PL162959B1 - Method for manufacturing a complex of cyclosporine antibiotics - Google Patents
Method for manufacturing a complex of cyclosporine antibioticsInfo
- Publication number
- PL162959B1 PL162959B1 PL28287689A PL28287689A PL162959B1 PL 162959 B1 PL162959 B1 PL 162959B1 PL 28287689 A PL28287689 A PL 28287689A PL 28287689 A PL28287689 A PL 28287689A PL 162959 B1 PL162959 B1 PL 162959B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- cyclosporin
- complex
- antibiotics
- cyclosporine
- sources
- Prior art date
Links
- PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N Cyclosporin A Chemical compound CC[C@@H]1NC(=O)[C@H]([C@H](O)[C@H](C)C\C=C\C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C1=O PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N 0.000 title claims abstract description 65
- 108010036949 Cyclosporine Proteins 0.000 title claims abstract description 63
- 229960001265 ciclosporin Drugs 0.000 title claims abstract description 62
- 229930182912 cyclosporin Natural products 0.000 title claims abstract description 48
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 16
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 title claims abstract description 14
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 title claims abstract description 14
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 4
- 229930105110 Cyclosporin A Natural products 0.000 claims abstract description 58
- 241001149964 Tolypocladium Species 0.000 claims abstract description 24
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical class N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 18
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 claims abstract description 15
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical class [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 12
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims abstract description 10
- 241000894007 species Species 0.000 claims abstract description 10
- 229910052757 nitrogen Chemical class 0.000 claims abstract description 9
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims abstract description 7
- 229910052500 inorganic mineral Chemical class 0.000 claims abstract description 7
- 239000011707 mineral Chemical class 0.000 claims abstract description 7
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims abstract description 7
- 238000010564 aerobic fermentation Methods 0.000 claims abstract description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 4
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 20
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 20
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 8
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 8
- UCOQITKXMNKTKF-MXGZYYNMSA-N (3s,6s,9s,12r,15s,18s,21s,24s,30s,33s)-33-[(e,1r,2r)-1-hydroxy-2-methylhex-4-enyl]-1,4,7,10,12,15,19,25,28,30-decamethyl-6,9,18,24-tetrakis(2-methylpropyl)-3,21-di(propan-2-yl)-1,4,7,10,13,16,19,22,25,28,31-undecazacyclotritriacontane-2,5,8,11,14,17,20,23 Chemical compound C\C=C\C[C@@H](C)[C@@H](O)[C@@H]1N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@H](C)NC1=O UCOQITKXMNKTKF-MXGZYYNMSA-N 0.000 claims description 7
- JTOKYIBTLUQVQV-QRVTZXGZSA-N (3s,6s,9s,12r,15s,18s,21s,24s,30s,33s)-30-[(1r)-1-hydroxyethyl]-33-[(e,1r,2r)-1-hydroxy-2-methylhex-4-enyl]-1,4,7,10,12,15,19,25,28-nonamethyl-6,9,18,24-tetrakis(2-methylpropyl)-3,21-di(propan-2-yl)-1,4,7,10,13,16,19,22,25,28,31-undecazacyclotritriacontan Chemical compound C\C=C\C[C@@H](C)[C@@H](O)[C@@H]1N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC1=O JTOKYIBTLUQVQV-QRVTZXGZSA-N 0.000 claims description 6
- JTOKYIBTLUQVQV-UHFFFAOYSA-N Cyclosporin C Natural products CC=CCC(C)C(O)C1N(C)C(=O)C(C(C)C)N(C)C(=O)C(CC(C)C)N(C)C(=O)C(CC(C)C)N(C)C(=O)C(C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CC(C)C)N(C)C(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)C(C(C)O)NC1=O JTOKYIBTLUQVQV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 claims description 6
- 108010019248 cyclosporin C Proteins 0.000 claims description 6
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 claims description 5
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 5
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 claims description 5
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 claims description 4
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 claims description 4
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 claims description 4
- LKDRXBCSQODPBY-AMVSKUEXSA-N L-(-)-Sorbose Chemical compound OCC1(O)OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O LKDRXBCSQODPBY-AMVSKUEXSA-N 0.000 claims description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 claims description 3
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 claims description 2
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 claims 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 claims 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 claims 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 abstract description 7
- 102220201851 rs143406017 Human genes 0.000 abstract 1
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 42
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 24
- DKPFZGUDAPQIHT-UHFFFAOYSA-N butyl acetate Chemical compound CCCCOC(C)=O DKPFZGUDAPQIHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 15
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 15
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 15
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 12
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N sodium nitrate Chemical compound [Na+].[O-][N+]([O-])=O VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 241001149960 Tolypocladium inflatum Species 0.000 description 8
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 7
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 6
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 6
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 6
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 6
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 6
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 6
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 6
- 235000010344 sodium nitrate Nutrition 0.000 description 6
- 239000004317 sodium nitrate Substances 0.000 description 6
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 6
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 6
- 108010036941 Cyclosporins Proteins 0.000 description 5
- 241001589091 Forsterygion varium Species 0.000 description 5
- 239000011790 ferrous sulphate Substances 0.000 description 5
- 235000003891 ferrous sulphate Nutrition 0.000 description 5
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 5
- 229910000359 iron(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 5
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 5
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 5
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 5
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 4
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 4
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 3
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 3
- 241001515886 Tolypocladium geodes Species 0.000 description 3
- 241000123975 Trichoderma polysporum Species 0.000 description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 3
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000000270 basal cell Anatomy 0.000 description 3
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 3
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 3
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 3
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 3
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 3
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 3
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 3
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 3
- 241000875119 Cylindrocarpon lucidum Species 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 2
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 2
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 2
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241001515878 Tolypocladium cylindrosporum Species 0.000 description 2
- GZCGUPFRVQAUEE-SLPGGIOYSA-N aldehydo-D-glucose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O GZCGUPFRVQAUEE-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000000843 anti-fungal effect Effects 0.000 description 2
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 2
- 239000001058 brown pigment Substances 0.000 description 2
- WORJEOGGNQDSOE-UHFFFAOYSA-N chloroform;methanol Chemical compound OC.ClC(Cl)Cl WORJEOGGNQDSOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate Chemical compound [Cu+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229910000366 copper(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- -1 inosit Chemical compound 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 229940099596 manganese sulfate Drugs 0.000 description 2
