JPH0763356B2 - 新種トリポクラディウム・バリウム、及びそれを利用するサイクロスポリン系抗生物質の生産方法 - Google Patents
新種トリポクラディウム・バリウム、及びそれを利用するサイクロスポリン系抗生物質の生産方法Info
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- JPH0763356B2 JPH0763356B2 JP1328529A JP32852989A JPH0763356B2 JP H0763356 B2 JPH0763356 B2 JP H0763356B2 JP 1328529 A JP1328529 A JP 1328529A JP 32852989 A JP32852989 A JP 32852989A JP H0763356 B2 JPH0763356 B2 JP H0763356B2
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- C07K7/645—Cyclosporins; Related peptides
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
- C12N1/145—Fungal isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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- C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、新種トリポクラディウム・バリウム、並びに
好気発酵によるサイクロスポリン複合体、あるいはその
構成単位であるサイクロスポリンＡ、サイクロスポリン
Ｂ、またはサイクロスポリンＣの微生物学的製造方法に
関する。
好気発酵によるサイクロスポリン複合体、あるいはその
構成単位であるサイクロスポリンＡ、サイクロスポリン
Ｂ、またはサイクロスポリンＣの微生物学的製造方法に
関する。
サイクロスポリンは、11個のアミノ酸から成る環状、中
性、無極性のオリゴペプチドであって、アミノ酸部分の
多少の相違によって、いくつかの種類に分けられる。
性、無極性のオリゴペプチドであって、アミノ酸部分の
多少の相違によって、いくつかの種類に分けられる。
初めに、サイクロスポリンＡ、およびサイクロスポリン
Ｂが、当初トリコデルマ・ポリスポールム［Trichoderm
a polysporum,リンク・エクス・ペルソーニア（Link ex
pers.）リファイ（Rifai）］として同定された真菌の
一種（NRRL 8044）の培地から、リュッガー（Ruegger）
らによって単離され［ヘルベチア・キミカ・アクタ（He
lv.Chim.Acta）、59巻（1976年）1075ページ］、サイク
ロスポリンＢ、Ｄ、ＥおよびＧは、トラバー（Traber）
らによって単離された［ヘルベチア・キミカ・アクタ、
60巻（1977年）1568ページ］。
Ｂが、当初トリコデルマ・ポリスポールム［Trichoderm
a polysporum,リンク・エクス・ペルソーニア（Link ex
pers.）リファイ（Rifai）］として同定された真菌の
一種（NRRL 8044）の培地から、リュッガー（Ruegger）
らによって単離され［ヘルベチア・キミカ・アクタ（He
lv.Chim.Acta）、59巻（1976年）1075ページ］、サイク
ロスポリンＢ、Ｄ、ＥおよびＧは、トラバー（Traber）
らによって単離された［ヘルベチア・キミカ・アクタ、
60巻（1977年）1568ページ］。
その後、この菌株の分類は改定され、以後トリポクラデ
ィウム・インフラーツム、ガムズ（Tolypocladium infl
atum,Gams）として文献中に記載されることとなった。
ィウム・インフラーツム、ガムズ（Tolypocladium infl
atum,Gams）として文献中に記載されることとなった。
現在、サイクロスポリンＡ乃至Ｚとして列挙される25種
類の異なるサイクロスポリン系抗生物質が知られている
［ヘルベチア・キミカ・アクタ、70巻（1987年）13ペー
ジ］。これらの構成単位の中では、選択的免疫抑制作用
を有するサイクロスポリンＡが、最も重要な物質とされ
ている。
類の異なるサイクロスポリン系抗生物質が知られている
［ヘルベチア・キミカ・アクタ、70巻（1987年）13ペー
ジ］。これらの構成単位の中では、選択的免疫抑制作用
を有するサイクロスポリンＡが、最も重要な物質とされ
ている。
サイクロスポリンＡは、当初は穏やかな抗真菌性抗生物
質として知られるようになり、その強力な免疫抑制作用
は、その後認められたに過ぎない［ボレル（J.F.Bore
l）ら：イミュノロジー（Immunology）、32巻（1977
年）1017ページ］。
質として知られるようになり、その強力な免疫抑制作用
は、その後認められたに過ぎない［ボレル（J.F.Bore
l）ら：イミュノロジー（Immunology）、32巻（1977
年）1017ページ］。
サイクロスポリンＡ、Ｃ、およびＧが非常に特異的な免
疫抑制剤であることは、一連のインビトロおよびインビ
ボの検定試験によって確認されている。
疫抑制剤であることは、一連のインビトロおよびインビ
ボの検定試験によって確認されている。
サイクロスポリンＡは、体液性免疫反応および細胞性免
疫反応の両者を阻害する。その作用機序の研究によれ
ば、これはインターロイキン２の合成とともに、Ｔ細胞
の増殖をも阻害するからである。
疫反応の両者を阻害する。その作用機序の研究によれ
ば、これはインターロイキン２の合成とともに、Ｔ細胞
の増殖をも阻害するからである。
ヒトの臓器移植におけるサイクロスポリンＡの治療的利
用は、1978年に報告された。最初に用いられたのは、腎
臓移植［カルネ（R.J.Calne）ら、ランセット（Lance
t）、1978年度第２号1323ページ］、および骨髄移植
［パウルズ（R.L.Powles）ら、ランセット、1978年度第
２号1327ページ］においてであった。
用は、1978年に報告された。最初に用いられたのは、腎
臓移植［カルネ（R.J.Calne）ら、ランセット（Lance
t）、1978年度第２号1323ページ］、および骨髄移植
［パウルズ（R.L.Powles）ら、ランセット、1978年度第
２号1327ページ］においてであった。
臓器（腎臓、膵臓、肝臓、心臓、肺）および骨髄の移植
に際しては、サイクロスポリンＡの投与によって、その
臓器あるいは骨髄の拒絶反応を抑制することができる。
更に、いくつかの自己免疫疾患（葡萄膜炎、リウマチ様
関節炎、乾癬、および筋無力症）の治療においても、投
与効果を発揮する。
に際しては、サイクロスポリンＡの投与によって、その
臓器あるいは骨髄の拒絶反応を抑制することができる。
更に、いくつかの自己免疫疾患（葡萄膜炎、リウマチ様
関節炎、乾癬、および筋無力症）の治療においても、投
与効果を発揮する。
特許文献においては、以下の微生物が、サイクロスポリ
ン複合体の製造に用いられている。すなわち、シリンド
ロカルポン・ルーシヅム（Cylindro-carpon lucidum Bo
oth）、NRRL 5760（スイス国特許第589,716号明細
書）；トリポクラディウム・インフラーツム、NRRL 804
4（（初期の分類によればトリコデルマ・ポリスポール
ム）（スイス国特許第603,790号明細書）、ビセット（B
isett）（1983年）によれば、トリポクラディウム・イ
ンフラーツム（1971年）は、新組合せトリポクラディウ
ム・ニベウム（ロストラップ（Rostrup））と同じもの
である。）；およびフサリウム・ソラニ（Fusarium sol
ani）、MCI-1549、MCI-1550（特開昭57-63093号明細
書）。
ン複合体の製造に用いられている。すなわち、シリンド
ロカルポン・ルーシヅム（Cylindro-carpon lucidum Bo
