CN109321612A - 一种发酵生产巴弗洛霉素a1的方法 - Google Patents

一种发酵生产巴弗洛霉素a1的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种发酵生产巴弗洛霉素A1的方法，更具体涉及一种以灰棕褐链霉菌发酵生产巴弗洛霉素A1的方法。本发明通过菌种筛选及诱变育种筛选得到一株高产bafliomycins化合物的灰棕褐链霉菌，该菌株能够有效提高发酵液中bafliomycin A1化合物的效价，并且经过对于发酵过程中发酵培养基及发酵条件的悉心研究，有效提高了发酵生产bafliomycin A1的效率，提高了目标化合物bafliomycin A1的产率。发酵实验显示，本发明利用自行筛选的灰棕褐链霉菌FIM‑Ba150115发酵产bafliomycin A1的效价高达615.87mg/L左右，极大地有利于bafliomycin A1的提取纯化工作，可以满足工业化需求。

Description

一种发酵生产巴弗洛霉素A1的方法
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种发酵生产巴弗洛霉素A1的方法，更具体涉及一种以灰棕褐链霉菌发酵生产巴弗洛霉素A1的方法。
背景技术
Bafliomycins是一类由放线菌发酵产生的含有16元环骨架的多烯大环内脂类抗生素，化学结构上极为特殊，大部分此类化合物侧链结构中都含有一个六元环的半缩醛结构。已报道的bafilomycins化合物有bafilomycin A1，A2，B1，B2，C1，C2，D，E，F，K和L等。Bafilomycins具有抗细菌、抗真菌、杀虫、抗肿瘤和免疫抑制等多种生物活性，还可用于治疗骨质疏松、耳聋等。且已有研究表明，Bafilomycins系列化合物，特别是bafilomycinA1具有特异性的自噬抑制作用和较好的抗瘤作用，可作为抗肿瘤先导化合物研究，用于创制衍生新的抗肿瘤药物；而且Bafilomycin A1具有特异性的杀伤儿童急性B淋巴细胞白血病细胞的新作用，可为制备治疗白血病新药物提供新的配方。
bafilomycin A1是一种空泡H+-ATP酶(vacuolar-type H+-ATPase，V-ATPase)的特异性抑制剂，在极低的nmol/L水平即可对V-ATPase具有较强的抑制作用。V-ATPase广泛分布于真核生物的液泡、反式高尔基体、溶酶体、核内体、分泌颗粒等细胞内膜系统中，并根据细胞器官的微小酸性差别，各自发挥独立机能，是一种新的药物靶点。Violetta N等于2010年的研究发现，低剂量的bafilomycin A1可在一定程度上维持正常的自噬过程，这使应用bafilomycin A1治疗帕金森综合症等神经退行性疾病成为可能。2013年Hans Peter等报道bafilomycin A1可以作为抗体药物(antibody-drug conjugate，ADC)用于治疗肿瘤。2015年YUAN N等报道bafilomycin A1在低浓度下(1nM)通过抑制细胞自噬和促进细胞凋亡两种途径抑制并且杀死急性B淋巴细胞白血病细胞。可见bafilomycins具有很强的应用潜力。
然而，目前己报道的bafilomycins系列化合物的生产，多数以微生物发酵法获得，但整体的发酵产量却并不是很高。1984年Gerherd Werner等从10L灰色链霉菌发酵液中分离得到bafilomycin A1 45mg、bafilomycinA2 36mg、bafilomycinB1 92mg、bafilomycinB241mg、bafilomycinC1 120mg、bafilomycinC2 24mg，整体的发酵效价极低；2010年GavinCarr等报道，从海洋放线菌Streptomyces sp.RJA71和RJA635中分离得到了8个bafilomycins化合物，其中bafilomycin F-J等5个为新结构化合物，其它3个为bafilomycin