- 239000011702 manganese sulphate Substances 0.000 description 2
- 235000007079 manganese sulphate Nutrition 0.000 description 2
- SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate Chemical compound [Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 2
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 2
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 2
- LPXPTNMVRIOKMN-UHFFFAOYSA-M sodium nitrite Chemical compound [Na+].[O-]N=O LPXPTNMVRIOKMN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 230000028070 sporulation Effects 0.000 description 2
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 2
- WSLDOOZREJYCGB-UHFFFAOYSA-N 1,2-Dichloroethane Chemical compound ClCCCl WSLDOOZREJYCGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001644 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy Methods 0.000 description 1
- PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 2-(3-bromo-2-fluorophenyl)acetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC(Br)=C1F PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000186361 Actinobacteria <class> Species 0.000 description 1
- 235000001674 Agaricus brunnescens Nutrition 0.000 description 1
- 241001480052 Aspergillus japonicus Species 0.000 description 1
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 description 1
- 101000765308 Aspergillus niger N-(5'-phosphoribosyl)anthranilate isomerase Proteins 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000223211 Curvularia lunata Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000427940 Fusarium solani Species 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 241000161910 Harposporium Species 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-JFNONXLTSA-N L-rhamnopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-JFNONXLTSA-N 0.000 description 1
- PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N L-rhamnose Natural products CC(O)C(O)C(O)C(O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PWHULOQIROXLJO-UHFFFAOYSA-N Manganese Chemical compound [Mn] PWHULOQIROXLJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 241000534579 Persoonia Species 0.000 description 1
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N Raffinose Natural products O(C[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O[C@@]2(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O1)[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 244000297179 Syringa vulgaris Species 0.000 description 1
- 235000004338 Syringa vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N UNPD196149 Natural products OC1C(O)C(CO)OC1(CO)OC1C(O)C(O)C(O)C(COC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010047115 Vasculitis Diseases 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000001166 ammonium sulphate Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 1
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 1
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000012225 czapek media Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- MDKXBBPLEGPIRI-UHFFFAOYSA-N ethoxyethane;methanol Chemical compound OC.CCOCC MDKXBBPLEGPIRI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N gamma-aminobutyric acid Chemical compound NCCCC(O)=O BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 229960003444 immunosuppressant agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 239000012499 inoculation medium Substances 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002506 iron compounds Chemical class 0.000 description 1
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 229910052748 manganese Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011572 manganese Substances 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- XELZGAJCZANUQH-UHFFFAOYSA-N methyl 1-acetylthieno[3,2-c]pyrazole-5-carboxylate Chemical compound CC(=O)N1N=CC2=C1C=C(C(=O)OC)S2 XELZGAJCZANUQH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000013048 microbiological method Methods 0.000 description 1
- 238000012009 microbiological test Methods 0.000 description 1
- 206010028417 myasthenia gravis Diseases 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 239000006916 nutrient agar Substances 0.000 description 1
- 239000006877 oatmeal agar Substances 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 108010009004 proteose-peptone Proteins 0.000 description 1
- 239000001057 purple pigment Substances 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N raffinose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N 0.000 description 1
- 238000001953 recrystallisation Methods 0.000 description 1
- 239000001054 red pigment Substances 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- HELHAJAZNSDZJO-OLXYHTOASA-L sodium L-tartrate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C([O-])=O HELHAJAZNSDZJO-OLXYHTOASA-L 0.000 description 1
- 235000010288 sodium nitrite Nutrition 0.000 description 1
- 239000001433 sodium tartrate Substances 0.000 description 1
- 229960002167 sodium tartrate Drugs 0.000 description 1
- 235000011004 sodium tartrates Nutrition 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
- C12N1/145—Fungal isolates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/64—Cyclic peptides containing only normal peptide links
- C07K7/645—Cyclosporins; Related peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/911—Microorganisms using fungi
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Virology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Botany (AREA)
- Mycology (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Crystals, And After-Treatments Of Crystals (AREA)
Abstract
1. Sposób wytwarzania kompleksu antybiotyków cyklosporynowych lub skladników tego kompleksu, to jest cyklosporyny A, cyklosporyny B i cyklosporyny C, przez aerobowa fermen- tacje nitkowatego szczepu grzyba, w którym zachodzi biosynteza tych antybiotyków na pozywce zawierajacej przyswajalne zródla wegla i azotu oraz sole mineralne i izolowanie wytworzonych produktów, znamienny tym, ze prowadzi sie hodowle szczepu nowego gatunku grzyba Tolypoc- ladium varium wytwarzajacego kompleks antybiotyków cyklosporynowych na pozywce zawie- rajacej zródla wegla, organiczne i nieorganiczne zródla azotu i sole mineralne, w warunkach aerobowych, w temperaturze 25-30°C, po czym ewentualnie izoluje sie i oczyszcza kompleks antybiotyków cyklosporynowych lub skladniki tego kompleksu. ( 1 9 ) PL (1 1 ) 162959 ( 1 3 ) B1 (51) IntCl5: C12P 21/04 C12N 1/14 C12R 1:645 PL PL PL PL PL PL PL PL
Description
Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania kompleksu antybiotyków cyklosporynowych lub składników tego kompleksu, to jest cyklosporyny A, cyklosporyny B i cyklosporyny C, przez fermentację aerobową.
Cyklosporyny są cyklicznymi, obojętnymi, niepolarnymi oligopeptydami jedenastoczłonowymi, różniącymi się niektórymi resztami aminokwasowymi. Cyklosporynę A i cyklosporynę B wyizolowali jako pierwsi A.Riigger i inni (Helv.Chim.Acta 59, 1075, 1976), natomiast cyklosporyny B, D, E i G wyizolowali R.Traber i inni (Helv.Chim.Acata 60, 1568, 1977) z hodowli grzyba NRRL 8044, wcześniej oznaczonego jako Trichoderma polysporum (Lingex Pers.) Rifai. Później szczep ten, po skorygowaniu systematyki, opisano w literaturze jako Tolypocladium inflatum Gams.
Obecnie znanych jest 25 różnych antybiotyków cyklosporynowych oznaczonych liteiami od A do Z (HeIv.Chim.Acta 70, 13, 1987). Spośród nich, substancją najbardziej cenną, o wybiórczym działaniu immunosupresyjnym, jest cyklosporyna A.
Cyklosporyna A znana była początkowo jako łagodny antybiotyk pizeciwgizybiczy. Jej ważne działanie immunosupresyjne poz.nano później (J.F.Borel i inni, Immunology 32, 1017 , 1977)
Serie badań in vitro i in vivo potwierdziły, że cyklosporynyA, C i G są bardzo specyficznymi środkami immunosupresyjnymi.
Cyklosporyna A hamuje reakcje immunologiczne, zarówno typu humoralncgo jak i komórkowego. Mechanizm jej działania polega na hamowaniu proliferacji komórek T oraz hamowaniu syntezy interleukiny II.
Pierwsze doniesienia o leczniczym zastosowaniu cyklospoiyny A pizy transplantacji oiganów ludzkich pojawiły się w 1978 r. Po raz pierwszy zastosowano ją przy tiansplantacji nerek (R.J. Calne i inni, Lancet 1978/2, 1323) i szpiku kostnego (R.L.Powieś i inni, Lancet 1978 /2, 1327).
Przy transplantacjach organów (nerek, trzustki, wątroby, serca, płuc) i szpiku kostnego reakcja odrzucenia organu lub szpiku kostnego przez organizm może być zahamowana pizez podanie cyklosporyny A.
162 959
Cyklosporynę A stosuje się ponadto z dobrymi wynikami do leczenia niektórych chorób autoimmunologicznych (zapalenia jjagodówki, pierwotnie postępującego gośćca stawowego, łuszczycy i miastenii).
