CN104140933A

CN104140933A - 土曲霉zrv2011f5及其应用

Info

Publication number: CN104140933A
Application number: CN201410384286.8A
Authority: CN
Inventors: 朱立颖; 冯纬; 王欣; 周利南
Original assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: ZHEJIANG WUWEIHE FOOD CO., LTD.
Priority date: 2014-08-06
Filing date: 2014-08-06
Publication date: 2014-11-12
Anticipated expiration: 2034-08-06
Also published as: CN104140933B

Abstract

本发明公开了一株新菌株-土曲霉菌(Aspergillus terreus)ZRV2011F5及其应用，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.8746，保藏日期为2014年1月20日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；该菌株能够生产莫纳可林K，其中分泌到培养基中的含量为116μg/ml，并且其代谢产物能够对sEH的两个酶具有抑制活性：水解酶与磷酸酶均有较高的抑制作用，5％添加量的抑制率分别为72％和93％。

Description

土曲霉ZRV2011F5及其应用

(一)技术领域

本发明涉及一种来自米醋发酵过程的能够生产莫纳可林K(monacolin K)的丝状真菌，特别涉及同时能够生产可溶性环氧化物水解酶(soluble epoxide hydrolase,sEH)抑制剂的土曲霉(Aspergillus terreus)ZRV2011F5及其应用。

(二)背景技术

他汀(statin)类化合物是抑制胆固醇合成的优良药物，能有效地降低LDL-胆固醇水平，并升高HDL-胆固醇水平，有效地阻止动脉粥样硬化斑的形成，全球销售额达到140亿美元以上，居治疗类药物的第三位(李师翁和冯琳，药物生物技术，2011，18(6)，536-68)。莫纳可林K，亦称为洛伐他汀，于1979年和1980年先后从Monascus ruber和Aspergillusterreus中发现，1987年由FDA批准上市。莫纳可林K的工业生产菌株为源于土壤的A.terreus。

莫纳可林K已经被证明具有多种药理作用，除了能显著降低血LDL-胆固醇，还具有调节炎症反应、抑制血栓形成，从而到达调控动脉硬化进程的作用。此外，莫纳可林K还具有促进葡萄糖代谢、增加胰岛素敏感性的作用，对代谢性疾病有治疗作用；还能刺激骨形成，对骨质疏松有一定的预防与治疗作用；具有免疫调节作用，能够阻止风湿性关节炎的发展，降低组织硬化性疾病的发生。

可溶性环氧化物水解酶(soluble epoxide hydrolase,sEH)是近几年出现的具有交叉功能的心血管疾病新靶标，该酶的抑制剂被认为是最具前景的心血管疾病靶标药物，不仅有抗高血压、抗炎症功能，还有保护心肌、肾脏、大脑等与高血压和粥样动脉硬化相关的终末器官的作用(Marino,J.P.,Jr.(2009)Soluble epoxide hydrolase,a target with multiple opportunitiesfor cardiovascular drug discovery.Curr Top Med Chem,9,452-63.)。

sEH是由两个60Kda的单体以反平行方式组成的同型二聚体，具有双重酶活性。每个单体有两个结构域，C末端有环氧化物水解酶活性，而N末端含有磷酸酶活性位点。sEH的主要生理功能是将环氧化二十碳三烯酸(epoxyeicosatrienoic acides,EETs)等环氧化合物水解成相应的二醇化合物，EETs被证明是内皮源性超极化因子，具有抗高血压、维持血管稳态平衡和抗炎症等作用，而这些环氧化合物的二醇化合物几乎不具备这类生理功能。因此抑制sEH的活性就能够增进EETs的心血管保护功能。

sEH的N末端磷酸酶活性，尽管功能尚未完全明确，已被认为是一个潜在高胆固醇血症的治疗靶标，而且sEH单核苷酸多态性的研究表明，拥有N末端Lys55Arg的人群，即使C末端的环氧化物水解酶活性不高，其较高的磷酸酶活性依然会增加冠心病的风险。

寻找sEH抑制剂已经成为世界各大制药公司新药研发的热点，已经有一个sEH的人工合成抑制剂1,3-二取代脲类化合物AR9281进入临床二期a研究(Imig,J.D.&B.D.Hammock(2009)Soluble epoxide hydrolase asa therapeutic target for cardiovascular diseases.Nature Reviews DrugDiscovery,8,794-805.)。而具有sEH抑制作用的天然化合物尚未见报道。