A1、B1、D；2011年Yu等从菌株YIM56209的9.6L发酵产物分离得到bafilomycinA1 9.8mg；2011年魏刚等从海洋放线菌Y12-26的发酵液中分离得到了3个大环内酯类活性化合物bafilomycin D(14.7mg)、bafilomycin A1(15.8mg)、bafilomyein K(9.6mg)；2012年潘华奇等的专利CN103829351B报道卡伍尔链霉菌(Streptomyces cavourensis)经发酵产生的bafilomycin B1和bafilomycin C1，含量分别达23.45mg/L和6.603mg/L；2013年杨巍民等从海洋放线菌Y-0117的40L发酵液经分离纯化得到Bafilomycin D纯品约14.7mg。以上这些已公开的报道bafilomycins系列化合物的微生物发酵生产方法，普遍存在的问题即是产量都比较低，不足以达到工业化水平。而造成这一问题的主要原因除了发酵条件的影响外，现有发酵菌株的发酵活力和稳定性较差也是一个重要因素。可见，筛选出发酵活力强的菌株以及发酵条件的研究优化对于bafilomycins系列化合物的发酵生产具有重要的意义。
发明内容
为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种发酵生产bafilomycin A1的方法，以解决现有技术中bafilomycin A1化合物发酵效价低的问题。
为解决上述技术问题，本发明所述的一种发酵生产bafliomycins A1的方法，其特征在于，包括将发酵菌株接种于适宜发酵培养基中进行发酵培养的步骤；
所述发酵菌株为灰棕褐链霉菌，其分类命名为Streptomyces griseobrunneusFIM-Ba150115，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.15241，保藏日期为2018年1月18日，所述菌株为bafliomycins A1化合物高产菌株。
所述发酵培养基包括如下质量含量的组分：可溶性淀粉3.0-4.0％、蛋白胨1.5-3％、酵母粉1-2％、玉米浆干粉0.5-1.5％、碳酸钙0.2-0.3％，调pH值7.0-7.5。
所述发酵培养基还包括0.025-0.3％的前体物。
所述前体物包括异丁醇、异丁酸、醋酸铵、异亮氨酸、亮氨酸和/或缬氨酸。
所述发酵培养的条件包括：控制转速200-400rpm，通气量0.08-1.2vvm，于25-30℃进行发酵培养。
所述的发酵生产bafliomycins A1的方法，还包括将所述的灰棕褐链霉菌接种于种子培养基中进行种子液培养的步骤，所述种子培养基包括如下质量含量的组分：可溶性淀粉2.0％、蛋白胨2.0％、酵母粉1.0％、碳酸钙0.2％，调pH值7.2。
所述的发酵生产bafliomycins A1的方法，还包括将所述的灰棕褐链霉菌接种于ISP2斜面培养基中进行保存的步骤，所述ISP2斜面培养基包括如下质量含量的组分：葡萄糖0.4％、麦芽提取物1.0％、酵母提取物0.4％、琼脂1.8％，调pH值7.2。
所述的发酵生产bafliomycins A1的方法，还包括将发酵液中bafliomycins A1进行提纯的步骤。
所述提纯步骤包括：
(1)发酵结束后，取发酵液加入95％的乙醇进行浸泡，离心并弃菌渣，收集乙醇浸泡清液以0.5BV/h的速度上样于HP20大孔吸附树脂柱进行吸附，然后分别用6倍柱体积的水，和40％乙醇-水溶液来进行洗脱，洗脱流速为1BV/h，以除去部分杂质色素；随后用4倍柱体积的95％乙醇进行洗脱，收集洗脱液，浓缩得到膏状粗提物；
(2)取膏状粗提物加入少量甲醇超声溶解，后与G200-300目硅胶充分搅拌混匀，并真空干燥去除溶剂；并将伴有粗品的硅胶填装到G200-300目硅胶柱上层，然后分别用石油醚：乙酸乙酯＝8：1、石油醚：乙酸乙酯＝4：1、石油醚：乙酸乙酯＝2：1作为流动相进行梯度洗脱，分段收集洗脱液；