oth）、NRRL 5760（スイス国特許第589,716号明細
書）；トリポクラディウム・インフラーツム、NRRL 804
4（（初期の分類によればトリコデルマ・ポリスポール
ム）（スイス国特許第603,790号明細書）、ビセット（B
isett）（1983年）によれば、トリポクラディウム・イ
ンフラーツム（1971年）は、新組合せトリポクラディウ
ム・ニベウム（ロストラップ（Rostrup））と同じもの
である。）；およびフサリウム・ソラニ（Fusarium sol
ani）、MCI-1549、MCI-1550（特開昭57-63093号明細
書）。
発明が解決しようとする課題は、上記公知の微生物を用
いて発酵生産を実施した場合、発酵期間を短縮するこ
と、サイクロスポリン系抗生物質を高水準で生産するこ
と、単離生産量を高くすることができないことである。
いて発酵生産を実施した場合、発酵期間を短縮するこ
と、サイクロスポリン系抗生物質を高水準で生産するこ
と、単離生産量を高くすることができないことである。
上記課題の解決にあたっては、従来の菌株におけるより
も有利な条件で、より高濃度のサイクロスポリン系抗生
物質複合体、あるいはその構成単位を生産する微生物の
菌株の発見に重点が置かれた。
も有利な条件で、より高濃度のサイクロスポリン系抗生
物質複合体、あるいはその構成単位を生産する微生物の
菌株の発見に重点が置かれた。
土壌から単離した多数の糸状菌の菌株をふるい分けるこ
とにより、トリポクラディウム属の一菌株が、サイクロ
スポリン系抗生物質複合体の生合成能を有することが発
見された。発明者らがCY-93と命名したこの微生物は、
分類学的調査からは、従来のサイクロスポリン複合体生
産真菌種のいずれとも同定することができなかった。し
たがって、この新種トリポクラディウム・バリウム（To
lypocladium varium）CY/93株は、種段階で分化したト
リポクラディウム属の新分類群である。
とにより、トリポクラディウム属の一菌株が、サイクロ
スポリン系抗生物質複合体の生合成能を有することが発
見された。発明者らがCY-93と命名したこの微生物は、
分類学的調査からは、従来のサイクロスポリン複合体生
産真菌種のいずれとも同定することができなかった。し
たがって、この新種トリポクラディウム・バリウム（To
lypocladium varium）CY/93株は、種段階で分化したト
リポクラディウム属の新分類群である。
上記課題を解決するための手段である本発明は、公知の
トリポクラディウム種のコロニーが、ブドウ糖、ペプト
ン、及び麦芽エキス−酵母エキスを含む培地に、無色、
或いは黄灰色のコロニーを形成するのに反し、暗濃−灰
黒色コロニーを形成する新種トリポクラディウム・バリ
ウムCY/93に関する。
トリポクラディウム種のコロニーが、ブドウ糖、ペプト
ン、及び麦芽エキス−酵母エキスを含む培地に、無色、
或いは黄灰色のコロニーを形成するのに反し、暗濃−灰
黒色コロニーを形成する新種トリポクラディウム・バリ
ウムCY/93に関する。
本発明の新種トリポクラディウム・バリウムCY/93は、
ハンガリー国ブダペスト市所在のナショナル・コレクシ
ョン・オブ・アグリカルチュラル・アンド・インダスト
リアル・マイクロオーガニスムスに受託番号NCAIM
（Ｐ）F001005の下に寄託されている。
ハンガリー国ブダペスト市所在のナショナル・コレクシ
ョン・オブ・アグリカルチュラル・アンド・インダスト
リアル・マイクロオーガニスムスに受託番号NCAIM
（Ｐ）F001005の下に寄託されている。
更に、上記課題を解決するための手段である本発明は、
サイクロスポリン、或いはサイクロスポリンＡ、サイク
ロスポリンB,及びサイクロスポリンＣからなるサイクロ
スポリン系複合体抗生物質を生合成する糸状菌菌株を、
炭素源、及び窒素源、並びに無機塩類を含む栄養培地で
好気性発酵すること、及び生成物を単離することにより
前記抗生物質を生産する方法であって、サイクロスポリ
ン、或いはサイクロスポリン系複合体抗生物質を生合成
する新種トリポクラディウム・バリウム糸状菌種の一菌
株を、炭素源、有機及び無機窒素源、並びに無機塩類を
含む栄養培地で、25〜30℃の好気条件下で培養するこ
と、そして希望するならば、生産されたサイクロスポリ
ン、或いはサイクロスポリン系複合体抗生物質を単離
し、精製することからなるサイクロスポリン、或いはサ
イクロスポリン系複合体抗生物質を微生物生産する方法
に関する。この方法において、本発明の新種トリポクラ
ディウム・バリウムCY/93を使用すると、発酵期間が短
く、サイクロスポリン系抗生物質の生産量が高水準であ
り、単離生産量も高いという効果を得る。この発明の一
態様において、発酵は、ペプトン、硫酸アンモニウム、
またはトリプトンを窒素源として、そしてブドウ糖、麦
芽糖、或いはソルビトールを炭素源として含有する培地
で行なはれる。発酵させたブロスには、主産物としての
サイクロスポリンＡの他、少量のサイクロスポリンＢ、
およびサイクロスポリンＣも含まれる。
サイクロスポリン、或いはサイクロスポリンＡ、サイク
ロスポリンB,及びサイクロスポリンＣからなるサイクロ
スポリン系複合体抗生物質を生合成する糸状菌菌株を、
炭素源、及び窒素源、並びに無機塩類を含む栄養培地で
好気性発酵すること、及び生成物を単離することにより
前記抗生物質を生産する方法であって、サイクロスポリ
ン、或いはサイクロスポリン系複合体抗生物質を生合成
する新種トリポクラディウム・バリウム糸状菌種の一菌
株を、炭素源、有機及び無機窒素源、並びに無機塩類を
含む栄養培地で、25〜30℃の好気条件下で培養するこ
と、そして希望するならば、生産されたサイクロスポリ
ン、或いはサイクロスポリン系複合体抗生物質を単離
し、精製することからなるサイクロスポリン、或いはサ
イクロスポリン系複合体抗生物質を微生物生産する方法
に関する。この方法において、本発明の新種トリポクラ
ディウム・バリウムCY/93を使用すると、発酵期間が短
く、サイクロスポリン系抗生物質の生産量が高水準であ
り、単離生産量も高いという効果を得る。この発明の一
態様において、発酵は、ペプトン、硫酸アンモニウム、
またはトリプトンを窒素源として、そしてブドウ糖、麦
芽糖、或いはソルビトールを炭素源として含有する培地
で行なはれる。発酵させたブロスには、主産物としての
サイクロスポリンＡの他、少量のサイクロスポリンＢ、
およびサイクロスポリンＣも含まれる。
トリポクラディウム属の種を見分けるための主要な性状
と比較した、真菌のこの新種の分類学的特徴は、次の通
りである。
と比較した、真菌のこの新種の分類学的特徴は、次の通
りである。
トリポクラディウム属は、1971年に、ガムズ（W.Gams）
によって、土壌中の叢生不完全菌目の新しい属として最
初に記載された。その特徴的な性状は、遅い成長速度、
枕状の白いコロニー、短い側枝上に部分的に発生し、大
きく膨大した基部と繊維状のしばしば折れ曲がった頸部
とを有し、一個の単細胞分生子へと続く末端生および側
生の小梗である。
によって、土壌中の叢生不完全菌目の新しい属として最
初に記載された。その特徴的な性状は、遅い成長速度、
枕状の白いコロニー、短い側枝上に部分的に発生し、大
きく膨大した基部と繊維状のしばしば折れ曲がった頸部
とを有し、一個の単細胞分生子へと続く末端生および側
生の小梗である。
この属に属するものとしては、トリポクラディウム・ゲ
オデス（T.geodes）、トリポクラディウム・シリンドロ
スポルム（T.cylindrosporum）、およびトリポクラディ
ウム・インフラーツム（T.inflatum）の３新種がガムズ
によって区分された。
オデス（T.geodes）、トリポクラディウム・シリンドロ
スポルム（T.cylindrosporum）、およびトリポクラディ
ウム・インフラーツム（T.inflatum）の３新種がガムズ
によって区分された。
トリポクラディウム・ゲオデスには、放線菌類特有の土
壌臭があることが知られているが、新種トリポクラディ
