CZ283557B6 - Plísňový kmen Tylypocladium varium a způsob mikrobiální přípravy cyklosporinového komplexu za použití tohoto kmene - Google Patents

Plísňový kmen Tylypocladium varium a způsob mikrobiální přípravy cyklosporinového komplexu za použití tohoto kmene Download PDF

Info

Publication number
CZ283557B6
CZ283557B6 CS897225A CS722589A CZ283557B6 CZ 283557 B6 CZ283557 B6 CZ 283557B6 CS 897225 A CS897225 A CS 897225A CS 722589 A CS722589 A CS 722589A CZ 283557 B6 CZ283557 B6 CZ 283557B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
cyclosporin
complex
varium
tolypocladium
strain
Prior art date
Application number
CS897225A
Other languages
English (en)
Inventor
Antonia Dr. Jekkel
Gabor Dr. Ambrus
Eva Dr. Toth
Agota Huelber
Attila Andor
Karoly Albrecht
Kalman Dr. Koenczoel
Valeria Dr. Szell
Eva Dr. Tomori
Imre Moravcsik
Kalman Dr. Polya
Janos Dr. Erdei
Lajos Kiss
Karoly Nagy
Bela Palotas
Etelka Dr. Deli
Karoly Buzasi
Aniko Dr. Molnar
Gyoergy Santha
Vilma Szaszhegyesi
Béla Makadi
Istvan Dr. Mihaly
Original Assignee
BIOGAL Gyógyszergyár
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by BIOGAL Gyógyszergyár filed Critical BIOGAL Gyógyszergyár
Publication of CZ722589A3 publication Critical patent/CZ722589A3/cs
Publication of CZ283557B6 publication Critical patent/CZ283557B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/145—Fungal isolates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/64—Cyclic peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/645—Cyclosporins; Related peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/911—Microorganisms using fungi

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Crystals, And After-Treatments Of Crystals (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)

Abstract

Příprava cyklosporinového komplexu nebo jeho složek, cyklosporinu A, cyklosporinu B a cyklosporinu C fermentací vláknitého plísňového kmene nového druhu plísně Tylypocladium varium v živném prostředí obsahujícím zdroje uhlí, organické a anorganické zdroje dusíku a minerální soli, za aerobních podmínek při 25 až 30.sup.o.n.C, po níž případně následuje izolace a čištění vyrobeného antibiotikového komplexu nebo jeho složek. Jako plísňový kmen se použije Tolypocladium varium sp.nov. CY/93 uložený v National Collection od Agricultural and Industrial Microorganisms, Budapešt, Maďarsko pod číslem NCAIM/P/F001005. Vyrobená antibiotika mají imunosupresivní účinek.ŕ

