CN114196552B - 一株土曲霉btbu20212047及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及土曲霉生产洛伐他汀的技术领域。本发明公开了一株土曲霉BTBU20212047 CGMCC No.23065。该菌株已于2021年7月21日作为专利菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，该中心简称为CGMCC，该中心地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏中心登记入册编号CGMCC No.23065。本发明通过土曲霉生物发酵制得的洛伐他汀，产率高，纯度高。
Description
技术领域
本发明涉及土曲霉生产洛伐他汀的技术领域。
背景技术
洛伐他汀(Lovastatin)可使胆固醇的合成减少，也使低密度脂蛋白受体合成增加，主要作用部位在肝脏，结果使血胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇水平降低，由此对动脉粥样硬化和冠心病的防治产生作用。
目前洛伐他汀的生产主要是利用红曲没再固体培养基中进行发酵。但固态发酵周期较长，发酵条件不溶液进行稳定控制。但由于生产成本和发酵水平的限制，液体发酵生产洛伐他汀一直没有形成产业化规模。因此获得洛伐他汀高产菌株和稳定的液态发酵条件，从而利用液态发酵大规模制备洛伐他汀，一直是工业领域希望解决的难题。
发明内容
本发明的第一目的是提供一株土曲霉(Aspergillus terreus)BTBU20212047，属于土曲霉属真菌(Aspergillus terreus)，该菌株已于2021年7月21日作为专利菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，该中心简称为CGMCC，该中心地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏中心登记入册编号CGMCC No.23065。
本发明的第二目的是提供利用该菌株发酵并纯化制得洛伐他汀的应用。
进一步地，所述洛伐他汀结构式如式I所示：
本发明通过土曲霉生物发酵制得的洛伐他汀，产率高，纯度高。
附图说明
图1为式I化合物的13C核磁共振图谱图。
图2为式I化合物的HPLC纯度色谱图。
具体实施方式
实施例1
1.菌株BTBU20212047的采集
2018年10月从中国福建省厦门市沿海采集的海泥中分离到一株菌，命名为菌株BTBU20212047。
2.菌株BTBU20212047的鉴定
菌株BTBU20212047的ITS部分序列见序列表的序列如SEQ ID NO.1所示，与GENBANK ACCESSION NO.AY373871.的序列相似性最高，相似性为99.67％。
根据以上鉴定结果，菌株BTBU20212047属于土曲霉(Aspergillus terreus)。
3.菌株BTBU20212047的保藏
菌株BTBU20212047，属于土曲霉(Aspergillus terreus)，已于2021年7月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，该中心简称为CGMCC，该中心地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏中心登记入册编号CGMCC No.23065。
4.菌株BTBU20212047制备洛伐他汀
1)取在-80℃甘油管中保藏的菌株BTBU20212047，用接种环接种于平皿马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基上，28℃静置培养7天得活化菌株。
所述PDA培养基为：40g Potato Dextrose Agar干粉(美国Gibco公司)，蒸馏水定容至1000mL，115℃灭菌30min。
2)用无菌水冲洗步骤1中的PDA培养基收集的活化菌株，将所收集的活化菌株接种到含有种子液培养基的250mL三角瓶中，150转，26℃摇床培养3天得到种子液。
将种子液按照5％比例接种到发酵培养基中，150转，26℃摇床培养10天得到发酵物。发酵液时发酵液为40ml，发酵结束后离心，分离菌体和上清液，上清液用等体积的乙酸乙酯萃取三次，浓缩乙酸乙酯得到粗提取物1(923mg)；菌体用20ml甲醇提取三次，浓缩甲醇得到粗提取2(2258mg)；粗体物1和2合并得到粗样品。称取100mg粗样品，溶解到1ml甲醇中，超声后，用0.45μm滤膜过滤。利用高效液相色谱进行分析，检测波长236nm，进样10μl。根据峰面积计算10μl样品中含有洛伐他汀33.47μg。
根据样品浓度为100mg/ml，得知10μl中含有样品1mg，因此计算：
33.47μg/mg×(923mg+2258mg)/40ml＝2662μg/ml
即离心，分离提纯发酵产物得到，测定发酵液中的洛伐他汀的含量为2662μg/ml。
所述PDA培养基上的活化菌株的接种量为所述种子液培养基体积的5％；
所述种子液培养基为马铃薯土豆培养基(购买自北京索莱宝科技有限公司)。
所述发酵培养基：硝酸钠3.0g，氯化钾0.5g，蔗糖20.0g，七水合硫酸镁0.5g，磷酸二氢钠0.2g，磷酸氢二钾1.0g，三氯化锑0.1g，碘化锶0.05g，次氯酸亚铁0.05g，硫酸锰0.6g，七水合硫酸亚铁0.01g，pH 6.0-6.5。
发酵结束后，发酵液离心，用进一步提纯发酵产物，得到如下式I所述化合物：
式I化合物的13C核磁共振图谱如图1所示，具体数值表如下：
式I化合物的HPLC纯度色谱图如图2所示，峰面积分析其中式I含量为98.89％。
本发明通过土曲霉生物发酵制得的洛伐他汀，产率高，最适条件下洛伐他汀的含量为2662μg/ml。
序列表
<110> 北京工商大学
<120> 一株土曲霉BTBU20212047及其应用
<130> P21052
<141> 2021-12-29
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 628
<212> DNA
<213> 土曲霉(Aspergillius terreus)
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Claims (6)
1.土曲霉(Aspergillus terreus)BTBU20212047，其保藏编号为CGMCC No.23065。
2.权利要求1所述土曲霉(Aspergillus terreus)BTBU20212047在制备洛伐他汀中的应用。
3.依据权利要求2所述土曲霉(Aspergillus terreus)BTBU20212047在制备洛伐他汀中的应用，其特征在于，所述洛伐他汀的化学式为：
4.权利要求1所述土曲霉(Aspergillus terreus)BTBU20212047制备洛伐他汀的方法，其特征在于，包括如下步骤：
将土曲霉(Aspergillus terreus)BTBU20212047用接种环接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，28℃静置培养7天得活化菌株；
将活化菌株接种到含有种子液培养基中，150转，26℃摇床培养3天得到种子液；
将种子液按照5％比例接种到发酵培养基中，150转，26℃摇床培养10天得到发酵物。
5.依据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基为：
硝酸钠3.0g，氯化钾0.5g，蔗糖20.0g，七水合硫酸镁0.5g，磷酸二氢钠0.2g，磷酸氢二钾1.0g，三氯化锑0.1g，碘化锶0.05g，次氯酸亚铁0.05g，硫酸锰0.6g，七水合硫酸亚铁0.01g，pH 6.0-6.5。
6.依据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述种子液培养基为马铃薯土豆培养基。
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
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