JP7304957B2 - 納豆菌及びｍｋ－７の生産方法 - Google Patents

納豆菌及びｍｋ－７の生産方法 Download PDF

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Description

CGMCC CGMCC17894
本願は生物分野に関するが、それに限らず、特に、新しい納豆菌ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１７８９４、該菌株を発酵してビタミンＫ２（ＭＫ－７）を生産する方法、及び該菌株のビタミンＫ２（ＭＫ－７）の製造における使用に関するが、それらに限らない。
ビタミンＫ２はメナキノン（Ｍｅｎａｑｕｉｎｏｎｅ）とも称され、一般的にＭＫで示される。ビタミンＫ２は１組の化合物からなり、合計して１４種類の形態がある。これらの形態の相違点は側鎖の長さが異なることであり、代表的な分子はＭＫ－４及びＭＫ－７である。ＭＫ－７は機能が多く、活性が高く、半減期が長く、安全であるという特徴を有し、主に細胞の成長・代謝並びに心脳血管及び腎臓血管の石灰化の防止に対して非常に重要な作用を果たす。米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）サプリメント事務局（ＯＤＳ）はビタミンＫ２（ＭＫ－７）が革命的で多分化能を有するビタミンであると評価する。ビタミンＫ２（ＭＫ－７）は凝血を促進し、動脈硬化を改善する作用を有する。現在、中国は既に高齢化社会になったため、骨粗しょう症患者の発病率が比較的高い。大量の資料によれば、ビタミンＫ２（ＭＫ－７）が欠乏すると、高齢者の寛骨の骨折及び骨密度の低下を引き起こす恐れがあることは明らかになった。ビタミンＫ２（ＭＫ－７）が欠乏すると、血清低カルボキシル化オステオカルシンレベルが低下し、血清カルボキシル化オステオカルシンレベルが低下する恐れもあり、このため、高齢者の骨密度が低下して寛骨が骨折することを引き起こす恐れがある。且つ、ビタミンＫ２（ＭＫ－７）は骨粗しょう症、心脳血管石灰化、癌、糖尿病、腎臓病、老年認知症を治療する薬物に使用されてもよく、ビタミンＫ２（ＭＫ－７）は健康でヘルシーであり、将来性が期待される。
「１６８国で住民が６５歳以前に心血管疾患により死亡した状況及び生物統計学、社会経済的地位、タバコ、性別、運動、大量の栄養元素及びビタミンＫの相関分析」（２０１６ Ｃｕｒｅｕｓ ８（８））によれば、ビタミンＫ２（ＭＫ－７）の１日平均摂取量が５μｇ／２０００ｋｃａｌ未満の国（ｎ＝７０）の男性及び女性の行列において、早すぎるＣＶＤ死亡率はビタミンＫ２（ＭＫ－７）の１日平均摂取量が２４μg／２０００ｋｃａｌを超える国（ｎ＝７２）の２．２倍であることは明らかになった。従って、ビタミンＫ２（ＭＫ－７）の補充は健康にとって不可欠である。天然食物におけるビタミンＫ２（ＭＫ－７）の含有量が極めて低いため、基本的に、食物から十分なビタミンＫ２（ＭＫ－７）を摂取することができない。
長年以来、各国はいずれもビタミンＫ２（ＭＫ－７）の生産経路を研究している。合計して以下の３つの態様がある。態様（１）としては化学合成法であり、該方法は有機溶媒を使用する必要があり、環境及び操作者に優しくないだけでなく、得られた製品にも有機溶媒が残留し、製品にシス－トランス構造のビタミンＫ２（ＭＫ－７）が共存する。態様（２）としては固体発酵納豆から抽出することであり、納豆におけるビタミンＫ２（ＭＫ－７）の含有量が極めて低いため、市場性がない。態様（３）としては、天然納豆菌液体を発酵する方法で得ることであり、該方法はサイクルが長く、収量が低い。
ビタミンＫ２（ＭＫ－７）の生産及び需要の現状に応じて、世界市場において効率の一層高いビタミンＫ２（ＭＫ－７）の生産方法を必要としている。
本願は納豆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｎａｔｔｏ）ＳＴ－１００８を提供し、寄託番号がＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１７８９４である。
一態様では、本願はビタミンＫ２の生産方法を提供し、前記方法は、培地で前記納豆菌ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１７８９４を培養することにより、前記菌株細胞内及び前記培地でビタミンＫ２を生産し、前記菌株細胞内及び前記培地からビタミンＫ２を回収して精製し、前記ビタミンＫ２がＭＫ－７であることを含む。
他の態様では、本願は前記納豆菌ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１７８９４の、ビタミンＫ２の製造における使用を更に提供する。