ウム・バリウムCY/93株は、これを完全に欠いている。
更に、トリポクラディウム・ゲオデスの担子細胞は、新
種トリポクラディウム・バリウムCY/93株のそれよりも
明らかに細い。トリポクラディウム・シリンドロスポル
ムの分生子は、特徴的に長く、引長された形状である
が、新種トリポクラディウム・バリウムCY/93株のそれ
は、球形であって、僅かに引長されているに過ぎない。
壌臭があることが知られているが、新種トリポクラディ
ウム・バリウムCY/93株は、これを完全に欠いている。
更に、トリポクラディウム・ゲオデスの担子細胞は、新
種トリポクラディウム・バリウムCY/93株のそれよりも
明らかに細い。トリポクラディウム・シリンドロスポル
ムの分生子は、特徴的に長く、引長された形状である
が、新種トリポクラディウム・バリウムCY/93株のそれ
は、球形であって、僅かに引長されているに過ぎない。
トリポクラディウム・インフラーツムの分生子は、特徴
的に卵形をしており、培養された新種トリポクラディウ
ム・バリウムCY/93株において観察されるそれよりも長
い。トリポクラディウム・インフラーツムの小梗は、輪
生個所において直接菌糸体上に、あるいは２〜３μｍの
長さの担子細胞上に形成される。しかし、新種トリポク
ラディウム・バリウムCY/93株においては、そのような
輪生配置形態は見られず、この配置は、常に、まばらに
検出されるに過ぎない。
的に卵形をしており、培養された新種トリポクラディウ
ム・バリウムCY/93株において観察されるそれよりも長
い。トリポクラディウム・インフラーツムの小梗は、輪
生個所において直接菌糸体上に、あるいは２〜３μｍの
長さの担子細胞上に形成される。しかし、新種トリポク
ラディウム・バリウムCY/93株においては、そのような
輪生配置形態は見られず、この配置は、常に、まばらに
検出されるに過ぎない。
主として白い綿状の気生菌糸体によって、既知のトリポ
クラディウムのすべての種のコロニーは白色を呈する
が、コロニーの裏面は黄色を帯びた灰色であるか、無
色、あるいは黄色である。典型的な可溶性色素の形成は
皆無である。この点に関しても、新種トリポクラディウ
ム・バリウムCY/93株を識別することができる。すなわ
ち、麦芽エキスおよび酵母エキスとともに、ブドウ糖お
よびペプトンを含有する培地においては、それぞれ、濃
い暗灰色で、しかも黒色の色素が、一時的な変異性を伴
って形成されるのである。
クラディウムのすべての種のコロニーは白色を呈する
が、コロニーの裏面は黄色を帯びた灰色であるか、無
色、あるいは黄色である。典型的な可溶性色素の形成は
皆無である。この点に関しても、新種トリポクラディウ
ム・バリウムCY/93株を識別することができる。すなわ
ち、麦芽エキスおよび酵母エキスとともに、ブドウ糖お
よびペプトンを含有する培地においては、それぞれ、濃
い暗灰色で、しかも黒色の色素が、一時的な変異性を伴
って形成されるのである。
この新種を、トリポクラディウムの他の既知種と比較す
る分類学的評価は、ガムズの論文［ペルソーニア（Pers
oonia）、６巻（1971）185〜191ページ］；バロン（G.
L.Barron）の論文［カナディアン・ジャーナル・オブ・
ボタニー（Can.J.Bot.）、５巻Ｒ（1980年）439〜442ペ
ージ］、およびビセット（Bisett、J.）の論文［カナデ
ィアン・ジャーナル・オブ・ボタニー、61巻（1983年）
1311〜1329ページ］に基ずいて行なったものである。
る分類学的評価は、ガムズの論文［ペルソーニア（Pers
oonia）、６巻（1971）185〜191ページ］；バロン（G.
L.Barron）の論文［カナディアン・ジャーナル・オブ・
ボタニー（Can.J.Bot.）、５巻Ｒ（1980年）439〜442ペ
ージ］、およびビセット（Bisett、J.）の論文［カナデ
ィアン・ジャーナル・オブ・ボタニー、61巻（1983年）
1311〜1329ページ］に基ずいて行なったものである。
新種トリポクラディウム・バリウムCY/93株の特徴的形
態は、要約すると次の通りである。
態は、要約すると次の通りである。
10日間経過後のコロニーは直径10〜25mmに達し、その表
面は、白色、綿状の、胞子形成の盛んな気生菌糸体で覆
われている。コロニーの裏面は、黄色を帯びた灰色、ま
たは濁った灰色である。複合培地においては暗灰色の可
溶性色素が形成されることがある。気生菌糸において
は、末端および側面の双方の胞子形成が観察される。
面は、白色、綿状の、胞子形成の盛んな気生菌糸体で覆
われている。コロニーの裏面は、黄色を帯びた灰色、ま
たは濁った灰色である。複合培地においては暗灰色の可
溶性色素が形成されることがある。気生菌糸において
は、末端および側面の双方の胞子形成が観察される。
小梗は、ときおり、輪性個所において、直接菌糸上に、
あるいは（２〜３μｍの）短い担子細胞上に密集するこ
となく、まばらに存在する。小梗は、膨大した基部（２
〜4x2〜３μｍ）と、長く、繊維状の頸部（２〜4x0.5〜
0.6μｍ）とから成る。頭頂部の分生子は、小さく（２
〜3x1.3〜2.2μｍ）、通常、球形、かつ滑らかである。
種名を示すバリウム（varium）なる小名は、小梗が変化
に富むことに因んでいる。
あるいは（２〜３μｍの）短い担子細胞上に密集するこ
となく、まばらに存在する。小梗は、膨大した基部（２
〜4x2〜３μｍ）と、長く、繊維状の頸部（２〜4x0.5〜
0.6μｍ）とから成る。頭頂部の分生子は、小さく（２
〜3x1.3〜2.2μｍ）、通常、球形、かつ滑らかである。
種名を示すバリウム（varium）なる小名は、小梗が変化
に富むことに因んでいる。
トリポクラディウム・バリウムは、別のところでも述べ
るが、ハルポスポリウム（Harposporium）と同じ生活環
を示す。
るが、ハルポスポリウム（Harposporium）と同じ生活環
を示す。
CY/93と命名された菌株は、ラフィノースを利用するこ
とができないが、表面培養においては、マンニトール、
イノシトール、庶糖、果糖、ラムノース、ガラクトー
ス、デキストロース、アラビノース、およびキシロース
を炭素源として活発に増殖する。培養に際して、この菌
株は、栄養寒天培地および麦芽エキス培地においてはあ
まり発育が良好ではないが、大豆粥寒天培地、ツァペッ
ク寒天培地、および馬鈴薯デキストロース寒天培地上で
は充分に発育する。オートミール寒天培地およびデキス
トロース・酵母エキス寒天培地は保存に適さない。
とができないが、表面培養においては、マンニトール、
イノシトール、庶糖、果糖、ラムノース、ガラクトー
ス、デキストロース、アラビノース、およびキシロース
を炭素源として活発に増殖する。培養に際して、この菌
株は、栄養寒天培地および麦芽エキス培地においてはあ
まり発育が良好ではないが、大豆粥寒天培地、ツァペッ
ク寒天培地、および馬鈴薯デキストロース寒天培地上で
は充分に発育する。オートミール寒天培地およびデキス
トロース・酵母エキス寒天培地は保存に適さない。
トリポクラディウム・バリウムは、面が三角形でかつ縁
部が若干くぼんでいる分生子を産生するトリポクラディ
ウム・トリゴノスポルムとは、明らかに異なっている。
トリポクラディウム・バリウムはまた、トリポクラディ
ウム・バラノイデスとも異なっている。後者のトリポク
ラディウム・バラノイデスは、壺状の側小梗を形成す
る。
部が若干くぼんでいる分生子を産生するトリポクラディ
ウム・トリゴノスポルムとは、明らかに異なっている。
トリポクラディウム・バリウムはまた、トリポクラディ
ウム・バラノイデスとも異なっている。後者のトリポク
ラディウム・バラノイデスは、壺状の側小梗を形成す
る。
更に、新種トリポクラディウム・バリウムの正基準型菌
株（CY/93）は、トリポクラディウム・インフラーツム
（CBS 714.70）の正統型菌株とは異なるものである。つ
まり、マルトース寒天培地を用いて培養した際、トリポ
クラディウム・インフラーツムの菌株が、多数の白色気
中菌糸体を生ずるのに対して、新種トリポクラディウム