W literaturze patentowej opisano następujące mikroorganizmy używane do wytwarzania kompleksu cyklosporyny: Cylindrocarpon lucidum Booth, NRRL 5760 (szwajcarski opis patentowy nr 589716), Tolypocladium inflatum Gams, NRRL 8044 (według wcześniejszej systematyki -Trichoderma polysporum (Link ex Pers/Rifai) szwajcarski opis patentowy nr 603 790); według Bisseta (1983) - Tol. inflatum W.Gams (1971) jest synonimem Tol.niveum (Rostrup) Bisset comb. mov. i Fusarium solani, MCI-1549, MCI-1550 (publikacja japońskiego złgoszenia patentowego nr 8 263 093). W procesach fermentacji prowadzonych z użyciem wyżej wymienionych mikroorganizmów wytwarza się cyklosporynę na niskim poziomie po długim czasie fermentacji, a także i wydajność izolacji jest niska. Istniała zatem potrzeba znalezienia szczepów mikroorganizmów zdolnych do wytwarzania kompleksu antybiotyków cyklosporynowych lub składników tego kompleksu, w wyższych stężeniach i w bardziej korzystnych warunkach niż przy użyciu poprzednich szczepów.
W wyniku badań szczepów grzybów nitkowatych izolowanych z gleby, nieoczekiwanie odkryto szczep mikroorganizmu, w którym zachodzi biosynteza kompleksu antybiotyków cyklosporynowych.
W oparciu o powyższe odkrycie opracowano sposób, będący przedmiotem wynalazku, to jest sposób wytwarzania kompleksu antybiotyków cyklosporynowych i/lub składników tego kompleksu czyli cyklosporyny A, cyklosporyny B i cyklosporyny C, przez aerobową fermentację nitkowatego szczepu grzyba, w którym zachodzi biosynteza powyższego antybiotyku na pożywce zawierającej przyswajalne źródła węgla i azotu oraz sole mineralne i izolowanie wytworzonych produktów, przy czym sposób ten polega na tym, że prowadzi się hodowlę szczepu nowego gatunku grzyba Tolypocladium varium wytwarzającego kompleks cyklosporyny, zwłaszcza Tolypocladium varium sp.nov. CY/93, zdeponowanego w Narodowej Kolekcji Mikroorganizmów Rolniczych i Przemysłowych w Budapeszcie (Węgry) pod numerem NCAIM/P/F 001005, na pożywce zawierającej źródła węgla, organiczne i nieorganiczne źródła azotu i sole mineralne, w warunkach aerobowych,w temperaturze 25-30°C, po czym ewentualnie izoluje się i oczyszcza kompleks antybiotyków cyklosporynowych lub składniki tego kompleksu.
W wyniku procesu prowadzonego sposobem według wynalazku uzyskuje się brzeczkę o wysokim stężeniu cyklosporyny. Brzeczka fermentacyjna, oprócz cyklosporyny A, jako produktu głównego, zawiera ponadto również niewielkie ilości cykosporyny B i cyklosporyny C.
Mikroorganizmu służącego do biosyntezy, oznaczonego symbolem CY/93, nie można było zaliczyć na podstawie badań taksonomicznych do żadnego gatunku grzyba wytwarzającego kompleks antybiotyków cyklosporynowych. Gatunek Tolypocladium varium sp.nov. CY/93 jest nowym taksonem rodzaju Tolypocladium, dającym się zróżnicować na poziomie gatunku.
Cechy taksonomiczne uzyskanego nowego gatunku grzyba porównano z podstawowymi, charakterystycznymi właściwościami rodzaju Tolypocladium.
Rodzaj Tolypocladium opisał po raz pierwszy Gams w 1971 r. jako nowy rodzaj rodziny Moniliales rosnących na glebie. Cechami charakterystycznymi tego rodzaju są powolny wzrost, białe kolonie poduszkowantego kształtu, terminalne i boczne fialida rozwijające się częściowo na krótkim bocznym odgałęzieniu z silnie nabrzmiałą podstawą i włókienkowatą, często łukowato wygiętą szyjką, kończącą się jednokomórkowym konidium. W obrębie tego rodzaju Gams wyodrębnił 3 nowe gatunki, to jest T.geodes, T.cylindrosporum i T.inflatum. T.geodes odznacza się wyraźną wonią gleby charakterystyczną dla Actinomycetes, natomiast nowy T.vaiiumsp.nov.CY/93 jest zupełnie pozbawiony tej cechy. Ponadto, komórki podstawowe T.geodes są znacznie węższe niż odpowiednie komórki T.varium sp.nov.CY/93. Konidia T.cylindrosporum są charakterystycznie długie i wydłużone, podczas gdy konidia T.varium sp.nov.CY/93 są kuliste i tylko lekką wydłużone. Konidia T.inflatum są owalne, dłuższe niż te, które obserwuje się w hodowli T.varium sp.nov.CY/93. Fialida T.inflatum tworzą się charakterystycznie baldaszkowato, albo bezpośrednio na strzępkach albo na komórkach podstawowych odługości 2 do 3μηι. W T.varium sp.nov.CY/93 nie obserwuje się takich baldaszkowatych form ułożenia, wykrywa się je tylko od czasu do czasu, sporadycznie. Głównie z powodu bawełno-podobnej, powietrznej grzybni o barwie
162 959 białej, kolonie wszystkich znanych gatunków w Tolypocladium mają barwę białą, a odwrotna strona tych kolonii ma barwę żółtawo-szarą, żółtą lub jest bezbarwna. Nie wytwarzają one typowych, rozpuszczalnych barwników.
Natomiast T. varium sp.nov.CY/93 można odróżnić w ten sposób, że na pożwyce zawierającej glukozę i pepton oraz wyciąg słodowo-drożdżowy wytwarzany jest z czasową zmiennością rozpuszczalny pigment o barwie odpowiednio ciemnoszarej i czarnej. Badania taksonomiczne nowego gatunku w porównaniu z innymi znanymi gatunkami Tolypocladium przeprowadzono opierając się na publikacjach: W.Gams, Persoonia, 6 185-191 (1971), G.L.Barron, Can. J.Bot. 5R, 439-442 (1980) i J.Bisset, Can.J.Bot. 61, 1311-1329 (1983).
Cechy diagnostyczne Tolypocladium varium sp.nov.CY/93 można podsumować następująco.
Dziesięciodniowe kolonie mają średnicę od 10 do 25 mm, ich powierzchnia pokryta jest bawelno-podobną, licznie zarodnikującą grzybnią powietrzną o barwie białej. Spodnia strona kolonii jest zabarwiona na kolor żółtoszary lub brudnoszary. Na niektórych złożonych pożywkach wytwarza się rozpuszczalny, ciemnoszary barwnik. Na strzępkach powietrznej grzybni obserwuje się sporulację zarówno na końcach jak i boczną. Fialida występują pojedynczo, rzadko, sporadycznie w baldaszkach (werticilach), bezpośrednio na strzępkach albo na krótkich (12-3pm) komórkach podstawowych. Fialida zbudowane są z nabrzmiałej podstawy (2-4 X 2-3gm) i długiej nitkowatej szyjki (2-4 X 5-0,6pm). Konidia główek są małe (2-3 X 1,3-2,2μιη), na ogół kuliste i gładkie. Specyficzna nazwa „varium“ odzwierciedla zmienność fialidów. Tol. varium wykazuje w swym cyklu życiowym pewne podobieństwo do rodzaju Harposporium. Szczep oznaczony CY/93, w hodowli powierzchniowej, nie potrafi wykorzystać rafinozy, natomiast rośnie w hodowli powierzchniowej, na następujących źródłach węgla: mannit, inozyt, sacharoza, fruktoza, ramnoza, galaktoza, dekstroza, arabinoza i ksyloza. Hodowle tego szczepu słabo rozwijają się na agarze odżywczym i na agarze z wyciągiem słodowym, natomiast dobrze rozwijają się na agarze z mączką sojową, na agarze Czapek'a i agarze ziemniaczanym z dekstrozą. Agar z mączką owsianą i agar z wyciągiem dekstrozowo-drożdżowym nie nadają się do przechowywania szczepu.
