膜激活肽KL-L9P和粘菌素，并且余下的一个是常规药物或重新定位药物。

为了测量膜激活肽和重新定位药物之间的协同作用，制备10x化合物，并且然后用蒸馏水系列稀释2/3倍。将MH肉汤(900μL)添加到10x化合物(100μl)中，并且与其混合，然后取200μL的混合物，将其添加到96孔板。使用MCFarland将培养一天的大肠杆菌调整至0.5MCF，并且稀释10倍，然后将10μL的稀释液添加至板的每个孔中(5x10⁵CFU/mL)。添加细菌细胞之后，将板在37℃孵育持续18小时，然后在UV-Vis(600nm)测量OD值。细胞活力(％)＝(样品的OD₆₀₀–阴性对照的OD₆₀₀)/(阳性对照的OD₆₀₀–阴性对照的OD₆₀₀)x100。基于对应于细胞活力<20％的浓度确定MIC。

三个化合物的协同作用与对于两个化合物获得的三种协同作用中的最佳值相当。这是非常好的结果。这是因为，当两个化合物的混合物的协同作用(FICI)值是0.3时，混合物在与单独使用两个化合物时相比约7倍稀释浓度杀死大肠杆菌，而三个化合物的共同施用表现出0.3的FICI值时，其在与单独使用三个化合物相比10倍稀释浓度杀死细菌。在本发明中，发现KL-L9P/粘菌素/利奈唑胺的协同作用值(FICI)为0.28。当三个化合物单独使用时，它们分别表现出13μM、0.8μM和60μM的MIC，并且当它们组合使用时，它们可分别在1μM、50nM和6μM的浓度(其分别是低12倍、16倍和10倍)杀死大肠杆菌。这样的结果可得出临时结论：当三个化合物共同施用时的协同作用可比两个化合物之间的协同作用更高。如果是这样的话，抗生素的协同作用(数字为n)难以想象地大。因此，可预期当多种化合物在天然状态下互相混合时，通过这些化合物的高协同作用会出现扩大的抗微生物活性。仅当所述化合物中的一个或多个是膜激活肽时该预期也是可能的。

此外，在对于两个化合物对所获得的三种协同作用中，最高的协同作用是通过使用KL-L9P获得的。这表明，本发明发现的KL-L9P肽对协同作用具有最大影响，并且协同作用取决于KL-L9P肽。然而，本发明的发明人愿意注意粘菌素的协同作用。这是因为如果粘菌素可表现出与用于其它目的的常规药物的协同作用以杀死革兰氏阴性菌，那么除非它们具有毒性，否则用于共同施用的两个药物就可立即被用作药物，即使粘菌素表现出比KL-L9P更低的协同作用。即，由于两个药物是商业上使用的，真正意义上的药物重新定位是可能的。抗革兰氏阴性菌的协同作用通常表示为FICI(分级抑制浓度指数)。当FICI值为0.5或更小时，认为其是协同的，并且当FICI值达到约0.2时，认为MIC可以为与单独使用两个抗生素时获得的MIC相比至少10倍的减少。在本发明中，发现与粘菌素达到0.2至0.4的协同作用的多种化合物。这些化合物包括姜黄素、布洛芬的两种异构体、辛伐他汀等。

实施例8：检测膜激活肽的一般特性

A)膜激活肽的一般条件

KL-L9P具有比其它突变肽更高的协同作用，需要检测该化合物的一般特性。首先，该肽的α-螺旋含量在膜条件下比在100％水条件下更高。虽然该肽通过脯氨酸(Pro)衍生自精确圆柱形的精确螺旋形状，但是确定的是螺旋的亲水侧与疏水侧之间的分离形状使膜活性强。通过PyMol程序预测的KL-L9P的结构还显示出扭折的α螺旋。一般相信，脯氨酸(Pro)突变部分形成顶(vertex)，在此处α螺旋被扭折，但是通过PyMol预测的形状表明，扭折部分是亲水侧和疏水侧之间的分界线。据信，该部分的精确形状仅在对详细形状进行研究后才可确定，但是通过多种化学实验可见以下事实：该肽在膜中的保留时间可通过扭折形状而增加。在这种情况下，能够形成非常长的α螺旋的突变肽已经在第一次筛选中被排除。在第一次筛选的条件下，选择了具有最低的抗宿主细胞溶血活性的肽，并且在这种情况下，据信，能够形成非常长的α螺旋的突变肽已经被完全排除。

据信，当具有短α螺旋长度和高α螺旋含量的肽长时间保留在膜中时，在革兰氏阴性菌的外膜中会出现对于该肽的离子团簇。在这种情况下，膜本身可变得松散，同时膜中分子的流动性增加。当膜变得松散时，许多不能穿过非松散膜的低分子抗生素候选物现在可穿过膜，并且进入膜，因此在表现出与该肽的协同作用的同时展示出抗微生物作用。