・バリウムCY/93は、そのような気中菌糸体を形成しな
い。
株（CY/93）は、トリポクラディウム・インフラーツム
（CBS 714.70）の正統型菌株とは異なるものである。つ
まり、マルトース寒天培地を用いて培養した際、トリポ
クラディウム・インフラーツムの菌株が、多数の白色気
中菌糸体を生ずるのに対して、新種トリポクラディウム
・バリウムCY/93は、そのような気中菌糸体を形成しな
い。
トリポクラディウム・インフラーツムの菌株は、鉄−ペ
プトン寒天倍地で菌糸基体中に赤褐色の内色素を生成さ
せるが、新種トリポクラディウム・バリウムCY/93の菌
糸体は、淡黄色のままである。
プトン寒天倍地で菌糸基体中に赤褐色の内色素を生成さ
せるが、新種トリポクラディウム・バリウムCY/93の菌
糸体は、淡黄色のままである。
新種トリポクラディウム・バリウムCY/93の菌株は、ア
ラビノースを利用しないが、トリポクラディウム・イン
フラーツムは利用する。亜硝酸ナトリウムを利用した場
合、トリポクラディウム・インフラーツム菌株は、多く
の菌糸体を発生するのに対して、新種トリポクラディウ
ム・バリウムCY/93は、殆んど成長しない。
ラビノースを利用しないが、トリポクラディウム・イン
フラーツムは利用する。亜硝酸ナトリウムを利用した場
合、トリポクラディウム・インフラーツム菌株は、多く
の菌糸体を発生するのに対して、新種トリポクラディウ
ム・バリウムCY/93は、殆んど成長しない。
新種トリポクラディウム・バリウムCY/93を、他のトリ
ポクラディウムの正統型菌株、トリコデルマ・ポリスポ
ルムATCC16,641、およびシリンドロカルポン・ルーシヅ
ムNRRL5760と比較したものを、表Ｉに示す。
ポクラディウムの正統型菌株、トリコデルマ・ポリスポ
ルムATCC16,641、およびシリンドロカルポン・ルーシヅ
ムNRRL5760と比較したものを、表Ｉに示す。
上記の知見に基ずき、本発明は、無機塩類とともに利用
可能な炭素源および窒素源を含有する栄養培地中で、サ
イクロスポリン系抗生物質複合体、またはその構成単位
である、サイクロスポリンＡ、サイクロスポリンＢ、お
よびサイクロスポリンＣの生合成を行なう糸状菌の菌株
の好気発酵、および、生成産物の単離による上記抗生物
質の製造方法に関係することとなる。
可能な炭素源および窒素源を含有する栄養培地中で、サ
イクロスポリン系抗生物質複合体、またはその構成単位
である、サイクロスポリンＡ、サイクロスポリンＢ、お
よびサイクロスポリンＣの生合成を行なう糸状菌の菌株
の好気発酵、および、生成産物の単離による上記抗生物
質の製造方法に関係することとなる。
その方法とは、ハンガリー国ブダペスト市所在のナショ
ナル・コレクション・オブ・アグリカルチュラル・アン
ド・インダストリアル・マイクロオーガニスムスに受託
番号NCAIM（Ｐ）F001005の下に寄託された新種トリポク
ラディウム・バリウムCY/93株であることが好ましい、
サイクロスポリン系抗生物質複合体を生産するトリポク
ラディウム・バリウムなる新真菌種の一菌株を、無機塩
類とともに炭素源、および有機および無機窒素源を含有
する栄養培地において、25〜30℃の温度範囲の好気的条
件のもとで培養する段階と、所望の場合における生成サ
イクロスポリン系抗生物質複合体またはその構成単位の
単離および精製段階とから成る。
ナル・コレクション・オブ・アグリカルチュラル・アン
ド・インダストリアル・マイクロオーガニスムスに受託
番号NCAIM（Ｐ）F001005の下に寄託された新種トリポク
ラディウム・バリウムCY/93株であることが好ましい、
サイクロスポリン系抗生物質複合体を生産するトリポク
ラディウム・バリウムなる新真菌種の一菌株を、無機塩
類とともに炭素源、および有機および無機窒素源を含有
する栄養培地において、25〜30℃の温度範囲の好気的条
件のもとで培養する段階と、所望の場合における生成サ
イクロスポリン系抗生物質複合体またはその構成単位の
単離および精製段階とから成る。
本発明の好適実施例によれば、サイクロスポリン系抗生
物質複合体は、新規である新種トリポクラディウム・バ
リウムCY/93株を用いて生産される。選択された菌株
は、増殖が速やかであることによる非常な利点がある。
物質複合体は、新規である新種トリポクラディウム・バ
リウムCY/93株を用いて生産される。選択された菌株
は、増殖が速やかであることによる非常な利点がある。
この菌株が、炭素源として、庶糖、ブドウ糖、ソルボー
ス、麦芽糖、果糖、澱粉、グリセロール、あるいは油脂
を、また、トウモロコシ浸出液、ペプトン、酵母エキ
ス、肉エキス、硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム、硫
酸アンモニウム、あるいは各種アミノ酸のような多様な
有機および無機窒素源を利用できることは、好都合な特
徴である。上記の炭素および窒素源に加え、サイクロス
ポリン系抗生物質複合体の生産に用いられる栄養培地に
は、無機塩類（塩化カリウム、硫酸マグネシウム、ある
いは燐酸二水素カリウム）、微量元素（銅、マグネシウ
ム、鉄塩）、更にビタミン、および消泡剤を加えること
ができる。
ス、麦芽糖、果糖、澱粉、グリセロール、あるいは油脂
を、また、トウモロコシ浸出液、ペプトン、酵母エキ
ス、肉エキス、硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム、硫
酸アンモニウム、あるいは各種アミノ酸のような多様な
有機および無機窒素源を利用できることは、好都合な特
徴である。上記の炭素および窒素源に加え、サイクロス
ポリン系抗生物質複合体の生産に用いられる栄養培地に
は、無機塩類（塩化カリウム、硫酸マグネシウム、ある
いは燐酸二水素カリウム）、微量元素（銅、マグネシウ
ム、鉄塩）、更にビタミン、および消泡剤を加えること
ができる。
本発明の好適な方法によれば、新種トリポクラディウム
・バリウムCY/93株の寒天斜面培養によって調製した分
生子と、菌糸体の懸濁液を用いて液体培地に接種が行な
われる。３日間の培養後に得られた前培地を用いて、抗
生物質生産用の培養液に接種を行ない、その後、これを
25〜30℃、好ましくは25℃の温度で５〜７日間温置す
る。発酵の間、pHは6.0〜2.5の範囲、好ましくはpH5.2
に保つ。発酵は、活発な攪拌（750〜1000rpm）および毎
時300リットルの通気による好気的条件下で行なわれ
る。
・バリウムCY/93株の寒天斜面培養によって調製した分
生子と、菌糸体の懸濁液を用いて液体培地に接種が行な
われる。３日間の培養後に得られた前培地を用いて、抗
生物質生産用の培養液に接種を行ない、その後、これを
25〜30℃、好ましくは25℃の温度で５〜７日間温置す
る。発酵の間、pHは6.0〜2.5の範囲、好ましくはpH5.2
に保つ。発酵は、活発な攪拌（750〜1000rpm）および毎
時300リットルの通気による好気的条件下で行なわれ
る。
発酵中は、微生物学的検定法、および高圧液体クロマト
グラフィー（HPLC）を用いてブロス中のサイクロスポリ
ン含量を監視する。抗生物質の最大生産量達成後は、直
ちに公知の抽出または吸着方法を用いて、培養液からこ
れらの抗生物質を回収する。
グラフィー（HPLC）を用いてブロス中のサイクロスポリ
ン含量を監視する。抗生物質の最大生産量達成後は、直
ちに公知の抽出または吸着方法を用いて、培養液からこ
れらの抗生物質を回収する。
ブロス中のサイクロスポリン濃度は、プレート拡散試験
を用い、サイクロスポリンの抗真菌活性を目安として測
定する。試験用生物としては、クロカビ（Aspergillus
nigar）、アスペルギルス・ジャポニクス（Aspergillus
Japonicus）、およびクルブラリア・ルナータ（Curvul
aria lunata）を用いるのが有利である［ドレイフス
（M.Dreyfuss）ら、ユーロピアン・ジャーナル・オブ・
アプライド・マイクロバイオロジー（European J.Appl.