Tol.varium wyraźnie różni się od Tol. trigonosporum, który wytwarza konidia trójkątne w widoku z lekko wklęsłymi końcami. Tol.varium różni się także od Tol. balanoides, który wytwarza boczne fialida o kształcie butelkowatym.
Ponadto, szczep holotypowy (CY/93) Tolypocladium varium n.sp. różni się od szczepu Tolypocladium inflatum (CBS 714.70) typu autentycznego tym, że ten ostatni szczep wytwarza obfitą grzybnię powietrzną o barwie białej podczas hodowli na pożywce agarowej z maltozą, natomiast Tolypocladium varium sp.nov. CY/93 nie wytwarza takiej grzybni powietrznej. Szczep Tolypocladium inflatum wytwarza czerwonobrązowy endopigment w swej grzybni podstawowej na pożywce agarowej zawierającej związek żelaza i pepton, a grzybnia podstawowa Tolypocladium carium sp.nov. CY/93 pozostaje jasnożółta. Szczep Tolypacladium varium sp. nov. CY/93 nie wykorzystuje arabinozy, a szczep Tolypocladium inflatum wykorzystuje ją. Wykorzystując azotyn sodowy ten ostatni szczep wytwarza obfitą grzybnię, a Tolypocladium varium sp.nov. CY/93 nieznacznie wzrasta.
W poniższej tabeli przedstawiono pewne właściwości Tolypocladium varium sp. nov. CY/93 w porównaniu z innymi szczepami autentycznymi Tolypocladium orazzTrichodermapolysporum ATCC 16641 i Cylindrocarpon lucidum NRRL 5760.
| TolypocladiumTohpocladiumTolypocladiumToh pot ladium Tolypocladium | Trichcderma pohsporum A CC 16641 | Cjlmdrocarpon lucicum SRRL S760 | |||||
| urtum | csłindrospo- rumCBS71'70 | cyhndrospo rum CBS 718 70 | geodes CBS 721 70 | geodes 722 70 | |||
| 1 | 1 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| Rozkład <elulo/\ | - | T — -r | - . _ | ||||
| Crz\bniu powietrzna zielona lub mebies kawozielona | • - - | ||||||
| W siwar/antc czerwonego rozpuszczalnego pigmentu nj agarze Kinga | — |
U brązowego pigmentu na aga · rze zawierającym związek zclaza i pcpion
162 959
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| Wytwarzanie ciemnobrązowego pigmentu na agarze z gliceryną syntetyczną | -t 4- - | ||||||
| Wykorzystanie sacharozy | 1- 4- + | + + * | + + + | + + *- | + + + | -t- + + | |
| Wykorzystanie insuliny | - | - | - | - | + τ - | ||
| Wzrost w 5°C | + + + | T + * | + * + | -+ + T | + r + | ||
| Wzrost w 37eC | - | - | - | + 4- 4- | |||
| Odporność na ogrzewanie w 504C przez 60 minut | ~ τ | — ~ | Η. - * | ||||
| Wytwarzanie kwasu z glukozy | — | - *4 | ± | ± | + -«-·* | — τ — | + * T |
| Wykorzystanie whcylanu sodowego | - | - | - | * + + | -* + - | ||
| Wykorzystanie maiomanu sodowego | + - | + + | + + | + + | T + | ||
| Wykorzystanie winianu sodowego | + | + + | + + | + τ | + + | ||
| Wytwarzanie liliowego rozpuszczalnego barwnika na agarze z tyrozyną i leucyną | + + + | + + + | . |
Dużą zaletą szczepu Tolypocladium varium sp. nov. CY/93 jest właściwość szybkiego wzrostu. Jest to cecha bardzo korzystna, jeśli przy tym uwzględni, że szczep ma zdolność wykorzystania sacharozy, glukozy, sorbozy, maltozy, fruktozy, skrobi, gliceryny oraz różnych tłuszczy i olei jako źródeł węgla oraz różnych organicznych i nieorganicznych źródeł azotu, takich jak namok kukurydziany, pepton, wyciąg drożdżowy, wyciąg mięsny, azotan sodowy, azotan amonowy, siarczan amonowy oraz różne aminokwasy. Poza wymienionymi powyżej źródłami węgla i azotu, podłoże hodowlane stosowne do wytwarzania kompleksu antybiotyków cyklosporynowych może zawierać również sole mineralne (chlorek potasowy, siarczan magnezowy, dwuwodorofosforan potasowy), pierwiastki śladowe (sole miedzi, manganu, żelaza), a ponadto witaminy i środki zapobiegające pienieniu.
W korzystnym wariancie sposobu według wynalazku, ciekłą pożywkę zaszczepia się zawiesiną konidiów i grzybni przygotowaną przez hodowlę Tolypocladium varium sp. nov. CY/93 na skosach agarowych. Po trzydniowej inkubacji, uzyskaną hodowlę wstępną stosuje się do inokulacji pożywki stosowanej do produkcji antybiotyku, po czym prowadzi się inkubację w temperaturze 25-30°C, korzystnie 25°C, w ciągu 5-7 dni. Podczas fermentacji, wartość pH utrzymuje się w zakresie 6,0-2,5, korzystnie 5,2. Fermentację prowadzi się w warunkach aerobowych, energicznie mieszając (750-1000 obrotów/minutę) i przepuszczając 300 litrów powietrza/godzinę.
Zawartość cyklosporyny w brzeczce monitoruje się podczas fermentacji metodami testów mikrobiologicznych i wysokosprawnej chromatografii cieczowej. Po osiągnięciu maksymalnego stężenia antybiotyku, izoluje się go z brzeczki znanymi metodami ekstrakcji i/lub adsorpcji.
Stężenie cyklosporyny w brzeczce oznacza się na podstawie pomiaru aktywności przeciwgrzybiczej metodą dyfuzyjną na płytkach. Do testów można stosować Aspergillus niger, Aspergillus japonicus i Curvularia lunata (M.Deryfuss i inni, European J.Appl. Microbiol. 3, 125-133 (1976)). Przy oznaczaniu stężenia cyklosporyny w brzeczce metodą HPLC, próbki brzeczki rozcieńcza się 10-krotnie metanolem (F. Kreuzig, J. Chromatog. 290,181 (1984)). Zastosowanie nowego szczepu Tolypocladium varium sp. nov. CY/93 pozwala na wytwarzanie kompleksu antybiotyków cyklosporynowych zawierającego cyklosporynę A jako produkt główny oraz małe ilości cyklosporyny B i cyklosporyny C z wysoką wydajnością 950/fg/ml.