由于添加至疏水侧的脯氨酸(Pro)氨基酸显示出疏水性，因此它不干扰该肽识别膜中的长烃链。看起来扭折的亲水侧和疏水侧之间的分离允许在两个末端(N-末端和C-末端)识别亲水侧的阳离子和膜表面的阴离子。这是因为，如果形成全圆柱形α-螺旋，就会使亲水侧对膜分子的识别变强，会使疏水侧的识别变弱，并且当使疏水侧对膜分子的识别变强时，可使亲水部分的识别变弱。长α-螺旋形状增加了通过抗宿主细胞的溶血活性降解真核细胞膜的潜力。

KL-L9P与其中脯氨酸被引入其它位置的异构体之间的差别在于该肽非常亲水，使得它可在相同HPLC条件下具有最短的保留时间。据信，这是因为KL-L9P中的正电荷被浓缩在一侧。在这种情况下，该肽可以具有更加明确的两亲性。膜激活肽一般具有最短的保留时间的事实也对应于LK-L7PL8P和LK-L8D，它们在其中引入两个脯氨酸残基的化合物之间具有最佳协同作用。

B)用两个脯氨酸(Pro)残基取代的肽的合成及其协同作用

假如这样的话，进行实验以检测是否在所有可能的LK或KL的突变体中只有KL-L9P会激活革兰氏阴性菌的外膜。首先，将LK肽和KL肽中的脯氨酸(Pro)突变由一个增加到两个。这是因为脯氨酸(Pro)突变能够显示出扭折结构，并且因此，当两个脯氨酸(Pro)残基(而非一个)被添加到肽中时，肽可以具有更加扭折的形状。制备其中在若干可能的位置中的两个位置用脯氨酸(Pro)突变的肽，并且下表6中示出了这些肽。

表6：LK 2个脯氨酸(Pro)突变体的氨基酸序列，抗大肠杆菌(ATCC 25922)和金黄 色葡萄球菌(ATCC 29213)的MIC值，以及用于溶血的MHC值。

在筛选引入两个脯氨酸(Pro)残基的肽时，还检测了肽是否会与粘菌素具有协同作用。这些引入两个脯氨酸(Pro)的肽的特征在于：这些肽(除了LK-L4PL5P和LK-L11PL12P之外)抗革兰氏阴性菌的MIC值比引入一个脯氨酸(Pro)的肽显著更高，因此需要以几十μM或更高使用以杀死革兰氏阴性菌。这意味着该肽穿透或降解膜的能力显著降低，并且在这种情况下，该肽抗宿主细胞的毒性可显著降低，表明该肽是一种良好的新型肽药物。显示出2.5μM的抗大肠杆菌的低MIC的LK-L11PL12P可以单独用作一种新药。在引入两个脯氨酸(Pro)残基的若干肽中，LK-L7PL8P突变肽显示出与粘菌素的最佳协同作用。该突变体与粘菌素的FICI达到0.3，表明该肽几乎比得上KL-L9P。然而，该肽的劣势在于：由于其在约8.4μM的浓度与粘菌素具有协同作用，因此其应该以4至5倍更大的量使用，而KL-K9P在2.6μM的浓度与粘菌素具有最大协同作用。LK-L7P/L8P还与利奈唑胺具有协同作用(FICI：约0.53)。该肽具有轻微低于KL-L9P的FICI值(0.40)的部分协同作用(表7)。当其与粘菌素和利奈唑胺混合时，LK-L7PL8P肽显示出0.27的FICI值，这与KL-L9P相似。因此，该肽的协同作用可能不那么小(表8)。通过肽形状预测程序预测的LK-L7P/L8P肽的形状具有如下形状：其中两个α螺旋被脯氨酸(Pro)部分断开。因此，该形状可以是给予协同作用的肽的一般特征。

表7：LK-L7PL8P与粘菌素和利奈唑胺的协同作用

表8：LK-L7PL8P与粘菌素和利奈唑胺的协同作用

C)使用D-氨基酸的D-型肽的制造

通过用D-氨基酸取代KL-L9P的所有氨基酸来制备KL-L9P-D肽，并且检测所制备的肽与粘菌素和利奈唑胺的协同作用。为何制备KL-L9P-D肽的原因是因为据信其化学稳定性及其抗天然蛋白酶的稳定性可比由天然存在的L-氨基酸组合的肽更好，并且该肽对膜的识别不会受到手性结构的影响，因此D-型肽可以具有与L-型肽相当的协同作用。然而，可见D-型的协同作用不显著高于L-型的协同作用。粘菌素表现出FICI＝0.38的部分协同作用，并且利奈唑胺表现出FICI＝0.66的部分协同作用。这得到以下结论：该肽的识别部分可识别与手性部分不非常相关的膜的一部分，并且它还识别与手性部分相关的膜的一部分(例如，磷酸盐阴离子等)。然而，鉴于D型具有总体协同作用的事实，它主要识别膜中存在的非手性部分，并且由于此原因，它可以用作可展示对杀死革兰氏阴性菌的协同作用的肽。

