KR0161664B1 - 사이클로스포린에이의 제조방법 및 변이미생물 - Google Patents

Abstract

[청구범위에 기재되어 있는 발명이 속하는 기술 분야]

미생물 및 화합물의 제법

[그 발명이 해결하고자 하는 기술적 과제]

미생물에 의한 발효법을 이용한 사이클로스포린A의 제법에서 수율의 개선

[그 기술적 과제의 해결방법의 요지]

신규한 균주 톨리포클라디움 인플라툼 KFCC를 배양배지에서 배양하고, 이의 발효액으로부터 균체혼합물을 분리하고, 이 균체혼합물로부터 사이클로스코린A를 추출하고 정제함을 특징으로 하는 사이클로스포린A의 제조방법.

[발명의 중요한 용도]

사이클로포린A의 제조

Description

사이클로포린에이의 제조방법 및 변이미생물

제 1도는 본 발명에 따른 발효액의 메탄올 추출액과 정제공정을 거친 후 결정으로 석출된 사이클로스포린A의 고속액체 크로마토그래프 분석결과이다.

사용용매: 아세토니트릴: 메탄올: 수중 0.1% H₃PO₄(65:5:30)

Area 면적비: 메탄올 추출물 85%, 최종결정 98.7%

본 발명은 사이클로스포린A를 세포내에 고농도로 축적하는 신규한 톨리포클라디움 인플라툼(Tolypocladium inflatum) 변이주 및 이를 이용한 사이클로스포린A의 제조방법에 관한 것이다.

본 출원인은 본 발명의 신규한 톨리포클라디움 인플라툼변이주를 한국 종균협회에 1996년 1월 8일에 수탁번호 KFCC10889로 기탁하였다.

사이클로스포린A는 항진균, 항기생충, 항염증 및 면역억제 활성을 갖는 물질로 11개의 아미노산으로 구성된 환상의 폴리펩타이드이다. 사이클로스포린A는 면역억제능으로 인해 인간의 장기이식 수술 및 자가면역증의 치료에 널리 사용되고 있다. 톨리포클라디움 인플라툼은 배양액중에 적어도 시이클로스포린A, B, C, D 4종의 사이클로스포린 유도체를 생성하는 것으로 알려져 있다. 이들은 모두 사이클로스포린 합성효소에 의해 생산되며 사이클로스포린A가 주요산물이다.

종래 미생물에 의한 발효법은 사이클로스포린A를 공업적으로 생산하는 경우 균체량을 증가시켜서 세포내 사이클로스포린A를 고농도로 축적시키기 위해 탄소원 및 질소원으로 복합배지 성분을 사용하므로 주요 산물인 사이클로스포린A 외에 사이클로스포린 B, C, D의 유도체가 동시에 다량 생산되는 단점이 있다. S.N. Agathos 등이 톨리포클라디움 인플라툼 ATCC 34921로부터 개발한 톨리포클라디움 인플라툼 M6변이주의 경우 사이클로스포린A 함량비가 68%인 것으로 보고되었다. [참조 : Annals New York Academy of Sciences, Biochemical Engineering V, The Fungal Production of Cyclosporine A, p657-662, 1987]. 이 경우 세포내에 축적된 여러 가지 유도체로부터 사이클로스포린A를 순수하게 추출하고 정제하기 위해서는 그 과정이 복잡하고 길어져서 수율이 하락하고 제품의 순도가 USP규격에 미달하는 문제점이 있다.

본 발명자들은 톨리포클라다움 인플라툼 ATCC 34912의 포자현탁액(10⁶내지 10⁷포자/㎖)에 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘의 돌연변이원을 공지의 방법으로 처리하여, 호모엑기스 1%, 펩톤 2%, 포도당 2% 및 한천 2%를 함유하는 고체 배지에 도말하고, 30℃에서 10일간 배양한 후 완전한 콜로니가 형성되면 과당 10%, L-발린 1%, 인산암모늄 1%, 황산마르네슘 0.05%, 염화칼륨 0.05%, 질산나트륨 0.3%, 인산칼륨 0.2% 및 황화철 0.001%를 함유하는 삼각플라스크내 배지에 접종하여, 하기 표 1에 나타낸 바와 같이 사이클로스포린A를 다량으로 생산하면서 상대적으로 사이클로스포린 B, C 및 D등의 유도체는 상당히 감소된량으로 생성하는 변이주를 얻게 되었다.