他の態様では、本願は更にＭＫ－７製剤を提供し、前記ＭＫ－７製剤はＭＫ－７とＭＫ－６を含み、ＭＫ－６はＭＫ－７の２重量％～７重量％であり、前記製剤は油剤又は粉剤の形態を呈する。
本願では、前記油剤は０．１重量％～２０重量％のＭＫ－７、８０重量％～９９重量％の担体、及び０．１重量％～１重量％の酸化防止剤を含む。
本願では、前記粉剤は０．１重量％～２０重量％のＭＫ－７、５５重量％～７５重量％の吸着剤、１０重量％～１５重量％の溶媒、５重量％～１０重量％の粉末化剤、３重量％～５重量％の乳化剤、及び０．２重量％～０．５重量％の酸化防止剤を含む。
本願は前記ＭＫ－７製剤の、食品又は保健用食品における使用を更に提供する。
他の態様では、本願は更にＭＫ－７純品プレミックスを提供し、前記ＭＫ－７純品プレミックスは０．１重量％～２５重量％のＭＫ－７、７４．５重量％～９９．７重量％の希釈剤、及び０．２重量％～０．５重量％の酸化防止剤を含む。
本願は前記ＭＫ－７純品プレミックスの、食品又は保健用食品における使用を更に提供する。
他の態様では、本願はＭＫ－７純品を提供し、前記ＭＫ－７純品は９８重量％～９９．９重量％のＭＫ－７と０．１重量％～２重量％のＭＫ－６を含む。
本願は前記ＭＫ－７純品の、骨粗しょう症、心脳血管石灰化、腎臓病患者の血管硬化症、腫瘍、筋痙攣、神経系疾患、糖尿病又は乾癬を治療する医薬品の製造における使用を更に提供する。
以下は本明細書において詳しく説明する主題の概略である。本概略は特許請求の範囲を制限するためのものではない。
従来技術の欠点を克服して市場需要を満足するために、本発明は純トランス構造のビタミンＫ２（ＭＫ－７）を高収率で生産する方法を提供することを目的とする。
具体的に、一態様では、本願は納豆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｎａｔｔｏ）ＳＴ－１００８を提供し、寄託番号がＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１７８９４である。
本出願者は長年に渡って深く綿密に研究してきたところ、野生型納豆菌から新しい納豆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｎａｔｔｏ）ＳＴ－１００８、ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１７８９４を突然変異誘発した。本出願者は市販されている、異なる由来の６種類の新鮮な納豆から菌株を分離し、異なるコロニー形態、コロニー色、菌体成長速度に基づいて分離精製してから発酵実験を行って、ビタミンＫ２（ＭＫ－７）生産菌を得た。ビタミンＫ２（ＭＫ－７）生産菌を出発菌株として、該菌株に対して紫外線による突然変異誘発を行って、紫外線による突然変異誘発を２６世代行った後に形態変異株を得て、ビタミンＫ２（ＭＫ－７）の収量は２０倍増加する。以上の形態変異及びビタミンＫ２（ＭＫ－７）の収量は数世代の継代培養を経って、比較的に安定している。該菌種の番号はＳＴ－１００８であり、菌種は中国微生物菌種寄託管理委員会普通微生物センターに寄託されており、アドレスが中華人民共和国北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所であり、寄託番号がＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１７８９４であり、寄託日が２０１９年０６月０５日である。
本願に係る新しい菌株ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１７８９４は、グラム陽性菌であり、芽胞が中央に存在し、菌の幅が１μｍ～２μｍであり、長さが３μｍ～５μｍであるという微生物学的特性を有する。ＬＢ寒天培地で、コロニーが広がって均一で灰黄色であり、コロニーの直径が０．３ｃｍ～０．５ｃｍであり、色素がなく、菌体が１０時間培養されると芽胞が発芽する。ＬＢ液体培地で、３０分間接種すると発芽し始め、１時間経ると菌体成長列は明確に分離されておらず、長さが約１１μｍ～１５μｍであり、２時間経ると菌体成長列は明確に分離され、各長列が８～１２個の菌体を直列接続してなり、長さが約２４μｍ～３６μｍであり、２．５時間経ると長列菌体は単一菌体に断裂し始める。
本願の他の態様では、該新しい菌種を発酵してビタミンＫ２（ＭＫ－７）を生産する方法を提供し、ビタミンＫ２（ＭＫ－７）を比較的高い収率で生産することができる。