(3)将收集的洗脱液采用HPLC检测有效组分，合并相同组分后真空减压浓缩，收集浓缩液溶于DMSO后上样于DAC动态轴向压缩系统，经HPLC检测后合并目标产物，真空干燥后，得bafliomycins A1化合物纯品。
所述DAC动态轴向压缩系统，填料为C18，流动相为70％乙腈-水溶液，控制流速10ml/min，检测波长247nm。
本发明通过菌种筛选及诱变育种筛选得到一株高产bafliomycins化合物的灰棕褐链霉菌，该菌株能够有效提高发酵液中bafliomycin A1化合物的效价，并且经过对于发酵过程中发酵培养基及发酵条件的悉心研究，有效提高了发酵生产bafliomycin A1的效率，提高了目标化合物bafliomycin A1的产率。发酵实验显示，本发明利用自行筛选的灰棕褐链霉菌FIM-Ba150115发酵产bafliomycin A1的效价高达615.87mg/L左右，极大地有利于bafliomycin A1的提取纯化工作，可以满足工业化需求。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中，
图1为FIM-Ba150115菌株的进化树；
图2为HPLC法检测bafilomycin A1的标准曲线图；
图3为对照品(A)和发酵液样品bafilomycin A1(B)紫外吸收峰图谱；
图4为发酵化合物Ba0115的HPLC-Q-TOF-MS图谱；
图5为发酵化合物Ba0115的红外图谱；
图6为发酵化合物Ba0115的1H-NMR谱图；
图7为发酵化合物Ba0115的13C-NMR谱图。
具体实施方式
实施例1菌株来源
本实验室是于2012年8月在东海沉积物中，经分离、培养、发酵、活性测定获得多株放线菌，经初步测定，其中一株链霉菌对黑曲霉具有较强的抑菌活性。
经过对该菌株的自然分离纯化、发酵及后提取工艺获得化合物Ba0115，经质谱核磁等鉴定与巴弗洛霉素A1(bafilomycin A1)同质。但是原始菌株发酵生产bafilomycin A1效价较低，本实施例以该菌株为出发菌株进行菌株的诱变。
孢子悬液制备：将出发菌株接种于ISP2斜面28℃培养10d左右，取新鲜斜面加入10mL无菌生理盐水，用接种铲轻轻刮下，倒入带有玻璃珠的无菌摇瓶振荡20min，后用灭菌双层擦镜纸过滤菌丝，留下孢子悬液备用。
ARTP(常压室温等离子体)诱变：设置ARTP诱变育种仪的工作功率100W，气源为氩气，气流量10L/min，等离子体发射源与样品之间的照射距离为2mm，照射时间设为0、30、60、90、120、150S；取制备好的孢子悬液10ul均匀涂抹于无菌金属载片上，再将其放入ARTP仪中的样品载台；按程序进行等离子体照射，样品处理完毕后用无菌镊子将载片放至装有1ml生理盐水的EP管中，将EP管在振荡器上震荡1min，把附着在菌物载片上的微生物洗脱到液体中，形成新的菌悬液；对新的菌悬液进行适当稀释，取0.1ml稀释液涂布平板，置于32℃恒温培养箱中培养12d，培养好的平皿用于计算致死率和菌种筛选。
挑取不同ARTP诱变剂量下的单菌落共591株转接ISP2斜面培养。通过摇瓶发酵，HPLC检测发酵液中bafilomycin A1含量，其中菌株编号为Ba076、Ba115、Ba367发酵液中bafilomycin A1效价提高5倍左右的突变菌株，bafilomycin A1的发酵效价分别达到310mg/L、308mg/L、298mg/L。
分别对以上三株高产菌株进行连续5代传代培养，考察突变菌株遗传稳定性，实验结果见下表1，结果显示突变株Ba115遗传稳定性较好，将其进一步保存，其编号命名为FIM-Ba150115。
表1高产突变株遗传稳定性实验
实施例2链霉菌FIM-Ba150115的形态学和培养学特征
经鉴定，本实施例所述链霉菌FIM-Ba150115经革兰氏染色为阳性，在高氏合成一号琼脂和ISP2等培养基上生长7d后，基内菌丝发育良好，无横隔，不断裂，气生菌丝生长良好，多分枝，孢子丝直或柔曲。
分别采用ISPl、ISP2、ISP3、ISP4等七种培养基，于30℃培养14d后，观察茵丝体的颜色及色素情况，结果见下表2所示。
表2 FIM-Ba150115培养特征
