KR100242267B1 - 미생물을 이용한 로바스타틴의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신규한 균주 아스퍼질러스 테리우스 CFC 423(KFCC-11002)을 배양 배지에서 배양하고, 이의 발효액으로부터 균체 혼합물을 분리하고, 이 균체 혼합물로 부터 로바스타틴을 분리하고, 이 균체 혼합물로 부터 로바스타틴을 추출하고 정제함을 특징으로하는 로바스타틴의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

미생물을 이용한 로바스타틴의 제조방법

본 발명은 로바스타틴을 세포내에 고농도로 축적하는 아스퍼질러스 테리우스(Aspergillus terreus) 변이주 및 이를 이용한 로바스타틴의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에 사용된 아스퍼질러스 테리우스 변이주는 한국 종균협회에 1997년 11월 24일에 수탁번호 KFCC-11002로 본 출원인에 의해 기탁되었다.

로바스타틴은 동맥경화 및 국소빈혈 심장병을 유발시키는 고지혈증에 탁월한 효과가 있는 치료제로서 베타 하이드록시락톤과 메틸부티르산으로 구성된 나프탈렌 환상 구조를 이루고 있다. 여기서 말하는 고지혈증이란 혈장내의 지질-콜레스테롤, 중성지방(트리글리세라이드)의 농도가 지단백질의 대사 이상으로 정상범위를 넘어 증가한 상태로, 혈장 콜레스테롤 농도가 260㎎/㎗, 중성지방의 농도가 190㎎/㎗ 이상인 때를 말한다. 임상적으로 주로 동맥경화증의 주원인이 되며, 나아가 말초세동맥에 초래시 고혈압이 유발되고, 뇌동맥에 침착시 뇌졸증을 가져오며, 관상동맥내에 침착시 허혈성 심질환을 가져온다고 알려져 있다.

아스퍼질러스 테리우스(ATCC 20542)를 이용한 고질혈증 치료제의 제조방법은 특허공고 (대한민국 특허공고 83-2438)된 바 있으며, 또한 공고된 균주 및 배지를 이용해 고지혈증 치료제를 생산한 결과 배양 기간 8일동안 수십 ㎎/ℓ의 메비놀린(로바스타틴의 다른 이름)을 생산하였다는 보고가 있다(Greenspan 등 (1985), J. of Bact. 162: 704-707).

본 발명의 목적은 배양 세포내에 로바스타틴을 고농도로 축적시켜 로바스타틴의 생산성을 현격하게 증가시키고자 하는 것이다. 이러한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 인공 변이법을 이용하여 로바스타틴 자체에 내성을 지닌 균주를 선별함으로써 로바스타틴 생산성을 증가시키는 방법을 제공한다.

본 발명은 로바스타틴에 대해 내성을 갖는 아스퍼질러스 테리우스 변이주인 CFC 423(KFCC-11002)에 관한 것이다.

본 발명자들은 아스퍼질러스 테리우스 ATCC 20542의 포자현탁액 (10⁶내지 10⁷포자/㎖)에 돌연변이 유도물질인 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(이하 NTG로 칭함)을 공지의 방법으로 처리하여, 로바스타틴을 함유하는 고체 배지(표 1)에 도말하고, 28℃에서 12일간 배양한 후 완전한 콜로니가 형성되면 삼각플라스크 발효 배지(표 2)에 접종하여, 로바스타틴을 다량으로 생산하는 변이주 CFC 423을 얻게 되었다.

본 발명에 따라 로바스타틴이 다량 축적된 본 발명 미생물의 발효액은 하기 표 3의 배지에서 1차 종배양하고, 이 배양액을 하기 표 4에서 2차 종배양하고, 필요한 경우 3차 종배양한 후, 배양액을 하기 표 5의 배지에서 배양해서 얻는 것이 바람직하다.

상기와 같이 수득된 발효액으로부터 로바스타틴의 추출 및 정제는 이하에서 상세히 기술하는 바와 같이 수행될 수 있다.