本願はビタミンＫ２の生産方法を提供し、前記方法は、培地で前記納豆菌ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１７８９４を培養することにより、前記菌株細胞内及び前記培地でビタミンＫ２を生産し、前記菌株細胞内及び前記培地からビタミンＫ２を回収して精製し、前記ビタミンＫ２がＭＫ－７であることを含む。
本願では、前記培地は本分野における通常又は既知の培地であってもよい。前記培地は炭素源、窒素源物質を含有する。更に、培地に有機物質又は無機物質を加えることにより、微生物の成長を促進し、ビタミンＫ２（ＭＫ－７）の収率を向上させることができる。
本願では、前記培地は０．２重量％～２０重量％の炭素源物質と０．２重量％～２０重量％の窒素源物質を含有し、前記炭素源物質はグルコース、サッカロース、マルトース、フルクトース及びグリセリンからなる群から選ばれるいずれか１つ又は複数のものであり、前記窒素源物質は酵母粉末、ペプトン（Ｔｒｙｐｔｏｎｅ）、大豆粉、ひよこ豆粉、牛肉エキス及び酵母エキス（Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ）からなる群から選ばれるいずれか１つ又は複数のものである。
本願では、前記培地は更に０．００１重量％～０．５重量％の無機物質を含有し、前記無機物質はリン酸塩、マグネシウム塩及びナトリウム塩からなる群から選ばれるいずれか１つ又は複数のものであり、
好ましくは、前記無機物質はリン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム及び塩化ナトリウムからなる群から選ばれるいずれか１つ又は複数のものである。
本願では、前記培地は更に発芽促進物質と前駆物質を含有し、前記発芽促進物質はホウ酸、ビタミンＢ１、硫酸銅及び硫酸マンガンからなる群から選ばれるいずれか１つ又は複数のものであり、前記前駆物質はソラネソール、エタノール、メナジオール及びフィトールからなる群から選ばれるいずれか１つ又は複数のものである。
前記菌はバチルス・ズブチリスであり、培養過程に芽胞があるため、芽胞の発芽を促進する元素は発芽促進物質として定義される。
本願では、前記培養過程において、前記培地の重量で、０．００１％～０．５％の前記発芽促進物質を加え、前記培養過程において、好ましくは、菌体の対数増殖期から定常期まで、前記培地の重量で、０．００３％～５％の前記前駆物質を加える。
本願では、前記培養は好気条件下で行われ、培養温度が３５～５０℃、培養時間が１０～４８ｈ、ｐＨが５．５～８．０、圧力が０．０３～０．０８ＭＰａである。
前記培養条件は本分野における通常又は既知の条件下で行われてもよい。前記発酵は好気条件下で行われてもよく、温度は３５～５０℃であってもよく、３８～４２℃が好ましい。培養時間は１０～４８時間であり、１６～２４時間が好ましい。前記発酵過程において、接種時に発芽促進物質であるホウ酸、ビタミンＢ１、硫酸銅、硫酸マンガンを加えることが好ましく、その濃度（培地での占有率）が０．００１％～０．１％であることが好ましい。前記発酵過程において、菌体の成長前期に加えることが好ましく、その濃度（培地での占有率）が０．００３％～５％である。
前記発酵過程は本分野における通常又は既知の装置及び条件下で行われてもよく、例えば、振とうフラスコを使用して本分野における通常又は既知の回転速度で行われてもよく、通常の発酵槽、例えば５Ｌ槽、５Ｔ発酵槽で行われてもよい。
本願では、ビタミンＫ２を回収して精製することは、
前記培養過程において得られた培養液から発酵菌体及び発酵上清液を分離する工程（１）と、
発酵菌体を乾燥させる工程（２）と、
工程（２）において得られた菌粉を有機溶媒で抽出し、抽出により得られた溶液を減圧蒸発して、溶媒を除去する工程（３）と、
工程（３）において得られたものをクロマトグラフィーカラムで脱色し、過酸化物価の除去を行う工程（４）と、
工程（４）において得られたものをクロマトグラフィーカラムで脱酸して、ビタミンＫ２製品を得る工程（５）と、を含む。
本願では、工程（１）において、前記分離はセラミック膜による分離及び遠心分離機による分離からなる群から選ばれる１つ又は２つのものであり、セラミック膜による分離が好ましい。
本願では、工程（２）において、前記乾燥は噴霧乾燥、冷凍乾燥及び減圧真空乾燥からなる群から選ばれるいずれか１つ又は複数のものであり、噴霧乾燥が好ましく、
前記乾燥は遮光条件下で行われることが好ましい。
本願では、工程（３）において、前記有機溶媒は石油エーテル、エタノール、メタノール、ジクロロメタン、イソプロパノール、酢酸エチルからなる群から選ばれるいずれか１つ又は複数のものであり、石油エーテル及び酢酸エチルが好ましい。