培养基 生长情况 气生菌丝 基内菌丝 可溶性色素
ISP1 ++ 灰白 灰色 无
ISP2 +++ 灰褐 灰褐色 无
ISP3 + 灰 贫乏 无
ISP4 + 浅浅灰 贫乏 无
ISP5 +～++ 褐 灰色 无
ISP6 +++ 灰褐 褐色 无
ISP7 + 褐色 无色 无
备注：+++:好；++:中等；+:差。
对所述菌株的生理生化性质鉴定按照链霉菌分类中的标准方法进行。经鉴定，保存菌株FIM-Ba150115的菌株的生理生化反应为：明胶液化，深褐色素，牛奶凝固并胨化，淀粉水解好，纤维素上生长不良，硝酸盐还原，产生类黑色素和H2S，能够利用D-葡萄糖、D-木糖、D-果糖、D-甘露醇、肌醇，而不能利用L-阿拉伯糖、蔗糖、鼠李糖、棉子糖。
对所述保存菌株进行16SrDNA序列分析分析：用溶菌酶法从新鲜菌体提取基因组DNA，采用通用引物进行16SrDNA扩增，PCR产物经检测、纯化后直接用Taq DeoxyTerminator Cyele Sequencing Kit测序，电泳及数Applied Biosystems DNASequencer(model377)自动进行。所测的16SrDNA序列经校对、拼接后与GenBank数据库中相关种属的序列进行BLAST比较，菌株FIM-Ba150115的16SrDNA进化树见附图1。
根据度菌株的形态特征、培养特征、生理生化特征及16SrDNA序列综合分析，证明本发明筛选的菌株FIM-Ba150115鉴定为一株新的灰褐色链霉菌(Streptomycesgriseobrunneus)。上述链霉菌FIM-Ba150115保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京朝阳区大屯路甲3号，中国科学院微生物研究所，简称为CGMCC)，其登记入册的编号是CGMCC No.15241，保藏日期为2018年1月18日。该菌株为bafliomycins A1化合物高产菌株。
实施例3发酵液中bafilomycin A1的检测
本发明下述各实施例中对发酵液中bafilomycin A1含量的检测按照现有技术中HPLC法进行。
发酵样品制备：取菌株发酵液10mL并加入20mL甲醇混匀，振荡混匀20min，离心，备用，并采用HPLC法进行bafilomycin A1的检测。
高效液相色谱分析条件色谱柱检测条件包括：
Ultimate LP-C18分析柱(5μm，4.6×250mm)；
流动相：体积比为85：15的甲醇-水溶液；
流速：1.0mL/min；
进样量：10μL；
检测波长：247nm；
采用时间：30min；
采用峰面积计算含量。
将bafilomycin A1对照品与待测发酵液样品经光电二极管阵列检测器210-400紫外扫描，观察二者的最大吸收峰，按色谱条件测定，若发酵液供试品色谱中相应峰与bafilomycin A1对照品色谱峰保留时间相同，则判断该峰为bafilomycin A1化合物。
标准曲线制作
准确称取bafilomycin A1标准品12.00mg于10mL容量瓶中，用甲醇溶解，配成浓度为1200μg/mL的标准品溶液，采用二倍稀释法精确吸取该标准品溶液用甲醇稀释成18.75、37.5、75、150、300、600μg/mL的系列溶液，分别取10μL注入HPLC仪，以浓度(C，μg/mL)为横坐标，峰面积积分值(A)为纵坐标，线性回归方程为：y＝30013x+53907，R2＝1(如图2所示)。
结果表明，bafilomycin A1浓度在18.75-600μg/mL的范围内，其浓度与峰面积线性关系良好，也证明本发明中采用上述HPLC法检测发酵液中bafilomycin A1的含量是可行的。
实施例4高效液相色谱-四级杆飞行时间串联质谱(HPLC-Q-TOF-MS)分析
本发明下述各实施例中对发酵产物bafilomycin A1的结构检测按照现有技术中HPLC-Q-TOF-MS法进行，具体色谱条件包括：
