JP4958781B2 - コリスチン原末の製造法 - Google Patents
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Description
(1)独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに、受託番号FERM P−20553として寄託された、バチルス・ポリミキサ・バー・コリスチニウス M50株。
(2)上記(1)に記載のバチルス・ポリミキサ・バー・コリスチニウスを培養し、培養物をイオン交換樹脂に吸着させ、溶出した後、濃縮して、乾燥することを特徴とする、400nmにおける5%濃度(W/V)水溶液の吸光度が0.15以下であるコリスチン原末の製造法。
(3)上記(2)に記載の製造法によって得られる、400nmにおける5%濃度(W/V)水溶液の吸光度が0.15以下であるコリスチン原末。
バチルス・ポリミキサ・バー・コリスチニウス(Bacillus polymyxa var. colistinus) M50株は、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター(〒305−8566 日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1中央第6)に、受託番号FERM P−20553として平成17年5月31日付けにて寄託された。
本発明では、従来のコリスチン発酵生産に使用される生産菌株に対し、人工的な突然変異処理を行い、目的とする生産菌株を取得した。
人工的な突然変異処理方法としては、人工的な変異処理であれば特に限定されないが、例えば、N−メチル−N’−ニトロ−N−ニトロソグアニジン(NTG)、エチルメタンスルホネートなどの変異剤による化学的方法;紫外線照射、X線照射などの物理的方法;遺伝子組換え、トランスポゾンなどによる生物学的方法などの変異処理方法を用いることができる。
突然変異処理を行い得られた菌群は、フラスコを用いて液体培養し、培養液の着色度およびコリスチンの生産能を指標にしてスクリーニングした。ここで、着色度は、培養液の濾紙濾過液の400nmにおける吸光度を測定した値を指標とする。また、コリスチン生産能は、培養液の濾紙濾過液をHPLCにより分析した値を指標とする。
このようにして、当該着色度が従来の生産菌株に比べて大幅に減少し、且つコリスチン生産能が同等以上の生産菌株バチルス・ポリミキサ・バー・コリスチニウス(Bacillus polymyxa var. colistinus)を取得した。
従来からコリスチン原末の製造に使用しているバチルス・ポリミキサ・バー・コリスチニウス202−71株に対して、濃度10〜1000μg/mgのNTGで、温度25〜30℃、1分〜24時間静置もしくは振盪して突然変異処理を行い、トリプトン2%、イーストエキス0.2%、グルコース1%からなる寒天培地プレート上にコロニーを生育させた。各々のコロニー(菌株)を普通ブイヨン2%、イーストエキス0.2%および塩化ナトリウム0.3%からなる液体シード培地へ植菌し、28℃で約24時間培養後、約0.1mLをコーンフラワー4.5%、コーンミール1.5%、小麦胚芽0.2%、脱脂大豆0.2%、硫酸アンモニウム1%、リン酸一カリウム0.05%、硫酸第一鉄0.005%、炭酸カルシウム0.05%および水飴1.5%からなる液体培地30mL入の250mL容三角フラスコへ植菌した。28℃で約120時間振とう培養後、培養液を濾紙を用いて濾過し、得られた濾液の色調およびコリスチンの生産性を比較した。これら菌群から202−71株のコリスチン生産能と同等以上で、且つ濾液の色調が明らかに202−71株のそれより薄い菌株として、M50株を選択した。202−71株とM50株の培養濾液について、分光光度計で300〜600nmの吸光度を測定し、結果を図1に示した。400nmの吸光度は202−71株由来の培養濾液で3.61に対して、M50株由来の培養濾液では1.42であり、明らかな差が認められた(表1)。
実施例1で得られた培養液の着色が薄いM50株および従来からコリスチン発酵生産に使用している培養液の着色が濃い202−71株を、普通ブイヨン2%、イーストエキス0.2%および塩化ナトリウム0.3%からなる液体シード培地へ植菌し、28℃で約24時間培養した後、各々約15mLをコーンフラワー4.5%、コーンミール1.5%、小麦胚芽0.2%、脱脂大豆0.2%、硫酸アンモニウム1%、リン酸一カリウム0.05%、硫酸第一鉄0.005%、炭酸カルシウム0.05%および水飴1.5%からなる液体培地4L入の5L容ジャーファメンターに植菌した。各々、通気・攪拌しながらpH5.0〜7.0で30℃にて約120〜144時間培養した。得られた培養液を濾紙を用いて濾過し400nmの吸光度を測定したところ、202−71株由来の培養濾液では4.50に対して、M50株由来の培養濾液では1.39であり、実施例1のフラスコでの試験結果と同様に明らかな差が認められた(表2)。
実施例2で得られたM50株および202−71株の5L容ジャーファメンター培養液を、濾過助剤(ボディミックス)を敷いたヌッチェで濾過した後、カラムに充填したイオン交換樹脂(アンバーライトIRC−50(Na+型)ロームアンドハース社製、300mL)へ吸着させた。イオン交換樹脂から約0.4mol/L硫酸でコリスチンを溶離させた後600mLの脱イオン水で洗浄し、得られた溶離液、洗浄液の混合液を約5%濃度(W/V)まで濃縮させ、コリスチン高含有液を得た。コリスチン高含有液の400nmにおける吸光度は、202−71株由来のコリスチン高含有液が0.359に対して、M50株由来のコリスチン高含有液が0.07であり、明らかにM50株由来のコリスチン高含有液の着色は薄かった(表3)。
実施例3で得られたM50株由来コリスチン原末を脱イオン水に溶解した液を液体クロマトグラフィー(HPLC)にて分析し、その結果を図2に示した。HPLCの測定条件は下記のとおりである。
測定条件
検出器:吸光度検出器(測定波長:215nm)
カラム:YMC−Pack ODS−AM(AM−312)(ワイエムシー社製)
150mm×Φ4.6mm
カラム温度:30℃
移動相: 4.46gの無水硫酸ナトリウムを900mlの純水に溶解し、2.5mlのリン酸を加え、100mlにメスアップする(pH2.3〜2.5)。この溶液78にアセトニトリルを22の割合で混合する。
流量:1.0ml/min
実施例3で得られた202−71株由来のコリスチン高含有液を、実施例3で得られたM50株由来のコリスチン高含有液の色調にするために必要な脱色カーボン量について試験した。202−71株由来のコリスチン高含有液の固形分換算量に対し、2%、5%、10%(それぞれW/V)に相当するカーボン(精製白鷺、武田薬品工業社製)を添加して30分間撹拌した後、桐山ロートで濾過し、得られた濾液をスプレードライした。各スプレードライ粉末を脱イオン水に溶解し、5%濃度(W/V)水溶液を得た。400nmにおける5%濃度(W/V)水溶液の吸光度を測定した結果、最も脱色カーボン量が多い10%(W/V)カーボン添加水溶液でも吸光度は0.135であり、実施例3で得られた脱色カーボン処理を行っていないM50株由来のコリスチン高含有液の吸光度0.087に達しなかった(表5)。
Claims (3)
- 独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに、受託番号FERM P−20553として寄託された、バチルス・ポリミキサ・バー・コリスチニウス M50株。
- 請求項1に記載のバチルス・ポリミキサ・バー・コリスチニウスを培養し、培養物をイオン交換樹脂に吸着させ、溶出した後、濃縮して、乾燥することを特徴とする、400nmにおける5%濃度(W/V)水溶液の吸光度が0.15以下であるコリスチン原末の製造法。
- 請求項2に記載の製造法によって得られる、400nmにおける5%濃度(W/V)水溶液の吸光度が0.15以下であるコリスチン原末。
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