本願では、工程（４）において、前記クロマトグラフィーカラムの充填材はシリカゲルである。
本願では、工程（５）において、前記クロマトグラフィーカラムの充填材はアルミナである。
工程（４）において使用されるカラム充填材はシリカゲルであり、使用される有機溶媒は本分野における通常又は既知の有機溶媒、例えば石油エーテル、エタノール、酢酸エチル等であり、石油エーテルが好ましく、通常の減圧回収方法で有機溶媒を回収する。工程（５）において使用されるカラム充填材はアルミナであり、使用される有機溶媒は本分野における通常又は既知の有機溶媒、例えば石油エーテル、エタノール、酢酸エチル等であり、石油エーテルが好ましく、通常の減圧回収方法で有機溶媒を回収する。
本発明の菌種ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１７８９４及び本発明の発酵方法を用いれば、サイクルが１６～２４時間に短縮し、収量が２００～３００ｍｇ／Ｌに増加し、食物におけるビタミンＫ２（ＭＫ－７）の含有量が不足するという問題を解決することができる。ｍｇ／Ｌとは、ＭＫ－７含有量と発酵液の総体積との比率を指す。
本願の他の態様では、前記納豆菌ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１７８９４の、ビタミンＫ２の製造における使用を更に提供する。
本願の他の態様では、本願は更にＭＫ－７製剤を提供し、ＭＫ－７とＭＫ－６を含み、ＭＫ－６はＭＫ－７の２重量％～７重量％であり、前記製剤は油剤又は粉剤の形態を呈する。
本願では、前記油剤は０．１重量％～２０重量％のＭＫ－７、８０重量％～９９重量％の担体、及び０．１重量％～１重量％の酸化防止剤を含む。
本願では、前記担体は大豆油、トウモロコシ油、ヒマワリ種子油、オリーブ油及び中鎖トリグリセリドからなる群から選ばれるいずれか１つ又は複数のものであり、
前記酸化防止剤はローズマリー、フェルラ酸、トコフェロール及びゴシポールからなる群から選ばれるいずれか１つ又は複数のものである。
本願では、重量で、前記粉剤は０．１重量％～２０重量％のＭＫ－７、５５重量％～７５重量％の吸着剤、１０重量％～１５重量％の溶媒、５重量％～１０重量％の粉末化剤、３重量％～５重量％の乳化剤、及び０．２重量％～０．５重量％の酸化防止剤を含む。
本願では、前記吸着剤は変性デンプン、耐性デキストリン、微結晶セルロース及び食物繊維からなる群から選ばれるいずれか１つ又は複数のものであり、
前記溶媒は大豆油、トウモロコシ油、ヒマワリ種子油、オリーブ油及び中鎖トリグリセリドからなる群から選ばれるいずれか１つ又は複数のものであり、
前記粉末化剤はカゼインナトリウム、カゼインホスホペプチド及びリン酸化ジスターチホスフェートからなる群から選ばれるいずれか１つ又は複数のものであり、
前記粉末化剤はオクテニルコハク酸デンプンナトリウム及びオクテニルコハク酸エステル化デンプンからなる群から選ばれるいずれか１つ又は２つのものであり、
前記乳化剤はモノグリセリン脂肪酸エステル、ジグリセリン脂肪酸エステル、アラビアゴム、大豆リン脂質、カプリル酸／カプリン酸グリセリル、モノパルミチン酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン、ステアロイル乳酸ナトリウム、ステアロイル乳酸カルシウム及びジアセチル酒石酸モノグリセリドからなる群から選ばれるいずれか１つ又は複数のものであり、
前記酸化防止剤はパルミチン酸アスコルビル、エリソルビン酸、エリソルビン酸ナトリウム、トコフェロール、グルタチオン、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）及びカロチノイドからなる群から選ばれるいずれか１つ又は複数のものである。
本願は前記ＭＫ－７製剤の、食品又は保健用食品における使用を更に提供する。
本願の更なる態様では、本願は更にＭＫ－７純品プレミックスを提供し、前記ＭＫ－７純品プレミックスは０．１重量％～２５重量％のＭＫ－７、７４．５重量％～９９．７重量％の希釈剤、及び０．２重量％～０．５重量％の酸化防止剤を含む。
本願では、前記希釈剤は変性デンプン、耐性デキストリン、微結晶セルロース及び食物繊維からなる群から選ばれるいずれか１つ又は複数のものであり、
前記酸化防止剤はパルミチン酸アスコルビル、エリソルビン酸、エリソルビン酸ナトリウム、トコフェロール、グルタチオン、クエン酸、ＥＤＴＡ及びカロチノイドからなる群から選ばれるいずれか１つ又は複数のものである。
本願は前記ＭＫ－７純品プレミックスの、食品又は保健用食品における使用を更に提供する。
本願の他の態様では、本願はＭＫ－７純品を提供し、９８重量％～９９．９重量％のＭＫ－７と０．１重量％～２重量％のＭＫ－６を含む。