Description

Oblast techniky
Vynález se týká nového plísňového kmene Tolypocladium varium a jeho použití při mikrobiální přípravě cyklosporinového komplexu nebo jeho složek, cyklosporinu A cyklosporinu B a cyklosporinu C, aerobní fermentací.
Dosavadní stav techniky
Cyklosporiny jsou cyklické, neutrální, apolámí jedenáctičlenné oligopeptidy, kde některé ze skupin aminokyselin jsou rozdílné. Cyklosporin A a cyklosporin B byly izolovány nejprve A. Riiegerem et al. (Helv. Chim. Acta 59, 1075 /1976/), zatímco cyklosporiny B, D, E a G R. Traberem et al. (Helv. Chim. Acta 60, 1568 /1977/) z kultury plísní /NRRL 8044/, identifikované nejprve jako Trichoderma polysporum /Ling. Ex. Pers./ Rifai. Později byla provedena taxonomií revize uvedeného kmene a byl potom popsán v literatuře jako Tolypocladium inflatum Gams.
V současnosti je známo 25 různých cyklosporinových antibiotik uvedených jako cyklosporiny A až Z (Helv. Chim. Acta 70, 13 /1987/). Z těchto složek je nejcennější cyklosporin A mající selektivní imunosupresivní účinek.
Cyklosporin A byl nejprve znám jako mírné antifungicidní antibiotikum, jeho význačný imunosupresivní účinek byl potvrzen teprve později (J. F. Borel et al.: Immunology 32, 1017 /1977/).
V sériích zkoušek in vitro a in vivo bylo potvrzeno, že cyklosporiny A, C a G jsou velmi specifické imunosupresivní látky.
Cyklosporin A inhibuje očekávanou humorální a tkáňovou imunitní odezvu. Při studium jeho způsobu účinku bylo zjištěno, že inhibuje T buněčnou proliferaci a také syntézu interleukinu 2.
Terapeutické použití cyklosporinu A při transplantaci lidských orgánů bylo uveřejněno v r. 1978. Nejprve byl aplikován při transplantaci ledvin /R. J. Calne et al.: Lancet 1978 /2, 1323/ a kostní dřeně /R. L. Powles et al.: Lancet 1978/2, 1327/ transplantations.
V průběhu transplantace orgánů (ledvin, slinivky, jater, srdce, plic) a kostní dřeně byla negativní reakce orgánů potlačena aplikací cyklosporinu A.
Dále byl cyklosporin A úspěšně aplikován při léčení některých autoimunních onemocnění (uveitidy, revmatické artritidy, psoriázy, a těžké myastenie).
V patentové literatuře byly použity pro produkci cyklosporinového komplexu následující mikroorganismy: Cylindrocarpon lucidum Booth, NRRL 5760 (švýcarský patent č. 589, 716); Tolypocladium inflatum Gams, NRRL 8044 (podle dřívější taxonomie: Trichoderma polysporum (Link ex Pers.) Rifai (švýcarský patent č. 603,790 podle Bisetta /1983/: Tol.inflatum w.Gams, 1971 je synonymní s Tol. niveum (rostrup) Bisett com.mov. a Fusarium solani, MCI-1549, MCI1150 (publikovaná japonská patentová přihláška č. 82 63093). V průběhu fermentačního procesu prováděného s výše uvedenými mikroorganismy byla získána po dlouhé době fermentace nízká hladina produkce cyklosporinu a výtěžek izolace byl také nízký.
Výzkum byl proveden za účelem nalezení kmenů mikroorganismů, které by produkovaly cyklosporinový antibiotikový komplex nebo jeho složky ve vyšší koncentraci a při výhodnějších podmínkách než u dřívějších kmenů. Při třídění velkého počtu vláknitých plísňových kmenů izolovaných z půdy byl nalezen kmen mikroorganismu Tolypocladium genus, který je schopen biosyntézy cyklosporinového antibiotikového komplexu.
Podstata vynálezu
Předmětem vynálezu je jednak tento mikroorganismus označený CY/93, který nemohl být identifikován při taxonomické studii žádným druhem plísní produkujícím cyklosporinový komplex. Tolypocladium species nova CY 93 je nový taxon kmene Tolypocladium genus, který se může diferencovat na úrovni druhu.
Předmětem vynálezu je dále také způsob mikrobiální přípravy cyklosporinového komplexu nebo jeho složek, cyklosporinu A, cyklosporinu B a cyklosporinu C, aerobní fermentací vláknitého plísňového kmene vedoucí k biosyntéze výše uvedeného antibiotika (antibiotik) v živném prostředí obsahujícím využitelné zdroje uhlíku a dusíku a minerální soli a isolací vytvořených produktů, který se vyznačuje tím, že se kmen výše uvedeného druhu plísně Tolypocladium varium produkující cyklosporinový antibiotikový komplex kultivuje v živném prostředí obsahujícím zdroje uhlíku, organické a anorganické zdroje dusíku a minerální látky, za aerobních podmínek při 25 až 30 °C a případně se vyrobený cyklosporinový antibiotikový komplex nebo jeho složky isolují a čistí.
Fermentace se provádí v prostředí obsahujícím pepton, síran amonný a trypton, jako zdroj dusíku a glukózu, maltózu a sorbit, jako zdroj uhlíku.
Taxonomické znaky nového druhu plísně byly srovnány s hlavními diagnostickými vlastnostmi druhu Tolypocladium následujícím způsobem.
Tolypocladium geneus byl nejprve popsán Gamsem v r. 1971 jako nový rod Moniliales. Jeho charakteristické vlastnosti jsou: pomalý růst, poduškovité bílé kolonie, koncové a postranní fialidy rozvinuté částečně na krátkém postranním větvení, se silně nabobtnalou bází a vláknitým, často skloněným hrdlem, končícím v jednobuněčném konidiu. V tomto rodu byly rozlišeny Gamsem následující tři nové druhy:
T.geodes, T.cylindrosporum a T.inflatum.
T.geodes se vyznačoval půdní vůní typu Actinomycetes, zatímco nový T.varium sp.nov. CY/93 je toho zcela zbaven. Dále jsou nosičové buňky T.geodes značně užší než buňky T.varium sp. nov. CY/93. Konidia T.cylindrosporum jsou charakteristicky dlouhé a prodloužené, zatímco konidia T.varium sp.nov.CY/93 jsou sférické a pouze nepatrně prodloužené. Konidia T.inflatum jsou vejčité a delší než pozorované v kultuře T.varium sp.nov. CY/93. Fialidy T.inflatum jsou charakteristicky produkovány ve verticilech buď přímo na hyfách, nebo na 2 až 3 pm dlouhých nosičových buňkách. T.varium sp.nov CY/93 neukazuje žádné vzory verticilátového uspořádání, je detektovatelné pouze čas od času ojediněle. V důsledku bílého chmýřitého vzdušného mycelia jsou kolonie všech známých druhů Tolypocladium bílé, zatímco rub kolonií je žlutavě šedý, bezbarvý nebo žlutý. Nejsou produkovány žádné typicky rozpustné pigmenty. T.varium sp.nov. CY/93 může se také odlišit v tomto ohledu: v prostředí obsahujícím glukózu a pepton a sladový- a kvasničný výtažek je produkován tmavý, tmavošedý (a černý) s časovou proměnlivostí.