본 발명은 사이클로스포린A, B, C 및 D를 생산하고 이들 중에서 세포내에 축적하는 사이클로스포린A 함량비가 80% 이상인 신규한 미생물 톨리포클라디움 인플라툼 KFCC 10889를 제공한다.

본 발명에 따른 신규한 톨리포클라디움 인플라툼 KFCC 10889와 이의 친주 톨리포클라디움 인플라툼 ATCC 34921의 균주 특성 차이는 표 2에 나타낸 바와 같다.

본 발명의 균주 톨리포클라디움 인플라툼 KFCC 10889의 형태학적, 배양학적 및 생리학적 성질은 다음과 같다. :

가. 형태학적 성질

1. 유백색에 가까운 균사체를 형성하며 격벽이 드문드문 있고 분기되어 있다.

2. 발표배지에서 호기적으로 배양시 균사, 분생포자 및 발아의 3가지 형태학적 과정을 거친다.

3. 사이클로스포린A의 생성은 얇은 균사로부터 분생분자로 거의 분화된 상태에서 얻어진다.

4. 균사체는 2 내지 3㎛ 두께로 원통형이다.

나. 배양학적 성질

효모엑기스 한천배지에서 배양시 집락의 지름은 4내지 5cm로 둥글고 방사형으로 주름을 형성하며 표면은 유백색의 솜털형태이고 뒷면은 진한 황색을 띤다.

다. 생리학적 성질

1. 생육온도 범위는 5 내지 40℃이다.

2. 최적 생육온도는 25 내지 30℃이다.

3. 생육 pH 범위는 2.0 내지 8.0 이다.

4. 최적 생육 pH는 5.0 내지 7.0이다.

5. 산소요구성은 호기성이다.

6. 색소는 생성하지 않는다.

본 발명에 따라 사이클로스포린A가 다량 축적된 본 발명 미생물의 발효액은 하기 표 3의 배지에서 1차 종배양하고, 이 배양액을 하기 표 4의 배지에서 2차 종배양하고, 필요한 경우 3차 종배양한 후, 배양액을 하기 표 5의 배지에서 배양하여 얻는 것이 바람직하다.

상기와 같이 수득된 발효액으로부터 사이클로스포린A의 추출 및 정제는 이하에서 상세히 기술하는 바와 같이 수행할 수 있다.