本願は前記ＭＫ－７純品の、骨粗しょう症、心脳血管石灰化、腎臓病患者の血管硬化症、腫瘍、筋痙攣、神経系疾患、糖尿病又は乾癬を治療する医薬品の製造における使用を更に提供する。
本願では、用語のＭＫ－７純品プレミックスとは、ＭＫ－７純品に希釈剤、酸化防止剤を加えた後、ふるい分け、混合、乾燥等の工程を行って得られた粉末を指す。
本願の他の特徴及び利点は下記の明細書において説明され、且つ部分的に明細書から明らかになり、又は本願を実施することにより理解される。本願の目的及び他の利点は明細書及び特許請求の範囲に特に指す構造により実現・取得されることができる。
本願の目的、技術案及び利点をより明確にするために、以下に本願の実施例を詳しく説明する。なお、衝突しない限り、本願の実施例及び実施例の特徴は互いに任意に組み合わせられてもよい。
実施例１
市販されている納豆から、ビタミンＫ２（ＭＫ－７）を生産する納豆菌を分離する
納豆（日本バイオテクノロジー株式会社から購入された）を滅菌水で溶解・希釈した後、固体ＬＢ培地プレートに塗布し、３７℃で２４時間恒温培養すると、プレートの表面に白色コロニーが成長することとなり、接種針でピックアップすると糸引き現象が生じる。白色コロニーをＬＢ斜面培地に移動し、３７℃で２４時間培養し、接種用ループで発酵培地（１００ｍｌの三角フラスコで２０ｍｌ詰め込み、培地の組成はグルコース２％、グリセリン４％、大豆粉３％、硫酸マグネシウム０．０１％、リン酸水素二カリウム０．０１％、塩化ナトリウム０．５％、セリン０．０８％である）に接種し、３７℃において２７０ｒｐｍで４８時間揺動し、等体積の酢酸エチルを加えて抽出して分層した後、酢酸エチル層を乾燥させてエキスを得て、高速液体クロマトグラフを使用して分析し、標準品と同じ保持時間を有するサンプルに対応する微生物を選択し、最終的にビタミンＫ２（ＭＫ－７）を生産する納豆菌を同定する。該微生物は、グラム陽性菌であり、芽胞が中央に存在し、菌の幅が０．２ｕｍであり、長さが１～２ｕｍであるという微生物学的特性を有する。ＬＢ寒天培地で、コロニーは白色で、培地の表面から突出し、コロニーの表面にしわがあり、コロニーは粘性を有し糸引きすることができ、コロニーは直径が０．３～０．５ｃｍであり、色素がなく、菌体が１０時間培養されると芽胞が発芽する。
実施例２
ビタミンＫ２（ＭＫ－７）を生産する菌種の突然変異誘発
実施例１において得られた、ビタミンＫ２（ＭＫ－７）を生産する菌株を出発菌株として、紫外線による突然変異誘発を行い、３６世代突然変異誘発して変異株ＳＴ－１００８を得る。該微生物は、グラム陽性菌であり、芽胞が中央に存在し、菌の幅が０．５ｕｍであり、長さが２～３ｕｍであるという微生物学的特性を有する。ＬＢ寒天培地で、コロニーが広がって均一で灰黄色であり、コロニーの直径が０．３～０．５ｃｍであり、色素がなく、菌体が１０時間培養されると芽胞が発芽する。ＬＢ液体培地で、３０分間接種すると発芽し始め、１時間経ると菌体成長列は明確に分離されておらず、長さが約１１～１５ｕｍであり、２時間経ると菌体成長列は明確に分離され、各長列が８～１２個の菌体を直列接続してなり、長さが約２４～３６ｕｍであり、２．５時間経ると長列菌体は単一菌体に断裂し始める。該菌種は中国微生物菌種寄託管理委員会普通微生物センターに寄託されており、アドレスが中華人民共和国北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所であり、寄託番号がＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１７８９４である。
実施例３
種子の製造
実施例において得られたＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１７８９４菌種を接種し、５０ｍｌの種子培地（表１参照）に入れ、３８～４２℃において、１５０～３００ｒｐｍでインキュベータを揺動しながら３～１６時間培養すると、接種待ちの菌種を得る。
Figure 0007304957000001
実施例４
５Ｌ槽による発酵
実施例３において得られた菌種を、発酵培地量を２０％占有する接種量で発酵生産のための基礎培地（表２参照）に接種し、４２℃で培養し、３０分間培養してからフィード培地（表３参照）を流加補充し始め、０．５時間当たりにフィード培地を１００ｍｌ加え、２０時間まで続けられ、合計して２Ｌ補充する。接種時に発芽促進物質である０．００１％ホウ酸、０．００１％ビタミンＢ１、０．００１％硫酸銅を加え、４時間まで培養してから前駆物質である０．０５％エタノールを加える。培養過程において、ｐＨ値が自然で、溶存酸素の濃度が３０％以上に制御される。発酵サイクルは２４時間である。高速液体クロマトグラフィ法で発酵収量が２００ｍｇ／Ｌであることを測定し、具体的な高速液体クロマトグラフィ測定条件は表２に示される。