Taxonomické hodnocení nových druhů ve srovnání s jinými známými druhy Tolypocladium bylo provedeno na základě následujících publikací: W. Gams: Perseonia, 6, 185-191 /1971/; G. L. Barron: Can. J. Bot. 5R, 439-442 /1980/ a Bisett J„ Can. J. Bot. 61, 1311-1329 /1983/.
-2CZ 283557 B6
Diagnostické vzory Tolypocladium varium sp.nov. CY/93 jsou shromážděny v následujícím:
dní staré kolonie mají průměr 10 až 25 mm, jejich povrch je pokryt bílým, chmýřovitým, bohatě sporulujícím vzdušným myceliem. Rub kolonií je žlutavě až špinavě šedý. V některých prostředcích se produkuje tmavě šedý, rozpustný pigment. Na hyfách vzdušného mycelia se pozoruje koncová a postranní spolurace. Fialidy jsou umístěny buď osaměle, nebo sporadicky, nahodile ve verticilech, přímo na hyfách nebo na krátkých (2 až 3 μιη) nosičových buňkách. Fialidy jsou vytvořeny z nabobtnalé báze (2 až 4 x 2 až 3 μιη) a dlouhého, vláknitého hrdla (2 až 4 x 0,5 až 0,6 μπι). Konidia hlaviček jsou malé (2 až 3 . 1,3 až 2,2 μιη), obvykle sférické a hladké. Specifický epiteton „varium“ se týká variability fialid. Tol.varium ukazuje ve svém životním cyklu určitou podobnost s rodem Harptsporium, o kterém bude zmíněno jinde. Kmen označený CY/93 nemůže využívat rafinózu, ale roste dobře na následujících zdrojích uhlíku: mannitu, inositu, sacharóze, fruktóze, rhamnóze, galaktóze, dextróze, arabinóze a xylóze v povrchových kulturách. Tyto kultury se špatně vyvíjejí na živné půdě a agaru se sladovým výtažkem a dobře se vyvíjí na agaru se sojovou moukou, Czapekově agaru a agaru s bramborovou dextrózou. Po uskladnění není vhodný agar s ovesnou moukou a agar s dextrózou a kvasničným výtažkem.
Tol. varium se ostře odlišuje od Tol. Trigonosporum, které produkuje konidia trojhranná na povrchu se slabě vydutými okraji. Tol. varium se také odlišuje od Tol. Balanoides. Poslední produkuje lahvovité postranní fialidy.
Kromě toho kmen /CY/93/ Tolypocladium varium n.sp. se odlišuje od autentického typu kmene Tolypocladium inflatum /CBS 714.70/ s ohledem na tom, že posledně jmenovaný kmen vyvíjí bohaté bílé vzdušné mycelium při kultivaci na živné půdě moltóza-agar, zatímco Tolypocladium varium sp.nov.CY/93 neprodukuje toto vzdušné mycelium. Typ kmene Tolypocladium inflatum produkuje v myceliu v živné půdě železo-pepton červenavě hnědý konečný pigment, zatímco mycelium Tolypocladium varium sp.nov.CY/93 zůstane světle žluté. Kmen Tolypocladium varium sp.nov CY/93 nevyužívá arabinózu, zatímco Tolypocladium inflatum využívá. Při použití dusitanu sodného vyvíjí posledně jmenovaný kmen bohaté mycelium, zatímco Tolypocladium varium sp.nov. CY/93 roste obtížně.
Srovnání Tolypocladium varium sp.nov. CY/93 s autentickými kmeny jiných Tolypocladium species, Trichoderma polysporum ATCC 16,641 a Cylindrocarpon lucium NRRL 5760 uvedeno v tab. 1.
Tab. I
Cylindrocarpon lucidum NRRL 5760 4- 4- 4- 4- 4- 4- + + 4- 4- 4- 4- 4- 4- 4- 4- 4 4- 1 4- 4- 4- 4· 4- 4- 4- 4- 4- 4- 4- 4- 4- 4- 4- 4-
Trichoderma polysporum ATCC 16641 4+ + 4+ + » 1 4+ + 1 1 1 4- 4- 4- 4- 4- 4- 4- 4- 4- 4- 4- 4- 4- 4- 1
Tolypocladium geodes CBS 722.70 1 1 1 1 + + 4- 1 4- 4- 4- I 1 4- 4- 4- 1 1 1 4- 4- 4-
Tolypocladium geodes CBS 721 70 1 1 1 1 4+ 4- l 4- 4- 4- 1 41 1 l 1 4- 4- 4-
Tolypocladium cylindrosporum CBS 718.70 • 1 1 1 1 4- 4- 4- 1 4- 4- 4- 1 1 41 l 4- 4- + 4- 1
Tolypocladiuin cylindrosporum CBS 717.70 1 í í 1 í 4- 4- 4- i 4- 4- 4- 1 t 4- 4- 4- í 4- 4- 4- 4- 1
Tolypocladium varium Cl/93 1 1 1 1 + + 4- 1 4- 4- 4- 1 4- 4- 4- 4- 4- 4- 1 4- 4- 4- 1
>. N 12 3 o Ό lz N O CČ O 4) c Ό N 5 ό o E P N c ž ></) 2 * = > c O Q jz 3 T3 O o_ 5 _5j p '>> 3 s a o. s >o 9 > 2? i 5 Q Λ >Q C <d Cfl 3 L. G OD 03 C3 C O O 3 T3 O u- CL c o s .2? £ £ <*j Ό N 1) -5 <υ -C >N 05 o g O Q LZ C •g ’S 50 5 s P a-g Cu ~ “O G ><U >% 3 <x -3 ς) > 3 03 Im G 03 r g OD H 05 >> N Ό L. 05 r· CJ OS (Λ >N 3 > 3 .2 >N 3 > O 0 IT) >u CX. ζΛ ®3 CEÍ u o r- c*i >u CL Ul »3 '2 >= 1 S ε o Q. Q. on O O o Ξ O Q 2 >C O CL. N Ό LZ J3 OD N _z OJ Q -iZ 3 Ό O L· cu o -C G •6 o czi O <Λ 4—· >N 3 > O -5 o 71 o 03 £ >N > O c Ό O ti 3 q 2 > >N 3 >> > D O 3 -Ό g 2 « Q- .3 -w Q C 3 o ϋ E — Έ E 2 r“ . 55 <3 cn cq q 3 Ld O. >» N ** O c/) Í 3 u- > 33 O OD .2 * LU C
Na základě výše uvedených poznatků se vynález týká způsobu přípravy cyklosporinového antibiotikového komplexu a/nebo jeho složek, cyklosporinů A, cyklosporinů B a cyklosporinů C, aerobní fermentací vláknitého plísňového kmene, který vede k biosyntéze výše uvedeného antibiotika (antibiotik) v živném prostředí obsahujícím využitelné zdroje uhlíku a dusíku a také minerální soli a izolací vytvořených produktů, který spočívá v kultivaci kmene nového druhu plísně Tolypocladium varium produkujícího cyklosporinový antibiotikový komplex, zejména Tolypocladium varium sp.nov. CY/93, uloženého vNational Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms, Budapest, Maďarsko pod číslem NCAIM/P/F 001005, v živném prostředí obsahujícím zdroje uhlíku, organické a anorganické zdroje dusíku a minerální soli, za aerobních podmínek, při teplotě v rozmezí 25 až 30 °C a případně izolaci a čištění cyklosporinového antibiotikového komplexu nebo jeho složek.
Pole výhodného provedení vynálezu se cyklosporinový- antibiotikový komplex vyrobí za použití nového kmene Tolypocladium varium sp.nov.CY/93. Vybraný kmen je velmi výhodný vzhledem k rychlému růstu. Je příznivým znakem, že kmen může využít sacharózu, glukózu, sorbózu, maltózu, fruktózu, škrob, glycerin a také tuky a oleje jako zdroje uhlíku a různé organické a anorganické zdroje dusíku, jako kukuřičný výluh, pepton, kvasničný výtažek, masový výtažek, dusičnan sodný, dusičnan amonný, síran amonný, a různé aminokyseliny. Kromě výše uvedených zdrojů uhlíku a dusíku mohou živná prostředí použitá pro produkci cyklosporinového antibiotikového komplexu také obsahovat minerální soli (chlorid draselný, síran horečnatý nebo dihydrogen-fosforečnan draselný), stopové prvky (soli mědi, manganu, železa), dále vitaminy a odpěňovadla.