Do izolacji kompleksu antybiotyków cyklosporynowych z brzeczki fermentacyjnej stosuje się korzystnie metody ekstrakcji. Przed ekstrakcją grzybnię oddziela się przez filtrację lub wirowanie. Antybiotyki wytworzone w procesie fermentacji wypłukuje się z komórek mikroorganizmu, korzystnie niższymi alkanolami, zwłaszcza metanolem albo ketonami ogranicznymi, zwłaszcza acetonem. Ekstrakcję cyklosporyn znajdujących się w przesączu z brzeczki prowadzi się za pomocą
162 959 nie mieszających się z wodą rozpuszczalników organicznych, takich jak octan etylowy, octan n-butylowy, dwuchlorometan, 1,2-dwuchloroetan lub chloroform, korzystnie octan n-butylowy. Uzyskany po ekstrakcji surowy produkt zanieczyszczony jest wytwarzanymi przez grzyba barwnikami czerwonym i fioletowym. Usuwa się je przez- adsorpcję na węglu aktywnym lub żelu krzemionkowym. Ewentualne zanieczyszczenia lipidowe (środek przeciw pienieniu) oddziela się przez rozdział w układzie eter naftowy-metanol zawierającym 10%o wody. Zanieczyszczenia przechodzą do warstwy eteru naftowego. Warstwę metanolowo-wodną zatęża się pod zmniejszonym ciśnieniem, po czym prowadzi się ekstrakcję pozostałości wodnej dwuchlorometanem. Po odparowaniu rozpuszczalnika uzyskuje się oczyszczoną cyklosporynę. Cyklosporynę A oddziela się od pozostałych składników kompleksu, występujących w małych ilościach, techniką chromatografii kolumnowej i rekrystalizacji.
Strukturę wyizolowanych produktów wyjaśniono metodami UV, IR, iH-NMR, i3C-NMR, spektroskopii masowej i analizy aminokwasów.
Wynalazek ilustrują poniższe przykłady.
Przykład I. Z hodowli Tolypocladium varium sp. nov. CY/93 na skosie agarowym z wyciągiem słodowo-drożdżowym przygotowuje się na zawiesinę konidiów lub grzybni w 5 ml 0,9% roztworu chlorku sodowego. lml tej zawiesiny stosuje się do zaszczepienia 100 ml sterylnej pożywki inokulacyjnej IC w kolbie Erlenmeyera o pojemności 500 ml.
Skład pożywki IC
| Glukoza | 40 g |
| Pepton kazeinowy | 5g |
| Azotan sodowy | 3g |
| Dwuwodorofosforan potasowy | 2g |
| Chlorek potasowy | 0,5 g |
| Siarczan magnezowy - 7 H2O | 0,5 g |
| Siarczan żelazawy - 7 H2O | 0,0 lg |
w 1000 ml wody wodociągowej.
Przed sterylizacją, pH pożywki doprowadza się do wartości 5,2 i mieszaninę sterylizuje się w temperaturze 121°C w ciągu 25 minut. Hodowlę inkubuje się w temperaturze 25°C na wstrząsarce rotacyjnej (340obrotów/minutę), po czym porcjami po 5 ml tej hodowli inokulum szczepi się 15 kolb Erlenmeyera o pojemności 500 ml, zawierających po 100 ml sterylnej pożywki FCi.
Skład pożywki FCi
| Glukoza | 80 g |
| Trypton | 40 g |
| Mocznik | 2g |
| Siarczan amonowy | 12g |
| Azotan sodowy | 3g |
| Dwuwodorofosfosran potasowy | 2g |
| Chlorek potasowy | 0,5 g |
| Siarczan magnezowy -7H2O | 0,5 g |
| Siarczan żelazawy -7 H2O | Ol g |
w 1000 ml wody wodociągowej
Przed sterylizacją, pH pożywki doprowadza się do wartości 5,2, po czym mieszaninę sterylizuje się w temperaturze 121°C w ciągu 25 minut. Kolby inkubuje się w temperaturze 25°C na wstrząsarce rotacyjnej (340obrotów/minutę). Stężenie antybiotyku w brzeczce podczas fermentacji monitoruje się wykonując testy dyfuzji na płytkach, stosując Aspergillus niger jako organizm testowy. Przy oznaczeniach stężenia kompleksu cyklosporyny w brzeczce, jako standard stosuje się cyklosporynę A.
162 959
Fermentację prowadzi się przez 168 godzin, uzyskując stężenie kompleksu cyklosporyny w brzeczce równe 400 /yg/ml. Kompleks cyklosporyny izoluje się następująco.
Komórki z litra brzeczki filtruje się i antybiotyki wymywa się z komórek dwukrotnie 200 ml metanolu. Roztwór metanolowo-wodny zatęża się pod zmniejszonym ciśnieniem, po czym prowadzi się ekstrakcję kompleksu antybiotyku z koncentratu wodnego porcjami po 50 ml octanu n-butylowego. Ekstrakcję cyklosporyny zawartej w przesączu z brzeczki prowadzi się 200 ml octanu n-butylowego. Ekstrakty octanu n-butylowego łączy się, suszy nad bezwodnym siarczanem sodowym i odparowuje pod zmniejszonym ciśnieniem w temperaturze 40°C. 3,7 g uzyskanego surowego produktu rozpuszcza się w 10 ml metanolu i przenosi na wierzchołek kolumny wypełnionej żelem Sephadex LH-20 (długość kolumny 40 cm, średnica 2,5 cm) traktowanym uprzednio metanolem. Zanieczyszczenia lipidowe oddziela się przez eluowanie metanolem. Frakcje zawierające kompleks cyklosporyny odparowuje się pod zmniejszonym ciśnieniem w temperaturze 40°C. Rozdział składników uzyskanego kompleksu cyklosporyny (1,05 g) prowadzi się metodą chromatografii, w kolumnie wypełnionej 20 g żelu krzemionkowego Kiselgel 40 (Reanal, Budapeszt). Eluowanie prowadzi się mieszaninami chloroformu i metanolu, zawierającymi zwiększające się stopniowo objętości metanolu. Eluowanie rozpoczyna się 100 ml chloroformu i kontynuuje się mieszaninami chloroform-metanol po 100 ml, zwiększając zawartość metanolu w kolejnych porcjach rozpuszczalnika o 0,5%. Zawartość cyklosporyny w poszczególnych frakcjach oznacza metodą chromatografii cienkowarstwowej na płytkach Kieselgel 60 F254 , DC Alufoil (Merck), stosując jako rozpuszczalnik rozwijający mieszaninę octanu etylowego i izopropanolu (95:5), a do detekcji - pary jodu. Cyklosporyny A, B i C eluuje się z kolumny mieszaninami metanolu z chloroformem, zawierającymi odpowiednio 2,0%, 2,5% i 3,0% metanolu. Frakcje zawierające czyste składniki odparowuje się pod zmniejszonym ciśnieniem i otrzymuje się 225 mg cyklosporyny A (temperatura topnienia 137-140°C, [ct]d = -189°C (metanol)), 25 mg cyklosporyny B (temperatura topnienia 149-151°^ i 52 mg cyklosporyny C (temperatura topnienia 150-152°C).