Figure 0007304957000002
Figure 0007304957000003
Figure 0007304957000004
得られた発酵液をセラミック膜で固液分離し、得られた菌体濃縮液を真空乾燥させ、菌粉：石油エーテル又はエタノールの１：３重量比で、乾燥後の菌粉にエタノール又は石油エーテルを加えて抽出する。抽出後、有機相を分離し、有機相を減圧回収して、ビタミンＫ２含有の粗生成物を得る。粗生成物はシリカゲルをカラム充填材とし、石油エーテルを移動相として、脱色を行う。脱色後の粗製品は、アルミナカラムを通過し、石油エーテルを移動相として酸価を除去する。得られたビタミンＫ２（ＭＫ－７）の収率が８０％である。
Figure 0007304957000005
Figure 0007304957000006
実施例５
実施例４との相違点は、接種時に発芽促進物質である０．０５％ホウ酸、０．００１％ビタミンＢ１、０．０５％硫酸銅、０．０５％硫酸マンガンを加えることである。発酵収量が２６０ｍｇ／Ｌである。
実施例６
実施例４との相違点は、接種時に発芽促進物質である０．１％ホウ酸、０．１％ビタミンＢ１、０．１％硫酸銅、０．１％硫酸マンガンを加えることである。発酵収量が２２０ｍｇ／Ｌである。
実施例７
実施例５との相違点は、４時間まで培養してから前駆物質である０．０５％ソラネソールを加えることである。発酵収量が２８０ｍｇ／Ｌである。
実施例８
実施例７との相違点は、４時間まで培養してから前駆物質である０．０５％ソラネソール、０．０５％のエタノールを加えることである。発酵収量が３００ｍｇ／Ｌである。
実施例９
実施例８との相違点は、１：３の重量比で乾燥後の菌粉に酢酸エチルを加えて抽出することである。ビタミンＫ２（ＭＫ－７）の収率が９０％である。
実施例１０
実施例８との相違点は、１：３の重量比で乾燥後の菌粉に酢酸エチルを加えて抽出することである。ビタミンＫ２（ＭＫ－７）製品の収率が９８％である。
本願の発酵方法により得られたビタミンＫ２は、ビタミンＫ２の化学合成の欠点、即ち異性体が大量生成され、副生成物が多く、収率が低く、環境を汚染するという問題を克服し、そのイソプレン側鎖がシス構造である場合が多く、活性が比較的低い。本願の発酵方法により得られたビタミンＫ２は、発酵収量が３００ｍｇ／Ｌに達することができ、菌粉を精製することにより、収率が９８％に達することができ、且つ構造の同定によって全トランスビタミンＫ２、即ちＭＫ－７の水素核磁気共鳴スペクトルデータに完全に一致する。
実施例１１
Ｋ２（ＭＫ－７）２ｇ、大豆油１２０ｇ、変性デンプン７４３ｇ、カゼインナトリウム１００ｇ、オクテニルコハク酸デンプンナトリウム２０ｇ、モノグリセリン脂肪酸エステル１０ｇ、パルミチン酸アスコルビル５ｇ。
Ｋ２（ＭＫ－７）に大豆油を加えて均一に撹拌し、完全に溶解させた後、続いてパルミチン酸アスコルビル、モノグリセリン脂肪酸エステル、オクテニルコハク酸デンプンナトリウム、カゼインナトリウムを加え、均一に攪拌し続けた後、変性デンプンを加え、均一に攪拌した後、８０メッシュのふるいをかけ、８０℃で２時間乾燥させると、２０００ｐｐｍのビタミンＫ２（ＭＫ－７）粉末を１ｋｇ得る。
実施例１２
Ｋ２（ＭＫ－７）２ｇ、大豆油９８８ｇ、ローズマリー１０ｇ。
Ｋ２（ＭＫ－７）にローズマリーを加え、更に大豆油を加えて均一に撹拌溶解すると、２０００ｐｐｍのビタミンＫ２（ＭＫ－７）油を１Ｋｇ得る。
実施例１３
ＭＫ－７の粉剤及び油剤の性能
Figure 0007304957000007
Figure 0007304957000008
ＭＫ－７の粉剤及び油剤並びに従来の粉剤及び油剤の安定性は「中国国家衛生と計画生育委員会公告２０１６年８号」に基づいて測定され、酸価及び過酸化物価はそれぞれＧＢ５００９．２２９－２０１６第一法及びＧＢ ５００９．２２７－２０１６第一法に基づいて測定される。
実施例１４
Ｋ２（ＭＫ－７）２ｇ、パルミチン酸アスコルビル２ｇ、微結晶セルロース９９６ｇ。
Ｋ２（ＭＫ－７）にパルミチン酸アスコルビルを加えて均一に混合し、８０メッシュのふるいをかけた後、微結晶セルロースを倍数比例で５回逓増し、その後、８０メッシュのふるいをかけ、残りの微結晶セルロースを加え、均一に混合した後、８０メッシュのふるいをかけ、８０℃で２時間乾燥させると、２０００ｐｐｍのビタミンＫ２（ＭＫ－７）プレミックスを１ｋｇ得る。
実施例１５
ＭＫ－７純品プレミックスの性能
Figure 0007304957000009
