CN117343855A - 一种热反硝化地芽孢杆菌及其发酵生产脂环肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种热反硝化地芽孢杆菌(Geobacillus thermodenitrificans)及其发酵生产脂环肽的方法，其保藏编号为CGMCC No.24896。本方法以该热反硝化地芽孢杆菌为生产菌株，通过菌株摇瓶活化、种子罐培养和发酵罐发酵制备得到含脂环肽的热反硝化地芽孢杆菌发酵液。本方法优化了发酵工艺条件，工艺过程简单，发酵周期短，制得的脂环肽含量最高可达1.51%，且生产成本低，适应于大规模工业化生产应用。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地涉及热反硝化地芽孢杆菌及其发酵生产脂环肽的方法。
背景技术
随着社会的发展以及国人生活水平的提高，越来越多的人关心食物的安全与健康。在畜牧养殖中，饲料添加剂是饲料的重要组成成分，其质量直接影响饲料的质量，进而又影响到畜禽产品的品质。低剂量的抗生素曾经广泛添加到饲料中，用于提高动物的免疫能力和生长指标，而抗生素的滥用导致细菌耐药性加剧。
脂环肽(也称为环脂肽)是微生物(例如某些芽孢杆菌)产生的次级代谢产物，是一类重要的由氨基酸和脂肪酸环化而成的抗菌肽，主要通过细菌的非核糖体肽和聚酮杂合途径合成。在脂环肽结构中既含有亲水性的氨基酸残基，又有疏水性脂肪酸链，因此整个脂环肽具有显著的两亲性。脂环肽可以被添加作为饲料添加剂以部分代替抗生素的作用。
但是，目前通过微生物发酵培养得到脂环肽产品在工业化生产过程中存在很多问题，如发酵生产产量低、规模小、生产成本高，脂环肽与培养基组分不易分离，以及发酵周期较长(32-48h)等问题，导致很难从实验室规模走向工业化规模生产。因此，筛选优化发酵生产工艺以大规模工业化生产脂环肽是当前需要解决的关键问题。
发明内容
针对上述问题，本发明旨在提供一种热反硝化地芽孢杆菌，通过优化发酵工艺，使用该菌株发酵生产能够得到满足工业化规模生产要求的脂环肽产品。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明提供了一种热反硝化地芽孢杆菌(Geobacillus thermodenitrificans)，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.24896。
本发明还提供了该热反硝化地芽孢杆菌在发酵生产permetin A类脂环肽中的应用。
本发明进一步提供了发酵生产脂环肽的方法，包括如下步骤：
1)斜面菌种活化：将上述热反硝化地芽孢杆菌接种在LB斜面培养基中培养活化；
2)种子摇瓶培养：将步骤1)活化的单菌落菌体接入灭菌的LB培养基摇瓶中，培养得到一级种子液；
3)种子罐培养：将种子培养基灭菌后，接种步骤2)得到的一级种子液，在种子罐中培养得到二级种子液；
4)发酵罐培养：将步骤3)得到的二级种子液，接种到发酵培养基中进行发酵培养22-30h，获得脂环肽发酵菌液；
5)喷雾干燥：将步骤4)得到的发酵菌液离心，获得的发酵上清液在喷雾干燥器内喷雾干燥后，获得脂环肽粉末。
优选地，步骤2)中所述种子摇瓶培养条件为：32-38℃，200rpm，摇瓶培养8-16h，直到菌体浓度达107-108cfu/mL。
优选地，步骤3)中所述种子培养基的配方为：蛋白胨1-5重量份、酵母粉1-3重量份和氯化钠0.5-3重量份。
进一步优选地，步骤3)中所述种子罐培养的条件为：接种量0.2-5％，罐温36.0-37.5℃，搅拌转速100-160r/min，pH 6.0-7.0，通风量13-20m3/h，罐压0.04-0.05MPa，培养时间为5.8-12h，直到菌体浓度达107-108cfu/mL。
优选地，步骤4)中所述发酵培养基的配方为：豆粕250-350重量份、玉米粉250-350重量份、葡萄糖20-24重量份、碳酸钙15-18重量份、硫酸镁5-6重量份、磷酸氢二钾5-6重量份、磷酸二氢钾5-6重量份、玉米浆干粉5-6重量份、硫酸锰1-1.2重量份。