D)通过使用除了脯氨酸(Pro)之外的氨基酸进行突变而产生扭折的结构

当除了脯氨酸(Pro)之外的亲水性氨基酸被添加到两亲性肽的疏水侧时，可破坏α螺旋的总体两亲性，并且可部分获得弯曲的形状。由于α-螺旋含量降低以及这种两亲性的破坏，可降低所述肽对宿主细胞的副作用，并且因此添加这些氨基酸可以具有与添加脯氨酸(Pro)相同的效果。因此，代替具有协同作用的KL-L9P中的脯氨酸(Pro)，通过添加其它亲水性氨基酸(G、S、N、Q、D和E)来制备突变肽，并且检测这些突变肽的协同作用。

表9

表10

表11

通过一个简单的实验可见，只有L9D以及L9P具有协同作用。使用Wimley的方法，通过FICI值测量所述肽与粘菌素和辛伐他汀的协同作用。如下表12中所示，KL-L9D与粘菌素和辛伐他汀的FICI值分别是0.46和0.61，表明KL-L9D的作用显著低于显示出0.26和0.18的FICI值的KL-L9P肽的作用。

表12：KL-L9D与粘菌素和辛伐他汀的协同作用

类似于KL-L9P，KL-L9D也显示出协同作用，但是对于这两个化合物，含有脯氨酸(Pro)的肽的协同作用比含有天冬氨酸(Asp)的肽的协同作用更高。因此，可见当不仅通过P，还可以通过D破坏疏水性肽的总体两亲性时，观察到该协同作用。

还制备了LK-L8D，其具有类似于具有最高协同作用并且含有两个脯氨酸(Pro)残基的肽LK-L7P/L8P的形状的形状，并且检测其协同作用。该肽也具有协同作用，虽然它比KL-L9P的协同作用小，这表明，类似于用脯氨酸(Pro)取代的肽，其疏水部分被天冬氨酸(Asp)破坏的肽接近可使革兰氏阴性菌的外膜松散的膜激活肽。然而，在总体两亲性被其它亲水性残基(例如，G、S、N、Q和E)破坏的肽中，未发现协同作用。

E)使用KL-L9P的丙氨酸(Ala)扫描观察协同作用的变化

丙氨酸(Ala)扫描方法是一种找出肽中的14个氨基酸中的哪个是在展示化学或生物学效应中作为重要位置的残基的良好方式。因此，将该方法用于对许多肽的研究。当在本发明中使用相同方法时，可能的是确定氨基酸中的哪个可激活膜并且与小分子产生大的协同作用。因此，在本发明中，对于丙氨酸(Ala)扫描文库中的每个肽，进行实验以检测每个肽与粘菌素的协同作用。为了找出对肽的协同作用具有最大影响的氨基酸位置，选择其协同作用值相对于KL-L9P和粘菌素之间的协同作用最大程度地改变的肽。可认为，对应肽的丙氨酸(Ala)取代位置是对膜的激活具有最大影响的氨基酸残基位置。然而，除了LK-L9PK14A之外，丙氨酸(Ala)扫描的肽未表现出对应于2倍或更大的大变化。由于LK-L9PK14A的MIC值比LK-L9P更好，据信，该部分的赖氨酸对于膜的激活不重要。接下来，检测了每个肽在1/2MIC浓度与粘菌素的协同作用，并且可从协同作用相对于KL-L9P最大程度地变化的氨基酸残基位置到协同作用最小程度地变化的氨基酸残基位置，罗列氨基酸位置(表13)。

表13：赖氨酸-丙氨酸(Lys-Ala)扫描肽文库以及与粘菌素的抗大肠杆菌(ATCC 25922)的FICI值

由于取代的丙氨酸被放置在内部的KL-L9P/K11A、KL-L9P/K8A、KL-L9P/K7A等的协同作用最大程度地降低，因此据信该位点的胺官能团对于展示协同作用是非常重要的。然而，在每个末端用丙氨酸(Ala)取代的KL-L9P/K1A或KL-L9P/K14A的协同作用未显著降低。鉴于这两个赖氨酸残基对协同作用不具有大的影响的事实，可预期由12个氨基酸组成的肽(排除这两个赖氨酸残基)的协同作用也会类似于KL-L9P与粘菌素的协同作用。

接下来，为了检测疏水侧的氨基酸对膜激活的影响，通过用丙氨酸扫描KL-L9P的疏水侧的亮氨酸来制备肽文库。下表14总结了每个肽的氨基酸序列以及每个肽抗大肠杆菌的MIC。如所预期的，由于用丙氨酸取代，两亲性肽的MIC与KL-L9P的MIC相比有所降低，同时两亲性肽的疏水侧的相互作用被减弱。具体地，KL-L6AL9P和KLA-L9P的MIC分别为80μM和>200μM，这有较大增加。可见，对肽的MIC有最大影响的亮氨酸(Leu)位置是第6位，并且第6位在破坏两亲性肽的疏水侧的相互作用方面发挥重要作用。当将KLA-L9P中的7个亮氨酸(Leu)残基中的3个用丙氨酸(Ala)取代时，由于肽的疏水性的降低，两亲性肽结构未恰当形成，或者大肠杆菌的细胞膜与肽之间的疏水相互作用被减弱，导致MIC的快速增加。