色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18RRHD色谱柱(2.1×50mm，1.8μm)；
流动相：0.1％甲酸-水溶液：甲醇(体积比20：80)；
流速：0.4mL/min；
柱温：40℃；
进样量：1μL。
所述质谱条件为：
飞行时间质谱采用电喷雾正离子模式；
鞘气温度：350℃；
鞘气流速：11.0L/min；
喷嘴电压：1000V；
毛细管电压：3500V；
雾化气压力：35psi；
干燥气温度：320℃；
干燥气流速：8.0L/min；
喷雾室电流：4.39μA；
毛细管电流：0.068μA；
fragmentor电压：175V；
Skimmer电压：65V；
八级杆电压：750V；
质谱测定数据扫描模式：全扫描模式采集；
数据采集范围m/z：100-800。
为了进一步确证样品，采用HPLC-Q-TOF-MS分析技术对目标质荷比进行ESI正离子选择监测，对其结构进行鉴定。
实施例5发酵培养
配制ISP2固体斜面培养基：葡萄糖0.4％、麦芽提取物1.0％、酵母提取物0.4％、琼脂1.8％，蒸馏水配制，调pH7.2。将本发明灰褐色链霉菌FIM-Ba150115(保藏编号CGMCCNo.15241)接种于上述ISP2斜面，后于28℃恒温培养10-12d，并于4℃保藏。
摇瓶种子液培养基配制：可溶性淀粉2.0％、蛋白胨2.0％、酵母粉1.0％、CaCO30.2％，自来水配制，调pH7.2。
摇瓶种子液培养：在500mL三角瓶中装入上述种子培养基80ml，121℃高压消毒30min，冷却后接种斜面孢子悬液，于摇床250rpm、28-32℃培养48h，制得种子液。
按上述配方制备摇瓶种子液600mL，之后按照3％的接种量接种于20L种子罐(实际装液量12L)中，进行种子罐培养，控制温度28℃，转速为200-400rpm，罐压0.03-0.05Mpa，通气量为1：1vvm，培养48小时，制得发酵罐种子液。
发酵罐培养基：可溶性淀粉3.0％、蛋白胨1.5％、酵母粉1.0％、玉米浆干粉0.5％、碳酸钙0.3％，自来水配制，调pH7.2。
将上述种子罐培养好的种子液以5.0％的接种量接种到100L发酵罐(实际装液量75L)中，发酵转速控制200-400rpm、通气量控制0.08-1.2vvm，培养时间为96-120h。
发酵过程每隔12小时取发酵液5ml并加入10ml甲醇混匀振荡30min，8000rpm/min离心10min，后取上清液0.22um滤膜过滤，按照实施例3中方法进行HPLC检测，
将bafilomycin A1对照品与待测发酵液样品经光电二极管阵列检测器210-400紫外扫描，观察二者的最大吸收峰，扫描结果见图3所示。结果表明，二者紫外吸收图谱基本一致，均在247.4nm处有最大吸收峰。按色谱条件测定，发酵液色谱中相应峰与bafilomycinA1对照品色谱峰保留时间相同，判断本实施例摇瓶发酵液中含有bafilomycin A1化合物。按照实施例3中标准曲线测得最终产物bafilomycin A1的效价为320mg/L。
实施例6发酵产物的提取、纯化和结构确认
取实施例5中发酵结束后的发酵液约70L，直接加入两倍95％的工业乙醇搅拌浸泡2h，后用框式三足离心机3000r/min离心20min，后弃菌渣，乙醇浸泡清液以0.5BV/h的速度上样于HP20大孔吸附树脂柱进行吸附，然后分别用6倍柱体积的水、40％乙醇-水溶液来进行洗脱，流速为1BV/h，除去部分杂质色素；后用4倍柱体积的95％乙醇洗脱，收集洗脱液，再用旋转蒸发仪浓缩蒸干溶剂，得到膏状粗提物约70g。
取膏状粗提物用少量甲醇超声溶解，后与G200-300目硅胶充分搅拌混匀，后真空干燥去除有机溶剂。将伴有粗品的硅胶填装到硅胶(G200-300目)柱上层，然后分别用石油醚：乙酸乙酯＝8：1、石油醚：乙酸乙酯＝4：1、石油醚：乙酸乙酯＝2：1作为流动相进行梯度洗脱，分段收集洗脱液。收集液采用HPLC检测有效组分，合并相同组分，后真空减压浓缩，浓缩液溶于少量DMSO后上样于DAC动态轴向压缩系统(填料为C18，流动相为70％乙腈-水，流速10ml/min，检测波长247nm)。经HPLC检测后合并目标产物，真空干燥后，得化合物Ba0115纯品，并对该化合物的性质进行鉴定。