进一步优选地，步骤4)中所述发酵罐培养的条件为：接种量2-15％，培养罐温36.8-37.5℃，搅拌转速100-180r/min，溶氧30-99％，通风量260-380m3/h，罐压0.05-0.06MPa，发酵时间22-30h。
优选地，步骤5)中所述喷雾干燥过程中，喷雾干燥塔内的进口温度为150-180℃，出口温度为60-65℃，干燥时间为9-20h。
进一步优选地，步骤5)中所述喷雾干燥是在复合载体上进行的，所述复合载体由选自水溶性淀粉、玉米淀粉、轻质碳酸钙和增益粉中的两种或以上混合而成。
本发明有如下优点：
1、本发明筛选到了一株高产脂环肽的热反硝化地芽孢杆菌(Geobacillusthermodenitrificans)，拓宽了脂环肽的生产菌株；
2、本发明的工艺优化了脂环肽发酵工艺中的有机氮源、碳源给料量、溶氧量、pH和发酵时间，获得了生产成本和产物产量的最佳平衡；
3、本发明的工艺解决了脂环肽发酵后发酵产物不易与培养基分离的问题，不再需要压滤、陶瓷膜等过滤系统进行分离，仅用普通离心方法就可以获得发酵上清液，降低了过滤过程中的产品损失；
4、本发明的工艺选择玉米淀粉、轻质碳酸钙等按照1：(0.2-2)的比例制备复合载体，让载体和发酵上清液在喷雾干燥塔内形成均质粉末，可以有效的提高抗菌肽的稳定性；
5、本发明工艺过程简单，操作简便，发酵周期短，生产成本低，可以应用于大规模生产应用，得到含量达1.02-1.51％的脂环肽产品。
附图说明
图1显示了permetin A类脂环肽标准品的HPLC图谱，从图谱中可以看出该标准品是紫外吸收一样的一组发酵产物；
图2显示了permetin A类脂环肽标准品浓度的标准曲线图；
标准曲线制备方法如下：
配制一定浓度的permetin A类脂环肽对照品工作母液，将工作母液按照两倍梯度稀释，获得一系列倍比浓度的对照品溶液。高效液相色谱仪在满足系统适应性要求后，每个梯度的脂环肽对照品溶液上样10uL，在280nm吸收波长下获得样品的检测图谱(即图1所示的HPLC图谱)。检测中，每个浓度的对照品溶液重复检测2次，获得样品的检测峰面积。计算平均峰面积，结合对应的上样溶液浓度做标准曲线。本发明中建立的标准曲线线性回归系数R2＝0.9993，则说明建立的标准曲线是可用的(即图2所示的标准曲线图)。
图3显示了本发明实施例1中脂环肽产品的HPLC图谱；
图4显示了本发明实施例1中脂环肽产品的C谱图，其测定条件与参考文献(Takeuchi,Y.,et al."The structure of permetin A,a new polypeptin typeantibiotic produced by Bacillus circulans."Journal of Antibiotics 32.2(1979):121-9)一致；
图5显示了本发明实施例1-7中所得脂环肽的含量结果图。
具体实施方式
以下通过具体的实施方案阐述本发明。除特定说明，在本发明中所使用的技术手段均为本领域技术人员所众所周知的方法。并且，本发明的具体实施方案应该被理解为说明性，而非限制本发明的保护范围，本发明的操作实质和保护范围由权利要求书所限定。对本领域的技术人员而言，在不违背本发明实质和范围的条件下，对本发明实施方案中的物料、添加量、发酵条件进行的各种改变以及改动都属于本发明所要保护的范围。
脂环肽按照结构主要可以分为两类：
(1)一类是脂肪酸链直接参与成环。这类脂环肽的显著特征是：脂肪酸通过羧基与肽链中氮末端氨基残基的氨基链接，或肽链碳端羧基与脂肪酸的β-OH成环。(2)第二类是脂肪酸链不参与成环，脂肪酸通过自身的羧基与肽链中氨基残基的氨基形成酰胺键而链接。
肽链的成环导致脂环肽结构的刚性变强，同时也将酶切位点隐藏在环状结构的内部，从而导致脂环肽很难经过结构调整，将自身的酶切位点暴露在消化酶的活性中心。因此，相对比于α-螺旋和β-折叠类的抗菌肽，脂环肽具有更高的生物稳定性。其次，脂环肽的疏水性脂肪酸能够通过疏水性相互作用与细菌的磷脂双分子层结构结合，亲水性的氨基残基能够通过静电相互作用与细菌的肽聚糖或脂多糖结构相互作用，从而实现其更为广谱的杀菌、抑菌活性。再者，由于脂环肽的两亲性，在机体摄入后更容易在机体胃肠道黏膜渗透性并被机体所吸收，因此具有更高的生物利用度。基于上述优势，新型脂环肽类抗菌肽极有可能成为一类新的“替抗”产品，在饲料添加剂领域实现其广泛的应用价值。