接下来，排除了MIC显著降低的KL-L6AL9P和KLA-L9P，并且测量了这些肽与粘菌素的协同作用。

表14：通过用丙氨酸(Ala)扫描KL-L9P亮氨酸(Leu)位置获得的肽的氨基酸序列， 以及所述肽抗大肠杆菌(ATCC 25922)的MIC值

表15显示了当1/4MIC肽或1/2MIC肽与粘菌素混合时的FICI值。当将1/4MIC肽的FICI值与1/2MIC肽的FICI值比较时，可以确定对KL-L9P的协同作用重要的亮氨酸(Leu)位置。如果肽和粘菌素具有协同作用，那么当肽从1/4MIC变为1/2MIC时，粘菌素的MIC会降低。即，当与粘菌素具有协同作用的肽从1/4MIC变为1/2MIC时，肽的分数从0.25增加到0.5，但是粘菌素侧的分数降低，因此总FICI值应该增加低于0.25的值。当KL-L5AL9P、KL-L9PL10A和KL-L9PL13A从1/4MIC变为1/2MIC时，其FICI值增加了0.37、0.31和0.29，表明其与粘菌素的协同作用快速降低。

表15：通过用丙氨酸(Ala)扫描KL-L9P亮氨酸(Leu)位置获得的肽的氨基酸序列， 以及与粘菌素的协同作用

可见对KL-L9P的协同作用重要的亮氨酸(Leu)位置是紧接脯氨酸(Pro)的第10位，并且KL-L9P肽的扭折结构对于协同作用是重要的。此外，当第5位和第13位的亮氨酸(Leu)被丙氨酸(Ala)取代时，协同作用降低，表明从扭折结构向两个方向的至多4个氨基酸(包括P在内的9个氨基酸)是重要的。

当基于以下结果综合检测亲水性/疏水性的结果时：通过膜激活能力减少了多少与粘菌素的协同作用或者MIC有多差，可见哪个氨基酸位置是重要的。协同作用以亲水侧中的第11位、第8位和第7位的顺序降低以及在疏水侧中的第6位、第5位和第10位的顺序降低。把这些结果结合起来，有效氨基酸可以表示为KPLK(四个氨基酸)、KKPLK(五个氨基酸)、LKKPLK(六个氨基酸)和LLKKPLK(七个氨基酸)。

F)具有协同作用的膜激活肽的形状

在84个构造的肽中，只有4个肽激活膜并且表现出与抗生素化合物的协同作用。因此，当检测这四个肽的结构特征时，可理解膜激活肽的一般特性。为了理解该肽结构，引入CD和分子预测程序。关于CD，在膜条件下发现相对高的α-螺旋含量(KL-L9P(70％)、KL-L9D(50％)、LK-L8D(50％)和LK-L7PL8P(60％))。与此相反，在水条件下的α-螺旋含量非常低(小于10％)。因此，预期这些肽会甚至在细菌外膜条件下具有高α-螺旋含量。然而，如图15中所示，通过分子模型预测程序预测的α-螺旋形状不是全圆柱形(图15A)，而是如图B-1、B-2和B-3所示的扭折的或弯曲的α-螺旋形状。鉴于此事实，据信，具有扭折结构并且由于其高α-螺旋含量而保持两亲性的肽会具有最大化地识别膜中存在的亲水性和疏水性分子的能力。据信，该最大化的识别能力在使膜松散而不使膜降解方面发挥很大作用，使得在不存在该肽的情况下不能穿过膜的疏水性小分子可穿透并进入膜。即使所述肽具有这种扭折形状，限定扭折的程度是不容易的。这是因为，即使当使用肽形状预测程序时，多种形状可同时存在于单一肽中，同时表现出能量的较大差异。

G)具有扭折形状的肽的协同作用

为了检测肽是否必须含有脯氨酸(Pro)用于α-螺旋结构，本发明的发明人通过经由二硫键引入人工扭折结构来制备肽。即，如下表6中所示的，通过用半胱氨酸取代第i和i+4(或i+3)位(其是α螺旋的较高部分和较低部分)以连接α螺旋的较高部分和较低部分，或者通过将烃U形钉接头连接至第i和i+8位，在具有与KL肽的氨基酸序列相同的氨基酸序列的肽中诱导扭折形状。将两个肽制成后，检测其与粘菌素的协同作用(表17)。两个肽都与粘菌素具有部分协同作用，虽然部分协同作用比含有脯氨酸(Pro)的肽弱。此外，肽、粘菌素和利奈唑胺的混合物也表现出协同作用(表18)。虽然该协同作用小于KL-L9P的协同作用，但是令人鼓舞的是，具有通过二硫键接引起的扭折结构的肽表现出明确的协同作用。此外，粘菌素和利奈唑胺的浓度类似于或稍微高于在KL-L9P的存在下获得的MIC浓度，并且仍然显著，并且所述扭折肽的MIC显著优于KL-L9P的MIC，表明所述肽可在降低的浓度使用。α-螺旋结构抗宿主细胞的毒性可由于扭折结构而被降低的事实，也可以是所述肽的优势。即使两亲性肽不是通过引入脯氨酸(Pro)而被扭折的，当在肽中形成人工扭折结构时，当与多种化合物共同施用时，所述肽也可激活革兰氏阴性菌的膜并且杀死细菌。