Microbiol.）、３巻（1976年）125〜133ページ］。
を用い、サイクロスポリンの抗真菌活性を目安として測
定する。試験用生物としては、クロカビ（Aspergillus
nigar）、アスペルギルス・ジャポニクス（Aspergillus
Japonicus）、およびクルブラリア・ルナータ（Curvul
aria lunata）を用いるのが有利である［ドレイフス
（M.Dreyfuss）ら、ユーロピアン・ジャーナル・オブ・
アプライド・マイクロバイオロジー（European J.Appl.
Microbiol.）、３巻（1976年）125〜133ページ］。
ブロス中のサイクロスポリン濃度のHPLC分析は、クロイ
ツィッヒ（F.Kreuzig）に従って、メタノールで10倍に
希釈したブロス試料に対して行なう［ジャーナル・オブ
・クロマトグラフィー（J.Chromat.）、290巻（1984
年）181ページ］。
ツィッヒ（F.Kreuzig）に従って、メタノールで10倍に
希釈したブロス試料に対して行なう［ジャーナル・オブ
・クロマトグラフィー（J.Chromat.）、290巻（1984
年）181ページ］。
発明者らの実験によれば、新種トリポクラディウム・バ
リウムCY/93株によって、主産物としてサイクロスポリ
ンＡ、および少量構成単位としてサイクロスポリンＢお
よびサイクロスポリンＣを含有するサイクロスポリン系
抗生物質複合体は高い歩留まりで（950μg/ml）生産さ
れる。
リウムCY/93株によって、主産物としてサイクロスポリ
ンＡ、および少量構成単位としてサイクロスポリンＢお
よびサイクロスポリンＣを含有するサイクロスポリン系
抗生物質複合体は高い歩留まりで（950μg/ml）生産さ
れる。
発酵ブロスからのサイクロスポリン複合体の単離につい
ては、抽出法を用いて有利に行うことができる。抽出の
前に、濾過または遠心分離のいずれかを用いて菌糸体を
分離する。微生物の細胞からは、メタノールであること
が好ましい低級アルコール、あるいは、アセトンである
ことが好ましい有機ケトン体を用いて、発酵中に生産さ
れた抗生物質を洗い出すのが有利である。一方、ブロス
濾液中のサイクロスポリンは、酢酸エチル、ｎ−酢酸ブ
チル、ジクロルメタン、1,2−ジクロルエタン、あるい
はクロロホルムのような水に混和されない有機溶媒、好
ましくはｎ−酢酸ブチルを用いて抽出することができ
る。抽出によって得られた粗生成物には、真菌によって
生成された赤色あるいは紫色の色素が混入しているが、
これは、活性炭またはシリカゲルに吸着させて除去する
ことができる。
ては、抽出法を用いて有利に行うことができる。抽出の
前に、濾過または遠心分離のいずれかを用いて菌糸体を
分離する。微生物の細胞からは、メタノールであること
が好ましい低級アルコール、あるいは、アセトンである
ことが好ましい有機ケトン体を用いて、発酵中に生産さ
れた抗生物質を洗い出すのが有利である。一方、ブロス
濾液中のサイクロスポリンは、酢酸エチル、ｎ−酢酸ブ
チル、ジクロルメタン、1,2−ジクロルエタン、あるい
はクロロホルムのような水に混和されない有機溶媒、好
ましくはｎ−酢酸ブチルを用いて抽出することができ
る。抽出によって得られた粗生成物には、真菌によって
生成された赤色あるいは紫色の色素が混入しているが、
これは、活性炭またはシリカゲルに吸着させて除去する
ことができる。
混入した恐れのある脂質（すなわち消泡剤）は、石油エ
ーテル、および10％の水を含むメタノールの系を用いた
分配により、不純物を石油エーテル相に移動させ、分離
することができる。
ーテル、および10％の水を含むメタノールの系を用いた
分配により、不純物を石油エーテル相に移動させ、分離
することができる。
メタノール水溶相を、減圧下で濃縮し、次いでジクロメ
タンを用いて抽出し、これを蒸発させて、精製サイクロ
スポリンが得られる。サイクロスポリンＡは、カラムク
ロマトグラフィーおよび再結晶法を用いて、他の少量サ
イクロスポリン構成単位から分離することができる。
タンを用いて抽出し、これを蒸発させて、精製サイクロ
スポリンが得られる。サイクロスポリンＡは、カラムク
ロマトグラフィーおよび再結晶法を用いて、他の少量サ
イクロスポリン構成単位から分離することができる。
単離された生成物の構造は、紫外線、赤外線、1H核磁気
共鳴、および13C核磁気共鳴を利用した分光分析法、質
量分光分析法、およびアミノ酸分析法を用いて解明され
る。
共鳴、および13C核磁気共鳴を利用した分光分析法、質
量分光分析法、およびアミノ酸分析法を用いて解明され
る。
以下、実施例を用いて本発明を説明するが、これらは、
本発明の対象範囲を限定するものではない。
本発明の対象範囲を限定するものではない。
実施例１ 麦芽エキスと酵母エキスを用いた新種トリポクラディウ
ム・バリウムCY/93株の寒天斜面培養から、分生子及び
菌糸体の0.9％塩化ナトリウム懸濁液5mlを調製する。こ
の懸濁液1mlを用いて、500ml入りエーレンマイヤーフラ
スコ中の滅菌IC移植片培養液100mlに播種を行なう。
ム・バリウムCY/93株の寒天斜面培養から、分生子及び
菌糸体の0.9％塩化ナトリウム懸濁液5mlを調製する。こ
の懸濁液1mlを用いて、500ml入りエーレンマイヤーフラ
スコ中の滅菌IC移植片培養液100mlに播種を行なう。
IC培養液の組成 タップウォーター1000ml中に ブドウ糖 40g カゼイン・ペプトン 5g 硝酸ナトリウム 3g 燐酸二水素カリウム 2g 塩化カリウム 0.5g 硫酸マグネシウム（結晶水７分子含有） 0.5g 硫酸鉄（II）（結晶水７分子含有） 0.01g 栄養培地のpHは、滅菌前にpH5.2に調整し、混合液を121
℃にて25分間滅菌する。培地を回転振盪器（340rpm）に
おいて、25℃で温置し、次いで、各々FC1滅菌培養液100
mlの入った500ml入りエーレンマイヤーフラスコ15本
に、この移植片培養液各5mlを加えて播種を行なう。
℃にて25分間滅菌する。培地を回転振盪器（340rpm）に
おいて、25℃で温置し、次いで、各々FC1滅菌培養液100
mlの入った500ml入りエーレンマイヤーフラスコ15本
に、この移植片培養液各5mlを加えて播種を行なう。
FC1培養液の組成 タップウォーター1000ml中に ブドウ糖 80g トリプトン 40g 尿素 2g 硫酸アンモニウム 12g 硝酸ナトリウム 3g 燐酸二水素カリウム 2g 塩化カリウム 0.5g 硫酸マグネシウム（結晶水７分子含有） 0.5g 硫酸鉄（II）（結晶水７分子含有） 0.01g 栄養培地のpHは、滅菌前にpH5.2に調整し、混合液を121
℃にて25分間滅菌する。
℃にて25分間滅菌する。
フラスコは、回転振盪器（340rpm）において、25℃で温
置する。ブロスにおける抗生物質濃度の監視は、プレー
ト拡散試験を用いて行なう。試験用生物としては、クロ
カビ（Aspergillus nigar）を使用する。ブロス中のサ
イクロスポリン系抗生物質複合体の濃度は、サイクロス
ポリンＡを標準物質として用いて検定する。
置する。ブロスにおける抗生物質濃度の監視は、プレー