Podle výhodné metody podle vynálezu se kapalné prostředí naočkuje suspenzí konidia a mycelia připraveného z kultury Tolypocladium varium sp.nov. CY/93 na šikmém agaru. Po třídenní kultivaci se získaná předkultura použije k naočkování prostředí použitého pro výrobu antibiotika, které se potom inkubuje při 25 až 30 °C, s výhodou při 25 °C, po dobu 5 až 7 dní. Během fermentace se pH udržuje v rozmezí 6,0 až 2,5, s výhodou při 5,2. Fermentace se provádí za aerobních podmínek, za intenzivního míchání (750 až 1000 otáček za minutu) a provzdušňování 300 1/h.
Během fermentace se obsah cyklosporinů živné půdy monitoruje mikrobiální zkouškou a vysokotlakou kapalinovou chromatografii. Jakmile se vyrobí maximální množství antibiotika, získají se tato z kultury známým způsobem extrakční a/nebo absorpční metodou.
Cyklosporinová koncentrace živné půdy se měří na základě antifungicidní účinnosti cyklosporinů deskovým difuzním testem. Jako zkoušené organismy se mohou s výhodou použít Aspergillus niger, Aspergillus japonicus a Curvularia lunata (M. Dreyfuss et al.: European J. Appl. Microbiol.3, 125-133 /1976/). Vysokotlaká kapalinová chromatografie cyklosporinové koncentrace živné půdy se provádí na vzorku půdy zředěním desetinásobně methanolem podle F. Kreuziga (J. Chromát. 290, 181 /1284/). Podle těchto pokusů se vyrobí cyklosporinový antibiotikový komplex obsahující cyklosporin A jako hlavní produkt a cyklosporin R s cyklosporin C jako menší složky ve vysokém výtěžku (950 mcg/ml) za použití nového kmene Tolypocladium varium sp.nov.CY/93.
Pro izolaci cyklosporinového komplexu z fermentační živné půdy se s výhodou může pouků extrakční metoda. Před extrakcí se mycelium oddělí buď filtrací, nebo odstředěním. Antibiotika vyrobená během fermentace se mohou výhodně vy mýt z buněk mikroorganismu nižšími alkanoly, s výhodou metanolem, nebo organickými ketony, s výhodou acetonem, z+ůncc cyklosporiny ve filtrátu se mohou extrahovat organickými rozpouštědly mísitelnými s vodou, jako ethylacetátem, n-buty lacetátem, dichlormethanem. 1,2-dichlorethanem nebo chloroform^ s výhodou n-butylacetátem. Surový produkt získaný extrakcí je znečištěn červenými a fia : :
pigmenty produkovanými plísní, které se mohou odstranit adsorpcí na aktivním uhlí nebo silikagelu. Případné lipidové znečištěniny (tj. odpěňovadlo) se mohou oddělit distnoom do
-5CZ 283557 B6 systému petroletheru a methanolu obsahujícího 10 % vody, kde se nečistoty převedou do petroletherové fáze.
Vodná methanolová fáze se koncentruje za sníženého tlaku, potom se vodný zbytek extrahuje dichlormethanem, který se odpaří a získá se čištěný cyklosporin. Cyklosporin A se může oddělit od menších cyklosporinových složek sloupcovou chromatografií a překrystalováním.
Struktura izolovaných produktů byla objasněna ultrafialovou, infračervenou, 'H nukleární magnetickou rezonanční, 13C nukleární magnetickou rezonanční a hmotovou spektroskopií a analýzou aminokyselin.
Příklady provedení vynálezu
Vynález bude objasněn v následujících příkladech, aniž by byl omezen jeho rozsah.
Příklad 1
Suspenze konidia a mycelia se připraví s 5 ml 0,9% roztoku chloridu sodného, získaného z kultury Tolypocladium varium nov.sp. CY/93 na šikmém agaru se sladovým výtažkem a kvasničným výtažkem. 1 ml této suspenze se použije k naočkování 100 ml sterilního IC inokulačního prostředí v 500 ml. Erlenmeyerově baňce.
Složení IC prostředí:
glukóza kasein-pepton dusičnan sodný dihydrogenfosforečnan draselný chlorid draselný síran horečnatý x 7 H2O síran železnatý x 7 H2O v 1000 ml vodovodní vody.
g g
g g
0,5 g
0,5 g
0,01 g pH živného prostředí se upraví před sterilizací na 5,2 a směs se steriluje 25 minut při 121 °C. Kultura se inkubuje při 25 °C na rotační třepačce (340 otáček za minutu), potom se použije 5 ml tohoto inokulačního prostředí k naočkování 15 500 ml. Erlenmeierových baněk obsahujících 100 ml FCi sterilního prostředí.
Složení FCi prostředí
glukóza 80 g
trypton 40 g
močovina 2 g
síran amonný 12 g
dusičnan amonný 3 g
dihydrogenfosforečnan
draselný 2 g
chlorid draselný 0,5 g
síran hořečnatý x 7 H2O 0,5 g
síran železnatý x 7 H2O 0,01 g
v 1000 ml vodovodní vody.
-6CZ 283557 B6 pH živného prostředí se upraví před sterilizací na 5,2 a směs se steriluje 25 minut při 121 °C.
Baňky se inkubují při 25 °C na rotační třepačce (340 otáček za minutu). Během fermentace se monitoruje antibiotiková koncentrace živné půdy deskovým difuzním testem.
Jako zkoušený organismus se použije Aspergillus niger. Koncentrace cyklosporinového antibiotikového komplexu v živné půdě se stanoví za použití cyklosporinu A jako standardu.
Fermentace probíhá 168 hodin, kdy živná půda obsahuje 400 pg/ml cyklosporinového antibiotikového komplexu. Cyklosporinová komplex se izoluje podle následující metody.
Buňky jednoho litru živné půdy se filtrují a antibiotika se promyjí dvakrát 200 ml methanolu. Vodný methanolový roztok se koncentruje za sníženého tlaku, potom se antibiotikový komplex extrahuje z vodného koncentrátu 2x 50 ml n-butylacetátu. Cyklosporinový obsah filtrátu se extrahuje 200 ml n-butylacetátu, n-butylacetátové extrakty se shromáždí, suší bezvodým síranem sodným, potom se odpaří za sníženého tlaku při 40 °C. 3,7 g získaného surového produktu se rozpustí v 10 ml methanolu a převede se na vrcholek gelové kolony Sephadex LH-20 (délka kolony 40 cm, průměr 2,5 cm) připravené s methanolem. Potom se lipidové nečistoty oddělí elucí methanolem. Frakce obsahující cyklosporinový komplex se odpaří za sníženého tlaku při 40 °C. Oddělení složek získaného cyklosporinového komplexu (1,05 g) se provádí chromatografíí na silikagelové koloně připravené z 20 g silikagelu 40 (Reanal, Budapest), elucí směsí chloroform-methanol obsahující postupně se zvyšující objem methanolu. Eluce začíná se 100 ml chloroformu, potom pokračuje se směsí chloroform-methanol, kde obsah methanolu každé 100 ml části se zvýší o 0,5 %. Cyklosporinový obsah frakcí se monitoruje chromatografíí na tenké vrstvě (deska: silikagel 60 F754, DC Alufoil /Měrek/, eluční činidlo: ethylacetatisopronaol 95 : 5, detekce: jodové páry). Cyklosporiny A, B a C se eluují z kolony směsí methanol/chloroform obsahující 2,0 %, 2,5 % a 3,0 % methanolu. Frakce obsahující čisté složky se odpaří za sníženého tlaku a získá se 225 mg cyklosporinu A (t.t.: 137-140 °C, [a]D: -189° /methanol/), 25 mg cyklosporinu B (t.t.: 149-151 °C) a 52 mg cyklosporinu C (t.t.: 150-152 °C).