经鉴定，化合物Ba0115为白色至淡黄色不定形粉末，易溶于甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿等有机溶剂。化合物Ba0115的最大紫外吸收峰在波长247nm，最小吸收峰在波长261nm，其紫外吸收峰和红外特征吸收峰特征和bafilomycin A1基本一致。
按照实施例4中方法对化合物Ba0115进行质谱分析，提取离子流显示bafilomycinA1对照品与发酵液中bafilomycin A1出峰时间一致，质谱图如图4所示，结果显示样品的钠加合离子峰[M+Na]+为645.3978，钾加合离子峰[M+K]+为661.3708，提示其分子量为622.83，与已知bafilomycin A1相对分子质量相符。
化合物Ba0115的红外图谱如图5所示，1H-NMR谱图如图6所示，13C-NMR谱图如图7所示，化合物Ba0115和bafilomycin A1的1H-NMR(400MHz)和13C-NMR(100MHz)数据如下表3所示。
表3化合物Ba0115和bafilomycin A1的1H-NMR(400MHz)和13C-NMR(100MHz)数据
通过1H-NMR和13C-NMR的数据比较，化合物Ba0115和bafilomycin A1的1H-NMR和13C-NMR的数据基本吻合。
综合上述HPLC-Q-TOF-MS、UV、IS和1H-NMR和13C-NMR分析，确定本发明发酵液中获得化合物Ba0115与bafilomycin A1同质，可制得目标产物。
实施例7摇瓶发酵
按照实施例5中方法配制ISP2固体斜面进行菌株斜面保存。
按照实施例5中方法配制摇瓶种子液培养基，并进行种子液培养，制得种子液。
本实施例摇瓶发酵培养基：可溶性淀粉3.0％、蛋白胨1.5％、酵母粉1.0％、玉米浆干粉0.5％、碳酸钙0.3％，自来水配制，调pH7.2。
摇瓶发酵培养：在500mL三角瓶中装入上述发酵培养基80mL，121℃高压消毒30min，冷却后接种培养好的种子液，接种量为5％，于摇床250rpm，28-32℃培养120h，收集发酵液。
发酵结束后取发酵液5ml加入10mL甲醇混匀振荡30min，8000rpm/min离心10min，后取上清液0.22um滤膜过滤，按照实施例3中记载方法对发酵液进行HPLC检测，测得发酵液中目标产物bafilomycin A1的效价为310mg/L。
实施例8摇瓶发酵
本实施例中菌株保存及种子液制备步骤中培养基选择和培养条件均与实施例5相同。
本实施例摇瓶发酵培养基：可溶性淀粉3.0％、蛋白胨2.0％、酵母粉1.5％、玉米浆干粉1.0％、碳酸钙0.2％，自来水配制，调pH7.2。按照实施例5中方法进行摇瓶发酵培养，制得发酵液。
发酵结束后，收集取发酵液进行HPLC检测，测得发酵液中目标产物bafilomycinA1的效价为484.73mg/L。
实施例9摇瓶发酵
本实施例中菌株保存及种子液制备步骤中培养基选择和培养条件均与实施例5相同。
本实施例摇瓶发酵培养基：可溶性淀粉3.0％、蛋白胨3.0％、酵母粉1.5％、玉米浆干粉1.0％、碳酸钙0.2％，自来水配制，调pH7.2。并按照实施例5中方法进行摇瓶发酵培养，制得发酵液。
发酵结束后，收集取发酵液进行HPLC检测，测得发酵液中目标产物bafilomycinA1的效价为392.79mg/L。
实施例10摇瓶发酵
本实施例中菌株保存及种子液制备步骤中培养基选择和培养条件均与实施例5相同。
本实施例摇瓶发酵培养基：可溶性淀粉4.0％、蛋白胨2.0％、酵母粉2.0％、玉米浆干粉1.0％、碳酸钙0.2％，自来水配制，调pH7.2。按照实施例5中方法进行摇瓶发酵培养，制得发酵液。
发酵结束后，收集取发酵液进行HPLC检测，测得发酵液中目标产物bafilomycinA1的效价为371.79mg/L。
实施例11摇瓶发酵