表16：二硫化物扭折肽的氨基酸序列以及抗大肠杆菌(ATCC 25922)的MIC值

表17：具有扭折结构的肽与粘菌素的协同作用

表18：具有扭折结构的肽与粘菌素或利奈唑胺之间的协同作用

H)Buforin(通过脯氨酸(Pro)扭折的天然肽，其不是LK或KL肽)的膜激活特性

本发明的发明人考虑是否不仅具有100％两亲性的模型肽如LK或KL肽而且具有合适水平的两亲性的肽或者很多种天然存在的抗微生物肽和细胞穿透肽都会具有这种革兰氏阴性菌特异性膜激活肽的特性。这是因为本发明的发明人发现的现象可以是一种非常合理的方法，由植物产生的活性成分姜黄素、白藜芦醇等通过该方法可杀死穿透植物的革兰氏阴性菌。即，虽然姜黄素具有杀死革兰氏阴性菌的能力，但是在不存在该膜激活肽的情况下，甚至当其以非常高的浓度使用时它才可杀死细菌。然而，如果本发明的发明人发现的膜激活肽诸如KL或LK肽在自然中存在，姜黄素可通过使用这些肽进入细菌，并且由于其协同作用而甚至可在非常低的浓度杀死细菌。

Buforin(21个氨基酸，TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK:SEQ ID NO:50)，是天然存在的组蛋白2A的一部分，具有宽的抗生素效应谱。许多抗生素效应是由于降解膜的特性，该Buforin具有穿透细菌膜的特性。其穿透细菌膜并且进入细菌之后，通过结合至细菌中的DNA或RNA而杀死细菌。为了减弱穿透细菌膜特性的同时保持激活膜的能力，本发明的发明人通过将Buforin II的21个氨基酸减少到16个氨基酸而产生Buforin 5-20(Buforin II的第5至20个氨基酸；RAGLQFPVGRVHRLLRK:SEQ ID NO:51)。该Buforin是以前被检测的不具有溶血活性、不具有抗革兰氏阳性菌的活性并且具有微弱抗革兰氏阴性菌的活性的肽。此外，这三个特性可非常类似于本发明的发明人开发的模型肽KL-L9P的特性。

接下来，合成Buforin 5-20肽，检测其抗大肠杆菌的MIC值、和Buforin 5-20肽是否会激活革兰氏阴性菌膜以及是否与粘菌素或利奈唑胺具有协同作用。首先，Buforin 5-20的MIC值是20μM，这与以前报道的基本相同。通过Winley的方法所测量的Buforin 5-20与粘菌素和利奈唑胺的FICI值分别是0.5和0.7。这表明，Buforin 5-20具有比KL-L9P低的激活革兰氏阴性菌膜的能力，因此其与其它抗生素具有协同作用。虽然Buforin 5-20的氨基酸序列显著区别于KL-L9P的氨基酸序列，但是Buforin5-20具有与LK-L9P及其衍生物的膜激活特性精确地一致的以下特性：1)其具有两亲性α-螺旋形状；2)其具有通过脯氨酸(Pro)扭折(弯曲)的α-螺旋结构；3)其带正电荷的氨基酸含量为35％(6/16)；4)其疏水性氨基酸含量为35％(6/16)；5)其不具有抗宿主细胞的溶血活性并且不具有抗革兰氏阳性菌的活性；6)其保持微弱抗革兰氏阴性菌的活性(MIC＝10-20μM)。因此，上述六个特性可以被确定为革兰氏阴性菌膜激活肽的一般特性。

Buforin 5-20是高度亲水的，因为在相同大小的氨基酸(即16个氨基酸)中其在HPLC中的保留时间非常短。此外，如上所述，这些结果与KL-L9P获得的结果一致，KL-L9P与其异构体(在其它位置含有脯氨酸)的区别在于它是高度亲水的，使得它会在HPLC条件下具有最短保留时间。膜激活肽的一般特性之一是它们含有带正电荷的部分(或疏水性部分)并且总体是亲水性的。

实施例9：与膜激活肽具有协同作用的化合物的一般特性

使用常规抗生素和药理学化合物检测与膜激活肽具有协同作用的小分子化合物。检测的小分子化合物包括用于抗革兰氏阳性菌的常规抗生素(包括利奈唑胺)、频繁用于抗炎和发热治疗目的的NSAID系列小分子化合物；作为高血脂治疗剂的基于他汀(statin)的小分子化合物；以及公知具有药用效果但是尚未被批准用作药物的营养食品(nutraceutical)化合物。

虽然膜激活肽的种类多种多样(实施例8)，使得肽起抗膜作用的机制在某种程度上可能不同，但是可使用KL-L9P计算协同作用。这是因为该肽与小分子化合物的协同作用可在微摩尔浓度容易地确定。这类微摩尔浓度类似于在对多种与所述肽具有协同作用的革兰氏阴性菌候选抗生素的实验中使用的有效浓度，并且因此可最小化候选化合物的浓度差异所导致的误差。