Příklad 2
1 IC inokulačního prostředí sterilovaného 45 minut při 121 °C v 10 1. laboratorním fermentoru se nočkuje 200 ml inokulační kultury připravené jak popsáno v příkladu 1, potom se inkubuje při 25 °C, míchá se při 750 otáček za minutu a provzdušňuje se 300 1/h vzduchu.
Fermentace se dále provádí 72 hodin, potom se použije 500 ml tohoto inokulačního prostředí k naočkování 5 1 FC2 prostředí, steriluje se 45 minut při 121 °C v 10 1. laboratorním fermentolu.
Složení FC2 prostředí:
glukóza 80g trypton 40g močovina 2g síran amonný 12g dusičnan sodný 3g dihydrogenfosforečnan draselný 2g chlorid draselný0,5 g síran horečnatý x 7 H2O0,5 g síran měďnatý x 5 H2O 0,01g síran manganatý x 7 H2O 0,01g síran železnatý x Ί H2O 0,01g v 1000 ml vodovodní vody.
pH prostředí se upraví před sterilací na 5,2 Naočkovaná kultura se inkubuje při 25 °C, míchá se při 750 otáček za minutu a provzdušňuje se 300 1/h.
Fermentace se provádí za výše uvedených podmínek 144 hodiny až se dosáhne vrcholu cyklosporinového titru, potom je živná půda bohatá a může se zpracovat.
Cyklosporin A se izoluje z 4,8 1 fermentační živné půdy obsahující 500 pg/ml cyklosporinového komplexu následujícím způsobem.
Buňky mikroorganismu se odstředí a cyklosporinový komplex se vymyje z buněk 2x 1 litrem methanolu. Vodný methanolový roztok se koncentruje za sníženého tlaku, potom se antibiotikový komplex extrahuje z vodného koncentrátu 2x 250 ml n-butylacetátu.
Cyklosporinový komplex se extrahuje z filtrátu fermentační živné půdy 2x 500 ml nbutylacetátu. Všechny n-butylacetátové extrakty se shromáždí, suší bezvodým síranem sodným, potom se roztok odpaří za sníženého tlaku při 40 °C. Předběžné čištění získaného surového produktu (19,2 g) se provádí chromatografií na koloně připravené se 100 g silikagelu 60 (velikost částic 0,063 až 0,2 mm), se směsí chloroform-methanol-aceton (92 : 4 : 4) jako elučním činidlem. Frakce obsahující cyklosporinový komplex (chromatografíe na tenké vrstvě: deska: silikagel 60 F254, DC Alufoil (Měrek); eluční činidlo: hexan-aceton 2:1; detekce: chlor (tolidin) se odpaří do sucha. Odparek (5,28 g) se podrobí sloupcové chromatografií a získá se cyklosporin A. Kolona se připraví ze 115 g silikagelu 60 (velikost částic 0,063 až 0,2 mm) a eluuje se směsí hexan-aceton obsahující postupně se zvyšující objem acetonu. Cyklosporin A se eluuje z kolony směsí obsahující 23 % acetonu. Odpařením frakcí obsahujících cyklosporin A se získá 1,46 g cyklosporinu A.
Příklad 3
Suspenze konidia a mycelia se připraví s 5 ml 0,9% roztoku chloridu sodného, získaného z kultury Tolypocladium varium nov.sp. CY/93 na šikmém agaru se sladovým výtažkem a kvasničným výtažkem a použije se k naočkování 800 ml IC inokulačního prostředí popsaného v příkladu 1 a steriluje se v 3 1. Erlenmeyerově baňce. Baňka se inkubuje při 25 °C na rotační třepačce (340 otáček za minutu) po dobu 2,5 dní, potom se tímto prostředím naočkuje 5 ' FC5 prostředí sterilovaného v 10 litrovém laboratorním fermentoru při 121 °C po 45 minut.
Složení FC3 prostředí:
sorbóza 60 g
trypton 40 g
močovina 2 g
síran amonný 12 g
dusičnan sodný 3 g
dihydrogenfosforečnan draselný 2 g
chlorid draselný 0.5 g
síran horečnatý x 7 H2O 0,5 g
síran manganatý x 7 H2O 0,01 g
síran železnatý x 7 H2O 0,01 g
v 1000 ml vodovodní vody.
pH prostředí se upraví před sterilací na 5,2. Naočkovaná kultura se inkubuje při Z· J ZH míchání při 1000 otáček za minutu a provzdušňuje se 300 1/h.
-8CZ 283557 B6
Fermentace se dále provádí 168 hodin, kdy obsahuje podle mikrobiální zkoušky fermentační živná půda 600 mcg/ml cyklosporinového komplexu.
Izolací podle příkladu 2 se získá z jednoho litru živné půdy 310 mg cyklosporinu A.
Příklad 4
Suspenze konidia a mycelia se připraví s 5 ml 0,9% roztoku chloridu sodného, získaného z pěti až sedmidenní kultury Tolypocladium varium nov.sp. CY/93 (NCAIM/P/F001005) na šikmém agaru se sladovým výtažkem a kvasničným výtažkem a použije se k naočkování 500 ml IC inokulačního prostředí popsaného v příkladu 1 a steriluje se v 3 1. Erlenmeyerově baňce. Baňka se inkubuje na rotační třepačce (340 otáček za minutu) po 3 dny při 25 °C, potom se toto prostředí použije k naočkování 5 1 FC4 prostředí sterilovaného v 10 1. laboratorním fermentoru při 121 °C po 45 minut.
Složení FC4 prostředí:
maltóza 80g trypton 40g močovina 2g síran amonný 12g dusičnan amonný 3g dihydrogenfosforečnan draselný 2g chlorid draselný0,5 g síran hořečnatý x 7 H2O0,5 g síran manganatý x 7 H2O 0,01g síran měďnatý x 5 H2O 0,01g síran železnatý x 7 H2O 0,01g v 1000 ml vodovodní vody.
pH prostředí se upraví před sterilací na 5,2.
Po naočkování se fermentační živná půda inkubuje při 25 °C, míchá se při 1000 otáček za minutu a provzdušňuje se 300 1/h.
Fermentace se dále provádí 144 hodiny, kdy fermentační živná půda obsahuje 620 mcg/ml cyklosporinového komplexu podle mikrobiální zkoušky.
Izolace se provádí metodou popsanou v příkladu 1. Z 1 litru živné půdy se získá 305 mg cyklosporinu A.
Příklad 5
Suspenze konidia a mycelia se připraví s 5 ml 0,9% roztoku chloridu sodného z 5 až 7 denní kultury Tolypocladium varium nov. Sp. CY/93 (NCAIM/P/F 001005), na šikmém agaru se sladovým výtažkem a kvasničným výtažkem a použije se k naočkování 500 ml IC inokulačního prostředí popsaného v příkladu la steriluje se v 3 1. Erlenmeyerově baňce. Baňka se inkubuje na rotační třepačce (340 otáček za minutu) pri 25 °C po dva dny, potom se tímto prostředím naočkuje 5 1 FCi prostředí sterilovaného v 10 1. laboratorním fermentoru při 121 °C po 45 minut. Po naočkování se fermentační živná půda míchá při 25 °C při 750 otáček za minutu a provzdušňuje se 300 1/h. Po 96 hodinové kultivaci se přidá sterilovaný vodný roztok 100 g
-9CZ 283557 B6 maltózy a fermentace pokračuje 144 hodiny, kdy živná půda obsahuje podle mikrobiální zkoušky 950 mcg/ml cyklosporinového komplexu. Získá se celkem 4,8 1 živné půdy. Izolace se provádí podle metody popsané v příkladu 2 a získá se 2,75 g cyklosporinu A.