目前脂环肽发酵工艺通常使用芽孢杆菌属(Bacillus)微生物进行发酵后从其代谢产物中分离。本发明所使用的新型发酵菌株则属于地芽孢杆菌(Geobacillus)，地芽孢杆菌属是国际上2001年新划分出来成为一个独立的细菌种属，该属的细菌具嗜冷热、耐酸碱、耐盐、好氧、碳源利用范围广、自养或异养等特性。本发明具体使用的菌株为热反硝化地芽孢杆菌(Geobacillus thermodenitrificans)，属于地芽孢杆菌的一种。
尽管该种属细菌的生理生化特性和形态学特征与普通的芽孢杆菌属菌株有一定相似性，但使用地芽孢杆菌发酵生产permetin A类脂环肽并优化发酵工艺以解决其规模化工业生产问题尚未见报道。目前报道的permetin A类脂环肽发酵工艺使用的菌株为环状芽孢杆菌(Bacillus Circulans)(参见例如Takahara,Y.,et al."Isolation of a newpeptide antibiotic,permetin A,from Bacillus circulans."Journal of Antibiotics32.2(1979):115；Takeuchi,Y.,et al."The structure of permetin A,a newpolypeptin type antibiotic produced by Bacillus circulans."Journal ofAntibiotics 32.2(1979):121-9以及美国专利US 4294754。以上参考文献的公开内容通过引用全文并入本申请)。
本发明使用的菌株为从重庆荣昌重庆岚峰森林公园(N 29°17′21″，E105°33′01″)土壤中分离得到的热反硝化地芽孢杆菌(Geobacillus thermodenitrificans)HS-1，该菌株已于2022年5月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.24896。
本发明分离的菌株经过鉴定，其形态特征为：菌落呈白色，表面油亮，具有褶皱边缘；菌体呈杆状，长2.0-4.5μm，宽0.6-1.0μm，菌体有鞭毛生长，可以形成芽孢，革兰氏阳性。对该菌株16S rRNA基因进行PCR扩增，并进行测序及系统发育分析，鉴定其为热反硝化地芽孢杆菌，命名为热反硝化地芽孢杆菌(Geobacillus thermodenitrificans)HS-1。
本发明使用的LB斜面培养基/LB培养基组成为：胰蛋白胨Tryptone 10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L，购自北京索莱宝科技有限公司。蛋白胨、酵母粉、氯化钠、豆粕、玉米粉、葡萄糖、碳酸钙、硫酸镁、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、玉米浆干粉、硫酸锰等培养基成分均为市售培养基成分。
本发明所涉及到的发酵工艺步骤及其参数均为本领域技术人员所熟知的。
实施例1
一种脂环肽发酵工艺，包括以下步骤：
1)斜面菌种活化：将保藏编号为CGMCC No.24896的热反硝化地芽孢杆菌HS-1冷藏管菌种接种在LB斜面培养基中培养活化16h；
2)种子摇瓶培养：将斜面培养的单菌落菌体按照1％的接种量接入中摇瓶，在38℃、200rpm条件下于LB培养基中培养16h，直到菌体浓度达107-108cfu/mL，得到热反硝化地芽孢杆菌一级种子液；
3)种子罐培养：种子培养基配方为：蛋白胨2.5kg、酵母粉1.25kg、氯化钠1.25kg、装罐量230L。将种子培养基灭菌后，将摇瓶中的一级种子液按照接种量1％接种到种子罐内，在罐温37℃、搅拌转速130r/min、pH 6.5、通风量17m3/h、罐压0.05MPa的培养条件下进行培养，培养时间为8h，直到菌体浓度达107-108cfu/mL，得到二级种子液；