ト拡散試験を用いて行なう。試験用生物としては、クロ
カビ（Aspergillus nigar）を使用する。ブロス中のサ
イクロスポリン系抗生物質複合体の濃度は、サイクロス
ポリンＡを標準物質として用いて検定する。
発酵を168時間継続させると、ブロス中には、1mlあたり
400μｇのサイクロスポリン系抗生物質複合体が含まれ
るようになる。サイクロスポリン複合体を単離する方法
は、次のとおりである。
400μｇのサイクロスポリン系抗生物質複合体が含まれ
るようになる。サイクロスポリン複合体を単離する方法
は、次のとおりである。
ブロス１リットルから細胞を瀘し取り、メタノール200m
lを２回用いて、抗生物質を洗い落とす。メタノール水
溶液を減圧下で濃縮し、次いで、この濃縮水溶液から、
ｎ−酢酸ブチル50mlを２回用いて、抗生物質複合体を抽
出する。ブロス瀘液中のサイクロスポリン含有物は、ｎ
−酢酸ブチル200mlを用いて抽出する。ｎ−酢酸ブチル
の抽出液を加え併せ、無水硫酸ナトリウムを用いて完全
に脱水し、次いで、40℃の減圧下で蒸発させる。
lを２回用いて、抗生物質を洗い落とす。メタノール水
溶液を減圧下で濃縮し、次いで、この濃縮水溶液から、
ｎ−酢酸ブチル50mlを２回用いて、抗生物質複合体を抽
出する。ブロス瀘液中のサイクロスポリン含有物は、ｎ
−酢酸ブチル200mlを用いて抽出する。ｎ−酢酸ブチル
の抽出液を加え併せ、無水硫酸ナトリウムを用いて完全
に脱水し、次いで、40℃の減圧下で蒸発させる。
得られた粗生成物3.7gをメタノール10mlに溶かし、メタ
ノールを用いて作成されたセファデックス（Sephadex）
LH-20番ゲルカラム（カラム長40cm、カラム径2.5cm）の
頂部に注ぐ。その結果、不純脂質は、メタノールへの溶
出によって分離される。
ノールを用いて作成されたセファデックス（Sephadex）
LH-20番ゲルカラム（カラム長40cm、カラム径2.5cm）の
頂部に注ぐ。その結果、不純脂質は、メタノールへの溶
出によって分離される。
サイクロスポリン複合体を含有する分画は、40℃にて減
圧下で蒸発させる。得られたサイクロスポリン複合体
（1.05g）からの各構成単位の分離は、キーゼルゲル（K
ieselgel）40番［レアナル（Reanal）社、ブダペスト］
20gを用いたシリカゲルカラムによるクロマトグラフィ
ーを用い、メタノール容積を漸増させつつカラムを通し
たクロロホルム／メタノール混合液中に溶出させること
によって行なわれる。すなわち、溶出は、クロロホルム
100mlを用いて開始し、100mlごとにメタノール含量を0.
5容量％ずつ増加させたクロロホルム／メタノール混合
液を100mlずつ用いて、これを続けるのである。
圧下で蒸発させる。得られたサイクロスポリン複合体
（1.05g）からの各構成単位の分離は、キーゼルゲル（K
ieselgel）40番［レアナル（Reanal）社、ブダペスト］
20gを用いたシリカゲルカラムによるクロマトグラフィ
ーを用い、メタノール容積を漸増させつつカラムを通し
たクロロホルム／メタノール混合液中に溶出させること
によって行なわれる。すなわち、溶出は、クロロホルム
100mlを用いて開始し、100mlごとにメタノール含量を0.
5容量％ずつ増加させたクロロホルム／メタノール混合
液を100mlずつ用いて、これを続けるのである。
分画中のサイクロスポリン含量の監視は、薄層クロマト
グラフィー［プレート：F254キーゼルゲル60番、DCアル
ホイル（Alufoil）（メルク（Merck）社）、展開液：酢
酸エチル／イソプロパノール95:5混合液、検出試薬：沃
素蒸気］を用いて行なう。
グラフィー［プレート：F254キーゼルゲル60番、DCアル
ホイル（Alufoil）（メルク（Merck）社）、展開液：酢
酸エチル／イソプロパノール95:5混合液、検出試薬：沃
素蒸気］を用いて行なう。
サイクロスポリンＡ、Ｂ、およびＣは、メタノール含量
がそれぞれ2.0、2.5、および3.0容量％のクロロホルム
／メタノール混合液によって溶出する。純粋な構成単位
を含有する分画を減圧下で蒸発させ、サイクロスポリン
Ａ［融点:137〜140℃、［α］D：−189℃（メタノー
ル）］225mg、サイクロスポリンＢ（融点149〜151℃）2
5mg、および、サイクロスポリンＣ（融点:150〜152℃）
52mgが得られる。
がそれぞれ2.0、2.5、および3.0容量％のクロロホルム
／メタノール混合液によって溶出する。純粋な構成単位
を含有する分画を減圧下で蒸発させ、サイクロスポリン
Ａ［融点:137〜140℃、［α］D：−189℃（メタノー
ル）］225mg、サイクロスポリンＢ（融点149〜151℃）2
5mg、および、サイクロスポリンＣ（融点:150〜152℃）
52mgが得られる。
実施例２ 10リットル入り研究室用発酵器内で121℃にて45分間滅
菌を施したIC移植片培養液５リットルに、実施例１に記
載の方法で調製した振盪培養による移植片培地200mlを
用いて播種を行い、次いで、750rpmで攪拌し、かつ、毎
時300リットルの通気を行ないつつ、25℃にて温置す
る。
菌を施したIC移植片培養液５リットルに、実施例１に記
載の方法で調製した振盪培養による移植片培地200mlを
用いて播種を行い、次いで、750rpmで攪拌し、かつ、毎
時300リットルの通気を行ないつつ、25℃にて温置す
る。
発酵は72時間継続させ、次いで、10リットル入りの研究
室用発酵器内で、121℃にて45分間滅菌されたFC2培養液
５リットルに、この移植片培養液500mlを用いて播種を
行なう。
室用発酵器内で、121℃にて45分間滅菌されたFC2培養液
５リットルに、この移植片培養液500mlを用いて播種を
行なう。
FC2培養液の組成 タップウォーター1000ml中に ブドウ糖 80g トリプトン 40g 尿素 2g 硫酸アンモニウム 12g 硝酸ナトリウム 3g 燐酸二水素カリウム 2g 塩化カリウム 0.5g 硫酸マグネシウム（結晶水７分子含有） 0.5g 硫酸銅（II）（結晶水５分子含有） 0.01g 硫酸マンガン（II）（結晶水７分子含有） 0.01g 硫酸鉄（II）（結晶水７分子含有） 0.01g 培養液のpHは、滅菌前にpH5.2に調整する。播種を行っ
た培地を750rpmにて攪拌し、かつ、毎時300リットルの
通気を行いつつ、25℃にて温置する。
た培地を750rpmにて攪拌し、かつ、毎時300リットルの
通気を行いつつ、25℃にて温置する。
上記の条件下で発酵を144時間継続して、サイクロスポ
リンの最大力価を達成し、次いで、ブロスからの回収を
行なう。
リンの最大力価を達成し、次いで、ブロスからの回収を
行なう。
サイクロスポリンＡは、1mlあたりサイクロスポリン複
合体500μｇが含まれる発酵ブロス4.5リットルから単離
されるが、その方法は次のとおりである。
合体500μｇが含まれる発酵ブロス4.5リットルから単離
されるが、その方法は次のとおりである。
微生物細胞は遠心分離を施し、メタノール１リットルを
用いた細胞からのサイクロスポリン複合体の洗い落とし
を２回行なう。メタノール水溶液を減圧下で濃縮し、次