膜激活肽KL-L9P与小分子化合物的协同作用通过使用Wimley的方法计算FICI来确定。该方法比常规检测板(checker-board)测定更准确。常规方法使用1/2-稀释，而新方法使用2/3-稀释，使得可检测是否会存在协同作用，同时可最小化由化合物或肽的稀释产生的误差。

如上文关于协同作用已经描述的，令人惊讶的是，大部分(约69％)的小分子化合物与KL-L9P具有协同作用(图18)。

具有协同作用的化合物具有多种带电情况(带中性电荷/正电荷/负电荷化合物)，并且因此，看来用带正电荷的肽识别不是协同作用的来源。这是因为两亲性肽诸如粘菌素表现出与KL-L9P肽的强协同作用，并且简单且带负电的化合物诸如布洛芬也在具有类似值的同时具有强协同作用。对于具有非常类似结构的辛伐他汀和洛伐他汀，辛伐他汀表现出非常强的协同作用，而洛伐他汀显示出比辛伐他汀的协同作用低得多的协同作用。非常有趣的是，布洛芬的两种对映异构体都具有协同作用(图19)。

然而，不是所有的化合物都具有协同作用。在抗生素中，D-环丝氨酸、万古霉素(vancomycin)、四环素(tetracyclin)、环丙沙星(ciprofloxacin)等不具有协同作用。在这些化合物中，万古霉素是不在革兰氏阴性菌中高度表达的酶的抑制剂，并且四环素和环丙沙星具有通过存在于细菌膜中的孔蛋白进入细菌的机制。在NSAID中，阿司匹林和对乙酰氨基酚不具有协同作用。这些物质具有非常低的分子量。在营养食品中，不寻常的是，黄连素不具有协同作用。该化合物是一种最初作为抗生素而被知晓的化合物，并且因此被认为是天然具有协同作用的，但是不具有使得FICI值达到1.5的协同作用。

然后，检测了与膜激活肽具有协同作用的小分子的一般特性。在抗生素中，不具有协同作用的化合物是通过孔蛋白进入细菌的化合物。此外，阿司匹林、对乙酰氨基酚等是分子量为200或更小的非常小的分子。即，这些是过分亲水的，并且因此预期不会直接穿透膜。鉴于这一事实，协同性化合物应该通过被膜激活肽变得疏松的疏水性膜进入细菌，并且如果这样的话，看来这些化合物应该在自然中具有高度疏水性。这种亲水性和疏水性通过分配系数logP值来表示。该值是溶解于疏水性辛醇中的化合物的浓度与溶解于水中的化合物的浓度的比率的对数值。随着logP增加，化合物的疏水性一般会增加。

检测了指示化合物的亲水性/疏水性的logP是否与协同作用具有相关性。通常，随着FICI值降低，协同作用增加。因此，标绘出了其倒数与logP之间的相关性。如下图13中所示，当KL-L9P用作膜激活肽时，化合物的疏水性与协同作用具有强相关性。即，随着化合物的疏水性增加，其协同作用增加。协同作用被定义为FICI值为1或更小，并且因此当化合物的logP值为0.19或更大时，化合物可具有协同性。然而，对该定义也有例外。虽然粘菌素和利奈唑胺是高度亲水性分子，但是它们具有良好的协同作用。此外，虽然阿司匹林、阿托伐他汀等在自然中是高度疏水的，但是它们不具有协同作用。具有良好协同作用同时在自然中是亲水性的化合物的特征是在生理pH条件下带正电荷的特性。尽管具有疏水性但是不具有协同作用的化合物极有可能是在生理pH条件下带负电荷的。考虑到革兰氏阴性菌的内膜或外膜表面是带负电荷的，就可以理解这类例外化合物具有协同作用的原因。即，带正电荷的化合物可结合至膜表面并且通过膜激活肽进入细菌，而带负电荷的化合物由于与细菌表面的阴离子的排斥力而具有失去机会的很大潜力(图11)。

还标绘出了分子量与协同作用之间的相关性(图12)。虽然在分子量与协同作用之间没有大的相关性，但是具有低于200分子量的大多数化合物不具有协同作用。结合上述亲水性/疏水性的结果，可见具有200或更高的分子量的相对疏水性的化合物可通过膜激活肽穿过革兰氏阴性菌的外膜，并且结合至细菌内部和外部的其靶标，从而展示出抗细菌活性。除了其机制已经被鉴定的抗生素之外，应该新发现了具有新的抗生素作用的可重新定位的药物(例如布洛芬、辛伐他汀等)的机制，但是该机制超出本发明的范围并且不涵盖在本发明中。

如图13中所示，可与膜激活肽具有协同作用的化合物的logP值和与该化合物的协同作用之间存在相关性，但是该相关性不那么强。为了进一步分析该相关性并且鉴定协同性化合物的一般特性，将协同性化合物分成三组：不带电荷的化合物组(带电0)、带负电荷的化合物组(带电-1)和带正电荷的化合物组。