Przykład II. Pięć litrów pożywki inokulacyjnej IC sterylizuje się w temperaturze 121°C w ciągu 45 minut w K^-litrowym fermentorze laboratoryjnym, po czym zawartość fermentora zaszczepia się 200 ml wytrząsanej hodowli inokulum, przygotowanej w sposób opisany w przykładzie I i prowadzi się inkubację w temperaturze 25°C, mieszając z szybkością 750 obrotów/minutę i napowietrzając hodowlę przez przepuszczanie 3001/godz. powietrza. Proces fermentacji prowadzi się przez 72 godziny. Następnie, 500 ml tej hodowli inokulum szczepi się 5 litrów pożywki FC2 w 10-litrowym fermentorze laboratoryjnym. Pożywkę tę sterylizuje się uprzednio w temperaturze 121°C w ciągu 45 minut.
Skład pożywki FC2
| Glukoza | 80 g |
| Trypton | 40 g |
| Mocznik | 2g |
| Siarczan amonowy | 12g |
| Azotan sodowy | 3g |
| Dwuwodorofosforan potasowy | 2g |
| Chlorek potasowy | 0,5 g |
| Siarczan magnezowy -7H2O | 0,5 g |
| Siarczan miedziowy ÓH2O | 0,01 g |
| Siarczan manganowy -7H2O | 0,01 g |
| Siarczan żelazawy -7 H2O | 0,01 g |
w 1000 ml wody wodociągowej
Przed sterylizacją, pH pożywki doprowadza się do wartości 5,2. Zaszczepioną hodowlę inkubuje się w temperaturze 25°C, mieszając z szybkością 750 obrotów/minutę i przepuszczając 3001/godz. powietrza. W tych warunkach prowadzi się fermentację przez 144 godziny aż do osiągnięcia maksymalnej zawartości cyklosporyny, po czym zbiera się brzeczkę.
Cyklosporynę A izoluje się z 4,8 litra brzeczki fermentacyjnej zawierającej 500//g/ml kompleksu cyklosporyny w następujący sposób.
162 959
Komórki mikroorganizmu odwirowuje się, po czym wymywa się kompleks cyklosporyny z komórek dwiema porcjami po litrze metanolu. Roztwór metanolowo-wodny zatęża się pod zmniejszonym ciśnieniem, następnie prowadzi się ekstrakcję kompleksu antybiotyku z wodnego koncentratu 2 porcjami po 250 ml octanu n-butylowego (2 X 250 ml).
Ekstrakcję kompleksu cyklosporyny prowadzi się z przesączu z brzeczki fermentacyjnej 2 porcjami po 500 ml octanu n-butylowego. Wszystkie ekstrakty octanu n-butylowego łączy się, suszy nad bezwodnym siarczanem sodowym i odparowuje się roztwór pod zmniejsznym ciśnieniem w temperaturze 40°C. Wstępne oczyszczanie 19,2 g surowego produktu prowadzi się metodą chromatograficzną, w kolumnie wypełnionej 100 g żelu Kieselgel 60 (rozmiary cząstek 0,0630,2 mm), stosując do eluowania mieszaninę chloroformu metanol i octanu (92:4:4). Obecność kompleksu cyklosporyny w poszczególnych frakcjach oznacza się metodą chromatografii cienkowarstwowej, stosując płytki Kieselgel 60 F254, DC Alufoil (Merck), mieszaninę heksanu i acetonu (2:1) jako układ rozwijający i odczynnik chlor/tolidyna do detekcji. Frakcje zawierające kompleks cyklosporyny odparowuje się do suchej pozostałości. Pozostałość po odparowaniu (5,28 g) poddaje się chromatografii w kolumnie, uzyskując cyklosporynę A. Kolumnę wypełnia się 115 g żelu Kieselgel 60 (rozmiary cząstek 0,063-0,2 mm), a eluowanie prowadzi się mieszaninami heksanu i acetonu o stopniowo wzrastającej zawartości acetonu. Cyklosporynę A eluuje się z kolumny mieszaniną zawierającą 23% acetonu. Po odparowaniu frakcji zawierających cyklosporynę A uzyskuje się l,46g tego antybiotyku.
Przykład III. Z hodowli Tolypocladium varium sp.nov.CY/93 na skosie agarowym z wyciągiem słodowo-drożdżowym przygotowuje się zawiesinę konidiów lub grzybni w 5 ml 0,9% roztworu chlorku sodowego i stosuje się do zaszczepienia 800 ml pożywki inokulacyjnej IC, opisanej w przykładzie I, uprzednio wysterylizowanej w 3-litrowej kolbie Erlenmeyera. Zawartość kolby inkubuje się na wstrząsarce rotacyjnej (340 obrotów/minutę) w temperaturze 25°C przez 2,5 dnia, po czym tą hodowlą zaszczepia się 5 litrów pożywki FC3, uprzednio wysterylizowanej w 10-llirowvm fermentorze laboratoryjnym w temperaturze 121°C przez 45 minut.
Skład pożywki FC3
| Sorboza | 60 g |
| Trypton | 40 g |
| Mocznik | 2g |
| Siarczan amonowy | 12g |
| Azotan sodowy | 3g |
| Dwuwodorofosforan potasowy | 2g |
| Chlorek potasowy | 0,5 g |
| Siarczan magnezowy ·7 H2O | 0,5 g |
| Siarczan manganowy ·7 H2O | 0,01 g |
| Siarczan żelazawy ·7 H2O | 0,01 g |
| w | ' 1000 ml wody wodociągowej |
Przed sterylizacją, pH pożywki doprowadza się do wartości 5,2. Zaszczepioną hodowlę inkubuje się w temperaturze 25°C, mieszając z szybkością 1000 obrotów/minutę i przepuszczając 3001/godz. powietrza. Proces fermentacji prowadzi się przez 168 godzin, do czasu aż zawartość kompleksu cyklosporyny w brzeczce osiągnie poziom 600jtfg/ml (oznaczenie zawartości metodą mikrobiologiczną).
Po izolacji prowadzonej w sposób opisany w przykładzie II uzyskuje się 310 mg cyklosporyny A z litra brzeczki.
Przykład IV. Z 5-7 dniowych hodowli Tolypocladium varium sp.nov.CY/93(NCAIN/P/F 001005) na skosie agarowym z wyciągiem słodowo-drożdżowym przygotowuje się zawiesinę konidiów lub grzybni w 5 ml 0,9% roztworu chlorku sodowego i stosuje się ją do zaszczepienia 500 ml pożywki inokulacyjnej IC opisanej w przykładzie I, uprzednio wysterylizowanej w 3-litrowej kolbie Erlenmeyera. Zawartość kolby inkubuje się na wstrząsarce rotacyjnej (340obrotów/minutę) w temperaturze 25°C w ciągu 3 dni, po czym tą hodowlą zaszczepia się 5 litrów pożywki FC4, uprzednio wysterylizowanej w 10-łltrowym fermentorze laboratoryjnym w temperaturze 121°C w ciągu 45 minut.