사이클로스포린A의 발효액(사이클로스포린A 농도 : 2 내지 3g/ℓ)에 액량 대비 4%(w/v)의 펄라이트를 첨가한 후 압축막분리기/드럼필터로 균체 혼합물을 분리한다. 분리된 균체 혼합물에 초기 발효액의 0.5배 부피의 메탄올을 첨가하여 상온에서 30분간 교반하며 추출한 뒤, 압축막분리기로 균체 혼합물을 분리한다 (1차 추출). 이를 다시 동량의 90% 메탄올로 반복추출한다(2차 추출). 1차 및 2차 추출액의 혼합물을 50℃ 진공농축관에서 20%이하의 부피로 농축한 뒤, 농축액의 0.5배 부피의 부칠아세테이트 또는 에칠아세테이트를 농축액에 첨가하고 50℃에서 30분간 교반하며 추출한다. 수용성 불순물을 제거하기 위하여 부칠(에칠)아세테이트 추출액과 동량의 1%(w/v) 가성소다 수용액을 혼합하여 15분간 교반한 뒤 상분리하고, 다시 동량의 증류수로 상분리된 물층의 pH가 중성이 될 때까지 반복하여 세척한다. 상분리된 부칠(에칠)아세테이트 추출액을 60℃이하의 진공농축기로 건조될 때까지 농축하고, 잔류물의 농도가 50g/ℓ가 되도록 90%(v/v) 메탄올을 첨가하여 다시 용해시킨 뒤, 용해액 대비 0.5배 부피의 페트롤리륨 에테르를 첨가하여 15분간 교반하고 상분리하는 작업을 2회에 걸쳐 실시하여 지용성 불순물을 제거한다. 세척된 메탈올 추출물을 약 30%로 농축시키고 농축액의 4배 부피의 부칠(에칠)아세테이트를 첨가하여 추출한다. 추출된 부칠(에칠)아세테이트액을 진공농축기로 건조될 때까지 농축한 뒤, 잔류물량 대비 3배 부피의 아세톤에 용해시킨 뒤 -15℃에서 결정을 석출시키는 과정을 실시하고, 결정을 제거한 모액에 대해서도 반복 실행하여 결정을 얻는다. 석출된 결정량 대비 1.5 내지 3.0배의 아세톤을 첨가하여 결정을 용해한다. 이 아세톤 용액에 동량(w/v)의 실리카젤(Merck, Silica gel 60, 70에서 230메쉬)을 서서히 첨가하며 혼합하여, 40℃ 진공건조기에서 건조시킨다. 위에서 사용된 실리카젤의 4 내지 5배에 해당하는 실리카젤을 n-헥산과 아세톤의 (3:1) 혼합물과 더불어 충진한 분리탑 위에, 추출작업의 잔여물을 흡수시켜 건조시킨 실리카젤을 충진하고, n-헥산과 아세톤의 혼합물(2:1에서 3:1)을 순차적으로 사용하여 전개한다. 사이클로스포린A을 함유하는 분획을 모아 1%(w/v)의 중성 활성탄을 넣어 30분간 탈색하고, 활성탄이 제거된 액을 50℃ 진공농축관에서 건조상태가 될 때까지 농축한다. 잔류물에 약 2 내지 3배의 아세톤을 넣어 용해시킨 뒤, -15℃에서 결정을 석출시키고, 결정을 분리한 뒤 건조시켜, 백색 분말상태의 사이클로스포린A을 얻는다.

따라서, 본 발명은 또한 톨리포클라디움 인플라툼 KFCC 10889를 상기한 표 5의 발효배지에서 배양하고, 이의 발효액으로부터 균체혼합물을 분리하고, 이 균체혼합물로부터 사이클로스포린A를 추출하고 정제함을 특징으로하여, 사이클로스포린A를 제조하는 개선된 방법을 제공한다.

이하 본 발명을 실시예를 통해 구체화한다. 그러나, 이들 실시예에 의해 본 발명이 한정되는 것으로 이해되어서는 안된다.

본 실시예에서 사용된 배지느 1차 종배양시 상기 표 3의 종배지를, 2차 종배양시는 상기 표 4의 종배지를, 발효배양시는 하기 표 6에 나타낸 배지를 사용하였다.

[실시예 1]

친주인 ATCC 34921과 본 발명균주인 KFCC 10889의 배양

상기 표 3의 1차 종배지를 50㎖씩 500㎖ 용량의 진탕용 삼각플라스크에 넣고, 살균시킨 후 각각의 포자현탁액을 식균하여 30℃에서 280rpm으로 68내지 74시간 1차 종배양하였다.

상기 표 4의 2차 종배지를 50㎖씩 500㎖ 용량의 진탕용 삼각플라스크에 넣고, 살균시킨 후 1차 종배양액 10%를 식균하여 30℃에서 280rpm으로 40 내지 48시간 2차 종배양하였다.

상기 표 5의 발효배지를 50㎖씩 500㎖ 용량의 진탕용 삼각플라스크에 넣고, 살균시킨 후 2차 종배양액 10%를 식균하여 30℃에서 220rpm으로 240시간 발효 배양하였다. 발효 완료 후 배지중의 사이클로포린A 농도는 표 7과 같다. 이때 사이클로스포린A농도는 USP 표준품을 표준 물질로 사용하여 HPLC 방법으로 정량하였다.