(三)发明内容

本发明目的是从米醋发酵醋醪中分离到一株能够生产莫纳可林K的土曲霉ZRV2011F5，其中分泌到培养基中的含量为116μg/ml。并且发现其代谢产物能够对sEH的两个酶具有抑制活性：水解酶与磷酸酶均有较高的抑制作用，体积终浓度5％添加量的抑制率分别为72％和93％。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一株新菌株--土曲霉(Aspergillus terreus)ZRV2011F5，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.8746，保藏日期为2014年1月20日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。

本发明还涉及所述土曲霉ZRV2011F5在制备莫纳可林K中的应用，具体所述的应用为：将土曲霉ZRV2011F5接种至M6培养基，25～30℃培养11～13天，获得含莫纳可林K的培养液，将培养液分离纯化，获得莫纳可林K；所述M6培养基的终浓度组成为:甘油70-110g/L，葡萄糖10-30g/L，豆粕30-50g/L，蛋白胨8g/L，硝酸钠2g/L，硫酸镁0.5-1g/L，橄榄油5g/L，溶剂为去离子水，pH值自然。

优选，所述培养液经24h冷冻干燥(Freeze Dry System，LABCONCO，USA)。

优选，所述M6培养基的终浓度组成为：甘油70g/L，葡萄糖30g/L，豆粕30g/L，蛋白胨8g/L，硝酸钠2g/L，硫酸镁1g/L，橄榄油5g/L，溶剂为去离子水，pH值自然。

所述土曲霉ZRV2011F5接种至M6培养基前，先接种至斜面培养基进行活化，所述活化方法为：将土曲霉ZRV2011F5接种至PDA斜面，25～30℃培养5天，获得菌体斜面；所述PDA培养基的组成：马铃薯浸出粉10.0g/L，葡萄糖20.0g/L，琼脂13g/L，氯霉素0.1g/L，溶剂为去离子水，pH值为自然。

本发明所述含莫纳可林K的培养液分离纯化的方法为：取培养液冷冻干燥后，加入培养液1倍体积的90％甲醇水溶液(体积浓度)，经涡旋混匀，置于超声波清洗仪(KUDOS，上海科导)中超声10sec后，在4℃浸提12h，获得甲醇浸提液，将浸提液离心取上清液，利用HPLC，收集莫纳可林K峰的组分，减压脱溶，获得莫纳可林K。

本发明还涉及所述土曲霉ZRV2011F5在抑制可溶性环氧化物水解酶活性中的应用，具体所述的土曲霉ZRV2011F5抑制剂为：将土曲霉ZRV2011F5接种至M6培养基，25～30℃培养11～13天，获得含莫纳可林K的培养液，将培养液冷冻干燥后，加入培养液1倍体积的体积浓度90％甲醇水溶液，在4℃静置浸提12h，获得甲醇浸提液，即获得抑制剂。

进一步，所述抑制剂的体积终浓度为1～5％(该浓度是指抑制剂在sEH酶活测定反应体系中的体积终浓度)。

本发明利用高效液相(HPLC)检测甲醇浸提液中的莫纳可林K含量；利用多孔板酶标仪检测甲醇浸提液对sEH的两种酶活性抑制情况：水解酶与磷酸酶的抑制作用。

目前尚未见到关于莫纳可林K能够抑制sEH活性的文献报道，因此本发明所述土曲霉的代谢产物既包含莫纳可林K，又具有抑制sEH活性的作用，表明不仅能够从抑制胆固醇合成的途径去控制血脂异常等心血管疾病，还能够从抑制sEH活性的途径去控制血压、抑制动脉硬化的发生与发展。

本发明所述土曲霉ZRV2011F5能够产生莫纳可林K，同时能够产生抑制环氧化物水解酶与环氧化物磷酸酶的活性物质，进而可以将该菌株的培养液应用于功能食品，从减少胆固醇合成，控制血压、抑制动脉硬化等多种途径，达到预防与控制心血管疾病的目的。

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明提供一株新菌株--土曲霉(A.terreus)ZRV2011F5，该菌株来自传统米醋发酵醋醪，不仅能够生产莫纳可林K，而且该菌培养产物对可溶性环氧化水解酶活性具有抑制作用，对sEH的水解酶与磷酸酶均有较高的抑制作用，尤其是对sEH磷酸酶的抑制率，在体积终浓度5％添加量时达到了93％，因此，土曲霉(A.terreus)ZRV2011F5能够用于生产抑制心血管疾病靶标sEH酶的抑制剂，从而起到多角度预防和治疗心血管疾病的作用。