4)发酵罐培养：将得到的二级种子液，接种到发酵培养基中发酵培养，发酵培养基配方：豆粕250kg、玉米粉250kg、葡萄糖20kg、碳酸钙18kg、硫酸镁6kg、磷酸氢二钾6kg、磷酸二氢钾6kg、玉米浆干粉6kg、硫酸锰1.2kg、装容量4.8m3。在泡沫高发期加入6kg消泡剂控制泡沫。培养罐温37℃，搅拌转速160r/min，通风量320m3/h，罐压0.05MPa，发酵培养22h，获得脂环肽发酵菌液；
5)发酵菌液在蝶式离心机中以3500rpm的转速离心后，获得的发酵上清液在喷雾干燥器内于混合复合载体上喷雾干燥。喷雾干燥过程中，喷雾干燥塔内的进口温度为170℃，出口温度为63℃，干燥时间为13h，获得脂环肽浅黄色粉末，色泽均匀，具有发酵香味的成品；
6)检测脂环肽含量：称量1g脂环肽产品，置于25mL容量瓶中，加适量的超纯水，用超声处理10-15min后定容至25mL。将得到的溶液转移至离心管内，在8000rpm、4℃条件下离心10min，获得的上清液用0.22μm水相滤膜过滤，过滤后面的溶液用高效液相色谱仪检测，每个样品检测两次，检测获得脂环肽含量。
如图3所示，本发明产品中脂环肽色谱峰的保留时间与图1标准品的基本一致；如图4所示，本发明产品中脂环肽C谱色谱峰位置与参考文献(Takeuchi,Y.,et al."Thestructure of permetin A,a new polypeptin type antibiotic produced by Bacilluscirculans."Journal of Antibiotics 32.2(1979):121-9)中披露的图谱基本一致，证明本发明的发酵产物为permetin A类脂环肽。
根据标准品的保留时间和本发明产品样品对应的保留时间以及峰面积进行计算本发明脂环肽产品中脂环肽的含量。含量结果如图5所示。
计算公式如下：
实施例2
将发酵培养基配方设置为：豆粕300kg、玉米粉300kg、葡萄糖24kg、碳酸钙18kg、硫酸镁6kg、磷酸氢二钾6kg、磷酸二氢钾6kg、玉米浆干粉6kg、硫酸锰1.2kg、装容量5.3m3。发酵培养22h，获得脂环肽发酵菌液。其他步骤的发酵工艺同实施例1。
实施例3
发酵过程中发酵培养时间为24h，其他步骤的发酵工艺同实施例2。
实施例4
发酵过程中发酵培养时间为26h，其他步骤的发酵工艺同实施例2。
实施例5
发酵过程中发酵培养时间为30h，其他步骤的发酵工艺同实施例2。
实施例6
将发酵培养基配方设置为：豆粕350kg、玉米粉350kg、葡萄糖20kg、碳酸钙15kg、硫酸镁5kg、磷酸氢二钾5kg、磷酸二氢钾5kg、玉米浆干粉5kg、硫酸锰1kg、装容量4.8m3。发酵培养26h，获得脂环肽发酵菌液。其他步骤的发酵工艺同实施例1。
实施例7
将发酵培养基配方设置为：豆粕300kg、玉米粉300kg、葡萄糖24kg、碳酸钙18kg、硫酸镁6kg、磷酸氢二钾6kg、磷酸二氢钾6kg、玉米浆干粉6kg、硫酸锰1.2kg，并且发酵26h左右后停止发酵，离心收集产物，最后喷雾干燥获得脂环肽成品。其他步骤的发酵工艺同实施例1。
对本发明实施例1-7进行产品含量的检测结果，所得数据见图5。
从图5可以看出，在实施例1中，当发酵培养基中的配方比例为：豆粕250kg、玉米粉250kg、葡萄糖20kg、碳酸钙18kg、硫酸镁6kg、磷酸氢二钾6kg、磷酸二氢钾6kg、玉米浆干粉6kg、硫酸锰1.2kg，发酵22h后，最终获得的脂环肽含量为1.02％。
在实施例2中，将发酵培养基中的配方比例改变为：豆粕300kg、玉米粉300kg、葡萄糖24kg、碳酸钙18kg、硫酸镁6kg、磷酸氢二钾6kg、磷酸二氢钾6kg、玉米浆干粉6kg、硫酸锰1.2kg，发酵22h后，最终获得的脂环肽含量为1.1％。这表明随着发酵培养基中碳氮源(豆粕、玉米粉、葡萄糖)的提高，有助于菌株生产脂环肽。
进一步地，在实施例3-5中，在实施例2的基础上将发酵培养的时间分别延长到24、26和30h。如图5的结果显示，在22-26h范围内，脂环肽的产量分别逐渐升高到1.1、1.35和1.4％，当培养时间延长到30h时，产量开始下降到1.25％。因此，在后续的大规模生产中，控制发酵罐内发酵时间为26h左右即可进行脂环肽产物的收集。