本实施例中菌株保存及种子液制备步骤中培养基选择和培养条件均与实施例5相同。
本实施例摇瓶发酵培养基：可溶性淀粉4.0％、蛋白胨3.0％、酵母粉2.0％、玉米浆干粉1.5％、碳酸钙0.2％，自来水配制，调pH7.2。按照实施例5中方法进行摇瓶发酵培养，制得发酵液。
发酵结束后，收集取发酵液进行HPLC检测，测得发酵液中目标产物bafilomycinA1的效价为371.13mg/L。
实施例12摇瓶发酵
本实施例中菌株保存及种子液制备步骤中培养基选择和培养条件均与实施例5相同。
本实施例摇瓶发酵培养基：可溶性淀粉4.0％、蛋白胨3.0％、酵母粉2.0％、玉米浆干粉1.5％、碳酸钙0.2％、醋酸铵0.05％，自来水配制，调pH7.2。按照实施例5中方法进行摇瓶发酵培养，制得发酵液。
发酵结束后，收集取发酵液进行HPLC检测，测得发酵液中目标产物bafilomycinA1的效价为432.08mg/L。
实施例13摇瓶发酵
本实施例中菌株保存及种子液制备步骤中培养基选择和培养条件均与实施例5相同。
本实施例摇瓶发酵培养基：可溶性淀粉4.0％、蛋白胨3.0％、酵母粉2.0％、玉米浆干粉1.5％、碳酸钙0.2％、亮氨酸0.1％，自来水配制，调pH7.2。按照实施例5中方法进行摇瓶发酵培养，制得发酵液。
发酵结束后，收集取发酵液进行HPLC检测，测得发酵液中目标产物bafilomycinA1的效价为446.82mg/L。
实施例14摇瓶发酵
本实施例中菌株保存及种子液制备步骤中培养基选择和培养条件均与实施例5相同。
本实施例摇瓶发酵培养基：可溶性淀粉4.0％、蛋白胨3.0％、酵母粉2.0％、玉米浆干粉1.5％、碳酸钙0.2％、异亮氨酸0.2％，自来水配制，调pH7.2。按照实施例5中方法进行摇瓶发酵培养，制得发酵液。
发酵结束后，收集取发酵液进行HPLC检测，测得发酵液中目标产物bafilomycinA1的效价为462.58mg/L。
实施例15摇瓶发酵
本实施例中菌株保存及种子液制备步骤中培养基选择和培养条件均与实施例5相同。
本实施例摇瓶发酵培养基：可溶性淀粉4.0％、蛋白胨3.0％、酵母粉2.0％、玉米浆干粉1.5％、碳酸钙0.2％、缬氨酸0.025％，自来水配制，调pH7.2。按照实施例5中方法进行摇瓶发酵培养，制得发酵液。
发酵结束后，收集取发酵液进行HPLC检测，测得发酵液中目标产物bafilomycinA1的效价为468.14g/L。
实施例16摇瓶发酵
本实施例中菌株保存及种子液制备步骤中培养基选择和培养条件均与实施例5相同。
本实施例摇瓶发酵培养基：可溶性淀粉4.0％、蛋白胨3.0％、酵母粉2.0％、玉米浆干粉1.5％、碳酸钙0.2％、缬氨酸0.05％，自来水配制，调pH7.2。按照实施例5中方法进行摇瓶发酵培养，制得发酵液。
发酵结束后，收集取发酵液进行HPLC检测，测得发酵液中目标产物bafilomycinA1的效价为448.68mg/L。
实施例17摇瓶发酵
本实施例中菌株保存及种子液制备步骤中培养基选择和培养条件均与实施例5相同。
本实施例摇瓶发酵培养基：可溶性淀粉4.0％、蛋白胨3.0％、酵母粉2.0％、玉米浆干粉1.5％、碳酸钙0.2％、缬氨酸0.1％，自来水配制，调pH7.2。按照实施例5中方法进行摇瓶发酵培养，制得发酵液。
发酵结束后，收集取发酵液进行HPLC检测，测得发酵液中目标产物bafilomycinA1的效价为529.95mg/L。
实施例18摇瓶发酵
本实施例中菌株保存及种子液制备步骤中培养基选择和培养条件均与实施例5相同。
本实施例摇瓶发酵培养基：可溶性淀粉4.0％、蛋白胨3.0％、酵母粉2.0％、玉米浆干粉1.5％、碳酸钙0.2％、缬氨酸0.2％，自来水配制，调pH7.2。按照实施例5中方法进行摇瓶发酵培养，制得发酵液。
发酵结束后，收集取发酵液进行HPLC检测，测得发酵液中目标产物bafilomycinA1的效价为615.87mg/L。
实施例19摇瓶发酵
本实施例中菌株保存及种子液制备步骤中培养基选择和培养条件均与实施例5相同。