162 959
Skład pożywki FC4
| Maltoza | 80 g |
| Trypton | 40 g |
| Mocznik | 2g |
| Siarczan amonowy | 12g |
| Azotan sodowy | 3g |
| Dwuwodorofosforan potasowy | 2g |
| Chlorek potasowy | 0,5 g |
| Siarczan magnezowy ·7 H2O | 0,5 g |
| Siaiczan manganowy -7H2O | 0,01 g |
| Siarczan miedziowy ·5 H2O | 0,01 g |
| Siarczan żelazawy ·7 H2O | 0,01 g |
w 1000 ml wody wodociągowej
Przed sterylizacją, pH pożywki doprowadza się do wartości 5,2. Po inokulacji, brzeczkę fermentacyjną inkubuje się w temperaturze 25°C, mieszając na wstrząsarce rotacyjnej z szybkością 1000 obrotów/minutę i przepuszczając 3001/godz. powietrza. Proces fermentacji prowadzi się przez 144 godziny. Po tym czasie brzeczka zawiera 620pg/mI kompleksu cyklosporyny (według oznaczenia mikrobiologicznego).
Izolację prowadzi się w sposób opisany w przykładzie I. Z litra brzeczki uzyskuje się 305 mg cyklosporyny A.
Przykład V. Z 5-7 dniowej hodowli Tolypocladium varium nov.sp.CY/93 (NCAIM/P/F 001005) na skosie agarowym z wyciągiem słodowo-drożdżowym przygotowuje się zawiesinę konidiów lub grzybni w 5 ml 0,9% roztworu chlorku sodowego i stosuje się ją do inokulacji 500 ml pożywki inokulacyjnej IC, opisanej w przykładzie I, uprzednio wysterylizowanej w 3-litrowej kolbie Erlenmeyera. Zawartość kolby inkubuje sią na wstrząsarce rotacyjnej (340 obrotów/minutę), w temperaturze 25°C wciągu 2 dni, po czym tą hodowlą zaszczepia się 5 litrów pożywki FC1, uprzednio wysterylizowanej w 10-litrowym fermentorze laboratoryjnym w temperaturze 121°C, w ciągu 45 minut. Po inokulacji, brzeczkę fermentacyjną miesza się z szybkością 750 obrotów/minutę w temperaturze 25°C, przepuszczając 3001/godz. powietrza. Po 96 godzinach hodowli dodaje się wysterylizowany, wodny roztwór 100 g maltozy i kontynuuje się fermentację do 144 godzin. Po tym czasie zawartość kompleksu cyklosporyny w brzeczce wynosi 950/ig/mi (według oznaczenia mikrobiologicznego). Łącznie zbiera się 4,8 litrów brzeczki. Po izolacji prowadzonej w sposób podany w przykładzie II uzyskuje się 2,75 g cyklosporyny A.
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz.
Cena 10 000 zł
Claims (3)
- Zastrzeżenia patentowe1. Sposób wytwarzania kompleksu antybiotyków cyklosporynowych lub składników tego kompleksu, to jest cyklosporyny A, cyklosporyny B i cyklosporyny C, przez aerobową fermentację nitkowatego szczepu grzyba, w którym zachodzi biosynteza tych antybiotyków na pożywce zawielającej przyswajalne źródła węgla i azotu oraz sole mineralne i izolowanie wytworzonych produktów, znamienny tym, że prowadzi się hodowlę szczepu nowego gatunku grzyba Tolypocladium varium wytwarzającego kompleks antybiotyków cyklosporynowych na pożywce zawierającej źródła węgla, organiczne i nieorganiczne źródła azotu i sole mineralne, w warunkach aerobowych, w temperaturze 25-30°C, po czym ewentualnie izoluje się i oczyszcza kompleks antybiotyków cyklosporynowych lub składniki tego kompleksu.
- 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako szczep nowego gatunku grzyba stosuje się Tylopocladium varium sp.nov.CY/93, zdeponowany w Narodowej Kolekcji Mikroorganizmów Rolniczych i Przemysłowych w Budapeszcie (Węgry), pod numerem NCAIM/P/F 001005.
- 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że proces fermentacji prowadzi się na pożywce zawierającej pepton, siarczan amonowy i trypton jako źródła azotu oraz glukozę, maltozę, sorbozę i sorbit jako źródła węgla.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| HU886497A HU201577B (en) | 1988-12-20 | 1988-12-20 | Process for producing cyclosporin antibiotics |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL162959B1 true PL162959B1 (en) | 1994-01-31 |
Family
ID=10971727
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL28287689A PL162959B1 (en) | 1988-12-20 | 1989-12-20 | Method for manufacturing a complex of cyclosporine antibiotics |
Country Status (23)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5156960A (pl) |
| EP (1) | EP0379708B1 (pl) |
| JP (1) | JPH0763356B2 (pl) |
| AT (1) | AT393135B (pl) |
| BG (1) | BG60274B1 (pl) |
| CA (1) | CA2006144C (pl) |
| CZ (1) | CZ283557B6 (pl) |
| DD (1) | DD290356A5 (pl) |
| DE (1) | DE58908740D1 (pl) |
| DK (1) | DK174719B1 (pl) |
| FI (1) | FI92603C (pl) |
| FR (1) | FR2640641B1 (pl) |
| GB (1) | GB2227489B (pl) |
| HU (1) | HU201577B (pl) |
| IT (1) | IT1237799B (pl) |
| LV (2) | LV10102B (pl) |
| NO (1) | NO175873C (pl) |
| PL (1) | PL162959B1 (pl) |
| RU (1) | RU1836425C (pl) |
| SE (1) | SE505442C2 (pl) |
| SK (1) | SK279768B6 (pl) |
| UA (1) | UA13320A (pl) |
| YU (1) | YU47100B (pl) |
Families Citing this family (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1992013094A1 (fr) * | 1991-01-25 | 1992-08-06 | Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. | Procede pour produire de la cyclosporine a et/ou c |
| ATE127528T1 (de) * | 1991-04-06 | 1995-09-15 | Dresden Arzneimittel | Verfahren zur fermentativen herstellung und isolierung von cyclosporin a sowie neue cyclosporin- bildende stämme. |
| FI92334C (fi) * | 1992-12-30 | 1994-10-25 | Leiras Oy | Menetelmä syklosporiinien tuottamiseksi ja menetelmässä käytettävä uusi Tolypocladium-kanta |
| SI9300303A (en) * | 1993-06-08 | 1994-12-31 | Krka Tovarna Zdravil | Process for isolation of hypolipemic effective substance |
| KR100304324B1 (ko) * | 1994-10-13 | 2001-11-22 | 김용규 | 사이클로스포린a의제조방법 |
| KR100341355B1 (ko) * | 1994-10-14 | 2002-10-25 | 주식회사종근당 | 사이클로스포린a의제조방법 |
| KR0126610B1 (ko) * | 1994-10-18 | 1997-12-29 | 김충환 | 고생산 세포융합변이균주에 의한 사이클로스포린 a의 제조방법 |
| EP0725076B1 (en) * | 1995-02-01 | 2001-06-06 | National Research Development Corporation of India | A process for the preparation of cyclosporin A from tolypocladium species |