此外，在实施例6中，在实施例2的基础上将发酵培养基中的配方比例改变为：豆粕350kg、玉米粉350kg、葡萄糖20kg、碳酸钙15kg、硫酸镁5kg、磷酸氢二钾5kg、磷酸二氢钾5kg、玉米浆干粉5kg、硫酸锰1kg，发酵26h后，获得的脂环肽的含量为1.23％。结果说明，通过再次提高豆粕和玉米粉的添加量，并不能进一步提升脂环肽的产量(结果1.23％与实施例5接近)。
最终在实施例7中，为了平衡发酵成本和脂环肽发酵产物产量的最佳结果，将发酵培养基配方设置为：豆粕300kg、玉米粉300kg、葡萄糖24kg、碳酸钙18kg、硫酸镁6kg、磷酸氢二钾6kg、磷酸二氢钾6kg、玉米浆干粉6kg、硫酸锰1.2kg，并且发酵26h左右后停止发酵，离心收集产物，最后喷雾干燥获得脂环肽成品，如图5所示的产量为1.51％。本实施例可以最大程度上平衡发酵成本和脂环肽发酵产物产量。
Claims (10)
1.一种热反硝化地芽孢杆菌（Geobacillus thermodenitrificans），其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No. 24896。
2.权利要求1所述的热反硝化地芽孢杆菌在发酵生产脂环肽中的应用。
3.发酵生产脂环肽的方法，其特征在于包括如下步骤：
1）斜面菌种活化：将权利要求1所述的热反硝化地芽孢杆菌接种在LB斜面培养基中培养活化；
2）种子摇瓶培养：将步骤1）活化的单菌落菌体接入灭菌的LB培养基摇瓶中，培养得到一级种子液；
3）种子罐培养：将种子培养基灭菌后，接种步骤2）得到的一级种子液，在种子罐中培养得到二级种子液；
4）发酵罐培养：将步骤3）得到的二级种子液，接种到发酵培养基中进行发酵培养22-30h，获得脂环肽发酵菌液；
5）喷雾干燥：将步骤4）得到的发酵菌液离心，获得的发酵上清液在喷雾干燥器内喷雾干燥后，获得脂环肽粉末。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤2）中所述种子摇瓶培养条件为：32-38℃，200 rpm，摇瓶培养8-16 h，直到菌体浓度达107-108 cfu/mL。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：步骤3）中所述种子培养基的配方为：蛋白胨1-5重量份、酵母粉1-3重量份和氯化钠0.5-3重量份。
6.根据权利要求3-5任一项所述的方法，其特征在于：步骤3）中所述种子罐培养的条件为：接种量0.2-5 %，罐温36.0-37.5 ℃，搅拌转速100-160 r/min，pH 6.0-7.0，通风量13-20 m³/h，罐压0.04-0.05 MPa，培养时间为5.8-12 h，直到菌体浓度达107-108 cfu/mL。
7.根据权利要求3-6任一项所述的方法，其特征在于：步骤4）中所述发酵培养基的配方为：豆粕250-350重量份、玉米粉250-350重量份、葡萄糖20-24重量份、碳酸钙15-18重量份、硫酸镁5-6重量份、磷酸氢二钾5-6重量份、磷酸二氢钾5-6重量份、玉米浆干粉5-6重量份、硫酸锰1-1.2重量份。
8.根据权利要求3-7任一项所述的方法，其特征在于：步骤4）中所述发酵罐培养的条件为：接种量2-15%，培养罐温36.8-37.5 ℃，搅拌转速100-180 r/min，溶氧30-99 %，通风量260-380 m3/h，罐压0.05-0.06 MPa，发酵时间22-30 h。
9.根据权利要求3-8任一项所述的方法，其特征在于：步骤5）中所述喷雾干燥过程中，喷雾干燥塔内的进口温度为150-180 ℃，出口温度为60-65 ℃，干燥时间为9-20 h。
10.根据权利要求3-9任一项所述的方法，其特征在于：步骤5）中所述喷雾干燥是在复合载体上进行的，所述复合载体由选自水溶性淀粉、玉米淀粉、轻质碳酸钙和增益粉中的两种或以上混合而成。
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