[실시예 2]

상기 표 3의 1차 종배지를 50㎖씩 500㎖ 용량의 진탕용 삼각플라스크에 넣고, 살균시킨 후 균주 KFCC 10889 및 ATCC 34921을 식균하여 30℃에서 280rpm으로 68 내지 74시간 1차 종배양하였다.

상기 표 4의 2차 종배지를 20ℓ씩 30ℓ 용량의 발효조에 넣고 121℃에서 30분간 살균시킨 후 1차 종배양액 50㎖을 식균하여 30℃에서 300 내지 350rpm으로 40내지 48시간 2차 종배양하였다.

상기 표 4의 2차 종배지를 18ℓ씩 30ℓ 용량의 발효조에 넣고 121℃에서 30분간 살균시킨 후 2차 종배양액 2ℓ를 식균하여 30℃에서 300내지 350rpm으로 20내지 24시간 3차 종배양하였다.

상기 표 6의 발효배지를 18ℓ씩 30ℓ 용량의 발효조에 넣고 살균시킨 후 3차 종배양액 2ℓ를 식균하여 30℃에서 200 내지 300rpm으로 240시간 발효배양하였다. 통기량은 0.3 내지 0.5vvm으로 하였고 내압은 0.3 내지 0.5kg/㎠로 조정하였다. 발효 완료 후 배지중의 사이클로스포린A 농도는 표 8과 같다.

[실시예 3]

상기 표 3의 1차 종배지를 50㎖씩 500㎖ 용량의 진탕용 삼각플라스크에 넣고, 살균시킨 후 균주 KFCC 10889를 식균하여 30℃에서 280rpm으로 68 내지 74시간 1차 종배양하였다.

상기 표 4의 2차 종배지를 20ℓ씩 30ℓ 용량의 발효조에 넣고 121℃에서 30분간 살균시킨 후 1차 종배양액 50㎖을 식균하여 30℃에서 300 내지 350rpm으로 40 내지 48시간 2차 종배양하였다.

상기 표 4의 2차 종배지를 90ℓ씩 150ℓ 용량의 발효조에 넣고 121℃에서 30분간 살균시킨 후 2차 종배양액 10ℓ를 식균하여 30℃에서 200 내지 250rpm으로 20 내지 24시간 3차 종배양하였다.

상기 표 6의 발효배지를 720ℓ씩 1.2㎘ 용량의 발효조에 넣고 살균시킨 후 3차 종배양액 80ℓ를 식균하여 30℃에서 100 내지 200rpm으로 240시간 발효배양하였다. 통기량은 0.3 내지 0.5vvm으로 하였고 내압은 0.3 내지 0.5kg/㎠로 조정하였다. 발효 완료후 배지중의 사이클로스포린A 농도는 표 9과 같다.

이와 같이 본 발명균주 KFCC 10889는 상기의 발효배지를 이용하여 사이클로스포린A를 고농도, 고비율로 생산할 수 있어 산업적 생산에 유용할 뿐만 아니라, 정제과정에서 유도체 제거가 용이한 점을 가진 균주이다.

[실시예 4]