(四)附图说明

图1为莫纳可林K的紫外图谱，A为三种形式莫纳可林K的HPLC紫外吸收图谱，B为三种形式的莫纳可林K经二极管阵列检测器(DAD)获得的紫外吸收光谱，其中a是开环酸钠盐形式的莫纳可林K，b为开环酸形式的莫纳可林K，c是内酯形式的莫纳可林K。

图2为实施例1中菌株ZRV2011F5的M6培养液的紫外图谱，A为HPLC紫外吸收图谱，B为20.01min峰(A中方框所示峰)的放大图，C为M6培养液的DAD光谱。

图3为实施例2中菌株ZRV2011F5的M6培养液的紫外图谱，A为HPLC紫外吸收图谱，B为20.02min峰(A中方框所示峰)的放大图，C为M6培养液的DAD光谱。

图4为实施例3中菌株ZRV2011F5的M6培养液的紫外图谱，A为HPLC紫外吸收图谱，B为20.03min峰(A中方框所示峰)的放大图，C为M6培养液的DAD光谱。

图5为实施例4中菌株ZRV2011F5的M6培养液对sEH的水解酶和磷酸酶活性的抑制作用图。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1.菌株ZRV2011F5的分离鉴定及其莫纳可林K的检测

1.菌株的分离纯化

利用马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基从米醋固态发酵醋醪(大米糖化阶段的料饼)中分离丝状真菌。采用无菌水将醋醪配制成质量浓度20％的悬浊液，进一步用无菌水稀释10倍，100倍和1000倍，分别涂布在虎红PDA平板，25℃-30℃培养5天，从能够挑出单个菌落的平板上，挑选不同形态的菌落于PDA平板进行划线培养，25℃-30℃培养3-5天，从划线培养的平板上挑选单个菌落，保存于PDA斜面。从PDA斜面挑取菌落接种到PDA平板进行划线培养，25-30℃培养3天，重复划线培养2次进行进一步的分离纯化，从划线培养的平板上挑选单个菌落，命名为菌株ZRV2011F5。

2.培养基的配制

PDA培养基的具体成分如下：马铃薯浸出粉10.0g/L，葡萄糖20.0g/L，琼脂13g/L，氯霉素0.1g/L，溶剂为去离子水，pH值为自然。虎红PDA培养基在PDA培养基的基础上添加终浓度0.05g/L的虎红。

3.HPLC检测分离菌株培养液中的莫纳可林K

利用HPLC的二极管阵列检测器(Diode Array Detector，DAD)检测莫纳可林K是近几年发展起来的较为简便的莫纳可林检测方法(Li,Y.G.,Zhang,F.,Wang,Z.T.,Hu,Z.B.J.Pharma.Biomed.Anal.35(2004)1101–1112.)。以C18柱PEGSIL-ODS(4.6×250,7μ,Senshu Scientific Co.,Tokyo,Japan)，采用L-2000系列高效液相色谱仪(Hitachi，日本)，流动相为甲醇与0.1％磷酸，流速为1ml/min，采用梯度方法在20分钟内甲醇的比例从10％上升到100％，利用DAD检测器L-2455(Hitachi,Ibaraki,Japan)在220nm处进行DAD分析。在此条件下对内酯形莫纳可林K、开环酸形莫纳可林K及开环酸钠盐形莫纳可林K三种标准品进行DAD分析，获得3个独立峰，保留时间分别为20.36min，19.94min和19.34min(图1中A)，并且在236nm处均获得相同的莫纳可林K的山形特征峰(图1中B)。

将菌株ZRV2011F5接种于M6培养基中，25℃-30℃培养13天，将培养液冷冻干燥，然后加入培养液等量体积的90％甲醇水溶液(体积浓度)，涡旋混匀，置于超声波清洗仪(KUDOS，上海科导)中超声10sec，4℃浸提12h，将浸提液离心取上清液，利用HPLC的紫外检测器分析上清液，检测到一个峰(保持时间20.01min)与开环酸形莫纳可林K(保留时间19.94)具有相同的保留时间(图2中B)，同时DAD检测器在236nm处检测到莫纳可林K的山形特征峰(图2中C)，表明菌株ZRV20115能够生产莫纳可林K。

M6培养基组成为：甘油70g/L，葡萄糖10g/L，豆粕30g/L，蛋白胨8g/L，硝酸钠1g/L，硫酸镁0.5g/L，橄榄油5g/L，溶剂为去离子水，pH值自然。