本实施例摇瓶发酵培养基：可溶性淀粉4.0％、蛋白胨3.0％、酵母粉2.0％、玉米浆干粉1.5％、碳酸钙0.2％、缬氨酸0.3％，自来水配制，调pH7.2。按照实施例5中方法进行摇瓶发酵培养，制得发酵液。
发酵结束后，收集取发酵液进行HPLC检测，测得发酵液中目标产物bafilomycinA1的效价为536.21mg/L。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种发酵生产bafliomycins A1的方法，其特征在于，包括将发酵菌株接种于适宜发酵培养基中进行发酵培养的步骤；
所述发酵菌株为灰棕褐链霉菌，其分类命名为Streptomyces griseobrunneus FIM-Ba150115，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.15241，保藏日期为2018年1月18日。
2.根据权利要求1所述的发酵生产bafliomycins A1的方法，其特征在于，所述发酵培养基包括如下质量含量的组分：可溶性淀粉3.0-4.0％、蛋白胨1.5-3％、酵母粉1-2％、玉米浆干粉0.5-1.5％、碳酸钙0.2-0.3％，调pH值7.0-7.5。
3.根据权利要求2所述的发酵生产bafliomycins A1的方法，其特征在于，所述发酵培养基还包括0.025-0.3％的前体物。
4.根据权利要求3所述的发酵生产bafliomycins A1的方法，其特征在于，所述前体物包括异丁醇、异丁酸、醋酸铵、异亮氨酸、亮氨酸和/或缬氨酸。
5.根据权利要求1-4任一项所述的发酵生产bafliomycins A1的方法，其特征在于，所述发酵培养的条件包括：控制转速200-400rpm，通气量0.08-1.2vvm，于25-30℃进行发酵培养。
6.根据权利要求1-5任一项所述的发酵生产bafliomycins A1的方法，其特征在于，还包括将所述的灰棕褐链霉菌接种于种子培养基中进行种子液培养的步骤，所述种子培养基包括如下质量含量的组分：可溶性淀粉2.0％、蛋白胨2.0％、酵母粉1.0％、碳酸钙0.2％，调pH值7.2。
7.根据权利要求1-6任一项所述的发酵生产bafliomycins A1的方法，其特征在于，还包括将所述的灰棕褐链霉菌接种于ISP2斜面培养基中进行保存的步骤，所述ISP2斜面培养基包括如下质量含量的组分：葡萄糖0.4％、麦芽提取物1.0％、酵母提取物0.4％、琼脂1.8％，调pH值7.2。
8.根据权利要求1-7任一项所述的发酵生产bafliomycins A1的方法，其特征在于，还包括将发酵液中bafliomycins A1进行提纯的步骤。
9.根据权利要求8所述的发酵生产bafliomycins A1的方法，其特征在于，所述提纯步骤包括：
(1)发酵结束后，取发酵液加入95％的乙醇进行浸泡，离心并弃菌渣，收集乙醇浸泡清液以0.5BV/h的速度上样于HP20大孔吸附树脂柱进行吸附，然后分别用6倍柱体积的水，和40％乙醇-水溶液来进行洗脱，洗脱流速为1BV/h，以除去部分杂质色素；随后用4倍柱体积的95％乙醇进行洗脱，收集洗脱液，浓缩得到膏状粗提物；
(2)取膏状粗提物加入少量甲醇超声溶解，后与G200-300目硅胶充分搅拌混匀，并真空干燥去除溶剂；并将伴有粗品的硅胶填装到G200-300目硅胶柱上层，然后分别用石油醚：乙酸乙酯＝8：1、石油醚：乙酸乙酯＝4：1、石油醚：乙酸乙酯＝2：1作为流动相进行梯度洗脱，分段收集洗脱液；
(3)将收集的洗脱液采用HPLC检测有效组分，合并相同组分后真空减压浓缩，收集浓缩液溶于DMSO后上样于DAC动态轴向压缩系统，经HPLC检测后合并目标产物，真空干燥后，得bafliomycins A1化合物纯品。
10.根据权利要求9所述的发酵生产bafliomycins A1的方法，其特征在于，所述DAC动态轴向压缩系统，填料为C18，流动相为70％乙腈-水溶液，控制流速10ml/min，检测波长247nm。
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