실시예 2에서 얻어진 KFCC 10889 발효액 20ℓ(사이클로스포린A 발효농도 : 2650mg/ℓ)에 800의 펄라이트를 첨가한 후 압축막분리기로 균체 혼합물 약 8kg을 분리하였다. 분리된 균체 혼합물에 10ℓ의 메탄올을 첨가하여 상온에서 30분간 교반하며 추출한 뒤, 다시 압축막분리기로 균체 혼합물을 분리하였다(1차 추출). 이를 다시 10ℓ의 90% 메탄올로 반복 추출하였다(2차 추출). 1, 2차 추출액의 혼합물 약 2ℓ를 50℃ 진공농축관(Buchi, Rotavapor RE121)에서 4ℓ부피로 농축한 뒤, 2ℓ의 부칠아세테이트를 농축액에 첨가하고 50℃에서 30분간 교반하며 추출하였다. 부칠아세테이트 추출액과 동량의 1%(w/v) 가성소다 수용액을 혼합하여 15분간 교반한 뒤 상분리하고 다시 동량의 증류수로 중성 pH가 될 때까지 반복하여 세척하였다. 상분리된 부칠아세테이트 추출액을 60℃ 이하의 진공농축기로 건조될 때까지 농축하고, 잔류물의 농도가 50g/ℓ가 되도록 90%(v/v) 메탄올을 첨가하여 다시 용해시킨 뒤, 용해액 대비 0.5배 부피의 페트롤리륨 에테르를 첨가하여 15분간 교반하고 상분리하는 작업을 2회에 걸쳐 실시하여 지용성 불순물을 제거하였다. 세척된 메탄올 추출물을 약 30%로 농축시키고 농축액의 4배 부피의 부칠아세테이트를 첨가하여 추출하였다. 추출된 부칠아세테이트액을 진공 농축기로 건조될 때까지 농축한 뒤, 잔류물량 대비 3배 부피의 아세톤에 용해시킨 뒤 결정을 -15℃에서 석출시키는 과정을 실시하고, 결정을 제거한 모액에 대해서도 반복 실행하여 결정을 얻었다. 석출된 결정에 70㎖의 아세톤을 첨가하여 결정을 용해한 뒤, 70g의 실리카젤(Merck, Silica gel 60, 70에서 230메쉬)을 서서히 첨가하며 혼합하고, 40℃ 진공건조기에서 건조시켰다. 미리 280g의 실리카젤을 n-헥산과 아세톤의 혼합물(3:1)과 더불어 충진한 분리탑(내경: 5.5cm, 길이: 50cm)위에 추출 작업의 잔여물을 흡수시켜 건조시킨 실리카젤을 충진하고, n-헥산과 아세톤의 혼합물 (3:1), (2.5:1), (2:1)을 각각 700㎖, 1,800㎖, 2,100㎖ 부피만큼 순차적으로 사용하여 전개하였다. 사이클로스포린A를 포함하는 분획을 모은 1,600㎖에 1%(w/v)의 중성 활성탄을 넣어 30분간 탈색하고, 활성탄이 제거된 액을 50℃ 진공농축관에서 건조상태가 될 때까지 농축하였다. 잔류물에 약 70㎖의 아세톤을 넣어 용해시킨 뒤, -15℃에서 결정을 석출시키고, 결정을 분리한 뒤 건조시켜, 백색 분발 상태의 다음과 같은 특성을 갖는 사이클로스포린A 약 35g을 얻었다.

순도 : 98.5%이상(건조량 기준), 건조감량 : 2%이하, 단일불순물 : 0.7%이하

전체불순물 : 1.5%이하, 중금속 : 20ppm이하

[실시예 5]