4.菌株ZRV20115的真菌ITS rRNA基因序列的分析

利用真菌ITS rRNA基因序列进行ZRV2011F5菌株的分子鉴定。采用真菌DNA提取试剂盒(Omega)提取DNA，利用真菌ITS引物ITS1(5'TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3')和ITS4(5'TCCTCCGCTTATTGATATGC 3')进行ITS rRNA基因序列的PCR扩增。扩增体系：反应体系25μL，DNA模板100ng，10×PCR Buffer 2.5μL，dNTP mix(10Mm)0.5μL，10μM上下游引物各0.5μL，Taq酶(5U/μL)0.2μL，加去离子水补足至25μL。扩增条件：预变性94℃5min，循环94℃1min，50℃1min，72℃2min，共30个循环，72℃延伸10min。

PCR产物纯化后送至上海桑尼生物工程有限公司(中国)进行DNA测序(SEQ ID NO：1所示)，将测序结果提交NCBI数据库中进行Blast比对，比对结果显示该菌株与Aspergillus terreus同源性为100％，将菌株ZRV2011F5鉴定为土曲霉菌(A.terreus)，命名为土曲霉菌(A.terreus)ZRV2011F5。

SEQ ID NO：1序列为：

GTCGACGATTTCCTCCGCTTATTGATATGCTTAAGTTCAGCGGGTATCCCTACCTGATCCGAGGTCAACCTGGAAAAAAACAAGTTGCAAATAAATGCGTCGGCGGGCGCCGGCCGGGCCTACGGAGCGGAAGACGAAGCCCCATACGCTCGAGGACCGGACGCGGTGCCGCCGCTGCCTTTCGGGCCCGTCCCCCGGGAGCCGGGGGACGAGGGCCCAACACACAAGCCGGGCTTGAGGGCAGCAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCCCCGGAATACCAGGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTAGTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCGGAACCAAGAGATCCATTGTTGAAAGTTTTAACTGATTGCAAAGAATCACACTCAGACTGCAAGCTTTCAGAACAGGGTTCATGTTGGGGTCTCCGGCGGGCACGGGCCCGGGGGCGAGTCGCCCCCCGGCGGCCAGCAACGCTGGCGGGCCCGCCGAAGCAACAAGGTACAATAGTCACGGGTGGGAGGTTGGGCCATAAAGACCCGCACTCGGTAATGATCCTTCCGCAGGTTCACCTACGGA

实施例2.土曲霉ZRV2011F5生产莫纳可林K

将土曲霉ZRV2011F5接种至PDA斜面，25-30℃培养5天，获得菌体斜面；从菌体斜面挑取菌体接种至M6培养基，25-30℃培养13天，取培养液冷冻干燥后，加入培养液1倍体积的体积浓度90％甲醇水溶液，涡旋混匀，在超声波清洗仪中超声10sec，在4℃静置浸提12h，获得甲醇浸提液，离心取上清液，采用实施例1步骤3所述方法进行HPLC检测。

在M6培养基中检测到了开环酸形莫纳可林K，保留时间为20.02min(图3中B)，含量达到了40μg/ml。

M6培养基的终浓度组成如下:甘油110g/L，葡萄糖30g/L，豆粕50g/L，蛋白胨8g/L，硝酸钠2g/L，硫酸镁1g/L，橄榄油5g/L，溶剂为去离子水，pH值自然。

实施例3

将实施例2中M6培养基的组成改为：

甘油70g/L，葡萄糖30g/L，豆粕30g/L，蛋白胨8g/L，硝酸钠2g/L，硫酸镁1g/L，橄榄油5g/L，溶剂为去离子水，pH值自然。

其它操作同实施例2，结果见图4所示。结果表明，在M6培养基中检测到了开环酸形莫纳可林K(图4中B和C)，含量为115μg/ml。结合实施例2，表明土曲霉ZRV2011F5能够在较广泛的培养基中生产莫纳可林K，有潜在的获得最优化生产条件的可能性。

实施例4土曲霉ZRV2011F5对sEH酶活性的抑制作用

1、高通量sEH活性检测方法

利用人工底物经sEH酶切后，其产物能够形成荧光的特点，采用多孔板检测仪SPECTRAMAX M5(MD，美国)动态监测酶反应过程中反应液的荧光强度，以反应的初速度来表示sEH活性的大小。在相同的100μL反应体系中，以添加缓冲液(25mM bis-tris HCl,1mM MgCl₂,0.1mg/ml BSA,pH 7.0)替代样品为空白对照，其活性计为100％，以添加样品为实验对象，分别检测sEH酶活性，从而获得抑制剂对sEH酶活性的抑制率。