実施例１４における純品プレミックス及び従来の純品プレミックスの安定性は「中国国家衛生と計画生育委員会公告２０１６年８号」に基づいて測定される。
以上は本願に開示される実施形態を説明したが、前記内容は本願を理解しやすくするために用いた実施形態であり、本願を制限するためのものではない。当業者であれば、本願に開示される趣旨や範囲を逸脱せずに、実施形式及び細部に対して種々の修正や変更を行うことができる。しかしながら、本願の保護範囲は、依然として添付の特許請求の範囲に準じるべきである。

Claims (28)

  1. 寄託番号がＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１７８９４である納豆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｎａｔｔｏ）ＳＴ－１００８。
  2. ＭＫ－７の生産方法であって、
    培地で請求項１に記載の納豆菌ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１７８９４を培養することにより、前記菌株細胞内及び前記培地でＭＫ－７を生産し、前記菌株細胞内及び前記培地でＭＫ－７を回収して精製することを含む、ＭＫ－７の生産方法。
  3. 前記培地の重量で、前記培地は０．２％～２０％炭素源物質及び０．２％～２０％窒素源物質を含有し、前記炭素源物質はグルコース、サッカロース、マルトース、フルクトース及びグリセリンからなる群から選ばれるいずれか１つ又は複数のものであり、前記窒素源物質は酵母粉末、ペプトン、大豆粉、ひよこ豆粉、牛肉エキス及び酵母エキスからなる群から選ばれるいずれか１つ又は複数のものである、請求項２に記載の生産方法。
  4. 前記培地の重量で、前記培地は更に０．００１％～０．５％無機物質を含有し、前記無機物質はリン酸塩、マグネシウム塩及びナトリウム塩からなる群から選ばれるいずれか１つ又は複数のものである、請求項２又は３に記載の生産方法。
  5. 前記無機物質はリン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム及び塩化ナトリウムからなる群から選ばれるいずれか１つ又は複数のものである、請求項４に記載の生産方法。
  6. 前記培地は更に発芽促進物質及び前駆物質を含有し、前記発芽促進物質はホウ酸、ビタミンＢ１、硫酸銅、硫酸マンガン及びセリンからなる群から選ばれるいずれか１つ又は複数のものであり、前記前駆物質はソラネソール、エタノール、メナジオール及びフィトールからなる群から選ばれるいずれか１つ又は複数のものである、請求項２～５のいずれか１項に記載の生産方法。
  7. 前記培地において、前記培地の重量で、０．００１％～０．５％の前記発芽促進物質を加える、請求項６に記載の生産方法。
  8. 前記培地において、前記培地の重量で、０．００３％～５％の前記前駆物質を加える、請求項６に記載の生産方法。
  9. 前記培養は好気条件下で行われ、培養温度が３５～５０℃、培養時間が１０～４８ｈ、ｐＨが５．５～８．０、圧力が０．０３～０．０８ＭＰａである、請求項２～８のいずれか１項に記載の生産方法。
  10. 前記ＭＫ－７を回収して精製することは、
    培養過程において得られた培養液から発酵菌体及び発酵上清液を分離する工程（１）と、
    発酵菌体を乾燥させる工程（２）と、
    工程（２）において得られた乾燥後の菌体を有機溶媒で抽出し、抽出により得られた溶液を減圧蒸発して、溶媒を除去する工程（３）と、
    工程（３）において得られたものをクロマトグラフィーカラムで脱色し、過酸化物価の除去を行う工程（４）と、
    工程（４）において得られたものをクロマトグラフィーカラムで脱酸して、ＭＫ－７を得る工程（５）と、を含む、請求項２～９のいずれか１項に記載の生産方法。
  11. 工程（１）において、前記分離はセラミック膜による分離及び遠心分離機による分離からなる群から選ばれる１つ又は２つのものである、請求項１０に記載の生産方法。
  12. 前記分離はセラミック膜による分離である、請求項１１に記載の生産方法。
  13. 工程（２）において、前記乾燥は噴霧乾燥、冷凍乾燥及び減圧真空乾燥からなる群から選ばれるいずれか１つ又は複数のものである、請求項１０～１２のいずれか１項に記載の生産方法。
  14. 前記乾燥は噴霧乾燥である、請求項１３に記載の生産方法。
  15. 前記乾燥は遮光条件下で行われる、請求項１２又は１３に記載の生産方法。
  16. 工程（３）において、前記有機溶媒は石油エーテル、エタノール、メタノール、ジクロロメタン、イソプロパノール及び酢酸エチルからなる群から選ばれるいずれか１つ又は複数のものである、請求項１０～１５のいずれか１項に記載の生産方法。