首先，不带电荷的化合物的logP值与协同作用表现出非常良好的相关性。这表明，该相关性比所有化合物的协同作用之间的相关性更一致。

然而，对于带负电荷的或带正电荷的化合物，看起来，化合物的亲水性/疏水性比率(一般从logP计算得出)不能很好地拟合。因此，将通过化合物的极性表面积除以分子量获得的值作为新的变量引入。这是指示每分子量的极性分子表面积的指标(PSA/MW)。因此，随着该值的降低，每分子量的极性表面积降低，并且随着该值增加，每分子量的极性表面积相对地增加。对于带负电荷的化合物，该值与化合物的协同作用呈负相关。这表明，随着每分子量的极性表面积降低，协同作用增加。

对于带正电荷的化合物，使用每分子量的极性表面积(PSA/MW)作为x-轴和指示协同作用的1/FIC值作为y-轴检测相关性(图14)。如所预期的，当极性表面积相对大时，协同作用与其具有大的相关性。这表明，随着带正电荷的表面积增加，协同作用值可增加。

总之，协同作用与化合物的疏水性具有很大的相关性(总体logP与协同作用之间存在相关性)。然而，也有一些例外。即，对于带负电荷的化合物，协同作用随着带电荷的部分变得更小而增加，并且对于带正电荷的分子，协同作用随着带正电荷的部分变得更大而增加。这证明，由于革兰氏阴性菌部分是带负电荷的，带正电荷的分子比带负电荷的分子在通过膜激活肽进入细菌方面更有利。

因此，据信，根据不能穿过革兰氏阴性菌外膜的化合物(具体是疏水性部分)通过膜激活肽进入细菌的机制，产生了新的抗细菌的抗微生物活性。虽然具有相对低分子量的物质是相对疏水性的，但是它们可在除了膜之外的部分(诸如孔蛋白)的帮助下进入细菌。这些分子与膜激活肽具有相对微弱的协同作用的事实，是解释上述机制的另一个证据。带正电荷的物质比带负电荷的物质具有更好的协同作用。似乎并不是与细菌表面上的负电荷不相关，但是也不清楚这是否由于外膜或内膜中的负电荷。

因为数据量小，未显示带正电荷的分子的相关性。与膜激活肽具有协同作用的化合物的相关性可定义为疏水性(logP>0.19)化合物。然而，具有过低分子量的化合物(M.W.<200)具有小协同作用，并且由于其过大的logP而在水溶性方面成问题的化合物也不能表现出增加的协同作用。因此，预期实际协同性化合物会具有约0.19<logP<5.0。

实施例10：使用肽的组合治疗

本发明涉及通过使用特异性激活革兰氏阴性菌的膜的KL-L9P找到新的抗革兰氏阴性菌的抗生素的方法，并且涉及包含所述肽的用于抑制革兰氏阴性菌的组合治疗剂。即，膜激活肽与用于其它目的的许多治疗剂中的65％具有协同作用，并且帮助重定这些治疗剂作为抗革兰氏阴性菌的治疗剂。在这些治疗剂中，具有最大协同作用的化合物包括NSAID类诸如(S)-布洛芬、他汀类诸如辛伐他汀、以及天然物质诸如姜黄素。刺激革兰氏阴性菌的外膜的常规药物之一是粘菌素，其与KL-L9P肽具有协同作用。已发现，粘菌素和KL-L9P二者都接触外膜，但是在其作用机制方面存在轻微差异。在具有激活外膜的能力的这两个肽的存在下，重新定位药物表现出增加的协同作用(FICI值小于0.3)。这表明，其具有在比这三个化合物(LK-L9P、粘菌素和重新定位药物)单独使用时显示的MIC低至少10倍的浓度杀死革兰氏阴性菌的效应。通过很好地使用它，在避免这三个化合物的毒性和细胞毒性的同时甚至在非常低的浓度杀死革兰氏阴性菌是可能的，这表明该重新定位药物可被用于具有耐药性的革兰氏阴性菌。下表19至23示出了当将重新定位药物中的利奈唑胺(表19)、氯唑西林(表20)、姜黄素(表21)和布洛芬(表22)中的每个与KL-L9P和粘菌素混合以形成两个或三个化合物的组合时，抗大肠杆菌的MIC。

在表19中，第一行(黑色)示出了当单独使用这三个化合物时的抗大肠杆菌的MIC；第二行(灰色)示出了当仅使用这三个化合物中的两个用于处理时的抗大肠杆菌的MIC；并且第三行(白色)示出了当将所有这三个化合物用作混合物用于处理时的抗大肠杆菌的MIC。在表20中，第一行(黑色)示出了当单独使用这三个化合物时的抗大肠杆菌的MIC；第二行(灰色)示出了当仅使用这三个化合物中的两个用于处理时的抗大肠杆菌的MIC；并且第三行(白色)示出了当将所有这三个化合物用作混合物用于处理时的抗大肠杆菌的MIC。在表21中，第一行(黑色)示出了当单独使用这三个化合物时的抗大肠杆菌的MIC；第二行(灰色)示出了当仅使用这三个化合物中的两个用于处理时的抗大肠杆菌的MIC；并且第三行(白色)示出了当将所有这三个化合物用作混合物用于处理时的抗大肠杆菌的MIC。在表22中，第一行(黑色)示出了当单独使用这三个化合物时的抗大肠杆菌的MIC；第二行(灰色)示出了当仅使用这三个化合物中的两个用于处理时的抗大肠杆菌的MIC；并且第三行(白色)示出了当将所有这三个化合物用作混合物用于处理时的抗大肠杆菌的MIC。在表23中，第一行(黑色)示出了当单独使用这三个化合物时的抗大肠杆菌的MIC；第二行(灰色)示出了当仅使用这三个化合物中的两个用于处理时的抗大肠杆菌的MIC；并且第三行(白色)示出了当将所有这三个化合物用作混合物用于处理时的抗大肠杆菌的MIC。