로바스타틴이 포함된 발효액에 2M 농도의 인산을 최종농도가 0.05-0.1M 농도가 되도록 첨가한 뒤 2시간 동안 끓여 로바스타틴을 락톤화시킨다. 상온으로 냉각시킨 락톤화액에 액량대비 4%(w/v)의 규조토를 첨가한 후, 압축막 분리기/드럼필터로 균체 혼합물을 분리한다. 분리된 균체 혼합물에 초기 발효액량 대비 1/3배 부피의 추출용매(에틸아세테이트:메탄올=9:1)를 첨가하여 상온에서 약 1시간 동안 교반하며 추출한 뒤, 압축막분리기로 균체 혼합물과 추출액을 분리한다(1차추출). 분리된 균체 혼합물을 다시 동량의 추출용매로 반복 추출한 뒤 균체 혼합물을 분리한다(2차추출). 1차 추출 및 2차 추출 혼합액을 40-50℃의 진공농축관에서 1/4 이하의 부피로 농축한 뒤, 분리되는 2개의 액체상에서 물이 주성분인 하층부를 제거한다. 남아있는 유기용매층인 상층부에 10%(w/v)의 무수황산나트륨을 첨가하고 30분간 교반한 뒤, 분리필터를 사용하여 수분을 함유한 황산나트륨을 제거한다. 수분이 제거된 추출액을 40-50℃의 진공농축관에서 슬러리 형태의 잔류물로 남을 때까지 완전히 농축하고 이염화메탄을 첨가하여 완전히 용해시킨다. 이 용액을 미리 충진한 실리카젤(Merck, 실리카젤 60, 직경은 70에서 230메쉬) 분리탑의 상부에 주입하고, 에틸아세테이트의 헥산의 성분비가 1:2, 1:1 및 2:1인 용매를 순차적으로 통액하여 전개한다. 로바스타틴을 함유하는 분획만을 모아 0.5%(w/v)의 중성 활성탄으로 30분간 교반하여 탈색하고, 활성탄이 제거된 액을 40-50℃의 진공농축관에서 건조상태가 될 때까지 완전히 농축한다. 잔류물에 6-7배(v/w)의 메탄올을 넣어 60℃에서 완전히 용해시키고 -15℃에서 결정을 석출시킨 뒤, 결정을 분리·건조시켜, 침상구조의 백색결정인 로바스타틴을 얻는다.

따라서, 본 발명은 아스퍼질러스 테리우스 CFC 423을 상기한 표 5의 발효배지에서 배양하고, 이의 발효액으로부터 균체 혼합물을 분리하고, 이 균체 혼합물로부터 로바스타틴을 추출하고 정제함을 특징으로 하여, 로바스타틴을 제조하는 개선된 방법을 제공한다.

이하, 실시예는 본 발명을 구체적으로 설명하는 것으로서, 이러한 실시예는 본 발명을 예시하는 것일뿐, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1]

로바스타틴에 대한 내성을 테스트하기 위하여 먼저 친주인 ATCC 20542 균주를 로바스타틴이 함유된 삼각플라스크 배지(상기 표 2)에서 12일간 발효시켜 균체 성장도 및 로바스타틴 생산성을 측정한 다음, 표 6에 기재하였다.

표 6에서 보듯이 로바스타틴이 3g/ℓ이상 함유된 발효배지내에서는 세포 성장이 일어나지 않았으며, 또한 로바스타틴이 0.5g/ℓ이상 함유된 배지에서는 로바스타틴 생산이 이루어지지 않았다. 따라서 고농도의 로바스타틴을 생산하기 위해서는 먼저 로바스타틴에 내성이 있는 균주를 개발하는 일이 우선되어야 함을 알 수 있었다.

[실시예 2]

로바스타틴 생산능력이 있는 아스퍼질러스 테리우스 ATCC 20542 균주의 독립 콜로니에 멸균된 식염수로 포자 현탁액 (10⁶내지 10⁷포자/㎖)을 만든후 NTG 농도가 500㎍/㎖가 되도록 최종 부피를 조정하였다. 이 용액을 30℃ 항온조에서 1시간 처리후 pH 7.0, 0.1M 인산 완충액으로 3차례 세척한 다음, 2g/ℓ의 로바스타틴이 함유된 고체 배지에 도말하였다.

이때 1% 이하의 세포 생존율을 보였으며 로바스타틴이 함유된 고체배지에서 독립 콜로니를 이룬 세포를 표 2의 삼각 플라스크 발효 배지에서 12일간 배양한 후 로바스타틴 농도를 측정하였다. 이 결과 최종 발효 농도가 300㎎/ℓ인 균주를 얻었으며, 이 균주를 다시 위와같은 방법으로 NTG 처리 후 3g/ℓ의 로바스타틴이 함유된 고체 배지에 도말한 다음 삼각 플라스크 역가 실험을 한 결과 580㎎/ℓ의 로바스타틴을 생산할 수 있는 균주를 얻게 되었다.

위와 같은 방법을 반복하여 점차적으로 로바스타틴에 대한 내성을 붙여나간 결과 10g/ℓ 이상의 로바스타틴이 함유된 고체 배지에서 성장 가능한 변이 균주를 얻게 되었으며, 이 균주를 삼각 플라스크에서 역가 테스트를 한 결과 3.5g/ℓ의 로바스타틴 최종 발효 농도를 얻을 수 있었다.