2、sEH酶活性检测条件

(1)磷酸酶活性检测

对照：以缓冲液(25mM bis-tris HCl,1mM MgCl₂,0.1mg/ml BSA,pH7.0)为反应介质，以终浓度为300ng/ml的人源sEH酶为催化剂，加入终浓度为5μM的底物Attophos(promega)，在30℃反应30分钟，以激发波长450nm、发射波长545nm进行荧光动态检测。

实验：

以缓冲液(25mM bis-tris HCl,1mM MgCl2,0.1mg/ml BSA,pH 7.0)为反应介质，以终浓度为300ng/ml的人源sEH酶为催化剂，加入终浓度为5μM的底物Attophos(promega)，再分别加入体积终浓度1％，3％和5％的实施例3获得的土曲霉ZRV2011F5培养液的甲醇浸提液作为抑制剂，在30℃反应30分钟，以激发波长450nm、发射波长545nm进行动态荧光检测。

(2)水解酶活性检测

对照：以缓冲液(25mM bis-tris HCl,1mM MgCl2,0.1mg/ml BSA,pH7.0)为反应介质，以终浓度为12.5μM的PHOME(Cayman)为底物，以终浓度为80ng/ml人源sEH酶为催化剂，30℃反应20分钟，以激发波长330nm，发射波长465nm进行荧光动态检测。

实验：

以缓冲液(25mM bis-tris HCl,1mM MgCl2,0.1mg/ml BSA,pH 7.0)为反应介质，以终浓度为80ng/ml的人源sEH酶为催化剂，加入终浓度为12.5μM的PHOME为底物，再分别加入体积终浓度1％，3％和5％实施例3获得的土曲霉ZRV2011F5培养液的甲醇浸提液作为抑制剂，在30℃反应30分钟，以激发波长330nm，发射波长465nm进行荧光动态检测。

结果：利用96孔板进行荧光检测，每个样品重复2次，分别计算每个孔板中的酶活性，与空白对照比较计算抑制率，取平均值。如图5所示，当的甲醇浸提物添加量为5％(V/V)时，其对sEH水解酶与磷酸酶的抑制率分别为72％和93％。

Claims

1.土曲霉(Aspergillus terreus)ZRV2011F5，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.8746，保藏日期为2014年1月20日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。

2.如权利要求1所述土曲霉ZRV2011F5在制备莫纳可林K中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的应用为：将土曲霉ZRV2011F5接种至M6培养基，25～30℃培养11～13天，获得含莫纳可林K的培养液，将培养液分离纯化，获得莫纳可林K；所述M6液培养基组成为：甘油70～110g/L，葡萄糖10～30g/L，豆粕30～50g/L，蛋白胨8g/L，硝酸钠2g/L，硫酸镁0.5～1g/L，橄榄油5g/L，溶剂为去离子水，pH值自然。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述M6液培养基终浓度组成为:甘油70g/L，葡萄糖30g/L，豆粕30g/L，蛋白胨8g/L，硝酸钠2g/L，硫酸镁1g/L，橄榄油5g/L，溶剂为去离子水，pH值自然。

5.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述土曲霉ZRV2011F5接种至M6培养基前，先接种至斜面培养基进行活化，所述活化方法为：将土曲霉ZRV2011F5接种至PDA斜面，25～30℃培养5天，获得菌体斜面；所述PDA培养基的组成：马铃薯浸出粉10.0g/L，葡萄糖20.0g/L，琼脂13g/L，氯霉素0.1g/L，溶剂为去离子水，pH值为自然。

6.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述含莫纳可林K的培养液分离纯化的方法为：取培养液冷冻干燥后，加入培养液1倍体积的体积浓度90％甲醇水溶液，在4℃静置浸提12h，获得甲醇浸提液，将浸提液离心取上清液，利用HPLC，收集莫纳可林K峰的组分，减压脱溶，获得莫纳可林K。

7.如权利要求1所述土曲霉ZRV2011F5作为可溶性环氧化水解酶活性抑制剂的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述的抑制剂为：将土曲霉ZRV2011F5接种至M6培养基，25～30℃培养11～13天，获得含莫纳可林K的培养液，将培养液冷冻干燥后，加入培养液1倍体积的体积浓度90％甲醇水溶液，在4℃静置浸提12h，获得甲醇浸提液，即获得抑制剂。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于所述抑制剂的体积终浓度为1～5％。