いでｎ−酢酸ブチル250mlを用いた抽出を２回行なっ
て、濃縮水溶液から抗生物質複合体を抽出する。発酵ブ
ロスの瀘液からのサイクロスポリン複合体の抽出は、ｎ
−酢酸ブチル500mlを２回用いて行なう。ｎ−酢酸ブチ
ルによる抽出液をすべて加え併せ、無水硫酸ナトリウム
を用いて完全に脱水し、次いで、溶液を40℃にて減圧下
で蒸発させる。得られた粗生成物（19.2g）の予備的精
製は、展開用溶媒としてクロロホルム／メタノール／ア
セトン（92:4:4）混合液を用い、キーゼルゲル60番（粒
子径0.063〜0.2mm）100gを用いて作成したカラムによる
クロマトグラフィーによって行なう。
用いた細胞からのサイクロスポリン複合体の洗い落とし
を２回行なう。メタノール水溶液を減圧下で濃縮し、次
いでｎ−酢酸ブチル250mlを用いた抽出を２回行なっ
て、濃縮水溶液から抗生物質複合体を抽出する。発酵ブ
ロスの瀘液からのサイクロスポリン複合体の抽出は、ｎ
−酢酸ブチル500mlを２回用いて行なう。ｎ−酢酸ブチ
ルによる抽出液をすべて加え併せ、無水硫酸ナトリウム
を用いて完全に脱水し、次いで、溶液を40℃にて減圧下
で蒸発させる。得られた粗生成物（19.2g）の予備的精
製は、展開用溶媒としてクロロホルム／メタノール／ア
セトン（92:4:4）混合液を用い、キーゼルゲル60番（粒
子径0.063〜0.2mm）100gを用いて作成したカラムによる
クロマトグラフィーによって行なう。
薄層クロマトグラフィー分析［プレート：F254キーゼル
ゲル60番、DCアルホイル（メルク社）；展開用溶媒：ヘ
キサン／アセトン／（2:1）混合液；検出試薬：塩素／
トリジン試薬］によって得られたサイクロスポリン複合
体含有分画を蒸発、乾燥させる。蒸発残渣（5.28g）に
カラムクロマトグラフィーを施して、サイクロスポリン
Ａを得る。カラムは、キーゼルゲル60番（粒子径0.063
〜0.2mm）115gを用いて作成し、アセトンの容積を漸増
させつつヘキサン／アセトン混合液をカラムに通して溶
出を行なう。サイクロスポリンＡは、23容量％のアセト
ンを含む混合液によってカラムから溶出する。サイクロ
スポリンＡ含有の分画の蒸発により、サイクロスポリン
A1.46gが得られる。
ゲル60番、DCアルホイル（メルク社）；展開用溶媒：ヘ
キサン／アセトン／（2:1）混合液；検出試薬：塩素／
トリジン試薬］によって得られたサイクロスポリン複合
体含有分画を蒸発、乾燥させる。蒸発残渣（5.28g）に
カラムクロマトグラフィーを施して、サイクロスポリン
Ａを得る。カラムは、キーゼルゲル60番（粒子径0.063
〜0.2mm）115gを用いて作成し、アセトンの容積を漸増
させつつヘキサン／アセトン混合液をカラムに通して溶
出を行なう。サイクロスポリンＡは、23容量％のアセト
ンを含む混合液によってカラムから溶出する。サイクロ
スポリンＡ含有の分画の蒸発により、サイクロスポリン
A1.46gが得られる。
実施例３ 新種トリポクラディウム・バリウムCY/93株の、麦芽糖
エキスと酵母エキスを用いた寒天斜面培養から、分生子
及び菌糸体の0.9％塩化ナトリウム懸濁液5mlを調製し
て、実施例１に記載され、３リットル入りエーレンマイ
ヤーフラスコ内で滅菌したIC移植片培養液800mlへの播
種に用いる。フラスコは、回転振盪器（340rpm）におい
て25℃にて2.5日間温置し、次いで、10リットル入り研
究室用発酵器内で、121℃にて45分間滅菌を施したFC3培
養液５リットルに播種する。
エキスと酵母エキスを用いた寒天斜面培養から、分生子
及び菌糸体の0.9％塩化ナトリウム懸濁液5mlを調製し
て、実施例１に記載され、３リットル入りエーレンマイ
ヤーフラスコ内で滅菌したIC移植片培養液800mlへの播
種に用いる。フラスコは、回転振盪器（340rpm）におい
て25℃にて2.5日間温置し、次いで、10リットル入り研
究室用発酵器内で、121℃にて45分間滅菌を施したFC3培
養液５リットルに播種する。
FC3培養液の組成 タップウォーター1000ml中に ソルボース 60g トリプトン 40g 尿素 2g 硫酸アンモニウム 12g 硝酸ナトリウム 3g 燐酸二水素カリウム 2g 塩化カリウム 0.5g 硫酸マグネシウム（結晶水７分子含有） 0.5g 硫酸マンガン（II）（結晶水７分子含有） 0.01g 硫酸鉄（II）（結晶水７分子含有） 0.01g 培養液のpHは、滅菌前にpH5.2に調整する。播種を行っ
た培地は、1000rpmで攪拌し、かつ、毎時300リットルの
通気を施しつつ、25℃にて温置する。
た培地は、1000rpmで攪拌し、かつ、毎時300リットルの
通気を施しつつ、25℃にて温置する。
発酵は168時間継続し、発酵ブロスには、微生物学的検
定によれば1mlあたり60μｇのサイクロスポリン複合体
が含まれるようになる。
定によれば1mlあたり60μｇのサイクロスポリン複合体
が含まれるようになる。
実施例２に記載の単離方法を用いて、ブロス１リットル
からサイクロスポリンA310mgが得られる。
からサイクロスポリンA310mgが得られる。
実施例４ 新種トリポクラディウム・バリウムCY/93株（NCAIM
（Ｐ）F001005）の、麦芽糖エキスと酵母エキスを用い
た５〜７日経過後の寒天斜面培養から、分生子及び菌糸
体の0.9％塩化ナトリウム懸濁液5mlを調製し、実施例１
に記載の、３リットル入りエーレンマイヤーフラスコ中
で滅菌したIC移植片培養液500mlへの播種に用いる。フ
ラスコは、回転振盪器（340rpm）において25℃にて３日
間温置し、次いで、10リットル入り研究室用発酵器中
で、121℃にて45分間滅菌を施したFC4培養液５リットル
にこれを用いて播種する。
（Ｐ）F001005）の、麦芽糖エキスと酵母エキスを用い
た５〜７日経過後の寒天斜面培養から、分生子及び菌糸
体の0.9％塩化ナトリウム懸濁液5mlを調製し、実施例１
に記載の、３リットル入りエーレンマイヤーフラスコ中
で滅菌したIC移植片培養液500mlへの播種に用いる。フ
ラスコは、回転振盪器（340rpm）において25℃にて３日
間温置し、次いで、10リットル入り研究室用発酵器中
で、121℃にて45分間滅菌を施したFC4培養液５リットル
にこれを用いて播種する。
FC4培養液の組成 タップウォーター1000ml中に 麦芽糖 80g トリプトン 40g 尿素 2g 硫酸アンモニウム 12g 硝酸ナトリウム 3g 燐酸二水素カリウム 2g 塩化カリウム 0.5g 硫酸マグネシウム（結晶水７分子含有） 0.5g 硫酸マンガン（II）（結晶水７分子含有） 0.01g 硫酸銅（II）（結晶水５分子含有） 0.01g 硫酸鉄（II）（結晶水７分子含有） 0.01g 培養液のpHは、滅菌前にpH5.2rpmに調整する。播種後、
発酵ブロスを、1000rpmで攪拌し、かつ、毎時300リット
ルの通気を施しつつ、25℃にて温置する。
発酵ブロスを、1000rpmで攪拌し、かつ、毎時300リット
ルの通気を施しつつ、25℃にて温置する。
発酵は144時間継続し、発酵ブロスには、微生物学的検
定によれば1mlあたり620μｇのサイクロスポリン複合体