실시예3에서 얻어진 KFCC 10889 발효액 800ℓ(사이클로스포린A 발효농도 : 2515㎎/ℓ)에 32kg의 펄라이트를 첨가한 후 드럼필터로 균체 혼합물 약 160kg을 분리하였다. 분리된 균체 혼합물에 400ℓ의 메탄올을 첨가하여 상온에서 30분간 교반하며 추출한 뒤, 다시 압축막분리기로 균체 혼합물을 분리하였다(1차 추출). 이를 다시 400ℓ의 90% 메탄올로 반복 추출하였다(2차 추출). 1, 2차 추출액의 혼합물 약 800ℓ를 50℃ 진공농축관 (Buchi, Rotavapor RE121)에서 160ℓ 부피로 농축한 뒤, 80ℓ의 에칠아세테이트를 농축액에 첨가하고 50℃에서 30분간 교반하며 추출하였다. 수용성 불순물을 제거하기 위하여 에칠아세테이트 추출액과 동량의 1%(w/v) 가성소다 수용액을 혼합하여 15분간 교반한 뒤 상분리하고, 다시 동량의 증류수로 중성 pH가 될 때까지 반복하여 세척하였다. 상분리된 에칠아세테이트 추출액을 60℃ 이하의 진공농축기로 건조될 때까지 농축하고, 잔류물의 농도가 50g/ℓ가 되도록 90%(v/v) 메탄올을 첨가하여 다시 용해시킨 뒤, 용해액 대비 0.5배 부피의 페트롤리륨 에테르를 첨가하여 15분간 교반하고 상분리하는 작업을 2회에 걸쳐 실시하여 지용성 불순물을 제거하였다. 세척된 메탄올 추출물을 약 30%로 농축시키고 농축액의 4배 부피의 에칠아세테이트를 첨가하여 추출하였다. 추출된 에칠아세테이트액을 진공농축기로 건조될 때까지 농축한 뒤, 잔류물량 대비 3배 부피의 아세톤에 용해시킨 뒤 결정을 -15℃에서 석출시키는 과정을 실시하고, 결정을 제거한 모액에 대해서도 반복 실행하여 결정을 얻었다. 석출된 결정 1.8kg에 3ℓ의 아세톤을 첨가하여 결정을 용해하였다. 이 아세톤 용액에 2.4kg의 실리카젤(Merck, Silica gel 60, 70에서 230메쉬)을 서서히 첨가하며 혼합하고, 40℃ 진공건조기에서 건조시켰다. 미리 12kg의 실리카젤을 n-헥산과 아세톤의 혼합물(3:1)과 더불어 충진한 분리탑(내경: 20cm, 길이 : 150cm)위에 추출 작업의 잔여물을 흡수시켜 건조시킨 실리카젤을 충진하고, n-헥산과 아세톤의 혼합물(3:1), (2.5:1), (2:1)을 각각 28ℓ, 72ℓ, 84ℓ 부피만큼 순차적으로 사용하여 전개하였다. 사이클로스포린A를 포함하는 분획을 모은 64ℓ에 1%(w/v)의 중성 활성탄을 넣어 30분간 탈색하고, 활성탄이 제거된 액을 50℃ 진공농축관에서 건조상태가 될 때까지 농축하였다. 잔류물에 약 3ℓ의 아세톤을 넣어 용해시킨 뒤, -15℃에서 결정을 석출시키고, 결정을 분리한 뒤 건조시켜, 백색 분발상태의 다음과 같은 특성을 갖는 사이클로스포린A 약 1.4kg을 얻었다.

순도 : 98.5% 이상(건조량 기준), 건조감량 : 2% 이하, 단일불순물 : 0.7% 이하

전체불순물 : 1.5% 이하, 중금속 : 20ppm 이하

Claims (5)

1. 미생물 배양시 발효액에 사이클로스포린 중 사이클로스포린A 함량비가 80%이상이고, 효모액기스 한천 배지에서 배양시 색소를 형성하지 않으며 유백색의 군락을 형성함을 특징으로 하는 톨리포클라디움 인플라툼 균주 KFCC 10889.
2. 제 1항의 미생물을 배양배지에서 배양하고, 이의 발효액으로부터 균체 혼합물을 분리하고, 이 균체혼합물로부터 사이클로스포린A를 추출하고 정제함을 특징으로하여, 사이클로스포린A를 제조하는 방법.
3. 제 2항에 있어서, 사용된 배양배지가 하기 표에 나타낸 바와 같이 조성된 배지인 방법.
4. 제 2항에 있어서, 추출액을 1%(w/v)가성소다 수용액으로 처리하여 수용성 불순물을 제거하는 단계를 포함하는 방법.
5. 제 2항에 있어서, 용리액으로서 구간 비율이 2:1 내지 3:1 비율의 n-헥산 대 아세톤의 혼합물을 사용한 크로마토그래피로 정제하는 방법.