이렇게 얻은 균주인 CFC 423은 모균주인 ATCC 20542에 비하여 발효농도가 50배 이상 증가하였다. 하기 표 7에서는 CFC 423 균주와 ATCC 20542 균주의 특징을 비교하여 보여주고 있다. 이때 로바스타틴 발효 농도는 USP 표준품을 표준 물질로 사용하여 HPLC 방법으로 정량하였다.

[실시예 3]

상기 표 3의 1차 종배양 배지를 200㎖씩 1ℓ용량의 진탕용 삼각 플라스크에 넣고, 살균시킨 후 균주 CFC 423(KFCC 11002) 및 ATCC 20542를 식균하여 28℃에서 240rpm 으로 68 내지 72시간 종배양 하였다.

상기 표 4의 2차 종배양 배지를 20ℓ씩 30ℓ 발효조에 넣고 121℃에서 30분간 살균시킨 후 1차 종배양액 200㎖을 식균하여 28℃에서 250 내지 300rpm 으로 48 내지 52시간 2차 종배양 하였다.

상기 표 5의 발효배지를 18ℓ씩 30ℓ용량의 발효조에 넣고 살균시킨 후 2차 종배양액 2ℓ를 식균하여 28℃에서 250 내지 300rpm으로 288시간 발효 배양 하였다. 통기량은 0.5 내지 1.0vvm으로 하였고 내압은 0.5 내지 1.0㎏/㎠로 조정하였다. 발효 완료 후 배지중의 로바스타틴 농도는 표 8과 같다.

[실시예 4]

CFC 423 발효 완료액 20ℓ에 2M의 인산을 750㎖ 첨가하여 최종 농도가 0.075M이 되게 하였고, 100℃에서 1시간 30분간 끓여서 발효조에서의 락톤화를 완성하였다. 상온으로 냉각된 상기 발효액에 4%(w/v)의 규조토를 첨가하고, 여과지 상에서 균체와 여과액으로 분리하여 함습균체 6.0㎏을 회수하였다. 회수균체에 에틸아세테이트와 메탄올의 9:1 혼합액을 7ℓ 첨가하여 1시간동안 교반 추출하고, 탁상용 압축막분리기로 균체와 추출액을 분리하였다. 분리된 균체에 상기 혼합액을 7ℓ 재차 첨가하여 2차 추출을 실행하였고, 분리기로 균체와 추출액을 분리한 뒤 1차 및 2차 추출 혼합액 14ℓ를 얻었다. 추출혼합액을 40-50℃의 회전 진공농축관에서 1/4 이하의 부피로 농축한 뒤, 물이 주성분인 하층부를 제거하였다. 상층부 유기용매층에 10%(w/v)의 무수 황산나트륨을 첨가하여 30분간 교반한 뒤, 분리필터를 사용하여 수분을 함유한 황산나트륨을 제거하였다. 수분이 제거된 추출액을 40-50℃의 진공농축관에서 슬러리 형태의 잔류물로 남을 때까지 완전히 농축하고 이염화메탄을 첨가하여 완전히 용해시킨 혼합물 500㎖를 얻었다. 이 용액을 미리 충진한 실리카젤(Merck, 실리카젤 60, 직경은 70에서 230메쉬) 분리탑의 상부에 주입하고, 에틸아세테이트와 헥산의 성분비가 1:2, 1:1 및 2:1인 용매를 순차적으로 통액하여 전개하였다. 로바스타틴을 함유하는 분획만을 모아 0.5%(w/v)의 중성 활성탄으로 30분간 교반하여 탈색하였고, 활성탄이 제거된 액을 40-50℃의 진공농축관에서 건조상태가 될 때까지 완전히 농축하여 잔류물 60g을 얻었다. 잔류물에 6-7배(v/w)의 메탄올을 넣어 60℃에서 완전히 용해시키고 -15℃에서 결정을 석출시킨 뒤, 결정을 분리·건조시켜, 로바스타틴 백색결정 50g을 얻었다.

본 발명은 신규한 균주 아스퍼질러스 테리우스 CFC 423을 배양 배지에서 배양하고, 이의 발효액으로부터 균체 혼합물을 분리하고, 이 균체 혼합물로부터 로바스타틴을 분리하고, 이 균체 혼합물로 부터 로바스타틴을 추출하고 정제함을 특징으로하여 로바스타틴을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따라 로바스타틴의 생산성이 현격하게 증가되었다.

Claims (2)

1. 로바스타틴에 대해 내성을 갖는 아스퍼질러스 테리우스 변이주인 CFC 423(KFCC-11002).
2. 제1항의 미생물을 배양하고 이의 배양액으로부터 균체 혼합물을 분리하고, 이 균체 혼합물로부터 로바스타틴을 추출하고 정제함을 특징으로하는 로바스타틴의 제조방법.