が含まれるようになる。
定によれば1mlあたり620μｇのサイクロスポリン複合体
が含まれるようになる。
実施例１に記載の方法を用いて単離を行なう。このよう
にして、ブロス１リットルからサイクロスポリンA305mg
が得られる。
にして、ブロス１リットルからサイクロスポリンA305mg
が得られる。
実施例５ 新種トリポクラディウム・バリウムCY/93株（NCAIM
（Ｐ）F001005）の、麦芽糖エキスと酵母エキスを用い
た５〜７日経過後の寒天斜面培養から、分生子及び菌糸
体の0.9％塩化ナトリウム懸濁液5mlを調製し、実施例１
に記載の、３リットル入りエーレンマイヤーフラスコ中
で滅菌したIC移植片培養液500mlへの播種に用いる。
（Ｐ）F001005）の、麦芽糖エキスと酵母エキスを用い
た５〜７日経過後の寒天斜面培養から、分生子及び菌糸
体の0.9％塩化ナトリウム懸濁液5mlを調製し、実施例１
に記載の、３リットル入りエーレンマイヤーフラスコ中
で滅菌したIC移植片培養液500mlへの播種に用いる。
フラスコは、回転振盪器（340rpm）において25℃にて２
日間温置し、次いで、10リットル入り研究室用発酵器の
中で、121℃にて45分間滅菌を施したFC1培養液５リット
ルにこれを用いて播種する。播種後、発酵ブロスは、75
0rpmで攪拌し、かつ、毎時300リットルの通気を行ない
ながら、25℃にて温置する。96時間培養した後に、麦芽
糖100gを溶かした滅菌水溶液を加え、培養を144時間ま
で継続すると、このブロスには、微生物学的検定によれ
ば、1mlあたり950μｇのサイクロスポリン複合体が含ま
れるようになる。全部で4.8リットルのブロスが回収に
用いられる。実施例２に記載の方法を用いて単離を行な
うと、サイクロスポリンA2.75gが得られる。
日間温置し、次いで、10リットル入り研究室用発酵器の
中で、121℃にて45分間滅菌を施したFC1培養液５リット
ルにこれを用いて播種する。播種後、発酵ブロスは、75
0rpmで攪拌し、かつ、毎時300リットルの通気を行ない
ながら、25℃にて温置する。96時間培養した後に、麦芽
糖100gを溶かした滅菌水溶液を加え、培養を144時間ま
で継続すると、このブロスには、微生物学的検定によれ
ば、1mlあたり950μｇのサイクロスポリン複合体が含ま
れるようになる。全部で4.8リットルのブロスが回収に
用いられる。実施例２に記載の方法を用いて単離を行な
うと、サイクロスポリンA2.75gが得られる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｐ 21/04 Ｃ１２Ｒ 1:645） (72)発明者 イシュトヴァーン ミハーイ サーボ ハンガリー国 1027 ブダペスト サース カー ウッツァ ２ (72)発明者 アゴタ ヒュルベル ネーエ ドボシュ ハンガリー国 1098 ブダペスト ベルゼ ーニ ウッツァ ４／イイ (72)発明者 アッティラ アーンドル ハンガリー国 1221 ブダペスト ペレシ ュ ウッツァ ４ (72)発明者 カーロイ アルブレヒト ハンガリー国 1145 ブダペスト メクシ コイ ウッツァ 44 (72)発明者 カールマン ケンツェル ハンガリー国 1134 ブダペスト ドゥニ ョヴ ウッツァ 16 (72)発明者 ワレリア セル ハンガリー国 1147 ブダペスト バラジ ュ ウッツァ 24／ベー (72)発明者 エーヴァ トモーリ ネーエ ヨスト ハンガリー国 1043 ブダペスト ベルダ イェー ウッツァ 44 (72)発明者 イムレ モラヴチク ハンガリー国 1095 ブダペスト メシュ テル ウッツァ 38 (72)発明者 カールマン ポイヤ ハンガリー国 デブレツェン ペチィ ウ ッツァ ９ (72)発明者 ヤーノシュ エルディ ハンガリー国 デブレツェン アンダハジ ウッツァ ８ (72)発明者 ラヨシュ キッシュ ハンガリー国 デブレツェン ミチューリ ン ウッツァ 171 (72)発明者 カーロイ ナジ ハンガリー国 デブレツェン ベトレン ウッツァ 48 (72)発明者 ベラ パロタシュ ハンガリー国 デブレツェン ドーザ ヂ ィ ウッツァ 17 (72)発明者 エテルカ デリ ネーエ コンスキー ハンガリー国 デブレツェン エリコー ウッツァ ８ (72)発明者 カーロイ ブザシ ハンガリー国 デブレツェン キシュヘゲ ッシ ウッツァ 46 (72)発明者 アニコー モルナール ネーエ アンタル ハンガリー国 デブレツェン イルエシュ ヂィ ウッツァ 20 (72)発明者 ジェルジ サンタ ハンガリー国 デブレツェン イシュトヴ ァーン ウッツァ 61 (72)発明者 ヴィルマ サースヘジェシィ ハンガリー国 デブレツェン ハトヴァー ニ イ ウッツァ 28
Claims (5)
- 【請求項１】公知のトリポクラディウム種のコロニー
が、ブドウ糖、ペプトン、及び麦芽エキス−酵母エキス
を含む培地に、無色、或いは黄灰色のコロニーを形成す
るのに反し、暗濃−灰黒色コロニーを形成する新種トリ
ポクラディウム・バリウムCY/93。 - 【請求項２】ハンガリー国ブダペスト市所在のナショナ
ル・コレクション・オブ・アグリカルチュラル・アンド
・インダストリアル・マイクロオーガニスムスに受託番
号NCAIM（Ｐ）F001005の下に寄託された新種トリポクラ
ディウム・バリウムCY/93。 - 【請求項３】サイクロスポリン、或いはサイクロスポリ
ンＡ、サイクロスポリンB,及びサイクロスポリンＣから
なるサイクロスポリン系複合体抗生物質を生合成する糸
状菌菌株を、炭素源、及び窒素源、並びに無機塩類を含
む栄養培地で好気性発酵すること、及び生成物を単離す
ることにより前記抗生物質を生産する方法であって、サ
イクロスポリン、或いはサイクロスポリン系複合体抗生
物質を生合成する新種トリポクラディウム・バリウム糸
状菌種の一菌株を、炭素源、有機及び無機窒素源、並び
に無機塩類を含む栄養培地で、25〜30℃の好気条件下で
培養すること、そして希望するならば、生産されたサイ
クロスポリン、或いはサイクロスポリン系複合体抗生物
質を単離し、精製することからなるサイクロスポリン、
或いはサイクロスポリン系複合体抗生物質を微生物生産
する方法。 - 【請求項４】トリポクラディウム・バリウム糸状菌種と
して、ハンガリー国ブダペスト市所在のナショナル・コ
レクション・オブ・アグリカルチュラル・アンド・イン
ダストリアル・マイクロオーガニスムスに受託番号NCAI
M（Ｐ）F001005の下に寄託されたトリポクラディウム・
バリウムCY/93を用いる請求項（３）記載のサイクロス
ポリン、或いはサイクロスポリン系複合体抗生物質を微
生物生産する方法。 - 【請求項５】ペプトン、硫酸アンモニウム、またはトリ
プトンを窒素源として、そしてブドウ糖、麦芽糖、或い
はソルビトールを炭素源として含有する培地で発酵を行
なう請求項（３）記載のサイクロスポリン、或いはサイ
クロスポリン系複合体抗生物質を微生物生産する方法。
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