Claims (3)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Plísňový kmen Tolypocladium varium sp. nov. CY/93 uložený v Národní sbírce zemědělských a průmyslových mikroorganismů „National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms“ pod číslem NCAIM/P/F 001005.
  2. 2. Způsob mikrobiální přípravy cyklosporinového komplexu nebo jeho složek, cyklosporinu A, cyklosporinu B a cyklosporinu C, aerobní fermentací vláknitého plísňového kmene vedoucí k biosyntéze výše uvedeného antibiotika nebo antibiotik v živném prostředí obsahujícím využitelné zdroje uhlíku a dusíku a minerální soli a isolací vytvořených produktů, vyznačující se tím, že se plísňový kmen Tolypocladium varium podle nároku 1, produkující cyklosporinový antibiotikový komplex, kultivuje v živném prostředí obsahujícím zdroje uhlíku, organické a anorganické zdroje dusíku a minerální soli, za aerobních podmínek při 25 až 30 °C a případně se vyrobený cyklosporinový antibiotikový komplex nebo jeho složky isolují a čistí.
  3. 3. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že se fermentace provádí v prostředí obsahujícím pepton, síran amonný a trypton, jako zdroj dusíku a glukózu, maltózu a sorbit, jako zdroj uhlíku.
CS897225A 1988-12-20 1989-12-20 Plísňový kmen Tylypocladium varium a způsob mikrobiální přípravy cyklosporinového komplexu za použití tohoto kmene CZ283557B6 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
HU886497A HU201577B (en) 1988-12-20 1988-12-20 Process for producing cyclosporin antibiotics