在所有情况下，当单独使用这三个化合物时MIC是最高的。仅用这三个化合物中的两个处理显示出较低的MIC，并且用这三个化合物的混合物处理显示出最低的MIC。

表19：KL-L9P、粘菌素和利奈唑胺之间的协同作用

表20：KL-L9P、粘菌素和氯唑西林之间的协同作用

表21：KL-L9P、粘菌素和姜黄素之间的协同作用

表22：KL-L9P、粘菌素和布洛芬之间的协同作用

表23：KL-L9P、粘菌素和辛伐他汀之间的协同作用

没有用于根除具有耐药性的革兰氏阴性菌的药物，因此应该以一种不同寻常的方式尽快发现新类型的药物。一种不同寻常的方法是使革兰氏阴性菌的外膜松散使得化合物可穿过外膜。构建了含有脯氨酸的两亲性肽的文库，并且选择具有激活革兰氏阴性菌的膜的能力的KL-L9P作为候选物。已发现，该肽不接触宿主细胞，并且因此对宿主细胞不具有毒性，同时它具有穿透革兰氏阴性菌的外膜的特性。然而，其不具有降解膜的能力，并且因此具有在膜中停留很长时间的同时使膜松散的作用。由于该作用，所述肽有助于其它候选抗生素穿过膜。在抗微生物活性被测试的化合物中，其抗革兰氏阴性菌的抗微生物作用未知的许多化合物可在细菌膜激活肽的存在下具有抗微生物作用。例如，利奈唑胺可在16μM杀死革兰氏阴性菌。可见，当使细菌的外膜松散的另一化合物粘菌素与KL-L9P一起刺激革兰氏阴性菌的膜时，协同性化合物的协同作用进一步增加。在这种情况下，利奈唑胺仅在6.7μM的浓度就能容易地杀死大肠杆菌。证实了当该膜激活肽的两亲性α-螺旋形状是弯曲形状时，该肽具有最大化的作用，并且还不具有对宿主细胞的毒性。已发现，当化合物是具有200或更高的分子量的疏水性分子(logP>0.19)时，与膜激活肽具有协同作用的这些化合物显示出作用。因此，可得到许多种能够杀死革兰氏阴性菌的物质。这个事实表明为何难以开发革兰氏阴性菌特异性抗微生物剂的原因是由于革兰氏阴性菌的外膜。此外，本发明证实，可使外膜松散以允许不具有膜穿透能力的小分子进入细菌的膜激活肽的存在，是最快和可靠的用于开发革兰氏阴性菌特异性抗微生物剂的方法。

工业实用性

如上文所述，根据本发明，革兰氏阴性菌的膜特异性激活肽的开发使得可以代替具有严重副作用(诸如肾毒性和神经毒性)的常规抗生素(例如粘菌素)。此外，当将所述肽与粘菌素共同施用时，可获得大的协同作用。因此，可以在比常规浓度低至少10倍的浓度施用具有强烈毒性的粘菌素，从而在使副作用最小化的同时杀死革兰氏阴性菌。如果可将根据本发明的膜激活肽的外膜松散作用与粘菌素的外膜松散作用结合，可以与本发明的发明人发现的抗生素组合使用所述肽和粘菌素来杀死革兰氏阴性菌，同时在降低的浓度使用所述开发的膜激活肽和粘菌素。当所述膜激活肽单独使用或与粘菌素组合使用以使革兰氏阴性菌的外膜松散时，由于非松散膜而难以穿透细菌的许多种化合物可穿透细菌。此外，可以精确地筛选候选化合物是否通过本发明的肽穿透革兰氏阴性菌的外膜，并且起抗生素的作用，并且因此发现新的抗生素的可能性也很高。

对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说显而易见的是，可在不违背本发明的范围的情况下基于以上描述进行多种应用和修改。

文本文件

参见所附序列表。

Claims (1)

1.一种抗微生物组合物，其包含i)革兰氏阴性菌膜穿透肽，其中所述肽的序列为序列SEQ ID NO:22；和ii)选自由以下组成的组的化合物：氯唑西林(Cloxacillin)、粘菌素(colistin)、利奈唑胺(Linezolid)、红霉素(erythromycin)、布洛芬(ibuprofen)、辛伐他汀(simvastatin)、姜黄素(curcumin)和白藜芦醇(resveratrol)。

Images