  17. 前記有機溶媒は石油エーテル及び酢酸エチルである、請求項１６に記載の生産方法。
  18. 工程（４）において、前記クロマトグラフィーカラムの充填材はシリカゲルである、請求項１０～１７のいずれか１項に記載の生産方法。
  19. 工程（５）において、前記クロマトグラフィーカラムの充填材はアルミナである、請求項１０～１８のいずれか１項に記載の生産方法。
  20. 請求項１に記載の納豆菌ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１７８９４の、ＭＫ－７の製造における使用。
  21. ＭＫ－７製剤の生産方法であって、
    前記ＭＫ－７製剤におけるＭＫ－７は請求項２～１９のいずれか一項に記載の方法により生産され、且つ前記ＭＫ－７製剤はＭＫ－７及びＭＫ－６を含み、ＭＫ－６はＭＫ－７の２重量％～７重量％であり、前記ＭＫ－７製剤は油剤又は粉剤の形態を呈する、ＭＫ－７製剤の生産方法。
  22. 前記油剤は０．１重量％～２０重量％のＭＫ－７、８０重量％～９９重量％の担体、及び０．１重量％～１重量％の酸化防止剤を含む、請求項２１に記載の生産方法。
  23. 前記担体は大豆油、トウモロコシ油、ヒマワリ種子油、オリーブ油及び中鎖トリグリセリドからなる群から選ばれるいずれか１つ又は複数のものであり、
    前記酸化防止剤はローズマリー、フェルラ酸、トコフェロール及びゴシポールからなる群から選ばれるいずれか１つ又は複数のものである、請求項２２に記載の生産方法。
  24. 前記粉剤は０．１重量％～２０重量％のＭＫ－７、５５重量％～７５重量％の吸着剤、１０重量％～１５重量％の溶媒、５重量％～１０重量％の粉末化剤、３重量％～５重量％の乳化剤、及び０．２重量％～０．５重量％の酸化防止剤を含む、請求項２１に記載の生産方法。
  25. 前記吸着剤は変性デンプン、耐性デキストリン、微結晶セルロース及び食物繊維からなる群から選ばれるいずれか１つ又は複数のものであり、
    前記溶媒は大豆油、トウモロコシ油、ヒマワリ種子油、オリーブ油及び中鎖トリグリセリドからなる群から選ばれるいずれか１つ又は複数のものであり、
    前記粉末化剤はカゼインナトリウム、カゼインホスホペプチド、リン酸化ジスターチホスフェート、オクテニルコハク酸デンプンナトリウム及びオクテニルコハク酸エステル化デンプンからなる群から選ばれるいずれか１つ又は複数のものであり、
    前記乳化剤はモノグリセリン脂肪酸エステル、ジグリセリン脂肪酸エステル、アラビアゴム、大豆リン脂質、カプリル酸／カプリン酸グリセリル、モノパルミチン酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン、ステアロイル乳酸ナトリウム、ステアロイル乳酸カルシウム及びジアセチル酒石酸モノグリセリドからなる群から選ばれるいずれか１つ又は複数のものであり、
    前記酸化防止剤はパルミチン酸アスコルビル、エリソルビン酸、エリソルビン酸ナトリウム、トコフェロール、グルタチオン、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸及びカロチノイドからなる群から選ばれるいずれか１つ又は複数のものである、請求項２４に記載の生産方法。
  26. ＭＫ－７純品プレミックスの生産方法であって、
    前記ＭＫ－７純品プレミックスにおけるＭＫ－７は請求項２～１９のいずれか一項に記載の方法により生産され、且つ前記ＭＫ－７純品プレミックスは０．１重量％～２５重量％のＭＫ－７、７４．５重量％～９９．７重量％の希釈剤、及び０．２重量％～０．５重量％の酸化防止剤を含む、ＭＫ－７純品プレミックスの生産方法。
  27. 前記希釈剤は変性デンプン、耐性デキストリン、微結晶セルロース及び食物繊維からなる群から選ばれるいずれか１つ又は複数のものであり、
    前記酸化防止剤はパルミチン酸アスコルビル、エリソルビン酸、エリソルビン酸ナトリウム、トコフェロール、グルタチオン、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸及びカロチノイドからなる群から選ばれるいずれか１つ又は複数のものである、請求項２６に記載の生産方法。
  28. ＭＫ－７純品の生産方法であって、
    前記ＭＫ－７は請求項２～１９のいずれか一項に記載の方法により生産され、且つ前記ＭＫ－７純品は９８重量％～９９．９重量％のＭＫ－７と０．１重量％～２重量％のＭＫ－６を含む、ＭＫ－７純品の生産方法。
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