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ722589A3 CZ722589A3 (cs) 1998-01-14
CZ283557B6 true CZ283557B6 (cs) 1998-05-13

Family

ID=10971727

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CS897225A CZ283557B6 (cs) 1988-12-20 1989-12-20 Plísňový kmen Tylypocladium varium a způsob mikrobiální přípravy cyklosporinového komplexu za použití tohoto kmene

Country Status (23)

Country Link
US (1) US5156960A (cs)
EP (1) EP0379708B1 (cs)
JP (1) JPH0763356B2 (cs)
AT (1) AT393135B (cs)
BG (1) BG60274B1 (cs)
CA (1) CA2006144C (cs)
CZ (1) CZ283557B6 (cs)
DD (1) DD290356A5 (cs)
DE (1) DE58908740D1 (cs)
DK (1) DK174719B1 (cs)
FI (1) FI92603C (cs)
FR (1) FR2640641B1 (cs)
GB (1) GB2227489B (cs)
HU (1) HU201577B (cs)
IT (1) IT1237799B (cs)
LV (2) LV10102B (cs)
NO (1) NO175873C (cs)
PL (1) PL162959B1 (cs)
RU (1) RU1836425C (cs)
SE (1) SE505442C2 (cs)
SK (1) SK279768B6 (cs)
UA (1) UA13320A (cs)
YU (1) YU47100B (cs)

Families Citing this family (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE158022T1 (de) * 1991-01-25 1997-09-15 Fujisawa Pharmaceutical Co Prozess zur produktion von cyclosporin-a und/oder c
ATE127528T1 (de) * 1991-04-06 1995-09-15 Dresden Arzneimittel Verfahren zur fermentativen herstellung und isolierung von cyclosporin a sowie neue cyclosporin- bildende stämme.
FI92334C (fi) * 1992-12-30 1994-10-25 Leiras Oy Menetelmä syklosporiinien tuottamiseksi ja menetelmässä käytettävä uusi Tolypocladium-kanta
SI9300303A (en) * 1993-06-08 1994-12-31 Krka Tovarna Zdravil Process for isolation of hypolipemic effective substance
KR100304324B1 (ko) * 1994-10-13 2001-11-22 김용규 사이클로스포린a의제조방법
KR100341355B1 (ko) * 1994-10-14 2002-10-25 주식회사종근당 사이클로스포린a의제조방법
KR0126610B1 (ko) * 1994-10-18 1997-12-29 김충환 고생산 세포융합변이균주에 의한 사이클로스포린 a의 제조방법
EP0725076B1 (en) * 1995-02-01 2001-06-06 National Research Development Corporation of India A process for the preparation of cyclosporin A from tolypocladium species
EP0846699A1 (en) * 1995-06-29 1998-06-10 Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. Substance wf16616, process for production thereof, and use thereof
DE19611094C2 (de) 1996-03-21 1999-06-17 Dresden Arzneimittel Verfahren zur Reinigung von Cyclosporin A und/oder verwandten Cyclosporinen aus einem Cyclosporin-haltigen Rohextrakt unter Anwendung chromatographischer Verfahren mit Kieselgel als Adsorbens
US5709797A (en) * 1996-06-05 1998-01-20 Poli Industria Chimica S.P.A. Method of isolating cyclosporins
US5747330A (en) * 1996-06-05 1998-05-05 Poli Industria Chimica Antibiotic producing microbe
HU223054B1 (hu) * 1997-03-25 2004-03-01 BIOGAL Gyógyszergyár Rt. Tisztítási eljárás nagytisztaságú ciklosporin A előállítására
DE69939335D1 (de) 1998-12-30 2008-09-25 Dexcel Ltd Dispergierbares konzentrat zur verabreichung von cyclosporin
US7732404B2 (en) 1999-12-30 2010-06-08 Dexcel Ltd Pro-nanodispersion for the delivery of cyclosporin
CA2401700A1 (en) 2000-02-29 2001-09-07 Biocon India Limited Manufacture and purification of cyclosporin a
RU2290196C2 (ru) * 2001-04-20 2006-12-27 Дебиофарм С.А. Модифицированный циклоспорин, который можно использовать в качестве пролекарства, и его применение
WO2004082629A2 (en) 2003-03-17 2004-09-30 Albany Molecular Research, Inc. Novel cyclosporins
EP1809656A4 (en) 2004-09-29 2009-03-25 Amr Technology Inc CYCLOSPORINAL KINANALOGA AND ITS PHARMACEUTICAL APPLICATIONS
EP1804823A4 (en) 2004-09-29 2010-06-09 Amr Technology Inc NEW CYCLOSPORIN ANALOGUE AND ITS PHARMACEUTICAL APPLICATIONS
US7361636B2 (en) 2004-10-06 2008-04-22 Amr Technology, Inc. Cyclosporin alkynes and their utility as pharmaceutical agents
US7696165B2 (en) 2006-03-28 2010-04-13 Albany Molecular Research, Inc. Use of cyclosporin alkyne analogues for preventing or treating viral-induced disorders
US7696166B2 (en) 2006-03-28 2010-04-13 Albany Molecular Research, Inc. Use of cyclosporin alkyne/alkene analogues for preventing or treating viral-induced disorders
EP2151450A1 (de) * 2008-07-29 2010-02-10 Sandoz AG Verfahren zur Aufarbeitung von mikrobiologisch hergestellten zyklischen Oligopeptiden
CA2834355A1 (en) * 2011-04-28 2012-11-01 Celgene Corporation Methods and compositions using pde4 inhibitors for the treatment and management of autoimmune and inflammatory diseases
GB201319791D0 (en) * 2013-11-08 2013-12-25 Sigmoid Pharma Ltd Formulations
CN117025407B (zh) * 2023-06-28 2024-06-18 中国人民解放军海军特色医学中心 一株弯颈霉属真菌及其在制备抗辐损伤药物中的应用