| EP0846699A1 (en) * | 1995-06-29 | 1998-06-10 | Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. | Substance wf16616, process for production thereof, and use thereof |
| DE19611094C2 (de) | 1996-03-21 | 1999-06-17 | Dresden Arzneimittel | Verfahren zur Reinigung von Cyclosporin A und/oder verwandten Cyclosporinen aus einem Cyclosporin-haltigen Rohextrakt unter Anwendung chromatographischer Verfahren mit Kieselgel als Adsorbens |
| US5709797A (en) * | 1996-06-05 | 1998-01-20 | Poli Industria Chimica S.P.A. | Method of isolating cyclosporins |
| US5747330A (en) * | 1996-06-05 | 1998-05-05 | Poli Industria Chimica | Antibiotic producing microbe |
| WO2000040219A1 (en) | 1998-12-30 | 2000-07-13 | Dexcel Ltd. | Dispersible concentrate for the delivery of cyclosporin |
| US7732404B2 (en) | 1999-12-30 | 2010-06-08 | Dexcel Ltd | Pro-nanodispersion for the delivery of cyclosporin |
| ATE306558T1 (de) | 2000-02-29 | 2005-10-15 | Biocon Ltd | Herstellung und reinigung von cyclosporin-a |
| US7696165B2 (en) | 2006-03-28 | 2010-04-13 | Albany Molecular Research, Inc. | Use of cyclosporin alkyne analogues for preventing or treating viral-induced disorders |
| US7696166B2 (en) | 2006-03-28 | 2010-04-13 | Albany Molecular Research, Inc. | Use of cyclosporin alkyne/alkene analogues for preventing or treating viral-induced disorders |
| EP2151450A1 (de) * | 2008-07-29 | 2010-02-10 | Sandoz AG | Verfahren zur Aufarbeitung von mikrobiologisch hergestellten zyklischen Oligopeptiden |
| EP2701701B1 (en) * | 2011-04-28 | 2018-01-24 | Celgene Corporation | Methods and compositions using pde4 inhibitors for the treatment and management of autoimmune and inflammatory diseases |
| GB201319791D0 (en) * | 2013-11-08 | 2013-12-25 | Sigmoid Pharma Ltd | Formulations |
| CN117025407A (zh) * | 2023-06-28 | 2023-11-10 | 中国人民解放军海军特色医学中心 | 一株弯颈霉属真菌及其在制备抗辐损伤药物中的应用 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4117118A (en) * | 1976-04-09 | 1978-09-26 | Sandoz Ltd. | Organic compounds |
| DE2819094A1 (de) * | 1977-05-10 | 1978-11-23 | Sandoz Ag | Cyclosporin-derivate, ihre verwendung und herstellung |
| US4215199A (en) * | 1978-06-05 | 1980-07-29 | Sandoz Ltd. | Antibiotic production |
| SE448386B (sv) * | 1978-10-18 | 1987-02-16 | Sandoz Ag | Nya cyklosporinderivat, forfarande for framstellning av dem samt farmaceutisk komposition innehallande dem |
| US4764503A (en) * | 1986-11-19 | 1988-08-16 | Sandoz Ltd. | Novel cyclosporins |
-
1988
- 1988-12-20 HU HU886497A patent/HU201577B/hu unknown
-
1989
- 1989-12-18 DK DK198906409A patent/DK174719B1/da not_active IP Right Cessation
- 1989-12-19 UA UA4742791A patent/UA13320A/uk unknown
- 1989-12-19 SE SE8904262A patent/SE505442C2/sv unknown
- 1989-12-19 RU SU4742791A patent/RU1836425C/ru active
- 1989-12-20 JP JP1328529A patent/JPH0763356B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1989-12-20 FR FR898916878A patent/FR2640641B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1989-12-20 BG BG090701A patent/BG60274B1/bg unknown
- 1989-12-20 CA CA002006144A patent/CA2006144C/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-12-20 AT AT2891/89A patent/AT393135B/de not_active IP Right Cessation
- 1989-12-20 SK SK7225-89A patent/SK279768B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1989-12-20 EP EP89123535A patent/EP0379708B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1989-12-20 NO NO895160A patent/NO175873C/no not_active IP Right Cessation
- 1989-12-20 DD DD89335977A patent/DD290356A5/de not_active IP Right Cessation
- 1989-12-20 FI FI896157A patent/FI92603C/fi active IP Right Grant
- 1989-12-20 YU YU241589A patent/YU47100B/sh unknown
- 1989-12-20 IT IT22765A patent/IT1237799B/it active IP Right Grant
- 1989-12-20 US US07/454,005 patent/US5156960A/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-12-20 DE DE58908740T patent/DE58908740D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1989-12-20 CZ CS897225A patent/CZ283557B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1989-12-20 GB GB8928715A patent/GB2227489B/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-12-20 PL PL28287689A patent/PL162959B1/pl unknown
-
1992
- 1992-05-04 LV LVP-92-10A patent/LV10102B/en unknown
-
1993
- 1993-06-28 LV LVP-93-708A patent/LV10500B/lv unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| PL162959B1 (en) | Method for manufacturing a complex of cyclosporine antibiotics | |
| JP3111470B2 (ja) | 新規ポリペプチド化合物およびその製造法 | |
| FI92334B (fi) | Menetelmä syklosporiinien tuottamiseksi ja menetelmässä käytettävä uusi Tolypocladium-kanta | |
| WO1994016091A9 (en) | A process for producing immunosuppressives and a novel microbial species to be employed therein | |
| US5747330A (en) | Antibiotic producing microbe | |
| EP0781348B1 (en) | Process for manufacturing cyclosporin a by highly productive fusant strain | |
| CN110832066B (zh) | 一种伊维菌素B1b产生菌及其应用 | |
| US5854276A (en) | Substance WF16616, process for production thereof, and use thereof | |
| CN109182180B (zh) | 一种灰棕褐链霉菌及其发酵生产巴弗洛霉素a1的应用 | |
| US5516686A (en) | Fungicidal antibiotic producing Streptomyces sp. NCIMB 40212 | |
| US5426038A (en) | Process for production of an antibiotic compound with Zalerion arboricola | |
| KR0143769B1 (ko) | 항균성 폴리펩티드 화합물과 그 제조방법 및 이를 함유하는 약학 조성물 | |
| SI8912415A (sl) | Mikrobni postopek za proizvodnjo imunosupresivnih antibiotikov | |
| KR20000049023A (ko) | Ｆｒ900482 및 유사 화합물의 신규한 제조방법 | |
| KR830001245B1 (ko) | 항생물질 마이코플라네신의 제조방법 | |
| EP0187528B1 (en) | A new compound fr-68504, production thereof and use thereof | |
| EP0525846A1 (en) | Sporomiella intermedia and processes therefrom | |
| CN109321612A (zh) | 一种发酵生产巴弗洛霉素a1的方法 |