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4117118A (en) * 1976-04-09 1978-09-26 Sandoz Ltd. Organic compounds
DE2819094A1 (de) * 1977-05-10 1978-11-23 Sandoz Ag Cyclosporin-derivate, ihre verwendung und herstellung
US4215199A (en) * 1978-06-05 1980-07-29 Sandoz Ltd. Antibiotic production
SE448386B (sv) * 1978-10-18 1987-02-16 Sandoz Ag Nya cyklosporinderivat, forfarande for framstellning av dem samt farmaceutisk komposition innehallande dem
US4764503A (en) * 1986-11-19 1988-08-16 Sandoz Ltd. Novel cyclosporins

Also Published As

Publication number Publication date
LV10102A (lv) 1994-05-10
DD290356A5 (de) 1991-05-29
SE505442C2 (sv) 1997-08-25
LV10102B (en) 1995-02-20
NO175873C (no) 1994-12-21
FI92603B (fi) 1994-08-31
ATA289189A (de) 1991-01-15
JPH0763356B2 (ja) 1995-07-12
BG60274B2 (en) 1994-03-31
YU47100B (sh) 1994-12-28
LV10500B (en) 1995-08-20
US5156960A (en) 1992-10-20
FI896157A0 (fi) 1989-12-20
HUT52164A (en) 1990-06-28
RU1836425C (ru) 1993-08-23
IT8922765A0 (it) 1989-12-20
GB8928715D0 (en) 1990-02-28
YU241589A (en) 1991-02-28
FR2640641B1 (fr) 1991-05-10
PL162959B1 (en) 1994-01-31
FI92603C (fi) 1994-12-12
SK722589A3 (en) 1999-03-12
FR2640641A1 (fr) 1990-06-22
JPH02231071A (ja) 1990-09-13
EP0379708A1 (de) 1990-08-01
HU201577B (en) 1990-11-28
GB2227489A (en) 1990-08-01
DK174719B1 (da) 2003-10-06
SE8904262D0 (sv) 1989-12-19
DK640989D0 (da) 1989-12-18
SE8904262L (sv) 1990-06-21
UA13320A (uk) 1997-02-28
DE58908740D1 (de) 1995-01-19
EP0379708B1 (de) 1994-12-07
CA2006144A1 (en) 1990-06-20
SK279768B6 (sk) 1999-03-12
CZ722589A3 (cs) 1998-01-14
GB2227489B (en) 1992-09-16
DK640989A (da) 1990-06-21
AT393135B (de) 1991-08-26
IT1237799B (it) 1993-08-31
IT8922765A1 (it) 1991-06-20
BG60274B1 (bg) 1994-03-31
NO895160D0 (no) 1989-12-20
NO175873B (cs) 1994-09-12
NO895160L (no) 1990-06-21
LV10500A (lv) 1995-02-20
CA2006144C (en) 1995-02-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ283557B6 (cs) Plísňový kmen Tylypocladium varium a způsob mikrobiální přípravy cyklosporinového komplexu za použití tohoto kmene
AU674723B2 (en) A process for producing immunosuppressives and a novel microbial species to be employed therein
WO1994016091A9 (en) A process for producing immunosuppressives and a novel microbial species to be employed therein
CA2257254C (en) Antibiotic producing microbe
KR960016874B1 (ko) 미생물에 의한 트랜스-4-히드록시-l-프롤린의 제조방법
US5854276A (en) Substance WF16616, process for production thereof, and use thereof
US5516686A (en) Fungicidal antibiotic producing Streptomyces sp. NCIMB 40212
RU2066687C1 (ru) Способ получения циклоспорина а, штаммы гриба sesquicilliopsis rosariensis g.arnold - продуценты циклоспорина а, штамм гриба tolypocladium inflatum - продуцент циклоспорина а
KR0143769B1 (ko) 항균성 폴리펩티드 화합물과 그 제조방법 및 이를 함유하는 약학 조성물
SI8912415A (sl) Mikrobni postopek za proizvodnjo imunosupresivnih antibiotikov
EP0525846A1 (en) Sporomiella intermedia and processes therefrom
RU2120997C1 (ru) Способ получения 2-амино-4(гидроксиметил)-3а,5,6,6а-тетрагидро-4h-циклопент-[d]-оксазол-4, 5,6-триола и продуцирующие его штаммы актиномицета micromonospora и актиномицета amycolatopsis
KR830001245B1 (ko) 항생물질 마이코플라네신의 제조방법
GB2241955A (en) Cyclohexapeptide compounds
JPS62275687A (ja) Ｙｐ−０２２５９ｌ−ａおよびｃ物質並びにその製法

Legal Events

Date Code Title Description
IF00 In force as of 2000-06-30 in czech republic
MK4A Patent expired

Effective date: 20091220